Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Genetics

עיבוד של הכלאה צלמו של חלבונים הקשורים כרומטין פרוטאומיקס בתרבית של תאים

doi: 10.3791/57140 Published: June 1, 2018

Summary

זוהי שיטה לזיהוי חלבונים אינטראקציה-DNA הרומן ב לוקוסים יעד ספציפיות, בהסתמך על רצף ספציפי לכידתו של כרומטין תפור עבור ניתוחים פרוטיאומיה מבנית עוקבות. ידע מוקדם לגבי פוטנציאל מחייב חלבונים, ולא תא שינויים נדרשים. בתחילה פותח עבור שמרים, הטכנולוגיה כבר עכשיו מותאם בתרבית של תאים.

Abstract

התפיסה הכלאה של חלבוני כרומטין-הקשורים לטכנולוגיה פרוטאומיקס (HyCCAPP) פותחה בתחילה לחשוף את הרומן אינטראקציות חלבון-דנ א של שמרים. היא מאפשרת ניתוח של אזור היעד עניין ללא צורך ידע מוקדם על חלבונים סביר מאוגד לאזור היעד. זה, באופן תיאורטי, מאפשר HyCCAPP לשמש כדי לנתח בכל אזור גנומית של עניין, והוא מספק גמישות מספקת לעבודה במערכות תאים שונים. שיטה זו לא נועד ללמוד אתרי קישור של גורמי שעתוק ידוע, פעילות מתאימה יותר Immunoprecipitation כרומטין (ChIP) ושיטות כמו שבב. כוחו של HyCCAPP טמונה היכולת לחקור את אזורי ה-DNA אשר יש מוגבלת או לא ידע על החלבונים המאוגד. זה יכול להיות גם שיטה נוחה כדי למנוע הטיות (קיים בשיטות כמו צ'יפס) שהוצגו על ידי חלבון מבוססת כרומטין העשרה באמצעות נוגדנים. באופן פוטנציאלי, HyCCAPP יכול להיות כלי רב עוצמה כדי לחשוף את הרומן באמת אינטראקציות חלבון-דנ א. עד היום, הטכנולוגיה הוחל בעיקר תאי שמרים או העתק גבוהה רצפים חוזרים בתאי יונקים. כדי להפוך כלי רב עוצמה שנוכל לדמות, גישות HyCCAPP צריך ניתן למטב ללכוד ביעילות עותק יחיד לוקוסים בתאי יונקים. כאן, אנו מציגים שלנו הסתגלות של השמרים הראשונית HyCCAPP ללכוד את פרוטוקול שורות תאים אנושיים, ולהראות כי אזורים כרומטין עותק יחיד יכול להיות יעילה מבודדת עם פרוטוקול זה שונה.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

במהלך העשור האחרון, ראה שיפור דרמתי בטכנולוגיות רצף, המאפשר הלימוד של מגוון רחב של הגנום במספר גדול של דוגמאות, ועם רזולוציה מדהימה. הקונסורציום האנציקלופדיה של ה-DNA אלמנטים (קידוד), מאמץ רב מוסדיים בקנה מידה גדול ובאסטרטגיות האנושי הגנום מחקר המכון הלאומי של מכוני הבריאות הלאומיים, סיפקה תובנות גורמי שעתוק כמה בודדים אחרים חלבוני לאגד ולתקשר עם הגנום. המאמץ הראשוני מאופיין אינטראקציות חלבון-דנ א ספציפי, כפי שקובעת מאת immunoprecipitation כרומטין (ChIP) מעל 100 ידוע DNA מחייב חלבונים1. שיטות אלטרנטיביות כגון DNase footprinting2 , פורמלדהיד בידוד בסיוע של אלמנטים רגולטוריות (שלהם)3 גם שימשו כדי לאתר אזורים ספציפיים בגנום אינטראקציה עם חלבונים, אבל עם המגבלה ברור זה גישות אלה אינם מזהים את החלבונים אינטראקציה. למרות המאמצים במהלך השנים, התפתחה שום טכנולוגיה המאפשרת ביעילות אפיון מקיף של אינטראקציות חלבון-DNA כרומטין, זיהוי, כימות של חלבונים הקשורים כרומטין.

כדי לטפל צורך זה, פיתחנו גישה מוזרה אשר אנחנו כינה Hybridization Capture of Chromatin-Associated חלבונים עבור פרוטאומיקס (HyCCAPP). שפותחה לראשונה שמרים4,5,6, הגישה מבודד אזורים של כרומטין תפור עניין (עם חלבונים מאוגד) באמצעות לכידת הכלאה רצף ספציפי. לאחר בידוד של קומפלקסים חלבונים-DNA, גישות כגון ספקטרומטר מסה יכול לשמש כדי לאפיין את קבוצת חלבונים מאוגד רצף של עניין. לפיכך, HyCCAPP יכול להיחשב גם בגישה לבחון לחשוף את הרומן אינטראקציות חלבון-דנ א, מובן כי אין להסתמך על נוגדנים וזה לגמרי אגנוסטי על החלבונים שעשויים להימצא. ישנן גישות אחרות מסוגל לחשוף את הרומן חלבונים אינטראקציה דנ א7, אבל הכי להסתמך על שיטות כמו צ'יפס8,9,10, פלסמיד הוספות11,12, 13,14, או אזורים עם העתק גבוהה מספרים15. לעומת זאת, ניתן להחיל HyCCAPP multi-יחיד-להעתיק אזורים, היא אינה דורשת כל מידע מוקדם על החלבונים באזור. בנוסף, בעוד חלק מהשיטות שהוזכרו לעיל יש תכונות יקר, ובייחוד ולהימנע מהצורך חלבון-דנ א crosslinking תגובות, התכונה הייחודית של HyCCAPP היא כי ניתן להחיל אותה על אזורים עותק יחיד ב יבוצעו בהם שינויים תאים, וללא כל ידע מוקדם על חלבונים בשם איגוד, או נוגדנים זמינים.

