Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Genetics

Адаптация гибридизации захвата Chromatin связанных белков для протеомики в клетках млекопитающих

doi: 10.3791/57140 Published: June 1, 2018

Summary

Это метод для выявления роман белков, ДНК взаимодействия в конкретных локусов, полагаясь на захват последовательности конкретных высокоструктурированные chromatin для последующих протеомного анализа. Без предварительных знаний о потенциальных связывания белков, ни ячейку изменения являются обязательными. Изначально разработанный для дрожжей, технология теперь была адаптирована для клеток млекопитающих.

Abstract

Захват гибридизации хроматина связанных белков для протеомики (HyCCAPP) технологии был первоначально разработан раскрыть Роман ДНК белковых взаимодействий в дрожжей. Это позволяет проводить анализ целевого региона интерес без необходимости предварительного знания о вероятно белки, привязан к целевой области. Это, в теории, позволяет HyCCAPP использоваться для анализа любого геномной региона интерес, и она обеспечивает достаточную гибкость для работы в различных клеточных системах. Этот метод не предназначен для изучения привязки сайтов известных транскрипционных факторов, задач лучше подходит для иммунопреципитации Chromatin (обломока) и чип подобных методов. HyCCAPP сила в его способность исследовать ДНК регионов, для которых ограничено или нет знаний о связанных с ним белков. Она также может быть удобный метод, чтобы избежать смещения (присутствует в чип как методы) введены на основе белка хроматина обогащения с использованием антител. Потенциально HyCCAPP может быть мощным инструментом для выявления действительно Роман ДНК белковых взаимодействий. На сегодняшний день технология преимущественно применяется для дрожжевых клеток или высокой копии повторения последовательностей в mammalian клетках. Для того чтобы стать мощным инструментом, который мы видим, HyCCAPP подходы должны быть оптимизированы для эффективного захвата поштучными локусов в mammalian клетках. Здесь мы представляем наши адаптации первоначального дрожжей HyCCAPP захватить протокол для линий клеток человека и показать, что поштучными хроматина регионы могут быть эффективно изолированы с этого измененного Протокола.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

В течение последнего десятилетия произошло резкое улучшение в последовательности технологий, позволяя изучение широкого круга геномов в большом количестве образцов и с удивительной резолюцией. Консорциум Энциклопедия элементов ДНК (кодирования), крупномасштабные межучрежденческие усилия под руководством национального человеческого генома научно-исследовательского института национальных институтов здравоохранения, предоставил понимание как отдельные факторы транскрипции и других регуляторных белков связывать и взаимодействовать с геном. Первоначальные усилия охарактеризовал конкретные ДНК белковых взаимодействий, как оцениваются иммунопреципитации Chromatin (обломока) для более чем 100 известных ДНК связывающих белков1. Альтернативные методы, такие как footprinting DNase2 и формальдегида помощь изоляции регуляторных элементов (ФЭР)3 также были использованы для обнаружения конкретных областей генома, взаимодействующих с белками, но с очевидным ограничением, Эти экспериментальные подходы не идентифицируют взаимодействуя белками. Несмотря на обширные усилия за последние годы технология не возникло, эффективно позволяет всеобъемлющего квалификация взаимодействий протеин дна хроматина, и идентификации и количественного определения связанных хроматина белков.

Для удовлетворения этой потребности, мы разработали новый подход, который мы назвать Hybridization Capture of Chromatin-Associated белки для протеомики (HyCCAPP). Изначально разработанный в дрожжи4,5,6, подход изолирует высокоструктурированные хроматина регионы интереса (с связанных белков) с помощью захвата последовательности конкретных гибридизации. После изоляции ДНК белковых комплексов подходы, как масс-спектрометрии может использоваться для характеристики набор белков, обязан последовательность интереса. Таким образом HyCCAPP может рассматриваться как беспристрастного подхода к раскрыть Роман ДНК белковых взаимодействий, в том смысле, что она не полагаться на антитела и он полностью агностиком о белки, которые могут быть найдены. Существуют другие подходы способны раскрыть Роман ДНК взаимодействуют белки7, но наиболее полагаться на чип как методы8,9,10, плазмида вставки11,12, 13,14, или регионов с высоким копировать номера15. В противоположность этому HyCCAPP может быть применен к мульти - и поштучными регионов, и она не требует никакой предварительной информации о белки в регионе. Кроме того, в то время как некоторые из методов упоминалось выше есть ценные функции, в частности избегая необходимости для ДНК белковых реакций сшивки, уникальной особенностью HyCCAPP является, что он может применяться к одной копии регионов в неизмененной клетки и без каких-либо предварительных знаний о предполагаемого связывания белков, или доступные антител.

На данный момент HyCCAPP преимущественно был применен к анализу различных регионах геномной дрожжи4,5,6и недавно был использован для анализа ДНК белковых взаимодействий в альфа спутник ДНК, повторите региона в геноме человека16. Как часть нашей текущей работы мы адаптировали подход захвата гибридизации, изначально разработанный для дрожжей хроматина применяться для анализа клеток человека, и здесь представить измененный Протокол, который позволяет селективного захват одной копии целевой регионы в геноме человека с эффективность похож на наши первоначальные исследования в дрожжей. Этот новый оптимизированный протокол теперь позволяет адаптации и использования технологии допросить взаимодействий протеин дна через генома человека, с помощью масс-спектрометрии или другие аналитические подходы.

Важно подчеркнуть, что метод HyCCAPP предназначен для анализа конкретных целевых областей и пока не подходит для анализа генома широкий. Эта технология особенно полезна при работе с регионами, для которых есть скудные сведения о взаимодействуя белками, или когда требуется более полный углубленный анализ взаимодействия белков в локусе конкретным геном. HyCCAPP предназначен для выявления ДНК связывающих белков, но не точно характеризуют сайтов связывания определенных белков в геномной ДНК. В своей текущей реализации методологии не предоставляют информацию о последовательности ДНК привязки или мотивы для индивидуальных белков. Таким образом он красиво дополняет существующие технологии, такие как FAIRE и может позволить выявление Роман связывания белков в регионах геномной выявленные первоначальный анализ FAIRE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. захват олигонуклеотида дизайн

  1. Дизайн группа олигонуклеотиды для использования во время захвата гибридизации целевого региона заключет.
    1. Направлены на дизайн 4 – 8 олигонуклеотиды каждого целевого региона, но как минимум, Дизайн по крайней мере один олигонуклеотида, на каждом конце целевого региона.
    2. Если длинные последовательности целевых объектов (> 500 пар оснований), Дизайн олигонуклеотиды как распространение как можно скорее обеспечить эффективное обогащение chromatin во всей целевой области.
      Примечание: Мы заметили, что оптимальный захватывает с 4 – 8 олигонуклеотидов. Несмотря на то, что этот процесс может хорошо работать с более олигонуклеотиды, это не редкость, чтобы наблюдать уменьшение урожайности обогащения, когда используется слишком много олигонуклеотиды.
  2. Дизайн олигонуклеотиды с аналогичными температуры плавления и убедитесь, что они не образуют сильное шпильки не имеют сильных взаимодействий (принимая во внимание, что гибридизациях будет осуществляться на 42 ᵒC).
    Примечание: Если зацепки элюции выбирается (4.12.3), дополнительных внешних 8 базовой последовательности должны быть добавлены к олигонуклеотида и потребует дополнительных «релиз» олигонуклеотиды во время элюции17. Ряд коммерческих программных средств может использоваться для выбора и анализа олигонуклеотиды. 25 РВК показали хорошие результаты, но в зависимости от размера генома и последовательности, захват олигонуклеотиды может содержать где-то между 20-80 баз. Как правило захват олигонуклеотиды имеют температуру плавления около 62 ᵒC, но это можно изменить в зависимости от их длины. Постоянной температуры плавления и/или олигонуклеотида длина всей смеси захват может помочь избежать нежелательных предубеждения в обогащения.
  3. Дизайн захват олигонуклеотиды с остаток биотина (предпочтительно разделенных прокладку из последовательности записи) на конце 3'.

2. клеточная культура

  1. Расти человеческого лимфобластоидных клеток (например, GM12878, показанный здесь) или других клеточных линий в СМИ RPMI 1640, дополненная пенициллин стрептомицина 1%, 2 мм L-глютамина и 5% плода бычьим сывороточным (ФБС), 37 ᵒC и 5% CO2.
    1. Семя первоначальный замороженные аликвоты (2 – 5 x 105 клеток) в T-25 колбу с 6 мл RPMI 1640 СМИ, подготовленный в 2.1.
    2. Контролировать плотность клеток и жизнеспособности.
      1. Возьмите представитель аликвота клеток и пачкает их соответствующей краской, например Трипановый синий.
      2. Измерьте плотность клеток с помощью Горяева или счетчик автоматизированных клеток.
    3. Прежде чем клетки достигнет плотность 1 х 106 клеток/мл, спина клетки вниз на 100 g x 5 мин и передать в T-75 колбу с 25 мл RPMI 1640 СМИ, подготовленный в 2.1 клетки. Рост клеток, пока плотность клеток подходы 1 х 106 клеток/мл.
    4. Передать в T-150 колбу в 38 мл RPMI 1640 СМИ (2.1) клетки и расти ячейки для еще двух дней.
      Примечание: Растут лимфобластоидных клеток в суспензии. Общие руководящие принципы для выращивания лимфобластоидных клеток рекомендуем плотности клеток, чтобы находиться между 0,2-1 х 106 клеток/мл. Из-за большого объема материалов, необходимых в этой технологии настоящий Протокол намеренно записывается вырастить клетки плотность ячеек за пределами того, что обычно используется. Протоколы клетки роста могут быть пересмотрены и адаптированы читателя в зависимости от типов клеток, которые будут использоваться.
    5. Спина клетки вниз на 100 g x 5 мин, Ресуспензируйте клетки в 10 мл RPMI 1640 СМИ (2.1) и залить подвеска в 850 cm2 ролика флакон, содержащий 500 мл средств массовой информации. Инкубировать клетки на тех же условиях, как и раньше, но на данный момент начать использовать постоянное вращение (~0.5 об/мин).
    6. Контролировать рост клеток и изменить СМИ при необходимости (обычно каждые 3 – 4 дня). Пусть клетки вырасти плотностью как можно ближе к 2 х 106 клеток/мл (1 х 109 клеток в общей сложности).
    7. При достижении желаемого клеток количество урожая клетки, вращая клетки вниз на 100 x g 5 мин и Ресуспензируйте клетки в 36 мл RPMI 1640 СМИ (2.1). Суспензию клеток передавать 50 мл Конические трубки. Возьмите небольшой аликвоты для подсчета клеток и экстракции ДНК.
  2. Crosslink, добавив 1 мл 37% формальдегида для достижения окончательного концентрации 1%.
    Предупреждение: Формальдегид является канцерогеном и должны быть обработаны в зонта.
    1. Инкубировать клетки с вращением (~ 30-60 об/мин) для 10 мин при комнатной температуре (RT).
    2. Утолите crosslink реакции, добавив 2 мл 2,5 М глицин раствора, для окончательного концентрации 125 мм.
    3. Инкубировать клетки с вращением (~ 30-60 об/мин) за 5 мин на RT. Пелле клетки центрифугированием при 100 x g 5 минут и промыть клетки дважды с лед холодной ПБС.
  3. Продолжайте следующий шаг или Ресуспензируйте гранулы в 5 мл буфера Lysis клетки (5 мм Hepes, 85 мм KCl, 0,5% Igepal, ингибиторы протеазы (ИП)) и оснастки заморозить подвеска по капле в жидком азоте. Хранение образцов-80 ᵒC.
    Примечание: Подготовьте > 25 мл буфера Lysis клетки без Igepal и PI и добавить эти реагенты свежие, когда готов к использованию. Избегайте длительного хранения буфера Lysis клетки, после Igepal и PI были добавлены. Буфер Lysis клетки магазин на 4 ᵒC на срок до 3 месяцев. Igepal является неионогенных, не денатурации моющего средства. NP-40 потенциально может использоваться как альтернатива Igepal, но мы не использовали его в этом контексте как NP-40 не рекомендуется, когда образцы в конечном итоге анализируются по масс-спектрометрии для характеристики протеины дна binding.

3. распад и стрижка

  1. Подготовка > 15 мл буфера Lysis ядер (10 мм ЭДТА, 50 мм трис рН 8,0, 1% SDS, PI).
    Примечание: Добавить PI свежие, просто к суммам, которые будут использоваться. Избегайте длительного хранения буфера Lysis ядер после добавления PI. Буфер Lysis ядер может храниться на RT сроком до 1 месяца.
  2. Ресуспензируйте гранулы в 20 мл буфера Lysis клетки (содержащие Igepal и PI). Пусть гранулы оттепели на льду и перемешать хорошо после размораживания. Пусть сидят еще 10 мин на льду образцы. Центрифуга клетки на 400 x g на 4 ᵒC 5 мин.
  3. Отменить супернатант и Ресуспензируйте клетки в 6 мл буфера Lysis ядер с PI (объем может быть увеличен, если ячейки не образуют подвеска).
  4. В рамках подготовки к sonication, делят образца равномерно в ~ 6 – 8 отцентрифугировать трубы (600-1000 мкл для каждой трубы).
    1. Поместите образцы льда или холодной стойку и sonicate образца с помощью sonicator с microtip. Используйте 65% амплитуды с 5 x 20 s постоянные всплески, позволяя подвеска остыть по крайней мере 40 s между импульсами.
      Примечание: Если увеличить объемы > 10 мл на образец, бокал, охлаждения клеток может использоваться вместо него. Все больше и больше очередей будет требоваться тогда. Sonicators сильно отличаются. Условия могут должны быть оптимизированы читателя. Также могут использоваться другие альтернативы sonication.
  5. Центрифуга клетки на 12000 g x 10 мин на 4 ᵒC, передавать супернатант новой трубки и отбросить гранулы.
  6. Оценки общего восстановления с помощью метода флуориметрический.
  7. Продолжать следующий шаг или оснастки замораживания и хранения образцов в ᵒC-80.
  8. Дополнительно: Возьмите аликвота, обратный сшивки, инкубации его на ночь в 67 ᵒC в 0,3 М NaCl. Очистить ДНК и запустить его в Bioanalyzer для определения длины фрагмента. Основная часть фрагментов должна быть между 500 и 1000 bp.
    Примечание: Это ОК, чтобы остановить на данный момент и хранения образцов-80 ᵒC.

4. гибридизации захват

  1. Подготовка 500 мл 2 x гибридизации (Гибнер) буфера (200 мм МЧС, 2 M NaCl, 40 мм ЭДТА, 0,02% Tween-20) и 500 мл буфера мытья (NaCl, 0,2% SDS, 200 мм 50 мм трис рН 8). Храните Гибнер и мыть буферов на 4 ᵒC и комнатной температуре, соответственно, на срок до 3 месяцев. Используйте половину 2 буфера x Hyb подготовить 1 x гибридизации буфера. Также храните его на 4 ᵒC на срок до 3 месяцев.
    Примечание: Общий объем гибридизации захвата будет вдвое больший объем результирующей выборки на предыдущем шаге (как описано до настоящего времени, объем образца будет около 6 мл и таким образом общая гибридизации объем будет 12 мл).
  2. Отложите бусы, равный 5% от объема всего гибридизации захвата (600 мкл в данном случае). Подходящих магнит необходима для работы с бисером в следующих шагах.
  3. Вымойте бусины три раза с 1 x Гибнер буфера, используя два раза объем бусины (1200 мкл). Ресуспензируйте бисер в 1200 мкл 2 x Гибнер буфера. Место труб на магните, до тех пор, пока решение очищает и удалить буфер.
  4. Выполнения предварительной очистки реакции в 1,5 мл отцентрифугировать трубы с максимум 700 мкл образца в трубку. Добавьте достаточно бусины (5%) и 2 x Гибнер буфер для разбавления Гибнер буфер 1 x (10 ламп с 600 мкл пример, 120 мкл промывают бисера высокомобильна в 2 x Гибнер буфера и 480 мкл 2 x Гибнер буфера). Инкубировать их за 10 мин на 31 ᵒC с конца над конце вращения (~ 30-60 об/мин).
  5. Место труб на магнит, пока бусы карданной передачи были заблокированы и передавать образцы новой трубы. Выбросите бисер.
    Примечание: С этого момента вперед, рекомендуются трубки низкого привязки.
  6. Ресуспензируйте захвата олигонуклеотиды для рабочего раствора 10 пмоль/мкл и мкл 4 этого решения к каждой трубе.
    Примечание: Различные регионы может выступать в качестве элемента управления для друг друга, но рекомендуется включить захват олигонуклеотида с ее последовательность, кинулись в качестве истинный отрицательный контроль.
  7. Инкубировать трубы для 40 мин на 42 ᵒC с конца над конце вращения (~ 30-60 об/мин).
  8. Во время инкубации выделить необходимые бисер (0,3 мкл/пмоль олигонуклеотида захвата). Мыть бисер три раза, как описано в шаге 4.3, но Ресуспензируйте клеток в 1 x Гибнер буфера.
  9. Добавить промытый бусины образца и Проинкубируйте образцы для 30 мин на RT с конца над конце вращения (~ 30-60 об/мин). Место труб на магните и удалить супернатант после иммобилизованных бисер.
  10. Стиральные шарики
    1. Добавить 1,2 мл буфера мытья и инкубации образца для 5 минут с конца над конце вращения (~ 30-60 об/мин) на RT. место трубы на магнит и ждать пару минут до решения очищает. Удаление буфера и повторите этот шаг.
    2. Добавить 1,2 мл буфера мытья и проинкубируйте 1 час с конца над конце вращения (~ 30-60 об/мин) на RT. место трубы на магните и подождать пару минут до решения очищает. Удаление буфера и повторите этот шаг, сокращая время инкубации до 30 мин во второй раз.
    3. Добавить 200 мкл буфера мытья и Инкубируйте 15 мин с конца над конце вращения (~ 30-60 об/мин) на 31 ᵒC. Место труб на магните и подождать пару минут до решения очищает. Удаление буфера.
    4. 200 мкл PBS и проинкубируйте 5 мин с конца над конце вращения (~ 30-60 об/мин) на RT. место трубы на магните и подождать пару минут до решения очищает. Удаление буфера и повторите этот шаг.
  11. Простые элюции
    1. 40 мкл молекулярного уровня воды к бисеру и Инкубируйте на 94 ᵒC за 5 мин.
    2. Место труб на магните и подождать пару минут, пока решение очищается.
    3. Перенесите супернатант в новой трубки. Выбросите бисер.
    4. Перейти к протеомного анализа или хранить образцы в ᵒC-80.
      Примечание: Этот тип элюции работает хорошо для последующего анализа ПЦР и некоторые измерения протеомики, но в других случаях два альтернативных подходов, описанных ниже доходности «чистого» элюаты.
  12. Элюирующий DNase.
    1. Мкл 40 1 x DNase Buffer и 2 U DNase к каждой трубе.
    2. Инкубируйте трубы для 15 мин при 37 ᵒC.
    3. Место труб на магнит и подождать пару минут, до тех пор, пока решение очищает.
    4. Удаление eluted образцы из бисера и образцы в новой трубки низкого привязки.
    5. Инкубируйте трубки на 94 ᵒC за 7 мин инактивирует фермент и приступить к протеомных анализов.
      Примечание: Нижняя DNase концентрации может использоваться, если наблюдается вмешательство с протеомных анализов. Он не будет можно рассчитать захвата сосредоточения на ПЦР, если используется этот метод элюции поскольку DNase лечения полностью разрушает ДНК материал в образце.
    6. Перейти к протеомного анализа или хранить образцы в ᵒC-80.
  13. Зацепки элюции17.
    Примечание: Этот метод не рекомендуется для длительного олигонуклеотиды (> 40 баз). Этот метод требует для захвата олигонуклеотиды содержат дополнительные 8 баз, которые не пересекаются с геномные последовательности и дополнительных релиз олигонуклеотидов для того, чтобы вытеснить целевой от захвата олигонуклеотидов.
    1. Развести 2 наномоль олигонуклеотидов выпуска в 40 мкл буфера SSC.
    2. Проинкубируйте втечение 20 мин на RT.
    3. Место труб на магнит и подождать пару минут, пока решение очищается.
    4. Удаление решения из бисера.
    5. Перейти к протеомного анализа или хранить образцы в ᵒC-80.

5. Оценка захвата выход ПЦР с праймерами для целевого региона захватить интерес

  1. Используйте соответствующее программное обеспечение или онлайн-инструмент для разработки грунты и зонды для целевого региона.
    Примечание: В этом эксперименте, были направлены промоутер региона DUSP3 и DUSP5 . Грунты и зонды используются, являются следующие. DUSP3: Праймер 1 - GTG TTT общ TTC CCT Гат CC, грунтовка 2 - КЭУ AAT GTC ТГК CTT CG, FAM-меченых зонд - TCC ГПТ КХЦ ГАА TTG TGA CGT КЭУ; DUSP5: Праймер 1 - TGA ГАА СМЖЛ CCT Гат GTG TC, грунтовка 2 - GCC TTC Ага AAC КХЦ AAA AG, FAM-меченых зонд ТГК ATT тег СМЖЛ СМЖЛ CAG ГПТ общ TT.
  2. Возьмите Алиготе элюата (не более 10 мкл) и развести 1:10 с молекулярной класса H2O.
  3. Извлечь ДНК одной из аликвоты, сделанной в шаге 2.1.7 и использовать этот образец ДНК для сделать стандартной кривой, выполнив пять последовательных 1:10 разведений в молекулярных класс H2O.
  4. Подготовка мастер смесь ПЦР (разнообразных коммерческих альтернатив), добавить грунты и зонды и распределять соответствующие суммы (15 мкл если реакция 20 мкл) в каждой скважине.
  5. Добавить 5 мкл либо:) разбавляют образца, b) стандартной кривой или c) молекулярной класса H2O (чтобы служить не шаблон элемента управления) для каждой скважины.
  6. Печать пластину и центрифуги на 100 x г за 1 мин.
  7. Выполняется в системе ПЦР со следующими параметрами: 5 минут, 95 ᵒC следуют 40 циклов 95 ᵒC для 20 s, 59 ᵒC для 20 s и 72 ᵒC для 25 s.
  8. Использование стандартной кривой урожайности ослов и кинулись захвата оценить специфику захвата.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Из-за необходимости для ввода большого количества хроматина HyCCAPP для достижения успеха клетки выращивают на относительно высокий уровень confluency. Трипановый голубой окраски используется для подтверждения, что клетки смертности умеренный (< 10%). В единственном экземпляре экспериментах, хроматина содержание до гибридизации захвата должна быть в диапазоне femtomolar, который, как правило, требует по крайней мере 109 клеток как исходный материал. До полномасштабных экспериментов рекомендуется протестировать производительность олигонуклеотида захвата в небольших партиях. Гибридизация захватывает с помощью титрования олигонуклеотиды показаны на рисунке 1. Количество захвата олигонуклеотиды постепенно увеличивается, в то время как общая концентрация остается неизменным. Этот эксперимент ясно показывает три ключевых аспекта. Во-первых она помогает определить, для данного региона, для достижения оптимальной (и максимальная) гибридизации эффективности необходимы сколько олигонуклеотидов. Во-вторых она показывает, если есть любые очевидные пагубные взаимодействия между заданным олигонуклеотиды. И наконец она показывает, если есть любой олигонуклеотиды с плохой специфики, которые несут значительные суммы фона (в этом случае измеряется ПЦР анализа с праймерами, ориентация других регионов в геноме).

Урожайность гибридизации захвата появится скромными ввиду сшитого образца хроматина. Значительная часть фрагментов в высокоструктурированные хроматина не будет поддаются для захвата гибридизации. Серийный гибридизации эксперименты демонстрируют этот (рис. 2). Если успешно выполняется захват гибридизации, последующих захвата эксперимент из того же материала хроматина, используя другой набор захвата олигонуклеотиды приведет к сопоставимых (чуть ниже) урожаи, чем при использовании свежих хроматина (~ 11% ниже на в среднем). Но если же региона предназначен снова с тем же набором олигонуклеотиды в второй захват эксперимент с использованием образца хроматина, оставшиеся после первого захвата экспериментировать, урожайность будет уменьшаться около 90%, подтверждающий что большая часть Гибридизация поддаются материал был захвачен. Если такое снижение захвата не наблюдается после последующих записей с тем же набором олигонуклеотиды, это указывает на технические проблемы в шаг записи гибридизации.

В простых системах как дрожжи мы наблюдали, эффективность захвата, приближается к 4%5, которые привели к выявлению 9 белков дифференциально обогащенный в 2 регионах, когда дрожжи был выращен в различных условиях. В клетках человека однако, имея геном ~ 250 раз больше дрожжей, гибридизации урожаи, как правило, ниже 1% (рис. 3). Как показано на рисунке 3 , один эксперимент может привести к недостаточной суммы для протеомики анализов. В этом случае несколько захваченных образцах придется быть объединены для того, чтобы выполнить анализ последующих масс-спектрометрии. Кроме того более низкие концентрации захваченных целевого региона хроматина может использоваться для целенаправленного анализа подходов, таких, как Западный blotting и массы на основе спектрометрия отдельных реакции, мониторинг анализов.

Figure 1
Рисунок 1: Box участка представление захвата олигонуклеотида титрования. Увеличение числа захвата олигонуклеотиды были протестированы и анализ ПЦР. Фон относится к анализы ПЦР, ориентация других регионов в геноме. Значения представлены как раз изменение от гибридизации захвата с помощью единого олигонуклеотида. Усы представляют собой минимальные и максимальные значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: поле Серийный захватывает участок представление. Гибридизация последовательные снимки с тем же набором олигонуклеотиды (A_A) показывают, сильное падение обогащения, по сравнению с последовательным гибридизации захватывает с использованием другого набора олигонуклеотиды (A_B) (p = 3,88 e-5). Обогащение измеряется ПЦР и показаны значения относительно захватов, с использованием свежих хроматина. Усы представляют собой минимальные и максимальные значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: гибридизации захвата использованием человеческих клеток. Гибридизация захват регионов, расположенных в разных хромосомах. Каждый регион служит отрицательный контроль для другого. Кроме того захват гибридизации выполняется с использованием омлет (Scr) последовательности как истинный отрицательный контроль. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

HyCCAPP метод, описанный здесь имеет много уникальных особенностей, которые делают его мощным подход для выявления ДНК взаимодействий, которые в противном случае будет оставаться недостижимой. Характер процесса дает HyCCAPP возможность работы в различных организмов и регионах генома. Это метод, однако, что имеет несколько ограничений для рассмотрения.

HyCCAPP — метод, который позволяет избежать любых изменений клеток так, чтобы он потенциально может применяться в первичной клетки, клетки культуры систем или образцы даже ткани. Из-за этого однако, он требует образцов быть высокоструктурированные, который уменьшает чувствительность в протеомного анализа и поэтому требует больших объемов ввода. Есть новые подходы, которые полагаются на ТРИФОСФАТЫ и biotinylation окружающих белков, которые могут функционировать без сшивки реакции12,13,14,18. Эти подходы могут быть очень мощным, если плазмида вставки не являются ограничением, но может использоваться только в системах культуры клеток. Другие подходы очень хорошо подходят для определения общего белка ассоциации, основанные на состояние хроматина или на наличие конкретного транскрипционных факторов, но не предназначены для изучения отдельных локусах9,10,19 .

HyCCAPP подход представляет альтернативный подход с широкой применимости, но это скорее всего того, что приложения в различных клеточных систем или организмов потребует оптимизации. Важнейший шаг оптимизации подход включает в себя дизайн и подбор захвата олигонуклеотидов. Ряд мелких тестов должен показать если разработан олигонуклеотиды подходят и последовательность в регионе фактически захватили. Существует несколько факторов, которые следует учитывать при разработке и тестировании захвата олигонуклеотиды, например длину олигонуклеотида, степень специфичности для целевого региона и взаимодействия среди множества олигонуклеотиды для использования. Все эти взаимодействия может быть легко проверен с помощью ПЦР анализа конкретного целевого региона. При желании, чип-Seq как рабочий процесс может использоваться для последовательности результирующие фрагменты ДНК и заверить, что специфика обогащения через весь геном5является удовлетворительным.

Наконец, сшивки условия также весьма важную роль в процедуре HyCCAPP, и мы наблюдали заметные различия между различными системами, получение лучших результатов в клетках человека cross-linking с 1% формальдегида, тогда как в дрожжи, сшивки с 3% формальдегида принесли более воспроизводимые результаты. Вполне возможно, что более интенсивным cross-linking с 3% формальдегида в клетках человека с более сложной структуре хроматина не обеспечивает достаточной доступности для гибридизации захвата олигонуклеотидов. Также предполагается, что наличие клеточной стенки в дрожжей препятствует доступу формальдегида в клетки, увеличивая количество формальдегида, необходимых для успешного сшивки уровней в хроматина.

Выполнение чипа и другие подходы захвата ориентации высокоструктурированные человека хроматина, мы заметили, что только около 1% ДНАО цели фактически могут быть захвачены. Для большинства подходы, основанные на ДНК и анализа это не является ограничивающим фактором. Однако в отличие от чип, где окончательный индикация основана на мы ДНК, HyCCAPP опирается на содержание белка для окончательного индикация. Из-за этого внутренние ограничения, требуются большие объемы ввода материала (культивируемых клеток в экспериментах, представленные здесь): это ограничение следует тщательно рассматривать прежде чем осмотреть эту методологию, особенно когда они применяются к одной копии регионов. Не все системы будут иметь возможность производить количество клеток требуется, или стоимость растущего числа необходимых клеток может быть непомерно высока. Ввода суммы, что HyCCAPP требует (~ 109 клеток) сопоставима с другими методами, которые полагаются на сетчатого материала с ввода суммы от 108 и 1011 клетки9,11,15. Будущие модификации технологии HyCCAPP будет изучать подходы к искусственно увеличить копировать количество целевых регионах, чтобы сделать этот метод более широко применимым. В то же время мы будем продолжать повышение общей эффективности процесса, который вместе с непрерывный прогресс в масс-спектрометрии следует уменьшить суммы ввода необходимы и сделать эту технологию возможно в нескольких системах.

Biotinylation на основе подходов, с помощью ТРИФОСФАТЫ, как enCHiP18 и другие13,14, показали, чтобы быть очень эффективным, устраняя необходимость сетчатого материала, повышения урожайности и значительно сократить ввод требования. Однако, сложной обработки клеток в этих методов не позволяет эти методы применяться в образцах тканей, направление, которое мы начали проводить с HyCCAPP и что производит многообещающие результаты.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Существует без конфликта интересов раскрыть.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана NIH грантов P50HG004952 и R01GM109099 в MO.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PrimerQuest tool IDT
OligoAnalyzer 3.1 IDT Analyze capture oligonucleotids
PairFold UBC Analyze interactions
RPMI 1640 media Thermo Fisher 11875093
Penicillin-streptomycin Thermo Fisher 15140122
L-Glutamine  Thermo Fisher 25030081
Fetal bovine serum Thermo Fisher 26140079
Countess automated cell counter Thermo Fisher
850 cm2 roller bottle  Greiner Bio-one 680058
Roller system Wheaton 22-288-525
37 % formaldehyde  Sigma-Aldrich F8775
Glycine Sigma-Aldrich
Igepal CA-630 Sigma-Aldrich I3021
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P4380
HEPES Thermo Fisher 15630080
Branson digital sonifier SFX 150 Emerson
Qubit 3.0 fluorometer Thermo Fisher
Qubit dsDNA BR assay kit Thermo Fisher Q32850
Bioanalyzer 2100 Agilent
Agilent DNA 1000 kit Agilent 5067-1504
MES sodium salt Sigma-Aldrich M3885
NaCl 5M Thermo Fisher AM9760G
EDTA Sigma-Aldrich
DynaMag-2 magnet Thermo Fisher 12321D
DynaMag-15 magnet Thermo Fisher 12301D
Dynabeads M-280 atreptavidin Thermo Fisher 60210
Low binding tubes Eppendorf 22431081
Hybridization oven SciGene
Tube shaker and rotator Thermo Fisher 415110Q
DNase I (RNase-free) New England BioLabs M0303
SSC buffer 20× concentrate Sigma-Aldrich S6639

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489, (7414), 57-74 (2013).
  2. Galas, D. J., Schmitz, A. DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Res. 5, (9), 3157-3170 (1978).
  3. Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. Nat. Protoc. 7, (2), 256-267 (2012).
  4. Dai, Y., Kennedy-Darling, J., Shortreed, M. R., Scalf, M., Gasch, A. P., Smith, L. M. Multiplexed Sequence-Specific Capture of Chromatin and Mass Spectrometric Discovery of Associated Proteins. Anal. Chem. 89, (15), 7841-7846 (2017).
  5. Guillen-Ahlers, H., et al. HyCCAPP as a tool to characterize promoter DNA-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Genomics. 107, (6), (2016).
  6. Kennedy-Darling, J., et al. Discovery of Chromatin-Associated Proteins via Sequence-Specific Capture and Mass Spectrometric Protein Identification in Saccharomyces cerevisiae. J Proteome Res. 13, (8), 3810-3825 (2014).
  7. Guillen-Ahlers, H., Shortreed, M. R. R., Smith, L. M. M., Olivier, M. Advanced methods for the analysis of chromatin-associated proteins. Physiol Genomics. 46, (13), 441-447 (2014).
  8. Lambert, J. -P., Fillingham, J., Siahbazi, M., Greenblatt, J., Baetz, K., Figeys, D. Defining the budding yeast chromatin-associated interactome. Mol Syst Biol. 6, 448 (2010).
  9. Soldi, M., Bonaldi, T. The Proteomic Investigation of Chromatin Functional Domains Reveals Novel Synergisms among Distinct Heterochromatin Components. Mol Cell Proteomics. 12, (3), 764-780 (2013).
  10. Wang, C. I., et al. Chromatin proteins captured by ChIP-mass spectrometry are linked to dosage compensation in Drosophila. Nat Struct Mol Biol. 20, (2), 202-209 (2013).
  11. Byrum, S. D., Raman, A., Taverna, S. D., Tackett, A. J. ChAP-MS: A Method for Identification of Proteins and Histone Posttranslational Modifications at a Single Genomic Locus. Cell Rep. 2, (1), 198-205 (2012).
  12. Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated immunoprecipitation ( eChIP ) using CRISPR. Biochem. Bioph. Res. Co. 439, (1), 132-136 (2013).
  13. Liu, X., et al. In Situ Capture of Chromatin Interactions by Biotinylated dCas9. Cell. 170, (5), 1028-1043 (2017).
  14. Myers, S. A., Wright, J., Zhang, F., Carr, S. A. CRISPR/Cas9-APEX-mediated proximity labeling enables discovery of proteins associated with a predefined genomic locus in living cells. bioRxiv. (2017).
  15. Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci. Cell. 136, (1), 175-186 (2009).
  16. Buxton, K. E., et al. Elucidating Protein-DNA Interactions in Human Alphoid Chromatin via Hybridization Capture and Mass Spectrometry. J. Proteome Res. 16, (9), 3433-3442 (2017).
  17. Kennedy-Darling, J., Holden, M. T., Shortreed, M. R., Smith, L. M. Multiplexed programmable release of captured DNA. Chembiochem. 15, (16), 2353-2356 (2014).
  18. Fujita, T., Fujii, H. Isolation of specific genomic regions and identification of associated molecules by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR. Chromatin Protoc. Third Ed. 43-52 (2015).
  19. Lambert, J. -P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A Novel Proteomics Approach for the Discovery of Chromatin-associated Protein Networks. Mol Cell Proteomics. 8, (4), 870-882 (2009).
Адаптация гибридизации захвата Chromatin связанных белков для протеомики в клетках млекопитающих
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guillen-Ahlers, H., Rao, P. K., Perumalla, D. S., Montoya, M. J., Jadhav, A. Y. L., Shortreed, M. R., Smith, L. M., Olivier, M. Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (136), e57140, doi:10.3791/57140 (2018).More

Guillen-Ahlers, H., Rao, P. K., Perumalla, D. S., Montoya, M. J., Jadhav, A. Y. L., Shortreed, M. R., Smith, L. M., Olivier, M. Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (136), e57140, doi:10.3791/57140 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter