Summary
Si tratta di un metodo per identificare nuove proteine che interagiscono con DNA loci target specifico, basandosi sull'acquisizione di sequenza-specifico della cromatina reticolato per analisi proteomica successive. Alcuna conoscenza pregressa potenziali proteine leganti, né modifiche di cella non sono necessari. Inizialmente sviluppato per il lievito, la tecnologia ora è stata adattata per cellule di mammifero.
Abstract
La cattura di ibridazione delle proteine della cromatina associate per tecnologia proteomica (HyCCAPP) è stato inizialmente sviluppata per scoprire nuove interazioni della DNA-proteina in lievito. Consente di analizzare una regione di destinazione di interesse senza la necessità di conoscenza pregressa probabile proteine legate alla regione di destinazione. Questo, in teoria, consente di HyCCAPP essere utilizzati per analizzare qualsiasi regione genomica di interesse e fornisce una flessibilità sufficiente per lavorare in diversi sistemi cellulari. Questo metodo non è destinato a siti di legame di fattori di trascrizione noti, un compito più adatto per immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) e ChIP-come metodi di studio. La forza di HyCCAPP sta nella sua capacità di esplorare le regioni di DNA, per cui c'è limitata o nessuna conoscenza circa le proteine legate ad esso. Può anche essere un metodo conveniente per evitare biases (presente nel ChIP-come metodi) introdotto da arricchimento di base di proteine della cromatina usando gli anticorpi. Potenzialmente, HyCCAPP può essere un potente strumento per scoprire veramente nuove interazioni della DNA-proteina. Ad oggi, la tecnologia è stata applicata principalmente di cellule di lievito o di ripetere sequenze di alta copia in cellule di mammifero. Al fine di diventare il potente strumento che noi immaginiamo, HyCCAPP approcci devono essere ottimizzate per catturare in modo efficiente copia singola loci in cellule di mammifero. Qui, presentiamo il nostro adattamento del lievito iniziale HyCCAPP protocollo di linee cellulari umane di catturare e mostrare che regioni singola copia della cromatina possono essere efficacemente isolate con questo protocollo modificato.
Introduction
Durante la decade passata, ha visto un forte progresso nelle tecnologie di sequenziamento, permettendo lo studio di una vasta gamma dei genomi in gran numero di campioni e con sorprendente risoluzione. Il Consorzio di Enciclopedia di DNA Elements (ENCODE), uno sforzo su larga scala di multi-istituzionale guidato dal National Human Genome Research Institute, del National Institutes of Health, ha fornito le comprensioni nei fattori di trascrizione come singoli e altre proteine regolatorie associare a e interagiscono con il genoma. Lo sforzo iniziale caratterizzato interazioni DNA-proteine specifiche, come valutato da immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) per oltre 100 noti DNA-binding proteins1. Metodi alternativi come dnasi footprinting2 e formaldeide assistita isolamento di elementi regolatori (FAIRE)3 sono stati utilizzati anche per individuare specifiche regioni del genoma che interagiscono con le proteine, ma con la limitazione evidente che questi approcci sperimentali non identificano le proteine interagenti. Nonostante i notevoli sforzi negli ultimi anni, nessuna tecnologia è emerso che in modo efficiente permette la completa caratterizzazione delle interazioni proteina-DNA nella cromatina e l'identificazione e la quantificazione delle proteine della cromatina-associate.
Per soddisfare questa esigenza, abbiamo sviluppato un nuovo approccio che abbiamo definiti come Hybridization Capture of Chromatin-Associated proteine per proteomica (HyCCAPP). Inizialmente sviluppato in lievito4,5,6, l'approccio isola reticolato della cromatina le regioni di interesse (con proteine rilegate) mediante acquisizione di ibridazione di sequenza-specifico. Dopo l'isolamento dei complessi proteina-DNA, approcci come spettrometria di massa possono essere utilizzati per caratterizzare l'insieme delle proteine associato alla sequenza di interesse. Così, HyCCAPP può essere considerato come un approccio imparziale per scoprire romanzo interazioni della DNA-proteina, nel senso che esso non si basa su anticorpi e si è completamente agnostico circa le proteine che potrebbero essere presenti. Ci sono altri approcci in grado di scoprire romanzo d'interazione DNA proteine7, ma più si basano su metodi ChIP8,9,10, plasmide inserimenti11,12, 13,14, o regioni con alta copia numeri15. Al contrario, HyCCAPP può essere applicato alle regioni multi - e unico-copia, e non richiede alcuna informazione preventiva circa le proteine nella regione. In aggiunta, mentre alcuni dei metodi menzionati sopra è di pregio, in particolare evitando la necessità per reazioni di reticolazione della DNA-proteina, la caratteristica unica di HyCCAPP è che può essere applicato alle regioni di singola copia in non modificato cellule e senza alcuna conoscenza pregressa proteine leganti presunti, o anticorpi disponibili.
A questo punto, HyCCAPP principalmente è stato applicato all'analisi delle varie regioni genomiche in lievito4,5,6e recentemente è stato utilizzato per analizzare le interazioni proteina-DNA nel DNA di alfa-satellite, una regione di ripetizione nel genoma umano16. Come parte del nostro lavoro in corso, abbiamo adattato l'approccio di cattura di ibridazione inizialmente sviluppato per cromatina lievito essere applicabile per l'analisi delle cellule umane e qui presenti un protocollo modificato che permette la cattura selettiva di copia singola destinazione regioni del genoma umano con efficienze simili ai nostri studi iniziali in lievito. Ora, questo nuovo protocollo ottimizzato permette l'adattamento e l'utilizzo della tecnologia per interrogare le interazioni proteina-DNA in tutto il genoma umano, utilizzando la spettrometria di massa o altri approcci analitici.
È importante sottolineare che il metodo di HyCCAPP è destinato per l'analisi delle regioni di destinazione specifico e non è ancora adatto per le analisi del genoma. La tecnologia è particolarmente utile quando si tratta di regioni per le quali c'è scarse informazioni sulle proteine interagenti, o quando si desidera un'analisi più completa e approfondita delle proteine d'interazione in un locus specifico genoma. HyCCAPP è destinato a scoprire proteine che legano il DNA ma non caratterizzare accuratamente i siti di legame della proteina specifica in DNA genomic. Nell'implementazione corrente, la metodologia non fornisce informazioni circa il grippaggio del DNA sequenze o motivi per singole proteine. Pertanto, ben integra le tecnologie esistenti quali FAIRE e possono consentire l'identificazione delle proteine leganti in regioni genomiche identificato da una prima analisi FAIRE.
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Protocol
1. catturare Oligonucleotide Design
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Progettare un riquadro di oligonucleotidi da usarsi durante la cattura di ibridazione della destinazione regione/s.
- Lo scopo di progettare oligonucleotidi di 4 – 8 per regione di destinazione, ma come minimo, progettare almeno un oligonucleotide targeting per ciascuna estremità della regione di destinazione.
- Se la sequenza di destinazione è lunga (> 500 paia di basi), progettare gli oligonucleotidi come diffusione fuori come possibile per assicurare l'effettivo arricchimento della cromatina in tutta la regione intera destinazione.
Nota: Abbiamo osservato cattura ottimale con oligonucleotidi di 4 – 8. Anche se questo processo può funzionare bene con oligonucleotidi più, non è raro osservare una diminuzione delle rese di arricchimento quando troppi oligonucleotidi sono utilizzati.
- Progettare oligonucleotidi con temperature di fusione simile e assicurarsi che essi non formare forcine forte né hanno interazioni forti (tenendo conto che ibridazioni si procederà a 42 ᵒC).
Nota: Se un'eluizione di punto d'appoggio è scelto (4.12.3), una sequenza base 8 esterna aggiuntiva deve essere aggiunto il oligonucleotide e richiederà oligonucleotidi complementari 'release' al momento dell' eluizione17. Diversi strumenti software commerciale possono essere utilizzati per selezionare e analizzare gli oligonucleotidi. 25 mers hanno dimostrato buoni risultati, ma a seconda della dimensione del genoma e la sequenza, cattura oligonucleotidi possono contenere da qualche parte tra 20 – 80 basi. In genere, oligonucleotidi di cattura hanno una temperatura di fusione vicino ᵒC 62, ma che può cambiare a seconda della loro lunghezza. Temperature di fusione coerente e/o lunghezza del oligonucleotide in tutto il mix di cattura può contribuire ad evitare distorsioni indesiderate in arricchimento. - Progettare i oligonucleotides di cattura con una molecola di biotina (preferibilmente separato da un distanziatore dalla sequenza di acquisizione) all'estremità 3'.
2. coltura cellulare
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Crescere le cellule linfoblastoidi umane (ad esempio GM12878 illustrato di seguito) o altre linee cellulari in RPMI 1640 media completati con 1% di penicillina-streptomicina, 2 mM L-Glutammina e 5% siero bovino fetale (FBS), a 37 ᵒC e 5% CO2.
- Iniziale di seme congelato aliquote (2 – 5 x 105 cellule) in un pallone di T-25 con 6 mL di RPMI 1640 media preparato al punto 2.1.
- Monitorare la densità delle cellule e la vitalità.
- Prendere un rappresentante aliquota delle cellule e li colorano con un colorante appropriato come trypan blu.
- Misurare la densità delle cellule usando un contatore automatizzato delle cellule o un emocitometro.
- Prima che la cella raggiunge densità di 1 x 106 cellule/mL, rallentare le cellule a 100 x g per 5 min e trasferire le cellule in un pallone di T-75 con 25 mL di RPMI 1640 media preparato al punto 2.1. Crescere le cellule fino a quando la densità delle cellule si avvicina a 1 x 106 cellule/mL.
- Trasferire le cellule in un pallone di T-150 in 38 mL di terreno RPMI 1640 (2.1) e far crescere le cellule per altri due giorni.
Nota: Le cellule linfoblastoidi crescono in sospensione. Linee guida generali per la coltivazione di cellule linfoblastoidi consigliano di densità delle cellule per essere compresa tra 0,2 – 1 x 106 cellule/mL. A causa della grande quantità di materiale necessaria in questa tecnologia, il presente protocollo è volutamente scritto a crescere le cellule ad una densità di cellule di là di ciò che è comunemente usato. Protocolli di crescita delle cellule possono essere rivisto e adattati dal lettore a seconda dei tipi di cella da utilizzare. - Rallentare le cellule a 100 x g per 5 min, risospendere le cellule in 10 mL di terreno RPMI 1640 (2.1) e versare la sospensione in un flacone di rullo2 850 cm contenente 500 mL di media. Incubare le cellule stesse condizioni come prima, ma a questo punto iniziare a utilizzare la costante rotazione (giri/min. ~0.5).
- Monitorare la crescita delle cellule e cambiare il supporto quando necessario (in genere ogni 3 – 4 giorni). Lasciate che le cellule crescono ad una densità più vicino possibile a 2 x 106 cellule/mL (1 x 109 celle in totale).
- Una volta raggiunto il numero di celle desiderato, raccogliere le cellule facendo girare le cellule giù a 100 x g per 5 min e risospendere le cellule in 36 mL di RPMI 1640 media (2.1). Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 50 mL. Prendere piccole aliquote per conta cellulare e di estrazione del DNA.
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Crosslink aggiungendo 1 mL di formaldeide al 37% per raggiungere una concentrazione finale dell'1%.
Attenzione: La formaldeide è una sostanza cancerogena e deve essere gestita in una cappa aspirante.- Incubare le cellule con rotazione (~ 30 – 60 giri/min) per 10 min a temperatura ambiente (TA).
- Placare la reazione di reticolazione con l'aggiunta di 2 mL di una soluzione di glicina di 2,5 M, per una concentrazione finale di 125 mM.
- Incubare le cellule con rotazione (~ 30 – 60 giri/min) per 5 min a RT. agglomerare le cellule mediante centrifugazione a 100 x g per 5 min e lavare le cellule due volte con PBS 1X freddo di ghiaccio.
- Continuare a passo successivo o risospendere il pellet in 5 mL di tampone di lisi delle cellule (5 mM Hepes, 85 mM KCl, 0,5% Igepal, inibitori della proteasi (PI)) e snap-congelare la sospensione goccia a goccia in azoto liquido. Conservare i campioni a-80 ᵒC.
Nota: Preparare > 25 mL di tampone di lisi delle cellule senza Igepal e PI e aggiungere quelli freschi di reagenti quando pronto all'uso. Evitare la conservazione a lungo termine di tampone di lisi delle cellule una volta Igepal e PI sono stati aggiunti. Conservare il tampone di lisi delle cellule a 4 ᵒC per fino a 3 mesi. Igepal è un detergente non ionico, non-denaturante. NP-40 può essere potenzialmente utilizzato come alternativa alla Igepal ma non abbiamo usato esso in questo contesto come NP-40 non è consigliato quando i campioni sono analizzati alla fine mediante spettrometria di massa per la caratterizzazione di proteine che legano il DNA.
3. Lisi e tosatura
- Preparare > 15 mL di tampone di lisi di Nuclei (10 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8.0, 1% SDS, PI).
Nota: Aggiungere PI fresco, solo per gli importi da utilizzare. Evitare la conservazione a lungo termine di tampone di lisi di Nuclei una volta PI è stato aggiunto. Buffer di lisi di nuclei possono essere conservati a RT per fino a 1 mese. - Risospendere il pellet in 20 mL di tampone di lisi delle cellule (contenente Igepal e PI). Lasciate che i pellet scongelare il ghiaccio e mescolano bene una volta scongelati. Lasciate i campioni riposare per altri 10 min sul ghiaccio. Centrifugare le cellule a 400 x g a 4 ᵒC per 5 min.
- Eliminare il supernatante e risospendere le cellule in 6 mL di tampone di lisi di Nuclei con PI (volume può essere aumentato se le cellule non formano una sospensione).
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In preparazione per sonicazione, dividere il campione in modo uniforme in ~ 6 – 8 tubi del microfuge (600-1.000 µ l per ogni tubo).
- Posizionare i campioni su ghiaccio o un rack freddo e Sonicare l'esempio utilizzando un sonicatore con un microtip. Utilizzare 65% ampiezza con 5x20 raffica costante di s, permettendo la sospensione raffreddare per almeno 40 s tra gli impulsi.
Nota: Se aumentano volumi > 10 mL per campione, un cella frigorifera di vetro può essere utilizzato invece. Scoppia più e più a lungo sarebbe necessaria quindi. Sonicatori differiscono notevolmente. Condizioni potrebbero essere necessario essere ottimizzato dal reader. Altre alternative di sonicazione possono essere usati pure.
- Posizionare i campioni su ghiaccio o un rack freddo e Sonicare l'esempio utilizzando un sonicatore con un microtip. Utilizzare 65% ampiezza con 5x20 raffica costante di s, permettendo la sospensione raffreddare per almeno 40 s tra gli impulsi.
- Centrifugare le cellule a 12.000 x g per 10 min a 4 ᵒC, trasferire il surnatante in una nuova provetta e scartare i pellet.
- Stima totale recupero utilizzando un metodo fluorimetrico.
- Continuare al passo successivo o snap-congelare e conservare il campione a-80 ᵒC.
- Opzionale: Prendere un'aliquota, invertire le reticolazioni incubando una notte al ᵒC 67 a 0,3 M NaCl. Pulire il DNA ed eseguirlo in Bioanalyzer per determinare la lunghezza di frammento. La maggior parte dei frammenti deve essere compreso tra 500 e 1.000 bp.
Nota: È OK per interrompere a questo punto e conservare i campioni a-80 ᵒC.
4. ibridazione cattura
- Preparare 500 mL di tampone di ibridazione (ibridazione): 2x (200mm MES, 2 M di NaCl, 40 mM EDTA, 0,02% Tween-20) e 500 mL di tampone di lavaggio (200 mM NaCl, 0,2% SDS, 50 mM Tris-HCl pH 8). Conservare il Hyb e Wash buffer a 4 ᵒC e temperatura ambiente, rispettivamente, fino a 3 mesi. Metà del buffer x Hyb 2 utilizzare per preparare un 1x tampone di ibridazione. Anche conservarlo a 4 ᵒC per fino a 3 mesi.
Nota: Il volume totale della cattura l'ibridazione sarà due volte il volume del campione risultante nel passaggio precedente (come descritto finora, il volume del campione sarebbe circa 6 mL e quindi il volume totale ibridazione sarebbe 12ml). - Mettere da parte perline pari al 5% del volume totale ibridazione cattura (600 µ l in questo caso). Un magnete adatto e appropriato è necessario per lavorare con le perline nei passaggi seguenti.
- Lavare le perle tre volte con tampone di ibridazione utilizzando due volte il volume di perline (1200 µ l) 1x. Risospendere le sfere in 1.200 µ l di Buffer IBRID: 2x. Posizionare i tubi sul magnete fino a quando la soluzione Cancella e rimuovere il buffer.
- Eseguire reazioni pre-schiarimento in provette da 1,5 mL microfuge con un massimo di 700 µ l di campione per tubo. Aggiungere abbastanza perline (5%) e 2 x Hyb Buffer per diluire il tampone di ibridazione a 1 x (10 tubi con 600 µ l di campione, 120 µ l di perline lavati risospesi in 2x Hyb Buffer e 480 µ l di Buffer IBRID: 2x). Li Incubare per 10 min a 31 ᵒC con fine sopra rotazione fine (~ 30 – 60 giri/min).
- Posizionare i tubi su un magnete fino a perline sono immobilizzati e trasferire i campioni in nuove provette. Scartare le perline.
Nota: Da questo punto in avanti, basso-associazione tubi sono raccomandati. - Risospendere i oligonucleotides di acquisizione a una soluzione di lavoro di 10 pmol / µ l e aggiungere 4 µ l di questa soluzione in ogni provetta.
Nota: Diverse regioni possono fungere da controllo per a vicenda, ma si consiglia di includere un oligonucleotide di cattura con la sua sequenza uova strapazzata per servire come un vero controllo negativo. - Incubare le provette per 40 min a 42 ᵒC con fine sopra rotazione fine (~ 30 – 60 giri/min).
- Durante l'incubazione, mettere da parte le perle necessarie (0,3 µ l/pmol dell'oligonucleotide di cattura). Lavare le perle tre volte come descritto al punto 4.3, ma risospendere le cellule in 1x tampone di ibridazione.
- Aggiungere le perline lavate al campione e incubare i campioni per 30 min a RT con fine sopra rotazione fine (~ 30 – 60 giri/min). Posizionare i tubi sul magnete e rimuovere il supernatante, una volta che le perle sono state immobilizzate.
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Le sfere di lavaggio
- Aggiungere 1,2 mL di tampone di lavaggio e incubare il campione per 5 min con fine sopra rotazione fine (~ 30 – 60 giri/min) a tubi RT. posto sul magnete e attendere un paio di minuti fino alle soluzione Cancella. Rimuovere il buffer e ripetere questo passaggio.
- Aggiungere 1,2 mL di tampone di lavaggio e incubare per 1 h con fine sopra rotazione fine (~ 30-60 giri/min) a RT. Posizionare i tubi sul magnete e attendere un paio di min soluzione Cancella. Rimuovere il buffer e ripetere questo passaggio riducendo il tempo di incubazione a 30 min la seconda volta.
- Aggiungere 200 µ l di tampone di lavaggio e incubare per 15 min con fine sopra rotazione fine (~ 30 – 60 giri/min) al 31 ᵒC. Posizionare i tubi sul magnete e attendere un paio di min soluzione Cancella. Rimuovere il buffer.
- Aggiungere 200 µ l di PBS e incubare per 5 min con fine sopra rotazione fine (~ 30 – 60 giri/min) a RT. Posizionare i tubi sul magnete e attendere un paio di min soluzione Cancella. Rimuovere il buffer e ripetere questo passaggio.
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Eluizione semplice
- Aggiungere 40 µ l di acqua di grado molecolare ai talloni e incubare 94 ᵒC per 5 min.
- Posizionare i tubi sul magnete e attendere un paio di minuti fino a quando la soluzione Cancella.
- Trasferire il surnatante in una nuova provetta. Scartare le perline.
- Procedere con l'analisi proteomica o conservare il campione a-80 ᵒC.
Nota: Questo tipo di eluizione funziona bene per un'analisi successiva di qPCR e alcune misurazioni di proteomica, ma in altri casi due approcci alternativi descritti di seguito resa "pulitore" eluati.
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Eluizione dnasi.
- Aggiungere 40 µ l di tampone di dnasi 1x e 2 U di dnasi in ogni provetta.
- Incubare le provette per 15 min a 37 ᵒC.
- Posizionare i tubi su un magnete e attendere un paio di minuti fino a quando la soluzione Cancella.
- Rimuovere i campioni eluiti dalle perline e i campioni in un nuovo tubo di basso-associazione.
- Incubare la provetta al 94 ᵒC per 7 min inattivare l'enzima e procedere alla analisi proteomica.
Nota: Le concentrazioni più basse di dnasi possono essere utilizzate se è osservata con analisi proteomica. Non sarà possibile calcolare l'acquisizione arricchimenti di qPCR se questo metodo di eluizione viene utilizzato dal momento che il trattamento della dnasi distrugge completamente il materiale di DNA nel campione. - Procedere alla analisi proteomica o conservare il campione a-80 ᵒC.
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Punto d'appoggio eluizione17.
Nota: Questo metodo non è consigliato per oligonucleotidi più a lungo (> 40 basi). Questo metodo richiede per gli oligonucleotidi di cattura contenere un 8 basi aggiuntive che non si sovrappongono con la sequenza genomic e oligonucleotidi complementari rilascio al fine di spostare il bersaglio dai oligonucleotides di cattura.- Diluire 2 nanomoles di oligonucleotidi di rilascio in 40 µ l di tampone SSC.
- Incubare per 20 minuti a TA.
- Posizionare i tubi su un magnete e attendere un paio di minuti fino a quando la soluzione Cancella.
- Rimuovere la soluzione dalle perle.
- Procedere alla analisi proteomica o conservare il campione a-80 ᵒC.
5. valutazione di catturare resa di qPCR con Primers per la regione di interesse di Target Capture
- Utilizzare un apposito software o strumento online per progettare primer e sonde per la regione di destinazione.
Nota: In questo esperimento, regione del promotore del DUSP3 e DUSP5 sono stati destinati. I primer e sonde utilizzate sono le seguenti. DUSP3: Primer 1 - GTG TTT AGG TTC CCT GAT CC, primer 2 - CGG AAT GTC TGC CTT CG, sonda marcata con FAM - TCC ATG che CCC GAA TTG TGA CGT CGG; DUSP5: Primer 1 - TGA GAA AGC CCT GAT GTG TC, primer 2 - GCC TTC AGA AAC CCC AAA AG, sonda marcata con FAM TGC ATT TAG AGC AGC CAG ATG AGG TT. - Prendere un'aliquota dell'eluato (non più di 10 µ l) e diluire 01:10 con grado molecolare H2O.
- Estrarre il DNA di uno delle aliquote nel passaggio 2.1.7 e utilizzare quel campione di DNA per fare una curva standard facendo cinque seriale 01:10 diluizioni in molecolare grado H2O.
- Preparare un mix master qPCR (grande varietà di alternative commerciali), aggiungere primer e sonde ed erogare quantità appropriata (15 µ l se in esecuzione di una reazione di 20 µ l) in ciascun pozzetto.
- Aggiungere 5 µ l di entrambi: un) diluito il campione, b) la curva standard o grado c) molecolare H2O (per servire come nessun controllo del modello) in ciascun pozzetto.
- Sigillare la piastra ed e centrifugare a 100 x g per 1 min.
- Esecuzione in un sistema qPCR con i seguenti parametri: 5 min a 95 ᵒC seguiti da 40 cicli di 95 ᵒC per 20 s, 59 ᵒC per 20 s e 72 ᵒC per 25 s.
- Utilizzare la curva standard a rendimenti di asini e cattura uova strapazzata per valutare la specificità di cattura.
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Representative Results
A causa della necessità di grandi quantità di input della cromatina per HyCCAPP avere successo, le cellule sono coltivate a livelli relativamente elevati di confluenza. Trypan blu colorazione viene utilizzato per confermare che i tassi di morte delle cellule sono moderati (< 10%). In singola copia esperimenti, contenuto di cromatina prima ibridazione cattura deve essere nella gamma femtomolar, che di solito richiede almeno 109 celle come materiale di partenza. Prima gli esperimenti di fondo scala, si consiglia di testare le prestazioni del oligonucleotide di cattura in batch più piccoli. Cattura di ibridazione utilizzando una titolazione di oligonucleotidi è mostrati nella Figura 1. Il numero di oligonucleotidi di cattura viene gradualmente aumentato, mentre la concentrazione totale rimane costante. Questo esperimento mostra chiaramente tre aspetti chiave. In primo luogo, contribuisce a determinare, per quella particolare regione, oligonucleotidi quanti sono necessari per raggiungere l'efficienza ottimale (e massimo) di ibridazione. In secondo luogo, esso rivela se ci sono eventuali interazioni dannose evidente tra un particolare insieme di oligonucleotidi. Infine, Mostra se ci sono qualsiasi oligonucleotidi con scarsa specificità che trasportano notevoli quantità di sfondo (in questo caso misurato dall'analisi qPCR con gli iniettori di altre regioni del genoma di targeting).
I rendimenti di ibridazione di cattura appare modesti a causa della natura reticolata del campione della cromatina. Una grande percentuale di frammenti nella cromatina reticolato non saranno favorevole per l'acquisizione di ibridazione. Gli esperimenti di ibridazione seriale dimostrano questo (Figura 2). Se la cattura di ibridazione è eseguita correttamente, un esperimento di acquisizione successiva dello stesso materiale della cromatina con un diverso insieme di oligonucleotidi di cattura si tradurrà in rendimenti comparabili (leggermente inferiori) rispetto a quando fresco della cromatina (~ 11% più in basso su Media). Ma se stessa regione si rivolge nuovamente con lo stesso set di oligonucleotidi in un secondo esperimento di cattura utilizzando il campione di cromatina rimanente dopo la cattura del prima esperimento, il rendimento diminuisce circa il 90%, confermando che la maggior parte della materiale suscettibile di ibridazione è stato catturato. Se una tal diminuzione nella cattura non è osservata dopo successive acquisizioni con lo stesso set di oligonucleotidi, indica un problema tecnico nella fase di acquisizione di ibridazione.
In sistemi semplici come lievito, abbiamo osservato l'efficienza di cattura si avvicina 4%5, che ha portato all'identificazione di 9 proteine differenzialmente arricchita in 2 regioni quando il lievito è stato coltivato in condizioni diverse. Nelle cellule umane, tuttavia, avendo un genoma ~ 250 volte più grande di lievito, ibridazione rendimenti sono in genere inferiore all'1% (Figura 3). Come illustrato nella figura 3 , un singolo esperimento potrebbe produrre gli importi insufficienti per le analisi di proteomica. In tal caso, parecchi campioni catturati dovranno essere riuniti al fine di eseguire un'analisi di spettrometria di massa successiva. In alternativa, le concentrazioni più basse della cromatina regione bersaglio acquisito possono essere utilizzate per un'analisi mirata approcci come western blotting e monitoraggio analisi della reazione selezionata basati sulla spettrometria di massa.
Figura 1: rappresentazione di trama di casella di titolazione del oligonucleotide di cattura. Crescente numero di cattura oligonucleotidi sono stati testati e analizzati da qPCR. Priorità bassa si riferisce ai saggi qPCR targeting per altre regioni del genoma. I valori sono presentati come cambiamento di piega dalla cattura di ibridazione usando un singolo oligonucleotide. Baffi rappresentano i valori minimi e massimi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: rappresentazione trama casella di catture seriale. Cattura di ibridazione sequenziale con lo stesso set di oligonucleotidi (A_A) Mostra un forte calo di arricchimento rispetto alla ibridazione sequenza cattura utilizzando diversi set di oligonucleotidi (A_B) (p = 3.88 e-5). Arricchimento è misurata da qPCR e i valori vengono visualizzati rispetto cattura utilizzando freschi della cromatina. Baffi rappresentano i valori minimi e massimi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: cattura di ibridazione con le cellule umane. L'ibridazione catturare delle regioni situate nei diversi cromosomi. Ogni regione serve come controllo negativo per l'altro. Inoltre, un'acquisizione di ibridazione viene eseguita utilizzando la sequenza di uova strapazzata (Scr) come un vero controllo negativo. Barre di errore rappresentano la deviazione standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il metodo di HyCCAPP qui descritto ha molte caratteristiche uniche che lo rendono un potente approccio per scoprire interazioni DNA che altrimenti rimarrebbero sfuggente. La natura del processo dà HyCCAPP la flessibilità di lavorare in diversi organismi e regioni del genoma. Si tratta di un metodo, tuttavia, che ha diverse limitazioni da considerare.
HyCCAPP è un metodo che evita eventuali modifiche di cella in modo che potenzialmente può essere applicato in cellule primarie, sistemi di coltura cellulare o campioni di tessuto anche. Per questo motivo, tuttavia, esso richiede campioni di essere reticolati, che riduce la sensibilità nell'analisi proteomica e pertanto richiede grandi quantità di input. Stanno emergendo gli approcci che si basano su CRISPR e biotinylation delle circostanti proteine che possono funzionare senza reticolazione reazioni12,13,14,18. Questi approcci possono essere molto potenti se gli inserimenti plasmide non rappresentano un vincolo, ma possono essere utilizzati solo in sistemi di colture cellulari. Altri approcci sono molto adatti per identificare proteine generale associazioni basano su uno stato della cromatina o sulla presenza di una serie di fattori di trascrizione particolare, ma non intendono studiare singoli loci9,10,19 .
L'approccio di HyCCAPP presenta un approccio alternativo con ampia applicabilità, ma è probabile che le applicazioni in diversi sistemi cellulari o organismi richiedono ottimizzazione. La fase più critica di ottimizzazione nell'approccio comporta la progettazione e la selezione di oligonucleotidi di cattura. Una serie di test su piccola scala dovrebbero mostrare se gli oligonucleotidi progettati sono appropriati e se la sequenza della regione viene catturata in modo efficace. Ci sono diversi fattori da considerare durante la progettazione e test di oligonucleotidi di acquisizione, come la lunghezza del oligonucleotide, grado di specificità della regione di destinazione, e interazioni tra il set di oligonucleotidi per essere utilizzato. Tutte queste interazioni possono essere facilmente testate utilizzando un'analisi qPCR specifiche alla regione di destinazione. Se lo si desidera, un ChIP-Seq-come flusso di lavoro consente di sequenziare i frammenti di DNA risultanti e assicurare che la specificità dell'arricchimento è soddisfacente attraverso l' intero genoma5.
Infine, le condizioni di reticolazione sono anche altamente importante nella procedura di HyCCAPP, e abbiamo osservato notevoli differenze tra i diversi sistemi, ottenendo i migliori risultati in cellule umane di cross-linking con 1% di formaldeide, considerando che in lievito, Cross-linking con 3% formaldeide prodotto più risultati riproducibili. È possibile che il cross-linking più intenso con il 3% di formaldeide in cellule umane con una struttura più complessa di cromatina non fornisce sufficiente accessibilità per l'ibridazione cattura oligonucleotides. È anche ipotizzabile che la presenza di una parete delle cellule in lievito ostacola l'accesso di formaldeide nella cellule, aumentando la quantità di formaldeide necessaria per livelli di successo reticolazione nella cromatina.
Esecuzione di ChIP e altri approcci di cattura targeting reticolato umano della cromatina, abbiamo osservato che solo circa l'1% del DNA dell'obiettivo in realtà può essere catturato. Per la maggior parte delle analisi e approcci basati su DNA, questo non è un fattore limitante. Tuttavia, a differenza di ChIP, dove la lettura finale si basa sul DNA amplificabile, HyCCAPP si basa sul contenuto proteico per la lettura finale. A causa di questa limitazione intrinseca, sono necessarie grandi quantità di materiale in ingresso (cellule coltivate negli esperimenti presentati qui): questo vincolo deve essere considerata attentamente prima di esplorare questa metodologia, specie se applicati a copia singola regioni. Non tutti i sistemi saranno in grado di produrre il numero di cellule necessarie, o il costo di crescente i numeri di cellulare richiesto potrebbe essere proibitivo. La quantità di input che HyCCAPP richiede (~ 109 celle) è paragonabile ad altri metodi che si basano su materiale reticolato con ingresso quantità variabili tra 108 e 1011 celle9,11,15. Future modifiche della tecnologia HyCCAPP esplorare approcci per aumentare artificialmente il numero di copie delle regioni di destinazione, per rendere questo metodo più largamente applicabile. Allo stesso tempo, lavoreremo per continuare aumentando l'efficienza complessiva del processo che, insieme ai continui avanzamenti nella spettrometria di massa, dovrebbe ridurre la quantità di input necessari e rendere questa tecnologia fattibile in più sistemi.
Biotinylation basato su approcci utilizzando CRISPR, come enCHiP18 e altri13,14, hanno dimostrato di essere molto efficace, eliminando la necessità di materiale reticolato, aumentando i rendimenti, e riducendo in modo significativo l'input requisiti. L'elaborata lavorazione delle cellule in questi metodi, tuttavia, non consente queste tecniche da applicare ai campioni di tessuto, una direzione che abbiamo cominciato a perseguire con HyCCAPP e che sta producendo risultati promettenti.
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Disclosures
Non ci sono nessun conflitti di interesse a divulgare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da NIH sovvenzioni P50HG004952 e R01GM109099 a MO.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PrimerQuest tool | IDT | ||
| OligoAnalyzer 3.1 | IDT | Analyze capture oligonucleotids | |
| PairFold | UBC | Analyze interactions | |
| RPMI 1640 media | Thermo Fisher | 11875093 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 26140079 | |
| Countess automated cell counter | Thermo Fisher | ||
| 850 cm2 roller bottle | Greiner Bio-one | 680058 | |
| Roller system | Wheaton | 22-288-525 | |
| 37 % formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | ||
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I3021 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P4380 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630080 | |
| Branson digital sonifier SFX 150 | Emerson | ||
| Qubit 3.0 fluorometer | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA BR assay kit | Thermo Fisher | Q32850 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | ||
| Agilent DNA 1000 kit | Agilent | 5067-1504 | |
| MES sodium salt | Sigma-Aldrich | M3885 | |
| NaCl 5M | Thermo Fisher | AM9760G | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ||
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher | 12321D | |
| DynaMag-15 magnet | Thermo Fisher | 12301D | |
| Dynabeads M-280 atreptavidin | Thermo Fisher | 60210 | |
| Low binding tubes | Eppendorf | 22431081 | |
| Hybridization oven | SciGene | ||
| Tube shaker and rotator | Thermo Fisher | 415110Q | |
| DNase I (RNase-free) | New England BioLabs | M0303 | |
| SSC buffer 20× concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 |
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