בשלב זה, HyCCAPP בעיקר הוחלה על הניתוח של אזורים שונים גנומית שמרים4,5,6, שימש לאחרונה ניתוח אינטראקציות חלבון-DNA ב- DNA אלפא-לווין, באזור חוזר הגנום האנושי16. במסגרת העבודה השוטפת שלנו, אנחנו הסתגלו הגישה לכידת הכלאה שפותחה לראשונה על שמרים כרומטין להיות רלוונטי לניתוח של תאים אנושיים, להציג כאן ששונה פרוטוקול המאפשר לכידת סלקטיבי היעד עותק יחיד אזורים בהגנום האנושי בעזרת יעילות דומה שלנו מחקרים ראשוניים של שמרים. פרוטוקול ממוטבת חדש זה מאפשר כעת את הסתגלות וניצול מיטבי של הטכנולוגיה לחקור אינטראקציות חלבון-DNA ברחבי הגנום האנושי, באמצעות ספקטרומטר מסה או גישות אנליטיות אחרות.

חשוב להדגיש כי השיטה HyCCAPP מיועד לניתוח של אזורים ספציפיים, עדיין אינו מתאים ניתוח הגנום כולו. הטכנולוגיה היא שימושית במיוחד בעת התמודדות עם אזורים אשר יש מידע נדיר על חלבונים אינטראקציה או בעת ניתוח מעמיק ומקיף יותר של חלבונים אינטראקציה-לוקוס הגנום ספציפי רצוי. HyCCAPP נועד לחשוף DNA מחייבת חלבונים אבל לא לאפיין במדויק את האתרים מחייב חלבון ספציפי ב- DNA גנומי. ביישומה הנוכחי, המתודולוגיה אינו מספק מידע אודות רצפי דנ א איגוד או מוטיבים חלבונים בודדים. לכן, זה יפה משלימה את טכנולוגיות קיימות כגון שלהם, עשוי לאפשר זיהוי מחייב הרומן חלבונים באזורים גנומית המזוהה על-ידי ניתוח ראשוני שלהם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. ללכוד את עיצוב Oligonucleotide

  1. עיצוב פאנל של oligonucleotides בו ייעשה שימוש בעת לכידת הכלאה של האזור היעד/s.
    1. המטרה היא לעצב oligonucleotides 4 – 8 לפי אזור היעד, אבל כמו מינימום, עיצוב oligonucleotide אחת לפחות מיקוד בכל קצה של אזור היעד.
    2. אם הרצף היעד ארוך (> 500 בסיסים), לעצב את oligonucleotides כמו פרוש ככל האפשר כדי להבטיח העשרת היעילה כרומטין ברחבי האזור כולו היעד.
      הערה: הבחנו לוכדת אופטימלית עם 4-8 oligonucleotides. אף-על-פי תהליך זה יכול לעבוד טוב עם oligonucleotides יותר, זה לא נדיר לצפות לירידה בתשואות העשרה כאשר משתמשים רבים מדי oligonucleotides.
  2. עיצוב oligonucleotides עם טמפרטורות ההיתוך דומה, וודא כי הם לא יוצרים סיכות חזקה ולא יש אינטראקציות חזקה (לוקח בחשבון hybridizations יבוצע ב 42 ᵒC).
    הערה: אם • תנאי מקום אחיזה לרגל נבחר (4.12.3), נוספים חיצוניים 8 בסיס רצף יש להוסיף את oligonucleotide, ידרוש משלימים 'שחרור' oligonucleotides בזמנו של • תנאי ה-17. ניתן להשתמש במספר כלים תוכנה מסחרית בחר ולנתח את oligonucleotides. 25 מרס הראו תוצאות טובות, אך תלוי בגודל הגנום רצף, לכידת oligonucleotides ניתן לכלול איפשהו בין 20-80 בסיסים. בדרך כלל, לכידת oligonucleotides יש חום ההיתוך קרוב 62 ᵒC, אבל זה יכול להשתנות בהתאם לאורכם. טמפרטורות ההיתוך עקבי ו/או oligonucleotide אורך ברחבי המיקס לכידת יכול לעזור למנוע הטיות בלתי רצויים בהעשרה.
  3. עיצוב oligonucleotides ללכוד עם moiety ביוטין (רצוי מופרדים כרווח מהרצף לכידת) בקצה 3'.

