Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Genetics

स्तनधारी कोशिकाओं को प्रोटियोमिक् के लिए क्रोमेटिन-जुड़े प्रोटीन का संकरण कैप्चर का अनुकूलन

doi: 10.3791/57140 Published: June 1, 2018

Summary

यह एक विधि उपंयास डीएनए की पहचान करने के लिए विशिष्ट लक्ष्य loci पर प्रोटीन बातचीत, बाद proteomic विश्लेषण के लिए crosslinked क्रोमेटिन के अनुक्रम विशेष कब्जा पर निर्भर है । संभावित बाध्यकारी प्रोटीन के बारे में कोई पूर्व ज्ञान, और न ही सेल संशोधनों की आवश्यकता है । शुरू में खमीर के लिए विकसित की है, प्रौद्योगिकी अब स्तनधारी कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया गया है ।

Abstract

प्रोटियोमिक् (HyCCAPP) प्रौद्योगिकी के लिए क्रोमेटिन-जुड़े प्रोटीन का संकरण कैप्चर शुरू में खमीर में उपंयास डीएनए प्रोटीन बातचीत को उजागर करने के लिए विकसित किया गया था । यह ब्याज की संभावना के बारे में पूर्व ज्ञान की आवश्यकता के बिना एक लक्ष्य क्षेत्र के विश्लेषण की अनुमति देता है लक्ष्य क्षेत्र के लिए बाध्य प्रोटीन के बारे में । यह, सिद्धांत रूप में, HyCCAPP के हित के किसी भी जीनोमिक क्षेत्र का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा करने की अनुमति देता है, और यह अलग सेल सिस्टम में काम करने के लिए पर्याप्त लचीलापन प्रदान करता है । इस विधि के लिए जाना जाता प्रतिलेखन कारकों, एक बेहतर क्रोमेटिन Immunoprecipitation (चिप) और चिप की तरह तरीकों के लिए अनुकूल कार्य के बंधन साइटों का अध्ययन करने का मतलब नहीं है । HyCCAPP की ताकत के लिए डीएनए क्षेत्रों के लिए जो वहां सीमित है या इसे करने के लिए बाध्य प्रोटीन के बारे में कोई जानकारी का पता लगाने की क्षमता में निहित है । यह भी पूर्वाग्रह से बचने के लिए एक सुविधाजनक तरीका हो सकता है (चिप की तरह वर्तमान तरीकों में मौजूद) एंटीबॉडी का उपयोग कर प्रोटीन आधारित क्रोमेटिन संवर्धन द्वारा शुरू की । संभावित, HyCCAPP वास्तव में उपंयास डीएनए-प्रोटीन बातचीत को उजागर करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हो सकता है । तारीख करने के लिए, प्रौद्योगिकी मुख्य रूप से खमीर कोशिकाओं को लागू किया गया है या उच्च प्रतिलिपि दोहराने के स्तनधारी कोशिकाओं में अनुक्रम । आदेश में हम कल्पना शक्तिशाली उपकरण बनने के लिए, HyCCAPP दृष्टिकोण को कुशलतापूर्वक स्तनधारी कोशिकाओं में एकल प्रतिलिपि loci पर कब्जा करने के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता है । यहां, हम मानव कोशिका लाइनों के लिए प्रारंभिक खमीर HyCCAPP कैप्चर प्रोटोकॉल के हमारे अनुकूलन मौजूद है, और पता चलता है कि एक प्रतिलिपि क्रोमेटिन क्षेत्रों कुशलता से इस संशोधित प्रोटोकॉल के साथ अलग किया जा सकता है ।

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

पिछले एक दशक के दौरान, वहां अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों में एक नाटकीय सुधार देखा है, नमूनों की बड़ी संख्या में जीनोम की एक विस्तृत श्रृंखला के अध्ययन की अनुमति है, और आश्चर्यजनक संकल्प के साथ । डीएनए तत्वों (सांकेतिक शब्दों में बदलना) कंसोर्टियम, एक बड़े पैमाने पर बहु-संस्थागत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के राष्ट्रीय मानव जीनोम रिसर्च इंस्टीट्यूट द्वारा नेतृत्व के प्रयास के विश्वकोश, कैसे व्यक्तिगत प्रतिलेखन कारकों में अंतर्दृष्टि प्रदान की गई है और अंय नियामक प्रोटीन के लिए बांध और जीनोम के साथ बातचीत । प्रारंभिक प्रयास विशिष्ट डीएनए प्रोटीन बातचीत विशेषता, के रूप में १०० से अधिक ज्ञात डीएनए के लिए क्रोमेटिन immunoprecipitation (चिप) द्वारा मूल्यांकन-बंधन प्रोटीन1। ऐसे DNase के पदचिह्न के रूप में वैकल्पिक तरीकों2 और विनियामक तत्वों के formaldehyde असिस्टेड अलगाव (साफ)3 भी प्रोटीन के साथ बातचीत जीनोम के विशिष्ट क्षेत्रों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है, लेकिन स्पष्ट सीमा के साथ कि इन प्रायोगिक दृष्टिकोण से बातचीत प्रोटीन की पहचान नहीं है । पिछले वर्षों में व्यापक प्रयासों के बावजूद, कोई प्रौद्योगिकी उभरा है कि कुशलतापूर्वक क्रोमेटिन में प्रोटीन-डीएनए बातचीत के व्यापक लक्षण वर्णन की अनुमति देता है, और पहचान और क्रोमेटिन के ठहराव-जुड़े प्रोटीन ।

इस जरूरत को हल करने के लिए, हम एक उपंयास दृष्टिकोण है जो हम प्रोटियोमिक् (HyCCAPP) के लिए क्रोमेटिन-जुड़े प्रोटीन के संकरण कब्जा के रूप में कहा विकसित की है । शुरू में खमीर4,5,6में विकसित की है, दृष्टिकोण crosslinked क्रोमेटिन ब्याज की (बाध्य प्रोटीन के साथ) क्षेत्रों अनुक्रम विशिष्ट संकरण कब्जा का उपयोग अलग । प्रोटीन-डीएनए परिसरों के अलगाव के बाद, ऐसे जन स्पेक्ट्रोमेट्री के रूप में दृष्टिकोण के लिए ब्याज के अनुक्रम के लिए बाध्य प्रोटीन के सेट की विशेषता इस्तेमाल किया जा सकता है । इस प्रकार, HyCCAPP एक गैर पक्षपातपूर्ण दृष्टिकोण के रूप में विचार किया जा सकता है उपंयास डीएनए को उजागर-प्रोटीन बातचीत, अर्थ है कि यह एंटीबॉडी पर भरोसा नहीं करता है और यह प्रोटीन है कि पाया जा सकता है के बारे में पूरी तरह से नास्तिक है । वहां अंय उपंयास डीएनए-बातचीत प्रोटीन7उजागर करने में सक्षम दृष्टिकोण हैं, लेकिन सबसे चिप की तरह तरीकों पर भरोसा करते है8,9,10, प्लाज्मिड निवेशन11,12, 13,14, या उच्च प्रतिलिपि संख्या15के साथ क्षेत्रों । इसके विपरीत, HyCCAPP बहु और एकल प्रतिलिपि क्षेत्रों के लिए लागू किया जा सकता है, और यह क्षेत्र में प्रोटीन के बारे में कोई पूर्व जानकारी की आवश्यकता नहीं है । इसके अलावा, जबकि उपर्युक्त विधियों में से कुछ मूल्यवान विशेषताएं हैं, विशेष रूप से डीएनए के लिए की आवश्यकता से परहेज-प्रोटीन crosslinking प्रतिक्रियाओं, HyCCAPP की अनूठी विशेषता यह है कि यह एकल के लिए लागू किया जा सकता है, unभएकै कोशिकाओं में प्रतिलिपि क्षेत्रों, और बिना किसी भी ख्यात बंधन प्रोटीन, या उपलब्ध एंटीबॉडी के बारे में पहले ज्ञान ।

इस बिंदु पर, HyCCAPP मुख्य रूप से खमीर में विभिंन जीनोमिक क्षेत्रों के विश्लेषण के लिए लागू किया गया है4,5,6, और हाल ही में प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था अल्फा में डीएनए बातचीत-सैटेलाइट डीएनए, एक दोहराने क्षेत्र मानव जीनोम16में । हमारे चल रहे काम के भाग के रूप में, हम संकरण कब्जा दृष्टिकोण शुरू में खमीर क्रोमेटिन के लिए विकसित करने के लिए मानव कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए लागू अनुकूलित है, और यहां वर्तमान एक संशोधित प्रोटोकॉल है कि एकल प्रतिलिपि लक्ष्य के चयनात्मक कब्जा अनुमति देता है खमीर में हमारे प्रारंभिक अध्ययन करने के लिए इसी तरह की क्षमता के साथ मानव जीनोम में क्षेत्रों । इस नए अनुकूलित प्रोटोकॉल अब अनुकूलन और प्रौद्योगिकी के उपयोग के लिए मानव जीनोम भर में प्रोटीन डीएनए बातचीत, मास स्पेक्ट्रोमेट्री या अंय विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण का उपयोग कर की अनुमति देता है ।

यह जोर देना महत्वपूर्ण है कि HyCCAPP विधि विशिष्ट लक्षित क्षेत्रों के विश्लेषण के लिए है और अभी तक जीनोम-वाइड विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं है । प्रौद्योगिकी विशेष रूप से उपयोगी है जब क्षेत्रों के लिए जो वहां प्रोटीन बातचीत के बारे में दुर्लभ जानकारी है, या जब एक विशिष्ट जीनोम लोकस में एक अधिक व्यापक प्रोटीन बातचीत के विश्लेषण में वांछित है से निपटने । HyCCAPP डीएनए बंधन प्रोटीन को उजागर करने के लिए मतलब है, लेकिन सही जीनोमिक डीएनए में विशिष्ट प्रोटीन बाध्यकारी साइटों की विशेषताएं नहीं । इसके वर्तमान कार्यान्वयन में पद्धति व्यक्तिगत प्रोटीन के लिए डीएनए बाइंडिंग दृश्यों या रूपांकनों के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करती है । इसलिए, यह अच्छी तरह से ऐसे मेलों के रूप में मौजूदा प्रौद्योगिकियों के पूरक हैं, और जीनोमिक एक प्रारंभिक निष्पक्ष विश्लेषण द्वारा पहचान क्षेत्रों में उपंयास बंधन प्रोटीन की पहचान की अनुमति दे सकता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. कब्जा Oligonucleotide डिजाइन

  1. oligonucleotides का एक पैनल डिजाइन लक्ष्य क्षेत्र के संकरण कब्जा के दौरान इस्तेमाल किया जा करने के लिए/
    1. लक्ष्य क्षेत्र के प्रति 4 – 8 oligonucleotides डिज़ाइन करने के लिए लक्ष्य करें, लेकिन न्यूनतम के रूप में, लक्ष्य क्षेत्र के प्रत्येक छोर को लक्षित करने वाले कम से oligonucleotide एक डिज़ाइन करें.
    2. यदि लक्ष्य अनुक्रम लंबा है (> 500 आधार जोड़े), oligonucleotides डिजाइन के रूप में संभव के रूप में बाहर प्रसार के लिए पूरे लक्ष्य क्षेत्र भर में क्रोमेटिन के प्रभावी संवर्धन आश्वासन ।
      नोट: हम 4-8 oligonucleotides के साथ इष्टतम कब्जा मनाया है । हालांकि इस प्रक्रिया को और अधिक oligonucleotides के साथ अच्छी तरह से काम कर सकते हैं, यह बहुत अधिक oligonucleotides उपयोग किया जाता है जब संवर्धन पैदावार में कमी का पालन करने के लिए असामान्य नहीं है.
  2. समान पिघलने तापमान के साथ डिजाइन oligonucleotides, और सुनिश्चित करें कि वे मजबूत hairpins फार्म नहीं है और न ही मजबूत बातचीत (खाते में ले कि hybridizations ४२ ᵒ c पर किया जाएगा) ।
    नोट: यदि कोई toehold रेफरेंस (4.12.3) चुना जाता है, तो oligonucleotide में अतिरिक्त बाह्य 8 आधार अनुक्रम को जोड़ा जाना चाहिए और इस रेफरेंस17के समय पूरक ' रिलीज ' oligonucleotides की आवश्यकता होगी । कई वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर उपकरण का चयन करें और oligonucleotides विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । 25 mers अच्छे परिणाम दिखाई है, लेकिन जीनोम के आकार और अनुक्रम पर निर्भर करता है, कब्जा oligonucleotides कहीं के बीच 20-80 कुर्सियां शामिल कर सकते हैं । आमतौर पर, कब्जा oligonucleotides ६२ ᵒ सी के लिए करीब एक पिघलने तापमान है, लेकिन है कि उनकी लंबाई के आधार पर बदल सकते हैं । कब्जा मिश्रण भर में लगातार पिघलने तापमान और/या oligonucleotide लंबाई संवर्धन में अवांछित पूर्वाग्रहों से बचने में मदद कर सकते हैं ।
  3. एक बायोटिन moiety के साथ कब्जा oligonucleotides डिजाइन (अधिमानतः कब्जा अनुक्रम से एक स्पेसर द्वारा अलग) पर 3 ' अंत ।

2. सेल संस्कृति

  1. विकसित मानव lymphoblastoid कोशिकाओं (जैसे यहां दिखाया GM12878) या RPMI १६४० मीडिया में अंय सेल लाइनों के साथ पूरक 1% पेनिसिलिन-streptomycin, 2 मिमी एल-glutamine और 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), पर ३७ ᵒ c और 5% सह2
    1. बीज प्रारंभिक जमे हुए aliquots (2-5 एक्स 105 कोशिकाओं) में एक टी-25 कुप्पी के साथ 6 मिलीलीटर RPMI १६४० मीडिया २.१ में तैयार की ।
    2. मॉनिटर सेल घनत्व और व्यवहार्यता ।
      1. कोशिकाओं का एक प्रतिनिधि aliquot ले लो और उंहें trypan नीले रंग के रूप में एक उपयुक्त डाई के साथ दाग ।
      2. एक hemocytometer या एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर कोशिका घनत्व को मापने ।
    3. इससे पहले कि सेल 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल के घनत्व तक पहुंच जाता है, 5 मिनट के लिए १०० x g पर कोशिकाओं को नीचे स्पिन और RPMI १६४० मीडिया २.१ में तैयार की 25 मिलीलीटर के साथ एक टी ७५ कुप्पी के लिए कोशिकाओं को हस्तांतरण । कोशिकाओं को बढ़ने तक सेल घनत्व दृष्टिकोण 1 x 106 कोशिकाओं/
    4. RPMI १६४० मीडिया (२.१) के ३८ मिलीलीटर में एक टी-१५० कुप्पी के लिए कोशिकाओं को स्थानांतरित और एक अतिरिक्त दो दिनों के लिए कोशिकाओं को विकसित.
      नोट: Lymphoblastoid कोशिकाओं निलंबन में वृद्धि । lymphoblastoid कोशिकाओं को उगाने के लिए सामान्य दिशानिर्देश 0.2 – 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल के बीच रखे जाने वाले सेल घनत्व की सिफारिश करते हैं । क्योंकि इस तकनीक में आवश्यक सामग्री की बड़ी राशि के, वर्तमान प्रोटोकॉल जानबूझकर क्या आमतौर पर इस्तेमाल किया जाता है परे एक कोशिका घनत्व के लिए कोशिकाओं को विकसित करने के लिए लिखा है । सेल वृद्धि प्रोटोकॉल संशोधित किया जा सकता है और पाठक द्वारा उपयोग किया जा करने के लिए सेल प्रकार के आधार पर अनुकूलित ।
    5. 5 मिनट के लिए १०० x जी में कोशिकाओं को नीचे स्पिन, RPMI १६४० मीडिया (२.१) के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से सस्पेंड और एक ८५० सेमी2 रोलर मीडिया के ५०० मिलीलीटर युक्त बोतल में निलंबन डालना । पहले के रूप में एक ही शर्तों के तहत कोशिकाओं को मशीन लेकिन इस बिंदु पर लगातार रोटेशन (~ ०.५ rpm) का उपयोग शुरू करते हैं ।
    6. सेल विकास पर नजर रखने और जब जरूरत मीडिया बदलने के लिए (आमतौर पर हर 3-4 दिन) । चलो कोशिकाओं के रूप में एक घनत्व को विकसित करने के लिए संभव के रूप में 2 x 106 कोशिकाओं/एमएल (1 x 109 कोशिकाओं में कुल) ।
    7. एक बार वांछित सेल गिनती तक पहुंच गया है, कोशिकाओं कताई 5 मिनट के लिए १०० x जी पर नीचे और RPMI १६४० मीडिया (२.१) के ३६ मिलीलीटर में कोशिकाओं reसस्पेंड द्वारा कोशिकाओं । सेल सस्पेंशन को ५० एमएल शंकु ट्यूब पर ट्रांसफर करें । सेल गिनती और डीएनए निष्कर्षण के लिए छोटे aliquots ले लो ।
  2. 1% की एक अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए ३७% formaldehyde की 1 मिलीलीटर जोड़कर Crosslink ।
    चेतावनी: Formaldehyde एक यलो है और एक धुएं डाकू में नियंत्रित किया जाना चाहिए ।
    1. कमरे के तापमान (आरटी) में 10 मिनट के लिए रोटेशन (~ 30-60 आरपीएम) के साथ कोशिकाओं को मशीन ।
    2. १२५ मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए, एक २.५ मीटर glycine समाधान के 2 मिलीलीटर जोड़कर crosslink प्रतिक्रिया बुझाने ।
    3. रोटेशन (~ 30-60 rpm) के लिए 5 मिनट के लिए आरटी. गोली के साथ कोशिकाओं की मशीन 5 मिनट के लिए १०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं और धो दो बार बर्फ ठंड 1x पंजाबियों के साथ कोशिकाओं ।
  3. अगले कदम के लिए जारी रखें या सेल Lysis बफर के 5 मिलीलीटर में गोली reसस्पेंड (5 मिमी Hepes, ८५ mm KCl, ०.५% Igepal, टीज़ अवरोधकों (PI)) और स्नैप-फ्रीज में ड्रॉप द्वारा निलंबन ड्रॉप तरल नाइट्रोजन । नमूनों की दुकान पर-८० ᵒ सी.
    नोट: तैयार > Igepal और PI के बिना सेल Lysis बफर के 25 मिलीलीटर और जब उपयोग करने के लिए तैयार वे नए सिरे से एजेंट जोड़ें । Igepal और PI जोड़ा गया है एक बार सेल Lysis बफर के दीर्घकालिक भंडारण से बचें । 3 महीने तक के लिए 4 ᵒ c पर स्टोर सेल Lysis बफर । Igepal एक गैर-ईओण, नॉन-denaturing डिटर्जेंट है । np-४० संभवतः Igepal के लिए एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन हम यह NP के रूप में इस संदर्भ में इस्तेमाल नहीं किया है-४० अनुशंसित नहीं है जब नमूनों अंततः मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण कर रहे है डीएनए बंधन प्रोटीन विशेषताएं ।

3. Lysis और बाल काटना

  1. तैयार > नाभिक Lysis बफर के 15 मिलीलीटर (10 मिमी EDTA, ५० मिमी Tris पीएच ८.०, 1% एसडीएस, PI) ।
    नोट: PI ताजा जोड़ें, बस मात्रा का उपयोग किया जा करने के लिए । PI जोड़ा गया है एक बार नाभिक Lysis बफ़र की लंबी अवधि के भंडारण से बचें । नाभिक Lysis बफर आरटी पर 1 महीने के लिए संग्रहीत किया जा सकता है ।
  2. सेल Lysis बफर के 20 मिलीलीटर में गोली reसस्पेंड (Igepal और PI युक्त) । बर्फ पर छर्रों को गल जाने दें और एक बार गल कर अच्छी तरह मिला लें । चलो नमूने बर्फ पर एक अतिरिक्त 10 मिनट के लिए बैठते हैं । 5 मिनट के लिए 4 ᵒ सी में ४०० x g पर कोशिकाओं केंद्रापसारक ।
  3. supernatant को छोड़ें और नाभिक Lysis बफ़र के 6 मिलीलीटर में PI के साथ कक्षों को पुनर्स्थगित करें (यदि कक्ष एक निलंबन नहीं बनाते हैं, तो वॉल्यूम बढ़ सकता है) ।
  4. sonication के लिए तैयार करने में, नमूना समान रूप में विभाजित ~ 6 – 8 microfuge ट्यूबों (६०० करने के लिए १,००० µ l प्रत्येक ट्यूब के लिए) ।
    1. नमूनों को बर्फ या कोल्ड रैक पर रखें और microtip के साथ sonicator का उपयोग करते हुए नमूना sonicate । 5 x 20 एस लगातार फटने के साथ ६५% आयाम का प्रयोग करें, निलंबन के लिए नीचे से कम के लिए ठंडा करने के लिए अनुमति देता है दालों के बीच ४० एस ।
      नोट: यदि वॉल्यूम बढ़ाएं > 10 नमूना प्रति मिलीलीटर, एक ग्लास कूलिंग सेल के बजाय इस्तेमाल किया जा सकता है । अधिक और अब फटने की आवश्यकता होगी तो । Sonicators काफी अलग हैं । शर्तों को पाठक द्वारा अनुकूलित करना पड़ सकता है । अन्य sonication विकल्प के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता ।
  5. 4 ᵒ सी में 10 मिनट के लिए १२,००० x g पर कोशिकाओं केंद्रापसारक, एक नई ट्यूब के लिए supernatant हस्तांतरण, और छर्रों त्यागें ।
  6. एक fluorometric विधि का उपयोग कर कुल वसूली का अनुमान ।
  7. अगले चरण के लिए जारी रखें या स्नैप-फ़्रीज़ करें और नमूना पर संग्रह-८० ᵒ c ।
  8. वैकल्पिक: एक aliquot ले लो, यह ६७ ᵒ सी में ०.३ मीटर NaCl में रात भर की मशीन द्वारा रिवर्स crosslinks । स्वच्छ डीएनए और यह में भाग लंबाई निर्धारित करने के लिए अंशों का थोक भाव ५०० और १,००० बीपी के बीच होना चाहिए ।
    नोट: यह इस बिंदु पर रोक और नमूनों की दुकान पर-८० ᵒ सी ठीक है ।

4. संकरण कैप्चर

  1. 2x संकरण (Hyb) बफर (२०० मिमी एमईएस, 2 एम NaCl, ४० मिमी EDTA, ०.०२% के बीच-20) और धो बफर के ५०० एमएल (२०० मिमी NaCl, ०.२% एसडीएस, ५० मिमी Tris पीएच 8) के ५०० मिलीलीटर तैयार करें । 3 महीने तक क्रमशः 4 ᵒ c और कमरे के तापमान पर Hyb और धो बफ़र्स संग्रहीत करें । एक 1x संकरण बफर तैयार करने के लिए 2x Hyb बफर के आधे का उपयोग करें । इसके अलावा इसे 4 ᵒ सी पर 3 महीने तक स्टोर करें ।
    नोट: संकरण कैप्चर की कुल मात्रा पिछले चरण में आने वाले नमूने की मात्रा दो बार किया जाएगा (जैसा कि अब तक वर्णित है, नमूना मात्रा 6 मिलीलीटर के आसपास होगा और इस प्रकार कुल संकरण मात्रा 12 मिलीलीटर होगा) ।
  2. इस मामले में (६०० µ एल) कुल संकरण कब्जा मात्रा के 5% के बराबर अलग मोती सेट करें । एक उपयुक्त और उपयुक्त चुंबक के लिए निंनलिखित चरणों में मोतियों के साथ काम करने की जरूरत है ।
  3. दो बार मोतियों की मात्रा (१२०० µ एल) का उपयोग 1x Hyb बफर के साथ तीन बार मोती धो लो । 2x Hyb बफर के १,२०० µ एल में मोतियों को reसस्पेंड । चुंबक पर ट्यूबों रखें जब तक समाधान साफ करता है और बफर हटा दें ।
  4. १.५ मिलीलीटर microfuge ट्यूबों में प्री-क्लियरिंग प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन अधिकतम ७०० µ एल के साथ प्रति ट्यूब नमूना । पर्याप्त मोती जोड़ें (5%) और 2x Hyb बफर Hyb बफर को पतला करने के लिए 1x (10 ट्यूबों ६०० µ l के साथ नमूना, धोया मोतियों का १२० µ एल के साथ 2x Hyb बफर में reसस्पैंड, और ४८० µ एल 2x Hyb बफर के) । अंत रोटेशन (~ 30-60 rpm) पर अंत के साथ 31 ᵒ सी में 10 मिनट के लिए उंहें मशीन ।
  5. एक चुंबक पर ट्यूबों प्लेस जब तक मोती मैटीरियल और नए ट्यूबों के लिए नमूने हस्तांतरण कर रहे हैं । मोतियों को त्यागें ।
    नोट: इस बिंदु से आगे, कम बाइंडिंग ट्यूबों की सिफारिश कर रहे हैं ।
  6. कब्जा oligonucleotides 10 pmol/µ एल के एक काम समाधान करने के लिए reसस्पेंड और प्रत्येक ट्यूब के लिए इस समाधान के 4 µ एल जोड़ें ।
    नोट: विभिन्न क्षेत्रों एक दूसरे के लिए नियंत्रण के रूप में कार्य कर सकते हैं, लेकिन यह एक सच्चे नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए तले हुए अपने अनुक्रम के साथ एक कब्जा oligonucleotide शामिल करने के लिए सिफारिश की है.
  7. अंत रोटेशन पर अंत के साथ ४२ ᵒ सी में ४० मिनट के लिए ट्यूब मशीन (~ 30-60 rpm) ।
  8. मशीन के दौरान, अलग सेट मोतियों की जरूरत (०.३ µ l/pmol of कैप्चर oligonucleotide) । मोतियों को धोकर तीन बार ४.३ चरण में वर्णित के रूप में, लेकिन 1 एक्स Hyb बफर में कोशिकाओं reसस्पेंड ।
  9. नमूना के लिए धोया मोती जोड़ें और अंत रोटेशन (~ 30-60 rpm) पर अंत के साथ आरटी पर 30 मिनट के लिए नमूनों की मशीन । चुंबक पर ट्यूब प्लेस और supernatant एक बार मोतियों को हटा दिया गया है ।
  10. मोतियों की धुलाई
    1. धोने बफर के १.२ मिलीलीटर जोड़ें और अंत रोटेशन पर अंत के साथ 5 मिनट के लिए नमूना मशीन (~ 30-60 आरपीएम पर) आरटी पर जगह ट्यूबों और समाधान स्पष्ट करता है जब तक मिनट की एक जोड़ी रुको । बफ़र निकालें और इस चरण को दोहराएं ।
    2. धोने बफर के १.२ मिलीलीटर जोड़ें और इसे 1 घंटे के अंत के साथ आरटी पर (~ 30-60 rpm) रोटेशन के साथ मशीन । चुंबक पर ट्यूबों प्लेस और समाधान स्पष्ट करता है जब तक मिनट की एक जोड़ी रुको । बफर निकालें और इस कदम को दोहराने की मशीन समय को कम करने के लिए 30 मिनट दूसरी बार ।
    3. धो बफर के २०० µ एल जोड़ें और अंत रोटेशन के साथ 15 मिनट के लिए यह गर्मी (~ 30-60 rpm) 31 ᵒ c पर । चुंबक पर ट्यूबों प्लेस और मिनट के कुछ इंतजार जब तक समाधान साफ करता है । बफ़र निकालें ।
    4. पंजाब के २०० µ एल जोड़ें और यह अंत रोटेशन पर अंत के साथ 5 मिनट के लिए (~ 30-60 rpm) पर आरटी । चुंबक पर ट्यूबों प्लेस और समाधान स्पष्ट करता है जब तक मिन के एक जोड़े रुको । बफ़र निकालें और इस चरण को दोहराएं ।
  11. सिंपल रेफरेंस
    1. ४० आणविक ग्रेड पानी की µ एल जोड़ें मोतियों को और यह ९४ ᵒ c पर 5 मिनट के लिए मशीन ।
    2. चुंबक पर ट्यूबों प्लेस और समाधान साफ करता है जब तक मिनट की एक जोड़ी रुको ।
    3. एक नई ट्यूब में supernatant स्थानांतरण । मोतियों को त्यागें ।
    4. proteomic विश्लेषण करने के लिए आगे बढ़ें या-८० ᵒ c पर नमूना संग्रहीत करें ।
      नोट: रेफरेंस के इस प्रकार के बाद qPCR विश्लेषण और कुछ प्रोटियोमिक् माप के लिए अच्छी तरह से काम करता है, लेकिन अन्य उदाहरणों में दो वैकल्पिक दृष्टिकोण उपज "क्लीनर" eluates नीचे वर्णित.
  12. DNase का रेफरेंस है ।
    1. 1x DNase बफर के ४० µ एल और प्रत्येक ट्यूब के लिए DNase के 2 यू जोड़ें ।
    2. ३७ ᵒ सी में 15 मिनट के लिए ट्यूब मशीन
    3. एक चुंबक पर ट्यूबों प्लेस और समाधान स्पष्ट करता है जब तक मिन के एक जोड़े रुको ।
    4. मोतियों से eluted नमूने निकालें और एक नया कम बाध्यकारी ट्यूब में नमूने जगह है ।
    5. ९४ ᵒ सी में 7 मिनट के लिए एंजाइम निष्क्रिय और proteomic विश्लेषण के लिए आगे बढ़ना ट्यूब मशीन ।
      नोट: proteomic विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप मनाया जाता है, तो कम DNase सांद्रता इस्तेमाल किया जा सकता है । यह qPCR द्वारा कब्जा संवर्धनों की गणना करने के लिए संभव नहीं होगा अगर इस रेफरेंस विधि के बाद से इस्तेमाल किया जाता है DNase उपचार पूरी तरह से नमूना में डीएनए सामग्री नष्ट कर देता है ।
    6. proteomic विश्लेषण करने के लिए आगे बढ़ें या-८० ᵒ c पर नमूना संग्रहीत करें ।
  13. Toehold रेफरेंस17.
    नोट: यह विधि अब oligonucleotides (> 40 कुर्सियां) के लिए अनुशंसित नहीं है । कैप्चर oligonucleotides से लक्ष्य को विस्थापित करने के लिए जीनोमिक अनुक्रम और पूरक रिलीज़ oligonucleotides के साथ अधिव्याप्त नहीं है एक अतिरिक्त 8 कुर्सियां शामिल करने के लिए इस विधि पर कब्जा oligonucleotides के लिए आवश्यक है ।
    1. पतला 2 nanomoles जारी oligonucleotides के ४० µ में एसएससी बफर की एल.
    2. आर टी पर 20 मिनट के लिए यह मशीन ।
    3. एक चुंबक पर ट्यूबों प्लेस और समाधान साफ करता है जब तक मिनट की एक जोड़ी रुको ।
    4. मोतियों से हल निकालें ।
    5. proteomic विश्लेषण करने के लिए आगे बढ़ें या-८० ᵒ c पर नमूना संग्रहीत करें ।

5. ब्याज के लक्ष्य पर कब्जा क्षेत्र के लिए प्राइमरों के साथ qPCR द्वारा कब्जा उपज का मूल्यांकन

  1. लक्ष्य क्षेत्र के लिए प्राइमर और जांच डिजाइन करने के लिए एक उपयुक्त सॉफ्टवेयर या ऑनलाइन उपकरण का उपयोग करें ।
    नोट: इस प्रयोग में DUSP3 और DUSP5 के प्रवर्तक क्षेत्र को निशाना बनाया गया । प्राइमरों और जांच का इस्तेमाल किया निंनलिखित हैं । DUSP3: प्राइमरी 1-GTG TTT AGG टीटीसी CCT गात सीसी, प्राइमरी 2-CGG AAT गोरखा TGC CTT सीजी, FAM-त्यसपछि जांच-टीसीसी ATG सीसीसी गाा TTG TGA CGT CGG; DUSP5: प्राइमरी 1-TGA गाा AGC CCT गात GTG टीसी, प्राइमरी 2-जीसीसी टीटीसी आगा AAC सीसीसी एएए एजी, FAM-लेबल जांच TGC ATT टैग AGC AGC सीएजी ATG AGG टीटी ।
  2. eluate के एक aliquot ले लो (कोई 10 से अधिक µ एल), और पतला 1:10 आणविक ग्रेड एच2ओ के साथ ।
  3. कदम 2.1.7 में ली गई aliquots में से एक का डीएनए निकालें और आणविक ग्रेड एच2ओ में पांच धारावाहिक 1:10 कमजोर पड़ने से एक मानक वक्र बनाने के लिए उस डीएनए नमूने का उपयोग करें ।
  4. एक qPCR मास्टर मिश्रण (वाणिज्यिक विकल्प की व्यापक विविधता) तैयार, प्राइमरों और जांच जोड़ने और उचित राशि (15 µ l अगर एक अच्छी तरह से एक 20 µ एल प्रतिक्रिया चल) बांटना ।
  5. जोड़ें 5 µ या तो: एक) पतला नमूना, ख) मानक वक्र या सी) आणविक ग्रेड एच2O (कोई नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए) एक अच्छी तरह से ।
  6. प्लेट सील और 1 मिनट के लिए १०० x g पर यह केंद्रापसारक ।
  7. निम्नलिखित मापदंडों के साथ एक qPCR प्रणाली में चलाने के लिए: 5 मिनट में ९५ ᵒ सी के बाद ९५ ᵒ सी के ४० चक्र के लिए 20 एस, ५९ ᵒ सी के लिए 20 एस और ७२ ᵒ सी के लिए 25 एस.
  8. पैदावार का आकलन करने के लिए मानक वक्र का उपयोग करें और कैप्चर विशिष्टता का आकलन करने के लिए कब्जा तले ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

HyCCAPP के लिए क्रोमेटिन के बड़े इनपुट मात्रा के लिए की आवश्यकता के कारण सफल होने के लिए, कोशिकाओं को प्रभावित करने के अपेक्षाकृत उच्च स्तर के लिए बड़े हो रहे हैं । Trypan नीला धुंधलान का उपयोग यह पुष्टि करने के लिए किया जाता है कि सेल की मृत्यु दर मध्यम है (< 10%) । एकल प्रति प्रयोगों में, संकरण कैप्चर करने से पहले क्रोमेटिन सामग्री को femtomolar श्रेणी में रखने की आवश्यकता होती है, जो आमतौर पर सामग्री को प्रारंभ करने के रूप में कम-से-9 कक्षों की आवश्यकता होती है । पूर्ण पैमाने प्रयोगों से पहले, यह छोटे बैचों में कैप्चर oligonucleotide प्रदर्शन का परीक्षण करने के लिए सिफारिश की है. oligonucleotides के अनुमापन का उपयोग करके संकरण कैप्चर चित्र 1में दिखाए जाते हैं । कब्जा oligonucleotides की संख्या में धीरे-धीरे वृद्धि हुई है जबकि कुल एकाग्रता निरंतर बनी हुई है. यह प्रयोग स्पष्ट रूप से तीन महत्वपूर्ण पहलुओं को दर्शाता है । सबसे पहले, यह निर्धारित करने में मदद करता है, उस विशेष क्षेत्र के लिए, कितने oligonucleotides इष्टतम (और अधिक से अधिक) संकरण क्षमता तक पहुंचने की जरूरत है । दूसरे, यह पता चलता है अगर वहां oligonucleotides के एक विशेष सेट के बीच किसी भी स्पष्ट हानिकारक बातचीत कर रहे हैं । अंत में, यह पता चलता है अगर वहां गरीब विशिष्टता के साथ किसी भी oligonucleotides कि पृष्ठभूमि की पर्याप्त मात्रा में ले रहे है (इस मामले में qPCR जीनोम में अंय क्षेत्रों लक्ष्यीकरण प्राइमरों के साथ विश्लेषण द्वारा मापा) ।

कब्जा संकरण पैदावार मामूली क्रोमेटिन नमूना के पार से जुड़े होने के कारण दिखाई देगा । crosslinked क्रोमेटिन में अंशों का एक बड़ा अनुपात संकरण कैप्चर के लिए उत्तरदायी नहीं होगा. धारावाहिक संकरण प्रयोगों इस (चित्रा 2) का प्रदर्शन. यदि संकरण कैप्चर सफलतापूर्वक चलाया जाता है, तो कैप्चर oligonucleotides का एक अलग सेट का उपयोग करते हुए एक ही क्रोमेटिन सामग्री के बाद कैप्चर प्रयोग तुलनीय (थोड़ा कम) में परिणाम होगा जब ताजा क्रोमेटिन का उपयोग कर (~ 11% कम पर औसत) । लेकिन अगर एक ही क्षेत्र फिर से एक दूसरे पर कब्जा प्रयोग में oligonucleotides का एक ही सेट के साथ लक्षित है क्रोमेटिन पहले कब्जा प्रयोग के बाद शेष नमूने का उपयोग कर, उपज के बारे में ९०% की कमी होगी, की पुष्टि है कि अधिकांश संकरण-नवागत सामग्री ने कब्जा कर लिया है । यदि ऐसी कोई कमी कैप्चर में oligonucleotides के समान सेट के साथ क्रमिक कैप्चर के बाद स्वीकार्य नहीं है, तो यह संकरण कैप्चर चरण में कोई तकनीकी समस्या इंगित करता है ।

खमीर की तरह सरल प्रणालियों में, हम पर कब्जा करने की क्षमता 4%5आ देखा है, जो 9 प्रोटीन की पहचान के लिए नेतृत्व में विभेदक 2 क्षेत्रों में समृद्ध जब खमीर अलग परिस्थितियों में हो गया था । मानव कोशिकाओं में तथापि, एक जीनोम होने ~ २५० खमीर से बड़ा बार, संकरण पैदावार आम तौर पर 1% से नीचे है (चित्रा 3) । चित्रा 3 शो के रूप में, एक ही प्रयोग प्रोटियोमिक् विश्लेषण के लिए अपर्याप्त मात्रा में उपज हो सकता है । उस मामले में, कई कैप्चर किए गए नमूनों के क्रम में एक बाद मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण करने के लिए परित होना होगा । वैकल्पिक रूप से, कब्जा कर लिया लक्ष्य क्षेत्र क्रोमेटिन के निचले सांद्रता इस तरह के पश्चिमी सोख्ता और जन स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित चयनित प्रतिक्रिया निगरानी परख के रूप में लक्षित विश्लेषण दृष्टिकोण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्र 1: कैप्चर oligonucleotide अनुमापन का बॉक्स प्लॉट प्रतिनिधित्व । कब्जा oligonucleotides की संख्या में वृद्धि का परीक्षण किया गया और qPCR द्वारा विश्लेषण । पृष्ठभूमि जीनोम में अंय क्षेत्रों लक्ष्यीकरण qPCR परख को संदर्भित करता है । मान एक एकल oligonucleotide का उपयोग करके संकरण कैप्चर से फ़ोल्ड परिवर्तन के रूप में प्रस्तुत किए जाते हैं । मूंछ न्यूनतम और अधिकतम मूल्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: सीरियल कैप्चर का बॉक्स प्लॉट प्रस्तुतिकरण. oligonucleotides (A_A) के एक ही सेट के साथ अनुक्रमिक संकरण कैप्चर oligonucleotides (A_B) के विभिन्न सेट का उपयोग कर अनुक्रमिक संकरण कब्जा करने के लिए की तुलना में संवर्धन में एक मजबूत ड्रॉप दिखाने (पी = ३.८८ ई-5). संवर्धन qPCR द्वारा मापा जाता है और मूल्यों के लिए ताजा क्रोमेटिन का उपयोग कर कब्जा रिश्तेदार दिखाया जाता है । मूंछ न्यूनतम और अधिकतम मूल्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: संकरण मानव कोशिकाओं का उपयोग कर कब्जा. विभिन्न गुणसूत्रों में स्थित क्षेत्रों की संकरण कब्जा । प्रत्येक क्षेत्र दूसरे के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है । साथ ही, एक संकरण कैप्चर एक सच्चे नकारात्मक नियंत्रण के रूप में तले हुए (के) अनुक्रम का उपयोग किया जाता है । त्रुटि पट्टियां मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

HyCCAPP विधि यहां वर्णित कई अनूठी विशेषताएं है कि यह एक शक्तिशाली दृष्टिकोण डीएनए-बातचीत है कि अंयथा मायावी रहेगा उजागर करना है । इस प्रक्रिया की प्रकृति विभिन्न जीवों और जीनोम के क्षेत्रों में काम करने के लिए लचीलापन HyCCAPP देता है । यह एक विधि है, तथापि, कि कई सीमाओं को माना जाता है ।

HyCCAPP एक तरीका है कि किसी भी सेल संशोधनों से बचा जाता है ताकि यह संभावित प्राथमिक कोशिकाओं में लागू किया जा सकता है, सेल संस्कृति प्रणालियों, या यहां तक कि ऊतक नमूने । इसके कारण, तथापि, यह नमूनों crosslinked, जो proteomic विश्लेषण में संवेदनशीलता कम कर देता है और इसलिए बड़ी इनपुट मात्रा की आवश्यकता है की आवश्यकता है । वहां उभरते दृष्टिकोण है कि CRISPR और आसपास के प्रोटीन है कि crosslinking प्रतिक्रियाओं12,13,14,18के बिना कार्य कर सकते है के biotinylation पर भरोसा करते हैं । इन तरीकों बहुत शक्तिशाली हो सकता है अगर प्लाज्मिड सम्मिलन एक बाधा का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं, लेकिन केवल सेल कल्चर सिस्टम में इस्तेमाल किया जा सकता है. अंय दृष्टिकोण बहुत अच्छी तरह से सामांय प्रोटीन एक क्रोमेटिन राज्य या एक विशेष प्रतिलेखन कारकों की उपस्थिति पर आधारित संघों की पहचान करने के लिए अनुकूल हैं, लेकिन मतलब के लिए व्यक्तिगत loci अध्ययन नहीं कर रहे है9,10,19 .

HyCCAPP दृष्टिकोण व्यापक प्रयोज्यता के साथ एक वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रस्तुत करता है, लेकिन यह संभावना है कि विभिंन सेल सिस्टम या जीवों में आवेदन अनुकूलन की आवश्यकता होगी । दृष्टिकोण में सबसे महत्वपूर्ण अनुकूलन कदम डिजाइन और कब्जा oligonucleotides के चयन शामिल है । छोटे पैमाने पर परीक्षण की एक श्रृंखला दिखाना चाहिए अगर डिजाइन oligonucleotides उचित है और अगर क्षेत्र में अनुक्रम प्रभावी ढंग से कब्जा कर लिया है । वहां कई कारकों है कि जब डिजाइन और परीक्षण पर कब्जा oligonucleotides, जैसे oligonucleotide लंबाई, लक्ष्य क्षेत्र के लिए विशिष्टता की डिग्री है, और oligonucleotides के सेट के बीच बातचीत करने के लिए इस्तेमाल किया जा माना जाना चाहिए रहे हैं । इन सभी बातचीत आसानी से एक qPCR लक्ष्य क्षेत्र के लिए विशिष्ट परख का उपयोग करके परीक्षण किया जा सकता है । यदि वांछित, एक चिप Seq की तरह कार्यप्रवाह के परिणामस्वरूप डीएनए टुकड़े अनुक्रम और विश्वास दिलाता हूं कि संवर्धन की विशिष्टता पूरे जीनोम5भर में संतोषजनक है इस्तेमाल किया जा सकता है ।

अंत में, पार से जोड़ने की स्थिति भी HyCCAPP प्रक्रिया में अत्यधिक महत्वपूर्ण हैं, और हम विभिंन प्रणालियों के बीच ध्यान देने योग्य अंतर देखा है, पार से मानव कोशिकाओं में सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त 1% formaldehyde के साथ जोड़ने, जबकि खमीर में, क्रॉस-3% formaldehyde के साथ जोड़ने से अधिक reproducible परिणाम झुकेंगे । यह संभव है कि अधिक तीव्र पार-एक अधिक जटिल क्रोमेटिन संरचना के साथ मानव कोशिकाओं में 3% formaldehyde के साथ जोड़ने संकरण कब्जा oligonucleotides के लिए पर्याप्त पहुंच प्रदान नहीं करता है । यह भी कल्पना है कि खमीर में एक कोशिका दीवार की उपस्थिति कोशिकाओं में formaldehyde का उपयोग बाधा, क्रोमेटिन में सफल crosslinking स्तर के लिए आवश्यक formaldehyde की मात्रा में वृद्धि ।

चिप और अंय कब्जा crosslinked मानव क्रोमेटिन लक्ष्यीकरण दृष्टिकोण प्रदर्शन, हमने देखा है कि केवल लक्ष्य डीएनए के बारे में 1% वास्तव में कब्जा किया जा सकता है । सबसे डीएनए आधारित दृष्टिकोण और विश्लेषण के लिए, यह एक सीमित कारक नहीं है । हालांकि, चिप के विपरीत, जहां अंतिम readout परिवर्धित डीएनए पर आधारित है, HyCCAPP अंतिम readout के लिए प्रोटीन सामग्री पर निर्भर करता है । इस आंतरिक सीमा के कारण, इनपुट सामग्री की बड़ी मात्रा में (यहां प्रस्तुत प्रयोगों में प्रसंस्कृत कोशिकाओं) आवश्यक हैं: इस विवशता सावधानी से इस पद्धति की खोज से पहले विचार किया जाना चाहिए, विशेष रूप से जब एकल प्रतिलिपि क्षेत्रों के लिए लागू. नहीं सभी प्रणालियों की जरूरत कोशिकाओं की संख्या, या आवश्यक सेल संख्या बढ़ की लागत का उत्पादन करने में सक्षम हो जाएगा निषेध हो सकता है । HyCCAPP की आवश्यकता होती है जो इनपुट मात्रा (~ 109 कक्ष) के बीच 108 और 1011 कक्ष9,11,15के बीच लेकर इनपुट मात्रा के साथ crosslinked सामग्री पर निर्भर अंय विधियों से तुलनीय है । HyCCAPP प्रौद्योगिकी के भविष्य के संशोधनों के दृष्टिकोण का पता लगाने के लिए कृत्रिम रूप से लक्ष्य क्षेत्रों की प्रतिलिपि संख्या बढ़ाने के लिए, इस विधि को और अधिक मोटे तौर पर लागू करना होगा । एक ही समय में, हम प्रक्रिया की समग्र दक्षता में वृद्धि जारी रखने के लिए काम करेंगे कि एक साथ सामूहिक स्पेक्ट्रोमेट्री में निरंतर प्रगति के साथ निवेश की जरूरत है और इस तकनीक को और अधिक प्रणालियों में व्यवहार्य कम करना चाहिए ।

Biotinylation आधारित CRISPR का उपयोग कर दृष्टिकोण, जैसे enCHiP18 और दूसरों को13,14, crosslinked सामग्री की जरूरत को नष्ट करने से बहुत प्रभावी हो दिखाया है, पैदावार में वृद्धि, और काफी इनपुट को कम करने आवश्यकताओं. इन तरीकों में कोशिकाओं के विस्तृत प्रसंस्करण तथापि, इन तकनीकों ऊतक नमूने, एक दिशा है कि हम HyCCAPP के साथ पीछा शुरू कर दिया है करने के लिए लागू किया जा करने की अनुमति नहीं है, और है कि आशाजनक परिणाम का उत्पादन होता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

कोई हितों का खुलासा करने के लिए संघर्ष कर रहे हैं ।

Acknowledgments

इस कार्य का समर्थन NIH पलाश P50HG004952 व R01GM109099 के मो.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PrimerQuest tool IDT
OligoAnalyzer 3.1 IDT Analyze capture oligonucleotids
PairFold UBC Analyze interactions
RPMI 1640 media Thermo Fisher 11875093
Penicillin-streptomycin Thermo Fisher 15140122
L-Glutamine  Thermo Fisher 25030081
Fetal bovine serum Thermo Fisher 26140079
Countess automated cell counter Thermo Fisher
850 cm2 roller bottle  Greiner Bio-one 680058
Roller system Wheaton 22-288-525
37 % formaldehyde  Sigma-Aldrich F8775
Glycine Sigma-Aldrich
Igepal CA-630 Sigma-Aldrich I3021
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P4380
HEPES Thermo Fisher 15630080
Branson digital sonifier SFX 150 Emerson
Qubit 3.0 fluorometer Thermo Fisher
Qubit dsDNA BR assay kit Thermo Fisher Q32850
Bioanalyzer 2100 Agilent
Agilent DNA 1000 kit Agilent 5067-1504
MES sodium salt Sigma-Aldrich M3885
NaCl 5M Thermo Fisher AM9760G
EDTA Sigma-Aldrich
DynaMag-2 magnet Thermo Fisher 12321D
DynaMag-15 magnet Thermo Fisher 12301D
Dynabeads M-280 atreptavidin Thermo Fisher 60210
Low binding tubes Eppendorf 22431081
Hybridization oven SciGene
Tube shaker and rotator Thermo Fisher 415110Q
DNase I (RNase-free) New England BioLabs M0303
SSC buffer 20× concentrate Sigma-Aldrich S6639

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489, (7414), 57-74 (2013).
  2. Galas, D. J., Schmitz, A. DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Res. 5, (9), 3157-3170 (1978).
  3. Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. Nat. Protoc. 7, (2), 256-267 (2012).
  4. Dai, Y., Kennedy-Darling, J., Shortreed, M. R., Scalf, M., Gasch, A. P., Smith, L. M. Multiplexed Sequence-Specific Capture of Chromatin and Mass Spectrometric Discovery of Associated Proteins. Anal. Chem. 89, (15), 7841-7846 (2017).
  5. Guillen-Ahlers, H., et al. HyCCAPP as a tool to characterize promoter DNA-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Genomics. 107, (6), (2016).
  6. Kennedy-Darling, J., et al. Discovery of Chromatin-Associated Proteins via Sequence-Specific Capture and Mass Spectrometric Protein Identification in Saccharomyces cerevisiae. J Proteome Res. 13, (8), 3810-3825 (2014).
  7. Guillen-Ahlers, H., Shortreed, M. R. R., Smith, L. M. M., Olivier, M. Advanced methods for the analysis of chromatin-associated proteins. Physiol Genomics. 46, (13), 441-447 (2014).
  8. Lambert, J. -P., Fillingham, J., Siahbazi, M., Greenblatt, J., Baetz, K., Figeys, D. Defining the budding yeast chromatin-associated interactome. Mol Syst Biol. 6, 448 (2010).
  9. Soldi, M., Bonaldi, T. The Proteomic Investigation of Chromatin Functional Domains Reveals Novel Synergisms among Distinct Heterochromatin Components. Mol Cell Proteomics. 12, (3), 764-780 (2013).
  10. Wang, C. I., et al. Chromatin proteins captured by ChIP-mass spectrometry are linked to dosage compensation in Drosophila. Nat Struct Mol Biol. 20, (2), 202-209 (2013).
  11. Byrum, S. D., Raman, A., Taverna, S. D., Tackett, A. J. ChAP-MS: A Method for Identification of Proteins and Histone Posttranslational Modifications at a Single Genomic Locus. Cell Rep. 2, (1), 198-205 (2012).
  12. Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated immunoprecipitation ( eChIP ) using CRISPR. Biochem. Bioph. Res. Co. 439, (1), 132-136 (2013).
  13. Liu, X., et al. In Situ Capture of Chromatin Interactions by Biotinylated dCas9. Cell. 170, (5), 1028-1043 (2017).
  14. Myers, S. A., Wright, J., Zhang, F., Carr, S. A. CRISPR/Cas9-APEX-mediated proximity labeling enables discovery of proteins associated with a predefined genomic locus in living cells. bioRxiv. (2017).
  15. Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci. Cell. 136, (1), 175-186 (2009).
  16. Buxton, K. E., et al. Elucidating Protein-DNA Interactions in Human Alphoid Chromatin via Hybridization Capture and Mass Spectrometry. J. Proteome Res. 16, (9), 3433-3442 (2017).
  17. Kennedy-Darling, J., Holden, M. T., Shortreed, M. R., Smith, L. M. Multiplexed programmable release of captured DNA. Chembiochem. 15, (16), 2353-2356 (2014).
  18. Fujita, T., Fujii, H. Isolation of specific genomic regions and identification of associated molecules by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR. Chromatin Protoc. Third Ed. 43-52 (2015).
  19. Lambert, J. -P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A Novel Proteomics Approach for the Discovery of Chromatin-associated Protein Networks. Mol Cell Proteomics. 8, (4), 870-882 (2009).
स्तनधारी कोशिकाओं को प्रोटियोमिक् के लिए क्रोमेटिन-जुड़े प्रोटीन का संकरण कैप्चर का अनुकूलन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guillen-Ahlers, H., Rao, P. K., Perumalla, D. S., Montoya, M. J., Jadhav, A. Y. L., Shortreed, M. R., Smith, L. M., Olivier, M. Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (136), e57140, doi:10.3791/57140 (2018).More

Guillen-Ahlers, H., Rao, P. K., Perumalla, D. S., Montoya, M. J., Jadhav, A. Y. L., Shortreed, M. R., Smith, L. M., Olivier, M. Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (136), e57140, doi:10.3791/57140 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter