Summary
이것은 후속 proteomic 분석에 대 한 가교 된 chromatin의 순서 특정 캡처에 의존 하는 특정 대상 loci에 새로운 상호 작용 하는 DNA 단백질을 식별 하는 방법. 잠재적인 바인딩 단백질도 세포 수정에 대 한 사전 지식이 요구 된다. 처음에 효 모에 대 한 개발, 기술은 지금 되었습니다 포유류 세포에 대 한 적응.
Abstract
단백질 (HyCCAPP) 기술에 대 한 단백질 chromatin 관련의 교 잡 캡처 효 모에 소설 DNA 단백질 상호 작용을 밝히기 위해 처음 개발 되었다. 분석을 대상 지역에 바인딩된 가능성이 단백질에 대 한 사전 지식 없이도 관심의 대상 영역을 수 있습니다. 이론에서 그러면 관심, 어떤 게놈 영역을 분석 하는 데 사용할 HyCCAPP 그리고 다른 세포 시스템에서 작동 하도록 충분 한 유연성을 제공 합니다. 이 방법은 알려진된 전사 인자, Chromatin Immunoprecipitation (칩) 및 칩 같은 방법에 대 한 더 적합 한 작업의 바인딩 사이트를 공부 하는 것은 아닙니다. HyCCAPP의 힘은 제한 된 DNA 영역을 탐구 하는 능력 또는 그것에 바인딩 단백질에 대 한 지식에 있다. 그것은 편견 (칩 같은 방법에 존재 하는) 단백질 기반 chromatin 농축 항 체를 사용 하 여 도입을 방지 하는 편리한 방법을 수 있습니다. 잠재적으로, HyCCAPP를 진정으로 새로운 DNA 단백질 상호 작용을 밝히기 위해 강력한 도구를 수 있습니다. 날짜 하려면, 기술은 주로 적용 된 효 모 세포 또는 포유류 세포에서 높은 복사 반복 시퀀스. 우리가 구상 하는 강력한 도구가 되었다, HyCCAPP 접근 포유류 세포에서 단일 복사 loci를 효율적으로 캡처를 최적화 해야 합니다. 여기, 선물이 우리의 적응 초기 효 HyCCAPP 프로토콜 인간의 세포 라인을 캡처하고 표시 단일 복사 chromatin 지역이 수정 프로토콜 효율적으로 격리 될 수 있습니다.
Introduction
지난 10 년 동안 많은 수의 샘플, 그리고 놀라운 해상도 다양 한 게놈의 연구를 수 있도록 시퀀싱 기술에 극적인 개선을 보았다. 백과 사전의 DNA 요소 (인코딩) 컨소시엄, 국가 인간 게놈 연구소는 건강의 국가 학회의 주도로 대규모 다 기관 노력 개별 녹음 방송 요인에 대 한 통찰력을 제공 하고있다 그리고 다른 규제 단백질 바인딩할 게놈 상호 작용. 초기 노력 Chromatin immunoprecipitation (칩)에 의해 100 개 이상의 알려진된 DNA 묶는 단백질1에 대 한 평가 특정 DNA 단백질 상호 작용, 특징. 등 DNase 프린팅2 포름알데히드 규제 요소 (시 키)3 의 보조 절연 단백질, 하지만 분명 한 제한으로 작용 하는 게놈의 특정 영역을 찾을 사용 되었습니다 또한 다른 방법에 실험 방법 팬 들은 상호 작용 단백질의 정보를 식별 하지 않습니다. 지난 년 동안 광범위 한 노력에도 불구 하 고 아무 기술 염색 질, 그리고 식별에 단백질 DNA 상호 작용의 포괄적인 특성화 및 정량화 chromatin 관련 단백질의 효율적으로 있도록 떠오르고 있다.
이 필요를 해결 하기 위해 우리는 우리가 Hybridization Capture of Chromatin-Associated 단백질으로 단백질 (HyCCAPP)에 대 한 불리는 새로운 접근 방식을 개발. 처음 개발 된 효 모4,5,6, 접근 가교 된 chromatin 관심 영역 (바인딩된 단백질)와 시퀀스 관련 교 잡 캡처를 사용 하 여 격리 합니다. 단백질-DNA 복합물의 고립, 후 질량 분석 등 접근 관심사의 순서에 바인딩된 단백질의 세트의 특성을 사용할 수 있습니다. 따라서, HyCCAPP 소설 DNA 단백질 상호 작용의 항 체 그리고 그것에 의존 하지 않습니다 의미를 밝히기 위해 바이어스 비 접근은 완전히 찾을 수 있는 단백질에 대 한 불가 지론으로 간주 될 수 있습니다. 다른 방법을 밝히기 소설 DNA 상호 작용 단백질7, 하지만 대부분 칩 같은 방법8,,910, 플라스 미드 삽입11,12,에 의존 하는 능력 13,14또는 높은 복사 번호15지역. 반면, HyCCAPP는 다중 및 단일 복사 영역에 적용할 수 있는 그리고 지역에서 단백질에 대 한 사전 정보는 필요 하지 않습니다. 또한, 일부 방법 중 위는 중요 한 기능, 특히 DNA-단백질 가교 반응, HyCCAPP의 독특한 특징은에 단일 복사 영역에 적용할 수 있습니다 필요를 피하고 수정 되지 않은 셀, 언급 하 고 없이 상 상속 의무적인 단백질, 또는 사용할 수 있는 항 체에 대 한 사전 지식.
이 시점에서, HyCCAPP 효 모4,,56, 다양 한 게놈 지역 분석에 주로 적용 되 고 최근 알파 위성 DNA 반복 영역에에서 단백질 DNA 상호 작용을 분석 하는 데 사용 했다 인간 게놈16. 우리의 지속적인 작업의 일환으로, 우리 처음 효 모 chromatin 인간 세포의 분석에 적용 되 고 현재 여기 단일 복사 대상의 선택적 캡처 수 있도록 수정 된 프로토콜에 대 한 개발 교 잡 캡처 접근을 적응 시켰다 우리의 초기 연구에서 효 모와 유사한 효율성으로 인간 게놈에 있는 영역입니다. 이 새로운 최적화 된 프로토콜 적응 및 질량 분석 또는 다른 분석 접근을 사용 하 여 인간 게놈 전체 DNA 단백질 상호 작용을 심문 기술의 활용 수 있습니다.
그것은 HyCCAPP 메서드를 사용 하면 특정 대상 지역 분석을 위한 게놈 넓은 분석에 적합 하지 않습니다 강조 하는 것이 중요. 기술 영역 상호 작용 단백질에 대 한 부족 한 정보는 거래 할 때 또는 특정 게놈 소재 시에 상호 작용 단백질의 더 포괄적인 심층 분석을 원할 때 특히 유용 하다. HyCCAPP은 DNA 묶는 단백질을 폭로 하지만 정확 하 게 genomic DNA에 특정 단백질 바인딩 사이트 특성을 하지 의미입니다. 현재 구현, 방법론 DNA 바인딩 시퀀스 또는 개별 단백질에 대 한 주제에 대 한 정보를 제공 하지 않습니다. 따라서, 그것은 멋지게 시 키, 같은 기존 기술을 보완 하 고 게놈 지역에 소설 묶는 단백질의 id는 초기 시 키 분석으로 식별 하는 것을 허용할 수 있습니다.
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Protocol
1. 캡처 Oligonucleotide 디자인
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대상 지역/s의 하이브리드 캡처 동안 사용할 oligonucleotides의 패널 디자인.
- 4-8 oligonucleotides 대상 지역, 그러나 최소한 디자인, 하나 이상의 oligonucleotide 대상 영역의 각 끝을 대상으로 디자인을 목표로 합니다.
- 대상 시퀀스는 긴 경우 (> 500의 기본적인 쌍), 전체 대상 지역 chromatin의 효과적인 농축을 최대한 밖으로 보기로 oligonucleotides 디자인.
참고: 우리는 4-8 oligonucleotides와 최적의 캡처 관찰. 이 프로세스는 더 많은 oligonucleotides 잘 사용할 수 있습니다, 하지만 너무 많은 oligonucleotides 사용 하는 경우 농축 수율의 감소를 관찰 하는 것은 드물지 않다.
- 유사한 녹는 온도, oligonucleotides 디자인 하 고는 그들이 하지 강한 헤어핀을 형성 않으며 강한 상호 작용 (고려 내 42 ᵒC에서 실시 될 것입니다)를가지고 있는지 확인 하십시오.
참고: 발 차입 (4.12.3)을 선택 하는 경우는 추가적인 외부 8 기준 시퀀스는 oligonucleotide에 추가 되어야 합니다 그리고 필요 합니다 보완 '릴리스' oligonucleotides 차입17시. 선택 하 고 분석 하는 oligonucleotides 여러 상용 소프트웨어 도구를 사용할 수 있습니다. 25 메 좋은 결과 보이고 있다 그러나 게놈 크기 순서에 따라, 캡처 oligonucleotides 포함 될 수 있습니다 어딘가에 사이 20-80 기지. 일반적으로, 캡처 oligonucleotides 62 ᵒC, 가까운 녹는 온도 하지만 그는 그들의 길이 따라 변경할 수 있습니다. 일관 된 용융 온도 및/또는 캡처 믹스 전체 oligonucleotide 길이 농축에 원치 않는 편견을 방지할 수 있습니다. - 캡처 oligonucleotides는 biotin moiety (선호 캡처 시퀀스에서 공백 구분 함) 3' 끝에와 함께 디자인.
2. 세포 배양
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37 ᵒC와 5% CO2에 인간 lymphoblastoid 셀 (예: GM12878 여기에 표시) 또는 다른 셀 라인 5% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 페니실린-스, 2 mM L-글루타민 보충 RPMI 1640 미디어에서를 성장 한다.
- 시드 초기 RPMI 1640 미디어 2.1에서 준비의 6 mL와 T-25 플라스 크에서 aliquots (2-5 105 셀 x) 냉동입니다.
- 셀 밀도 생존을 모니터링 합니다.
- 대표 셀의 aliquot 고 블루 trypan 같은 적절 한 염료와 얼룩.
- hemocytometer 또는 자동화 된 셀 카운터를 사용 하 여 셀 밀도 측정 합니다.
- 셀에 1 x 106 셀/mL의 조밀도 도달 하면, 전에 5 분 x 100g에 셀 아래로 회전 하 고 2.1에서 준비 RPMI 1640 미디어의 25 mL와 T-75 플라스 크에 세포를 전송. 셀 밀도 접근 1 x 106 셀/mL까지 세포 성장.
- RPMI 1640 미디어 (2.1)의 38 ml T-150 플라스 크에 세포를 전송 추가 2 일에 대 한 셀을 성장 하 고.
참고: Lymphoblastoid 세포 현 탁 액에서 성장. 성장 하는 lymphoblastoid 세포에 대 한 일반 지침 셀 밀도를 0.2-1 x 106 셀/mL 사이 보관 될 것이 좋습니다. 이 기술에 필요한 자료의 큰 양 때문에 현재 프로토콜 고의로 넘어 무엇 일반적으로 사용 되는 셀 밀도 세포 성장에 기록 됩니다. 세포 성장 프로토콜 개정 하 고 적응 사용할 수 세포 유형에 따라 독자 수 있습니다. - 5 분 x 100g에 셀 아래로 회전 RPMI 1640 미디어 (2.1) 10 mL에 셀 resuspend 하 고, 미디어의 500 mL를 포함 하는 850 cm2 롤러 병에 현 탁 액을 부 어. 앞으로 동일한 조건 하에서 세포를 품 어 하지만 시점에서 지속적인 회전 (~0.5 rpm)를 사용 하 여 시작 합니다.
- 세포 성장 모니터링 하 고 미디어 (일반적으로 매 3-4 일) 필요할 때 변경. 2 x 106 셀/mL (총에서 1 x 109 셀)에 최대한 가까이 밀도 성장 세포를 하자.
- 원하는 셀 수에 도달 하면 5 분 동안 100 x g에 아래로 셀을 회전 시켜 세포를 수확 하 고 RPMI 1640 미디어 (2.1)의 36 ml 셀 resuspend. 50 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 전송. 셀 계산 및 DNA 추출을 위한 작은 aliquots를 가져가 라.
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1%의 최종 농도 도달 Crosslink 37% 포름알데히드의 1 mL을 추가 하 여.
주의: 포름알데히드는 발암 물질 이며, 증기 두건에서 처리 되어야 합니다.- 회전 셀을 품 어 (~ 30-60 rpm) 실 온 (RT)에서 10 분.
- 125 mM의 최종 농도 대 한 2.5 M 글리신 솔루션의 2 개 mL를 추가 하 여 crosslink 반응을 끄다.
- 회전 셀을 품 어 (~ 30-60 rpm) 실시간에서 5 분 5 분 동안 100 x g에서 centrifuging 여 셀을 펠 렛 및 얼음 감기 1 x PBS로 두 번 셀을 세척.
- 계속 해 서 다음 단계 또는 세포 세포의 용 해 버퍼 (5 mM Hepes, 85 m m KCl, 0.5 %Igepal, protease 억제제 (PI)) 5 mL에 펠 릿을 resuspend 스냅-동결 정지 액체 질소에 의해 드롭. -80 ᵒC에서 샘플을 저장 합니다.
참고: 준비 > 25 mL Igepal 및 PI 없이 세포 세포의 용 해 버퍼의 그 시 약 신선한 때 사용할 준비가 추가. Igepal 및 PI 추가 되었습니다 일단 세포 세포의 용 해 버퍼의 장기 저장을 하지 마십시오. 최대 3 개월까지 4 ᵒC에서 세포 세포의 용 해 버퍼를 저장 합니다. Igepal 비, 비 변성 시키기 세제입니다. NP-40 Igepal 안으로 잠재적으로 사용 될 수 있지만 우리가 그것을 사용 하지이 샘플은 결국 DNA 의무적인 단백질을 특성화 하는 질량 분석에 의해 분석 하면 NP-40은 권장 하지 않습니다.
3. 세포 및 전단
- 준비 > 핵 세포의 용 해 버퍼 (10 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8.0, 1 %SDS, PI)의 15 mL.
참고: 추가 PI 사용 될 금액을 신선한. PI를 추가 핵 세포의 용 해 버퍼의 장기 저장을 하지 마십시오. 핵 세포의 용 해 버퍼 최대 1 개월 RT에 저장할 수 있습니다. - 세포 세포의 용 해 버퍼 (Igepal, PI 포함) 20 mL에 펠 릿을 resuspend. 잘 한 번 해 동 얼음에 녹여와 섞어 알 약에 하자. 샘플 얼음에 추가 10 분 동안 앉아 보자. 4 ᵒC 5 분 동안에 400 x g에서 셀 원심
- 상쾌한 무시 하 고 PI와 핵 세포의 용 해 버퍼의 6 mL에 셀 resuspend (볼륨 증가 될 수 있다 경우에 세포는 현 탁 액을 형성 하지 않는다).
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쥡니다 위한 준비, 분할 ~ 6-8에 균등 하 게 샘플 microfuge 관 (각 관에 대 한 1000 600 µ L).
- 얼음 이나 차가운 랙에 샘플을 놓고는 sonicator는 microtip을 사용 하 여 샘플을 sonicate. 5 x 20 s 일정 한 필요, 적어도 40에 대 한 진정 서 스 펜 션 수 65% 진폭을 사용 하 여 펄스 사이 s.
참고: 볼륨이 증가 하는 경우 > 샘플, 세포를 냉각 하는 유리 당 10 mL 대신 사용할 수 있습니다. 점점 더 이상 파열을 해야 할 것 이다 다음. Sonicators는 크게 다릅니다. 조건은 독자에 의해 최적화 할 수 있습니다. 다른 쥡니다 대안 뿐만 사용할 수 있습니다.
- 얼음 이나 차가운 랙에 샘플을 놓고는 sonicator는 microtip을 사용 하 여 샘플을 sonicate. 5 x 20 s 일정 한 필요, 적어도 40에 대 한 진정 서 스 펜 션 수 65% 진폭을 사용 하 여 펄스 사이 s.
- 12000 x g 4 ᵒC에서 10 분 동안에 세포를 원심, 새로운 튜브에는 상쾌한을 전송 하 고 알 약을 삭제.
- Fluorometric 메서드를 사용 하 여 전체 복구를 예상 하고있다.
- 계속 해 서 다음 단계 또는 스냅-동결-80 ᵒC에서 샘플을 저장할.
- 선택 사항: 0.3 M NaCl에 67 ᵒC에서 하룻밤 배양 하 여 aliquot, crosslinks을 가져가 라. DNA를 깨끗 하 고 조각 길이 결정 하는 Bioanalyzer에 그것을 실행. 파편의 대부분은 500 그리고 1000 bp 사이 이어야 한다.
참고: 그것은 시점에서 중지 하 고-80 ᵒC에서 샘플을 저장 하려면 확인입니다.
4. 교 잡 캡처
- 교 잡 (Hyb) 버퍼 x 2의 500 mL를 준비 (200mm MES, 2 M NaCl, 40 mM EDTA, 0.02% 트윈-20) 워시 버퍼 (200 m m NaCl, 0.2 %SDS, 50 mM Tris pH 8)의 500 ml. 저장 Hyb 및 워시 버퍼 4 ᵒC 및 실 온에서 각각 최대 3 개월까지 합니다. 교 잡 버퍼 x 1을 준비 하는 2 x Hyb 버퍼의 절반을 사용 합니다. 또한 최대 3 개월까지 4 ᵒC에 저장할.
참고: 교 잡 캡처의 전체 볼륨은 이전 단계에서 결과 샘플의 볼륨을 두 번 있을 것입니다 (지금까지 설명 된 대로 샘플 볼륨 약 6 mL 것과 따라서 총 교 잡 볼륨 12 mL 것). - 따로 설정 구슬 총 교 잡 캡처 볼륨 (이 경우 600 µ L)의 5%. 적절 하 고 적합 한 자석 구슬 다음 단계에 함께 작동 하도록 필요 합니다.
- 워시 세 번 Hyb 버퍼 두 번 구슬 볼륨 (1200 µ L)를 사용 하 여 x 1와 구슬. 2x Hyb 버퍼의 1200 µ L에 구슬 resuspend. 해결 될 때까지 자석에 튜브를 배치 하 고 버퍼를 제거.
- 1.5 mL 튜브 당 샘플의 700 µ L의 최대 microfuge 관 전 개간 반응을 수행 합니다. 충분 한 구슬 (5%)와 2 배 희석 (10 튜브 샘플의 600 µ L, 씻어 구슬 Hyb 버퍼, x 2에 resuspended의 120 µ L와 Hyb 버퍼 x 2의 480 µ L) x 1 Hyb 버퍼 Hyb 버퍼 추가 합니다. 최종 회전 이상 끝 31 ᵒC에서 10 분 동안 그들을 품 어 (~ 30-60 rpm).
- 구슬 움직일 수는 새로운 관에 샘플을 전송 때까지 자석에 튜브를 놓습니다. 비즈를 삭제 합니다.
참고:이 시점에서 앞으로, 낮은 바인딩 튜브는 권장 됩니다. - 10 pmol / µ L의 작업 솔루션을 캡처 oligonucleotides resuspend 고 각 관에이 솔루션의 4 µ L를 추가 합니다.
참고: 다른 지역, 서로 대 한 제어 역할을 할 수 있지만 진정한 부정적인 제어 역할을 발진의 시퀀스 캡처 oligonucleotide를 포함 하는 것이 좋습니다. - 마지막 회전에 엔드와 42 ᵒC에서 40 분 동안 튜브를 품 어 (~ 30-60 rpm).
- 부 화, 동안 필요한 구슬 (0.3 µ L/캡처 oligonucleotide의 pmol) 제쳐 설정 합니다. 4.3, 단계에서 설명한 대로 구슬 세 번 씻어 하지만 Hyb 버퍼 x 1에 있는 셀을 resuspend.
- 씻어 구슬 샘플을 추가 하 고 최종 회전 이상의 끝에서 RT 30 분 샘플을 품 어 (~ 30-60 rpm). 자석에 튜브를 놓고 일단 구슬이 움직일 수 있는 상쾌한을 제거 합니다.
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구슬 세척
- 워시 버퍼의 1.2 mL을 추가 하 고 최종 회전 동안 끝 5 분에 대 한 샘플을 품 어 (~ 30-60 rpm) 자석 및 대기에 실시간 장소 튜브에서 솔루션까지 최소 몇 지웁니다. 버퍼를 제거 하 고이 단계를 반복 합니다.
- 워시 버퍼의 1.2 mL을 추가 하 고 최종 회전 이상 끝 1 h 품 어 (~ 30-60 rpm) 실시간에 튜브 자석에 놓고 솔루션 지웁니다 때까지 몇 분을 기다립니다. 버퍼를 제거 하 고 2 시간 30 분에 부 화 시간을 단축 하는이 단계를 반복 합니다.
- 워시 버퍼의 200 µ L을 추가 하 고 최종 회전 이상 끝 15 분 동안 품 어 (~ 30-60 rpm) 31 ᵒC에서. 자석에 튜브를 놓고 솔루션 클리어까지 몇 분 기다려야 합니다. 버퍼를 분리 합니다.
- PBS의 200 µ L을 추가 하 고 최종 회전 동안 끝 5 분 동안 품 어 (~ 30-60 rpm) 실시간에 튜브 자석에 놓고 솔루션 지웁니다 때까지 몇 분을 기다립니다. 버퍼를 제거 하 고이 단계를 반복 합니다.
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간단한 차입
- 구슬에 분자 학년 물 40 µ L을 추가 하 고 5 분 동안 94 ᵒC에서 품 어.
- 자석에 튜브를 놓고 몇 분 해결 될 때까지 기다립니다.
- 새로운 관으로는 상쾌한을 전송 합니다. 비즈를 삭제 합니다.
- Proteomic 분석 하십시오 또는-80 ᵒC에서 샘플을 저장할.
참고:이 유형의 차입 작품 나중 정량 분석 및 일부 단백질 측정을 위해 잘 하지만 다른 경우에 항복 "청소기" 있다 아래에 설명 된 두 가지 대체 방법을.
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DNase 차입입니다.
- 각 튜브를 DNase 버퍼 x 1과 DNase의 U 2의 40 µ L를 추가 합니다.
- 37 ᵒC에 15 분 동안 튜브를 품 어.
- 자석에 튜브를 놓고 해결 될 때까지 몇 분 기다려야 합니다.
- 구슬에서 eluted 샘플을 제거 하 고 새로운 낮은 바인딩 튜브에서 샘플을 배치.
- 효소를 비활성화 및 proteomic 분석 진행 7 분 94 ᵒC에서 튜브를 품 어.
참고: 낮은 DNase 농도 간섭 proteomic 분석 관찰 되는 경우 사용할 수 있습니다. 그것은이 차입 메서드 DNase 치료 샘플에서 DNA 자료를 완전히 파괴 이후 사용 하는 경우 캡처 풍부 정량 계산 가능한 되지 않습니다. - Proteomic 분석 하십시오 또는-80 ᵒC에서 샘플을 저장할.
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발 차입17.
참고:이 메서드는 권장 되지 않습니다 오래 oligonucleotides (> 40 기지). 이 방법은 게놈 시퀀스와 오버랩 되지 않는 한 추가 8 기지를 포함 하는 캡처 oligonucleotides 및 보완 자료 oligonucleotides 캡처 oligonucleotides에서 대상을 제거 하려면 필요 합니다.- SSC 버퍼의 40 µ L에서 릴리스 oligonucleotides의 2 nanomoles 희석.
- 실시간에서 20 분 동안 품 어
- 자석에 튜브를 놓고 몇 분 해결 될 때까지 기다립니다.
- 구슬에서 솔루션을 제거 합니다.
- Proteomic 분석 하십시오 또는-80 ᵒC에서 샘플을 저장할.
5. 평가 대상 캡처 영역의 관심에 대 한 뇌관으로 정량 하 여 항복 캡처
- 적절 한 소프트웨어 또는 온라인 도구를 사용 하 여 뇌관 및 대상 지역에 대 한 프로브 디자인.
참고:이 실험에서 DUSP3 및 DUSP5 의 발기인 지역 대상으로 했다. 뇌관 및 프로브 사용 되는 다음입니다. DUSP3: 뇌관 1-GTG TTT AGG TTC CCT GAT CC, 뇌관 2-CGG AAT GTC TGC CTT CG, FAM 표시 된 프로브-TCC ATG CCC GAA TTG TGA CGT CGG; DUSP5: 뇌관 1-TGA GAA AGC CCT GAT GTG TC, 뇌관 2-GCC TTC AGA AAC CCC AAA AG, FAM 표시 된 프로브 TGC ATT 태그 AGC AGC CAG ATG AGG TT. - Eluate (10 개 이상 µ L)의 약 수를가지고 고 희석 1:10 분자 학년 H2o.
- 2.1.7 단계에서 aliquots의 한의 DNA를 추출 하 고 그 DNA 샘플 5 직렬 1:10 희석 분자에 H2o. 학년을 수행 하 여 표준 곡선을 사용 하 여
- 정량 마스터 믹스 (다양 한 상업 대안) 준비, 뇌관 및 프로브를 추가 하 고 적절 한 금액 (15 µ L 20 µ L 반응을 실행 하는 경우)에 각 잘 분배.
- 추가 5 µ L의: a) 희석 샘플, b)는 표준 곡선 또는 c) 분자 급료 H2O (템플릿 제어 역할)을 각 잘 하.
- 접시를 밀봉 하 고 1 분 동안 100 x g에서 원심.
- 다음 매개 변수는 정량 시스템에서 실행: 95 ᵒC에서 5 분 뒤에 20 95 ᵒC의 40 주기 s, 20 59 ᵒC s 및 25 72 ᵒC s.
- 엉덩이 수율과 뒤섞여 캡처를 표준 곡선을 사용 하 여 캡처 특이성 평가.
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Representative Results
때문에 성공 하려면 HyCCAPP chromatin의 대용량 입력된에 대 한 필요성, 세포 confluency의 상대적으로 높은 수준에 성장 된다. Trypan 세포 사망률은 보통 확인 하는 데 사용은 블루 얼룩 (< 10%). 단일 복사본 실험, chromatin 콘텐츠 교 잡 캡처 해야 femtomolar 범위에서 이전에 보통 시작 물자로 적어도 109 셀을 필요 합니다. 전체 규모 실험, 이전에 더 작은 일괄 처리 캡처 oligonucleotide 성능을 테스트 하는 것이 좋습니다. 교 잡 캡처 oligonucleotides의 적정을 사용 하 여 그림 1에 표시 됩니다. 캡처 oligonucleotides의 수는 총 농도 일정 하 게 유지 하는 동안에 점차적으로 증가 했다. 이 실험은 명확 하 게 세 가지 주요 측면을 보여준다. 첫째, 그것은 얼마나 많은 oligonucleotides 최적의 (및 극대) 교 잡 효율에 도달 하는 데 필요한 그 특정 지역에 대 한 결정에 도움이 됩니다. 둘째, oligonucleotides의 특정 집합 사이 어떤 명백한 해로운 상호 작용 되는지 보여준다. 마지막으로, 그것은 경우에 상당한 양의 배경 (이 경우에 게놈에 다른 영역을 대상으로 한 뇌관으로 정량 분석에 의해 측정) 수행으로 가난한 어떤 oligonucleotides 보여줍니다.
캡처 교 잡 수익률 chromatin 샘플의 교차 연결 된 특성으로 인해 겸손 표시 됩니다. 가교 된 chromatin에서 파편의 큰 비율 교 잡 캡처 받을 수 없습니다. 직렬 교 잡 실험 입증이 (그림 2). 교 잡 캡처 성공적으로 실행 하는 경우 캡처 oligonucleotides의 다른 세트를 사용 하 여 동일한 chromatin 소재의 후속 캡처 실험 때 신선한 chromatin (~ 11%에 낮은 사용 하 여 보다 비교 (약간 낮은) 수확량 귀 착될 것 이다 평균)입니다. 하지만 수익률 확인 하는 대부분의 약 90% 줄어 같은 지역 첫 번째 캡처 실험 후 chromatin 샘플 잔여 사용 하 여 두 번째 캡처 실험에서 oligonucleotides의 동일한 세트와 함께 다시 대상, 하는 경우는 교 잡 의무가 소재를 점령 했다. 캡처에서 이러한 감소 oligonucleotides의 동일한 집합을 가진 후속 캡처 후 나타나지 않으면, 그것은 교 잡 캡처 단계에서 기술적인 문제를 나타냅니다.
효 모 같은 간단한 시스템에서 우리는 효 모는 다른 조건 하에서 성장 될 때 캡처 효율 45, 9 단백질의 id에 차동 주도 접근 2 지역에서 농축 관찰. 그러나 인간 세포에, 게놈 ~ 250 번 효 모, 보다 큰 데 교 잡 수익률은 일반적으로 1% (그림 3). 그림 3 에서 알 수 있듯이, 단일 실험 proteomics 분석에 대 한 부족 금액을 생성할 수 있습니다. 이 경우, 여러 캡처된 샘플 후속 질량 분석 분석을 수행 하려면 풀링 될 해야 합니다. 또는 캡처된 대상 지역 chromatin의 낮은 농도 서쪽에 게 더 럽 히기 등 질량 분석 기반 선택된 반응 분석 모니터링 대상된 분석 접근에 대 한 사용할 수 있습니다.
그림 1: 상자 플롯 표현의 캡처 oligonucleotide 적정. 캡처 oligonucleotides 테스트 되었고 정량 분석의 수를 증가. 배경 게놈에 있는 다른 영역을 대상으로 정량 분석을 말합니다. 값은 단일 oligonucleotide를 사용 하 여 교 잡 캡처에서 배 변경 되 게 됩니다. 수염은 최소 및 최대 값을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 직렬 캡처의 박스 플롯 표현. 순차적 교 잡 캡처 oligonucleotides (A_A)의 동일한 집합을 가진 순차 교 잡에 비해 농축에 강한 드롭 캡처 oligonucleotides (A_B)의 다른 세트를 사용 하 여 표시 (p = 3.88 e-5). 농축 정량에 의해 측정 되 고 캡처 신선한 chromatin를 사용 하 여 상대 값 표시 됩니다. 수염은 최소 및 최대 값을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 인간 세포를 사용 하 여 교 잡 캡처. 교 잡 지역의 다른 염색체에 위치 하 고 캡처합니다. 각 지역 다른 부정적인 제어로 제공합니다. 또한, 교 잡 캡처 진정한 부정적인 컨트롤로 스크램블된 (Scr) 시퀀스를 사용 하 여 수행 됩니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기서 설명 하는 HyCCAPP 메서드는 그것에 게 밝히기 애매 남아 것 이다 DNA 상호 작용 하는 강력한 접근 방식을 많은 독특한 기능이 있습니다. 과정의 성격 HyCCAPP 다른 유기 체와 게놈의 지역에서 작동 하도록 유연성을 제공 합니다. 그러나 그것은 방법,, 그는 몇 가지 제한이 간주.
HyCCAPP 일차 전지, 세포 배양 시스템, 또는 심지어 조직 샘플에서 잠재적으로 적용할 수 있도록 셀 수정 방지 하는 방법입니다. 그러나 그 때문에,, 그것은 요구 한다 가교 화, proteomic 분석에서 감도 감소 하 고 따라서 입력된 대용량을 필요로 하는 샘플을. CRISPR 및 주변 가교 반응12,13,,1418없이 작동할 수 있는 단백질의 biotinylation에 의존 하는 방법 등장 하고있다. 플라스 미드 삽입 제약 조건을 나타내지 않는 세포 배양 시스템 에서만 사용할 수 있는 경우 이러한 접근은 매우 강력한 될 수 있습니다. 다른 접근은 협회 chromatin 상태 또는 특정 녹음 방송 요인의 존재 기반으로 하지만 개별 loci9,10,19 공부 하는 의미가 없습니다 일반 단백질을 식별 하는 매우 적합 .
HyCCAPP 접근 광범위 한 적용으로 다른 접근을 선물 하지만 그것은 가능성이 다른 세포 시스템에서 해당 응용 프로그램 또는 유기 체 최적화가 필요 합니다. 접근 방법에서 가장 중요 한 최적화 단계 설계 및 캡처 oligonucleotides의 선택을 포함 한다. 일련의 작은 규모 테스트 설계 oligonucleotides 적절 한 경우와 지역에 시퀀스 캡처 효과적으로 표시 합니다. 여러 요인이 고려 되어야 할 때 설계 및 테스트 캡처 oligonucleotides oligonucleotide 길이, 대상 지역 및 oligonucleotides 집합 간의 상호 작용 특이성의 정도 등 사용할 수 있습니다. 대상 지역에 특정 정량 분석 결과 사용 하 여 이러한 모든 상호이 작용을 쉽게 테스트할 수 있습니다. 원하는 경우 결과 DNA 파편을 시퀀싱 하 고 전체 게놈5에 걸쳐 농축의 특이성은 만족 하는 칩 Seq 같은 워크플로 사용할 수 있습니다.
마지막으로, 가교 조건은 또한 HyCCAPP 절차에서 매우 중요 하 고 우리가 다른 시스템, 반면 1% 포름알데히드와 cross-linking에 의해 인간의 세포에서 최상의 결과 얻기의 눈에 띄는 차이 관찰 해야 효 모에 3% 포름알데히드와 cross-linking 재현성 결과 더 나왔고. 그것은 가능한 인간의 세포는 더 복잡 한 염색 질 구조에 3% 포름알데히드와 더 강렬한 cross-linking 캡처 oligonucleotides 교 잡에 대 한 충분 한 접근성 제공 하지 않습니다. 그것은 또한 생각할 수는 효 모 세포 벽의 존재는 세포로 포름알데히드는 chromatin에서 성공적인 가교 레벨에 필요한 양을 증가 포름알데히드 액세스를 방해.
칩 및 가교 된 인간의 chromatin 타겟팅 다른 캡처 방법을 수행, 우리는 관찰 대상 DNA의 약 1%를 캡처할 수 있다 실제로. 대부분의 DNA 기반 접근 및 분석에 대 한 제한 하는 요인이 아니다. 그러나, 칩, 어디 최종 판독 amplifiable DNA 기반, 달리 HyCCAPP 최종 판독에 대 한 단백질 함량에 의존 합니다. 이 본질적인 제한으로 인해 많은 양의 입력된 자료 (여기에 제시 된 실험에서 경작된 한 세포)는 필요:이 제한 단일 복사 영역에 적용 하는 경우에 특히이 방법론을 탐험 하기 전에 주의깊게 고려 되어야 한다. 모든 시스템 필요, 셀의 수를 생산할 수 있을 것 이다 또는 성장 하는 필요한 핸드폰 번호의 비용 금지 될 수도 있습니다. HyCCAPP (~ 109 셀)에서는 입력된 금액은 입력 금액 10 까지인 가교 된 재료에 의존 하는 다른 방법에 비해8 및 1011 셀9,,1115. HyCCAPP 기술의 미래 수정이이 방법 더 광범위 하 게 적용할 수 있도록 대상 영역의 복사본 수를 인위적으로 증가 접근을 모색할 것입니다. 같은 시간에 우리는 질량 분석에 지속적인 발전과 함께 입력된 금액을 감소 해야 하는 프로세스의 전반적인 효율성 증가 필요 하 고이 기술을 가능한 더 많은 시스템에 계속 작동 합니다.
CRISPR를 사용 하 여 Biotinylation 기반으로 접근, enCHiP18 와 같은 다른13,14, 나타났습니다 가교 된 재료의 필요성을 제거, 수율을 입력으로 크게 줄이는 매우 효과적인 것으로 요구 사항입니다. 그러나 이러한 방법에서 세포의 정교한 처리, 조직 샘플을 적용 하려면 이러한 기법을 허용 하지 않습니다, 그리고 우리 HyCCAPP, 그리고 그와 함께 추구 하기 시작 했습니다 방향은 유망한 결과 생산 하 고 있다.
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Disclosures
공개 관심의 없습니다 충돌을 확인 하 고 있습니다.
Acknowledgments
이 작품 NIH 교부 금 P50HG004952와 모에 R01GM109099에 의해 지원 되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PrimerQuest tool | IDT | ||
| OligoAnalyzer 3.1 | IDT | Analyze capture oligonucleotids | |
| PairFold | UBC | Analyze interactions | |
| RPMI 1640 media | Thermo Fisher | 11875093 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 26140079 | |
| Countess automated cell counter | Thermo Fisher | ||
| 850 cm2 roller bottle | Greiner Bio-one | 680058 | |
| Roller system | Wheaton | 22-288-525 | |
| 37 % formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | ||
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I3021 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P4380 | |
| HEPES | Thermo Fisher | 15630080 | |
| Branson digital sonifier SFX 150 | Emerson | ||
| Qubit 3.0 fluorometer | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA BR assay kit | Thermo Fisher | Q32850 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | ||
| Agilent DNA 1000 kit | Agilent | 5067-1504 | |
| MES sodium salt | Sigma-Aldrich | M3885 | |
| NaCl 5M | Thermo Fisher | AM9760G | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ||
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher | 12321D | |
| DynaMag-15 magnet | Thermo Fisher | 12301D | |
| Dynabeads M-280 atreptavidin | Thermo Fisher | 60210 | |
| Low binding tubes | Eppendorf | 22431081 | |
| Hybridization oven | SciGene | ||
| Tube shaker and rotator | Thermo Fisher | 415110Q | |
| DNase I (RNase-free) | New England BioLabs | M0303 | |
| SSC buffer 20× concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 |
References
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