2. תרבית תאים

  1. לגדל תאים lymphoblastoid האנושי (כגון GM12878 המוצגת כאן) או שורות תאים אחרים בתקשורת RPMI 1640 בתוספת 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 2 מ מגלוטמין ו- 5% סרום שור עוברית (FBS), ב 37 ᵒC ו- 5% CO2.
    1. הזרע הראשוני קפוא aliquots (2-5 x 105 תאים) בבקבוקון T-25 עם 6 מ של מדיה RPMI 1640 המבושלות 2.1.
    2. לפקח צפיפות התאים ואת הכדאיות.
      1. קח נציג aliquot של תאים, תכתים אותם עם צבע המתאים כגון trypan blue.
      2. מודדים את צפיפות התאים באמצעות hemocytometer או מונה הניתן תא אוטומטית.
    3. לפני התא מגיע צפיפות של עונה 1 פרק 106 תאים למ"ל, ספין התאים למטה ב- g x 100 עבור 5 דקות ולהעביר את התאים אל בקבוק T-75 25 מ של מדיה RPMI 1640 המבושלות 2.1. לגדל את התאים עד תא צפיפות מתקרב עונה 1 פרק 106 תאים/מ ל....
    4. להעביר את התאים בקבוקון T-150 ב 38 mL RPMI 1640 מדיה (2.1) ולגדול התאים עבור שני ימים נוספים.
      הערה: Lymphoblastoid התאים גדלים ההשעיה. הנחיות כלליות לגידול תאים lymphoblastoid ממליצים תא צפיפויות להישמר בין 0.2-1 x 106 תאים/מ ל.... בגלל כמות גדולה של החומר הנדרש בטכנולוגיה זו, בפרוטוקול הנוכחי נכתבה בכוונה לגדול תאים צפיפות תא מעבר מה הוא נפוץ. פרוטוקולי גידול התא יכול להיות מתוקן, הותאם על ידי הקורא בהתאם סוגי תאים כדי לשמש.
    5. ספין התאים למטה ב g x 100 למשך 5 דקות, resuspend התאים 10 מ"ל של מדיה RPMI 1640 (2.1) ויוצקים את המתלים לתוך בקבוק רולר2 ס מ 850 המכיל 500 מ"ל של מדיה. דגירה התאים תחת באותם התנאים כמו בעבר אך בשלב זה להתחיל באמצעות סיבוב קבוע (~0.5 סל ד).
    6. לפקח על הגידול תא ולשנות את המדיה בעת הצורך (בדרך כלל כל יום 3-4). תן את התאים לגדול צפיפות קרוב ככל האפשר 2 x 106 תאים/מ ל (1 x 109 תאים בסך הכל).
    7. לאחר ספירת הרצוי מתמלאת, לקצור את התאים על ידי סחרור התאים למטה ב 100 x g למשך 5 דקות, resuspend התאים 36 mL RPMI 1640 מדיה (2.1). העברה התליה תא צינור חרוטי 50 מ. קח aliquots קטן עבור תא ספירת והפקת הדנ א.
  2. Crosslink על-ידי הוספת 1 מ"ל של 37% פורמלדהיד להגיע ריכוז סופי של 1%.
    התראה: פורמלדהיד הוא חומר מסרטן ויש לטפל בשכונה fume.
    1. דגירה התאים עם סיבוב (~ 30 – 60 סל ד) 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    2. להרוות את התגובה crosslink על-ידי הוספת 2 מ"ל של הפתרון גליצין 2.5 מטר, ריכוז סופי של 125 מילימטר.
    3. דגירה התאים עם סיבוב (~ 30 – 60 סל ד) עבור 5 דקות ב RT. גלולה התאים על ידי צריך שתוציאו ב 100 x g למשך 5 דקות ולשטוף את התאים פעמיים עם PBS קר 1 x קרח.
  3. להמשיך הצעד הבא או resuspend בגדר ב 5 מ של מאגר פירוק התא (5 מ מ. Hepes, 85 מ מ אשלגן כלורי, 0.5% Igepal, מעכבי פרוטאז (PI)), snap-להקפיא המתלים טיפה על ידי ירידה חנקן נוזלי. אחסן את הדגימות ב-80 ᵒC.
    הערה: להכין > 25 מ של מאגר פירוק התא ללא Igepal ו- PI ולהוסיף הללו טריים ריאגנטים כאשר הוא מוכן לשימוש. הימנע אחסון לטווח ארוך של מאגר פירוק התא ברגע Igepal ו- PI נוספו. לאחסן מאגר פירוק התא-4 ᵒC עד 3 חודשים. Igepal הוא חומר ניקוי nonionic, הלא denaturing. NP-40 יכול לשמש באופן פוטנציאלי כחלופה Igepal אבל לא השתמשנו בו בהקשר זה כמו NP-40 לא מומלץ כאשר דוגמאות מנותחות בסופו של דבר באמצעות ספקטרומטר מסה כדי לאפיין את החלבונים איגוד ה-DNA.

3. פירוק ו הטיה

  1. להכין > 15 מ"ל של מאגר פירוק גרעיני (10 מ מ EDTA, 50 מ מ טריס pH 8.0, 1% מרחביות, PI).
    הערה: להוסיף פאי טרי, רק כדי הסכומים כדי לשמש. הימנע אחסון לטווח ארוך של גרעינים פירוק מאגר ברגע PI נוספה. ניתן לאחסן מאגר פירוק גרעיני ב RT עד כחודש.
  2. Resuspend בגדר ב- 20 מ של מאגר פירוק התא (מכיל Igepal ו- PI). תן את כדורי להפשיר בקרח ומערבבים טוב פעם הקרת. תן דוגמאות לשבת 10 דקות נוספות על קרח. Centrifuge התאים ב 400 g x-4 ᵒC במשך 5 דקות.
  3. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend התאים 6 מ של מאגר פירוק גרעיני עם PI (אמצעי אחסון ניתן להגדיל אם תאים לא בצורת השעיה).
  4. כהכנה sonication, לחלק את הדגימה בשכבה אחידה ~ 6-8 microfuge צינורות (600 עד 1,000 µL לכל שפופרת).
    1. מניחים את הדוגמאות על קרח או מתלה קר, sonicate הדגימה באמצעות sonicator microtip. השתמש משרעת 65% 5 x 20 s קבוע צרורות, המאפשר את המתלים להתקרר לפחות 40 s בין פולסים.
      הערה: אם להגדיל אמצעי אחסון > 10 מ"ל לכל דגימה, כוס קירור תא ניתן להשתמש במקום זאת. התפרצויות יותר, ארוך יותר יהיה צורך לאחר מכן. Sonicators ונבדלים זה מזה. התנאים ייתכן שתצטרך להיות אופטימיזציה על ידי הקורא. חלופות אחרות sonication יכול לשמש גם כן.
  5. Centrifuge התאים ב g x 12,000 10 דקות ב- 4 ᵒC, להעביר את תגובת שיקוע צינור, וזורקים כדורי.
  6. מעריכים להזדהות באמצעות שיטת fluorometric.
  7. המשך הצעד הבא או snap-הקפאת ולאחסן את הדגימה ב-80 ᵒC.
  8. אופציונלי: לקחת crosslinks aliquot, להפוך על ידי המקננת אותו בן לילה-ᵒC 67 ב- 0.3 M NaCl. לנקות את ה-DNA ולהפעיל אותו ב- Bioanalyzer כדי לקבוע את אורך קטע. רוב השברים צריך להיות בין 500 ו- 1000 bp.
    הערה: זה בסדר להפסיק בשלב זה ולאחסן את הדגימות ב-80 ᵒC.

4. הכלאה לכידת

  1. הכנת 500 מ"ל של 2 x מאגר הכלאה (Hyb) (200 מ"מ MES, 2 M NaCl, 40 מ מ EDTA, 0.02% Tween-20), 500 מ"ל של שטיפת מאגר (200 מ"מ NaCl, 0.2% מרחביות, 50 מ מ טריס pH 8). אחסן את Hyb ואת שטיפת מאגרי ב 4 ᵒC, בטמפרטורת החדר, בהתאמה, עד 3 חודשים. השתמש חצי המאגר x Hyb 2 כדי להכין 1 x מאגר הכלאה. גם לאחסן אותו ב- 4 ᵒC עד 3 חודשים.
    הערה: הנפח הכולל של לכידת הכלאה תהיה פעמיים היקף המדגם שנוצר בשלב הקודם (כפי שתואר עד כה, האחסון מדגם יהיה בסביבות 6 מ ל וובכך האחסון הכלאה הכולל יהיה 12 מ ל).
  2. להפריש חרוזים שווה ל- 5% נפח לכידת הכלאה סה כ (600 µL במקרה זה). מגנט הולם ומתאים יש צורך לעבוד עם החרוזים בשלבים הבאים.
  3. לשטוף את החרוזים שלוש פעמים עם 1 x Hyb מאגר שימוש פעמיים חרוזים באמצעי האחסון (1200 µL). Resuspend את החרוזים ב- 1,200 µL של 2 x Hyb מאגר. במקום הצינורות על המגנט עד הפתרון ולהסיר את המאגר.
  4. לבצע סליקה מראש תגובות 1.5 mL צינורות microfuge עם מספר מרבי של 700 µL מדגם למחזור. הוסף מספיק חרוזים (5%) ו- 2 x Hyb מאגר כדי לדלל את המאגר Hyb ל- 1 x (10 צינורות עם 600 µL מדגם µL 120 של חרוזים שטף resuspended 2 x Hyb מאגר, 480 µL של 2 x Hyb מאגר). דגירה להם 10 דקות בᵒc 31 עם סוף נגמר סוף הסיבוב (~ 30 – 60 סל ד).
  5. במקום הצינורות על מגנט עד חרוזים הינם ללא יכולת תנועה ולהעביר את הדגימות צינורות חדשים. למחוק את החרוזים.
    הערה: מרגע זה והלאה, צינורות מחייב נמוך מומלצים.
  6. Resuspend את oligonucleotides ללכוד את הפתרון עבודה של 10 pmol/µL ולהוסיף 4 µL של פתרון זה כל שפופרת.
    הערה: אזורים שונים יכולים לשמש בקרה אחד לשני, אך מומלץ לכלול oligonucleotide של לכידת עם רצף שלו מעורבל לשמש פקד שלילי אמיתי.
  7. דגירה הצינורות למשך 40 דקות בᵒc 42 עם סוף נגמר סוף הסיבוב (~ 30 – 60 סל ד).
  8. במהלך הדגירה, להפריש את החרוזים הדרושים (0.3 µL/pmol של לכידת oligonucleotide). לשטוף את החרוזים שלוש פעמים כפי שמתואר בשלב 4.3, אך resuspend תאי 1 x Hyb מאגר.
  9. להוסיף את החרוזים שטף הדגימה, דגירה בדגימות למשך 30 דקות ב- RT עם סוף נגמר סוף הסיבוב (~ 30 – 60 סל ד). במקום הצינורות על המגנט ולהסיר את תגובת שיקוע ברגע החרוזים יש היה מרותק למיטה.
  10. לשטוף את החרוזים
    1. להוסיף 1.2 מ של מאגר לשטוף, דגירה המדגם למשך 5 דקות עם סוף נגמר סוף הסיבוב (~ 30 – 60 סל ד)-המקום RT. צינורות על מגנט, חכה כמה דקות עד פתרון מנקה. להסיר את המאגר, חזור על שלב זה.
    2. להוסיף 1.2 מ של שטיפת מאגר ולאחר תקופת דגירה זה של h 1 עם סוף נגמר סוף הסיבוב (~ 30-60 סל ד) RT. במקום הצינורות על המגנט, חכה כמה דקות עד פתרון יתפזר. להסיר את המאגר, חזור על שלב זה צמצום זמן הדגירה 30 דקות בפעם השנייה.
    3. להוסיף 200 µL שטיפת המאגר, דגירה זה למשך 15 דקות עם סוף נגמר סוף הסיבוב (~ 30 – 60 סל ד) ב- 31 ᵒC. במקום הצינורות על המגנט, חכה כמה דקות עד פתרון יתפזר. הסר את המאגר.
    4. להוסיף 200 µL ל- PBS, תקופת דגירה זה של 5 דקות עם סוף נגמר סוף הסיבוב (~ 30 – 60 סל ד) RT. במקום הצינורות על המגנט, חכה כמה דקות עד פתרון יתפזר. להסיר את המאגר, חזור על שלב זה.
  11. • תנאי פשוטה
    1. µL 40 כיתה מולקולרית מים להוסיף החרוזים, דגירה זה-94 ᵒC במשך 5 דקות.
    2. במקום הצינורות על המגנט ולחכות מספר דקות עד הפתרון.
    3. להעביר את תגובת שיקוע לתוך צינור חדש. למחוק את החרוזים.
    4. המשך הניתוח פרוטיאומיה מבנית או לאחסן את הדגימה ב-80 ᵒC.
      הערה: • תנאי מסוג זה עובד היטב עבור ניתחה qPCR ומדידות פרוטאומיקס קצת, אבל במקרים אחרים שתי גישות אלטרנטיביות המתוארים להלן תשואה "מנקה" eluates.
  12. • תנאי DNase.
    1. להוסיף 40 µL של 1 x DNase מאגר ו- 2 U DNase כל שפופרת.
    2. דגירה הצינורות למשך 15 דקות ב 37 ᵒC.
    3. במקום הצינורות על מגנט, חכה כמה דקות עד הפתרון.
    4. להסיר את הדגימות eluted החרוזים ולמקם את הדגימות צינור נמוך מחייב.
    5. דגירה הצינור-94 ᵒC למשך 7 דקות להשבית את האנזים והמשך פרוטיאומיה מבנית ניתוחים.
      הערה: ריכוז DNase נמוך יותר ניתן להשתמש אם נצפית הפרעה עם ניתוחים פרוטיאומיה מבנית. זה לא יהיה ניתן לחשב את לכידת enrichments על ידי qPCR אם שיטה זו • תנאי משמש מאז הטיפול DNase הורסת לגמרי את החומר DNA במדגם.
    6. המשך ניתוח פרוטיאומיה מבנית או לאחסן את הדגימה ב-80 ᵒC.
  13. • תנאי מקום אחיזה לרגל17.
    הערה: שיטה זו אינה מומלצת יותר oligonucleotides (> 40 בסיסים). שיטה זו מחייבת את oligonucleotides לכידת להכיל של 8 בסיסים נוספים, שאינם חופפים עם רצף גנומית, שחרור משלימים oligonucleotides כדי לתפוס את המטרה של oligonucleotides ללכוד.
    1. למהול 2 nanomoles של שחרור oligonucleotides ב 40 µL מאגר האס.
    2. תקופת דגירה זה של 20 דקות ב- RT.
    3. במקום הצינורות על מגנט ולחכות מספר דקות עד הפתרון.
    4. הסר את הפתרון של החרוזים.
    5. המשך ניתוח פרוטיאומיה מבנית או לאחסן את הדגימה ב-80 ᵒC.

5. הערכת ללכוד תשואה על-ידי qPCR עם צבעי יסוד במטרה ללכוד אזור של הריבית

  1. להשתמש תוכנה מתאימה או כלי מקוון כדי לעצב תחל וזונדים עבור אזור היעד.
    הערה: בניסוי זה, האזור המקדם של DUSP3 ושל DUSP5 ממוקדים. תחל וזונדים המשמש הן הבאות. DUSP3: פריימר 1 - חברתנו TTT AGG TTC CCT גת CC, תחל 2 - CGG AAT GTC TGC CTT CG, התווית על-ידי FAM בדיקה - TCC ATG CCC גה TTG TGA מס רווחי הון CGG; DUSP5: פריימר 1 - TGA גה AGC CCT גת חברתנו TC, תחל 2 - GCC TTC אגא AAC CCC AAA AG, בדיקה התווית על-ידי FAM TGC ATT תג קובי קובי חטיבתי ATG AGG TT.
  2. קח את aliquot של eluate (לא יותר מ- 10 µL), לדלל 1:10 עם מולקולרית כיתה ח2O.
  3. לחלץ את ה-DNA של אחד aliquots נלקח בשלב 2.1.7 ולהשתמש דנ א הזה כדי להפוך עיקול רגיל על-ידי ביצוע חמש טורי 1:10 דילולים במולקולרית כיתה ח2O.
  4. להכין תערובת בסיס qPCR (מגוון רחב של חלופות מסחריות), להוסיף תחל וזונדים, לוותר על הכמות המתאימה (µL 15 אם מפעיל תגובת 20 µL) כל היטב.
  5. להוסיף 5 µL משני: א) מדולל לדוגמה, b) עקומת רגיל או כיתה ג) מולקולרית H2O (כדי לשמש אין שליטה תבנית) כל טוב.
  6. לאטום את הצלחת, centrifuge זה ב 100 x g עבור 1 דקות.
  7. הפעלת מערכת qPCR עם הפרמטרים הבאים: 5 דקות ב- 95 ᵒC ואחריו 40 מחזורי 95 ᵒC עבור 20 s, ᵒC 59 עבור 20 s ו- 72 ᵒC ב-25 s.
  8. השתמש העיקול סטנדרטי ישבנים התשואות וללכוד מקושקשות להעריך לכידת ירידה לפרטים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

בשל הצורך עבור קלט כמויות גדולות של כרומטין HyCCAPP להצליח, התאים גדלים רמות גבוהות יחסית של confluency. Trypan צביעת התכלת משמש כדי לאשר כי שיעורי המוות התא הם מתון (< 10%). בניסויים עותק בודד, כרומטין תוכן לפני הכלאה לכידת צריך להיות בטווח femtomolar, אשר בדרך כלל דורש לפחות 109 תאים כמתחילה חומר. לפני ניסויים בקנה מידה מלא, מומלץ לבחון ביצועים oligonucleotide לכידת אצוות קטנות יותר. לכידות הכלאה באמצעות טיטור של oligonucleotides מוצגים באיור1. המספר של לכידת oligonucleotides הוא גדל בהדרגה תוך ריכוז מוחלט נשאר קבוע. ניסוי זה מראה בבירור שלושה היבטים מרכזיים. קודם כל, זה עוזר לקבוע, עבור אזור מסוים, כמה oligonucleotides יש צורך להגיע היעילות הכלאה של האופטימלית (ו מקסימלי). שנית, היא מגלה אם יש באינטראקציה מזיקה ברור בין מסוימת של oligonucleotides. לבסוף, זה מראה אם יש כל oligonucleotides עם ירידה לפרטים המסכן שנושאים כמויות ניכרות של הרקע (במקרה זה נמדד על ידי ניתוח qPCR עם צבעי בסיס פילוח אזורים אחרים בגנום).

התשואות הכלאה של לכידת יופיעו צנוע בשל אופיו צולבים של המדגם כרומטין. חלק ניכר של קטעים בכרומטין תפור לא תהיה לשכנוע לכידת הכלאה. הכלאה טורי ניסויים להפגין זו (איור 2). אם התפיסה הכלאה מופעל בהצלחה, ניסוי לכידת הבאים מאותו חומר כרומטין באמצעות קבוצה שונה של לכידת oligonucleotides תגרום תשואות דומות (מעט נמוך יותר) מאשר בעת שימוש טריים כרומטין (~ 11% נמוך על ממוצע). אבל אם באותו האזור המיועד שוב עם אותה קבוצה של oligonucleotides בניסוי לכידת השני באמצעות כרומטין מדגם הנותרים לאחר הלכידה הראשונה להתנסות, התשואה יקטן כ-90%, המאשר כי רוב כבר נתפס חומר הכלאה-קלה. ירידה כזו בלכידה לא נצפו לאחר לכידות הבאים עם אותה קבוצה של oligonucleotides, מציין בעיה טכנית בשלב לכידת הכלאה.

במערכות פשוטות כמו שמרים, הבחנו היעילות לכידת מתקרב 4%5, אשר הובילה הזיהוי של חלבונים 9 באופן שונה מועשר 2 אזורים כאשר שמרים גדל בתנאים שונים. בתאי אדם לעומת זאת, עובר הגנום ~ 250 פעמים גדול יותר שמרים, הכלאה התשואות הם בדרך כלל מתחת 1% (איור 3). איור 3 מראה, ניסוי יחיד עשוי להניב כמויות מספיקות עבור ניתוחים פרוטאומיקס. במקרה זה, מספר דגימות שנתפסו יצטרך להיות איחדו על מנת לבצע ניתוח ספקטרומטר מסה עוקבות. לחלופין, ריכוז נמוך יותר של כרומטין אזור היעד שנתפסו יכול לשמש עבור ניתוח ממוקד גישות כגון סופג המערבי מבוסס ספקטרומטר מסה התגובה שנבחרה ניטור מבחני.

Figure 1
איור 1: תיבת מגרש ייצוג לכידת oligonucleotide טיטור. מספר גדל והולך של לכידת oligonucleotides היו נבדק, נותחו על ידי qPCR. רקע מתייחס qPCR מבחני מיקוד אזורים אחרים בגנום. הערכים מוצגים כשינוי קיפול מן הכלאה לכידה באמצעות oligonucleotide של יחיד. . שפם מייצגים את ערכי המינימום והמקסימום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: תיבת מגרש ייצוג לכידות טורי. לכידות סדרתית הכלאה עם אותה קבוצה של oligonucleotides (A_A) להראות ירידה חזקה העשרה לעומת הכלאה רציפים לוכדת באמצעות קבוצה שונה של oligonucleotides (A_B) (p = 3.88 e-5). העשרה נמדדת qPCR, הערכים מוצגים ביחס לכידות באמצעות כרומטין טריים. . שפם מייצגים את ערכי המינימום והמקסימום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: לכידת הכלאה באמצעות תאים אנושיים. הכלאה ללכוד של אזורים ממוקם כרומוזומים שונים. כל אזור משמש פקד שלילי עבור האחר. בנוסף, לכידה הכלאה מתבצעת באמצעות הרצף (Scr) מקושקשות כפקד שלילי אמיתי. קווי שגיאה לייצג סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

שיטת HyCCAPP המתוארים כאן יש תכונות ייחודיות רבות, המאפשרות גישה רב-עוצמה לחשוף את הדנ א-אינטראקציות אחרת הייתם נשארים חמקמקים. מהות התהליך נותן HyCCAPP את הגמישות לעבוד אורגניזמים שונים והאזורים של הגנום. זו שיטה, עם זאת, יש מספר מגבלות כדי להיחשב.

HyCCAPP היא שיטה אשר ימנע שינויים תא כך זה פוטנציאלי יכול להיות מיושם ראשי תאים, תא תרבות מערכות או דגימות רקמה אפילו. עם זאת, בגלל זה, זה דורש דגימות להיות תפור, אשר מפחית את הרגישות בניתוח פרוטיאומיה מבנית, ולכן דורשת כמויות קלט. שם מתגלים גישות המסתמכות על CRISPR ו- biotinylation של סביב חלבונים יכולים לתפקד ללא crosslinking תגובות12,13,14,18 גישות אלה יכולות להיות חזקות מאוד אם הוספות פלסמיד אינם מייצגים אילוץ, אך יכול לשמש רק במערכות התרבות תאים. גישות אחרות מתאימים היטב לזהות חלבון כללי אגודות מבוסס על מדינה כרומטין או על המצאות גורמי שעתוק מסוים, אך לא נועדו ללמוד לוקוסים בודדים9,10,19 .

הגישה HyCCAPP מציג גישה אלטרנטיבית עם ישימות רחבה, אך סביר כי יישומים במערכות תא שונים או אורגניזמים ידרוש אופטימיזציה. השלב הקריטי ביותר מיטוב בגישה כוללת מבחר של לכידת oligonucleotides ועיצוב. סדרה של בדיקות בקנה מידה קטן צריך להראות אם oligonucleotides מעוצב מתאימים ואם הרצף באזור נלכד ביעילות. ישנם מספר גורמים אשר יש לקחת בחשבון בעת תכנון ובדיקות לכידת oligonucleotides, כגון oligonucleotide אורך, תואר היחודיות באזור היעד וכן אינטראקציות בין קבוצת oligonucleotides כדי לשמש. כל האינטראקציות האלה יכול להיבדק בקלות על-ידי שימוש של qPCR assay ספציפי לאזור היעד. אם רצונך בכך, זרימת עבודה דמויי Seq שבב יכול לשמש כדי רצף שברי DNA שנוצר ולהבטיח כי ייחודה של העשרת הוא משביע רצון על פני כל הגנים5.

לבסוף, התנאים cross-linking הן גם מאוד חשוב בהליך HyCCAPP, הבחנו הבדלים בולטים בין מערכות שונות, להשגת התוצאות הטובות ביותר בתאי אדם מאת cross-linking עם 1% פורמלדהיד, ואילו בשמרים, cross-linking עם 3% פורמלדהיד הניבו תוצאות רבות לשחזור. זה אפשרי כי יותר אינטנסיבי cross-linking עם 3% פורמלדהיד בתאי אדם עם מבנה מורכב יותר של כרומטין אינו מספק מספיק נגישות עבור הכלאה לכידת oligonucleotides. . זה גם מתקבל על הדעת כי הנוכחות של קיר התא שמרים מעכבת פורמלדהיד גישה לתוך התאים, להגדיל את כמות פורמלדהיד הדרושים עבור רמות crosslinking מוצלחת כרומטין.

ביצוע שבב וגישות אחרות-לכידת מיקוד כרומטין האנושי תפור, הבחנו כי למעשה ניתן ללכוד רק כ 1% של יעד ה-DNA. עבור רוב הגישות מבוססות DNA וניתוחים, זו אינה גורם מגביל. עם זאת, בניגוד שבב, איפה המדידה האחרונה מבוססת על ה-DNA amplifiable, HyCCAPP מסתמך על תכולת החלבון לבדיקה הסופית. בשל מגבלה זו מהותי, כמויות גדולות של חומר קלט (בתרבית תאים בניסויים המובאת כאן) נדרשים: אלץ הזה יש לשקול בזהירות לפני שתצאו לחקור מתודולוגיה זו, במיוחד בשעת החלתם על אזורים עותק יחיד. לא כל המערכות יהיו מסוגלים לייצר מספר התאים הדרושים, או עלות גידול המספרים הדרושים תא אסורה. הכמויות קלט כי HyCCAPP דורש (~ 109 תאים) משולה בשיטות אחרות המסתמכות על חומר תפור עם קלט סכומים הנעים בין 108 ו 1011 תאים9,11,15. שינויים עתידיים של טכנולוגיית HyCCAPP תוכל לחקור גישות מלאכותי להגדיל מספרים עותק של האזורים היעד, כדי להפוך שיטה זו ישימה בצורה רחבה יותר. במקביל, נעבוד להמשיך להגדיל את היעילות הכוללת של תהליך זה יחד עם התקדמות רציפה ספקטרומטר מסה אמור להפחית את הסכומים קלט צריכה להפוך בטכנולוגיה זו ישים במערכות נוספות.

גישות Biotinylation המבוסס על שימוש CRISPR, כמו enCHiP18 ואחרים13,14, הראו ויעילים מאוד על ידי ביטול הצורך של חומר תפור, הגדלת תפוקה מפחיתה משמעותית את הקלט דרישות. עיבוד משוכלל של תאים בשיטות אלה עם זאת, אינו מאפשר טכניקות אלה כדי להחיל על דגימות רקמה, כיוון שאנחנו התחילו לרדוף HyCCAPP, וכי מפיק תוצאות מבטיחות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ישנם שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקים P50HG004952 ו- R01GM109099 כדי מו

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PrimerQuest tool IDT
OligoAnalyzer 3.1 IDT Analyze capture oligonucleotids
PairFold UBC Analyze interactions
RPMI 1640 media Thermo Fisher 11875093
Penicillin-streptomycin Thermo Fisher 15140122
L-Glutamine  Thermo Fisher 25030081
Fetal bovine serum Thermo Fisher 26140079
Countess automated cell counter Thermo Fisher
850 cm2 roller bottle  Greiner Bio-one 680058
Roller system Wheaton 22-288-525
37 % formaldehyde  Sigma-Aldrich F8775
Glycine Sigma-Aldrich
Igepal CA-630 Sigma-Aldrich I3021
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P4380
HEPES Thermo Fisher 15630080
Branson digital sonifier SFX 150 Emerson
Qubit 3.0 fluorometer Thermo Fisher
Qubit dsDNA BR assay kit Thermo Fisher Q32850
Bioanalyzer 2100 Agilent
Agilent DNA 1000 kit Agilent 5067-1504
MES sodium salt Sigma-Aldrich M3885
NaCl 5M Thermo Fisher AM9760G
EDTA Sigma-Aldrich
DynaMag-2 magnet Thermo Fisher 12321D
DynaMag-15 magnet Thermo Fisher 12301D
Dynabeads M-280 atreptavidin Thermo Fisher 60210
Low binding tubes Eppendorf 22431081
Hybridization oven SciGene
Tube shaker and rotator Thermo Fisher 415110Q
DNase I (RNase-free) New England BioLabs M0303
SSC buffer 20× concentrate Sigma-Aldrich S6639

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489, (7414), 57-74 (2013).
  2. Galas, D. J., Schmitz, A. DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Res. 5, (9), 3157-3170 (1978).
  3. Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. Nat. Protoc. 7, (2), 256-267 (2012).
  4. Dai, Y., Kennedy-Darling, J., Shortreed, M. R., Scalf, M., Gasch, A. P., Smith, L. M. Multiplexed Sequence-Specific Capture of Chromatin and Mass Spectrometric Discovery of Associated Proteins. Anal. Chem. 89, (15), 7841-7846 (2017).
  5. Guillen-Ahlers, H., et al. HyCCAPP as a tool to characterize promoter DNA-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Genomics. 107, (6), (2016).
  6. Kennedy-Darling, J., et al. Discovery of Chromatin-Associated Proteins via Sequence-Specific Capture and Mass Spectrometric Protein Identification in Saccharomyces cerevisiae. J Proteome Res. 13, (8), 3810-3825 (2014).
  7. Guillen-Ahlers, H., Shortreed, M. R. R., Smith, L. M. M., Olivier, M. Advanced methods for the analysis of chromatin-associated proteins. Physiol Genomics. 46, (13), 441-447 (2014).
  8. Lambert, J. -P., Fillingham, J., Siahbazi, M., Greenblatt, J., Baetz, K., Figeys, D. Defining the budding yeast chromatin-associated interactome. Mol Syst Biol. 6, 448 (2010).
  9. Soldi, M., Bonaldi, T. The Proteomic Investigation of Chromatin Functional Domains Reveals Novel Synergisms among Distinct Heterochromatin Components. Mol Cell Proteomics. 12, (3), 764-780 (2013).
  10. Wang, C. I., et al. Chromatin proteins captured by ChIP-mass spectrometry are linked to dosage compensation in Drosophila. Nat Struct Mol Biol. 20, (2), 202-209 (2013).
  11. Byrum, S. D., Raman, A., Taverna, S. D., Tackett, A. J. ChAP-MS: A Method for Identification of Proteins and Histone Posttranslational Modifications at a Single Genomic Locus. Cell Rep. 2, (1), 198-205 (2012).
  12. Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated immunoprecipitation ( eChIP ) using CRISPR. Biochem. Bioph. Res. Co. 439, (1), 132-136 (2013).
  13. Liu, X., et al. In Situ Capture of Chromatin Interactions by Biotinylated dCas9. Cell. 170, (5), 1028-1043 (2017).
  14. Myers, S. A., Wright, J., Zhang, F., Carr, S. A. CRISPR/Cas9-APEX-mediated proximity labeling enables discovery of proteins associated with a predefined genomic locus in living cells. bioRxiv. (2017).
  15. Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci. Cell. 136, (1), 175-186 (2009).
  16. Buxton, K. E., et al. Elucidating Protein-DNA Interactions in Human Alphoid Chromatin via Hybridization Capture and Mass Spectrometry. J. Proteome Res. 16, (9), 3433-3442 (2017).
  17. Kennedy-Darling, J., Holden, M. T., Shortreed, M. R., Smith, L. M. Multiplexed programmable release of captured DNA. Chembiochem. 15, (16), 2353-2356 (2014).
  18. Fujita, T., Fujii, H. Isolation of specific genomic regions and identification of associated molecules by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR. Chromatin Protoc. Third Ed. 43-52 (2015).
  19. Lambert, J. -P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A Novel Proteomics Approach for the Discovery of Chromatin-associated Protein Networks. Mol Cell Proteomics. 8, (4), 870-882 (2009).
עיבוד של הכלאה צלמו של חלבונים הקשורים כרומטין פרוטאומיקס בתרבית של תאים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guillen-Ahlers, H., Rao, P. K., Perumalla, D. S., Montoya, M. J., Jadhav, A. Y. L., Shortreed, M. R., Smith, L. M., Olivier, M. Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (136), e57140, doi:10.3791/57140 (2018).More

Guillen-Ahlers, H., Rao, P. K., Perumalla, D. S., Montoya, M. J., Jadhav, A. Y. L., Shortreed, M. R., Smith, L. M., Olivier, M. Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (136), e57140, doi:10.3791/57140 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter