Summary
여기, 우리는 쥐 냄새 차별 테스트는 연관 학습 작업에 기차. 이 프로토콜은 또한 두뇌에 구조적인 변화를 유도 하는 학습에 대 한 연구에 대 한 수 있습니다.
Abstract
후각이는 마우스에 주된 감각 양식 적임 이며 구하고, 약탈자 탐지, 짝짓기, 그리고 육아를 포함 하 여 많은 중요 한 동작에 영향을 미칩니다. 중요 한 것은, 쥐 후 각 회로 기능에 대 한 통찰력을 제공 하기 위해 특정 행동 응답 소설 냄새 연관 훈련 될 수 있다. 이 프로토콜 훈련 쥐 작업에 대 한 이동/노 가기 작동 학습에 대 한 절차를 자세히 설명합니다. 이 방법에서는, 마우스는 자동화 된 시험의 수백에 매일 2-4 주에 대 한 훈련과 소설 가/노 갈 냄새 쌍 후 각 차별 평가 또는 냄새 학습 구조 또는 후 각의 기능을 변경 하는 방법에 대 한 연구에 대 한 사용을 테스트할 수 있습니다. 회로입니다. 또한, 마우스 후 각 전구 (OB) 성인 선천적인 신경의 지속적인 통합을 갖추고 있습니다. 흥미롭게도, 후 각 학습 증가 생존 및 이러한 성인 선천적인 신경의 시 냅 스 연결 합니다. 따라서,이 프로토콜 다른 생화학, electrophysiological, 그리고 이미징 기술을 신경 생존 및 소성 중재 학습 및 활동-종속 요소를 공부 하 결합 될 수 있다.
Introduction
오늘, 어디 냄새 정보는 먼저 중앙 신경 시스템 (CNS)를 입력, 마우스 경험-종속 구조 변화를 연구 하는 훌륭한 모델을 제공 합니다. 산부인과 回 지속적으로 활동에 종속적으로 성인 선천적인 신경 통합합니다. 성인 선천적인 신경 선구자 창시자 帯 측면 심1에 인접 한 줄에서 떨어져 분할. 산부인과로 마이그레이션 시 이러한 신경 선구자 생존, 분화, 및 억제과 립 세포로 통합 또는 apoptosis2를 받 다. 세포 운명에 대 한 선택 후 각 학습3,4,,56을 포함 하 여 후 각 활동에 의해 영향을 받습니다. 통합, 후 학습 유도 시 냅 스 변화는 2 주 중요 한 기간7,8중과 립 세포에서 발생합니다. 따라서, 후 각 학습에 대 한 분석은 어떻게 경험 종속 소성 영향 구조 및 기능 개편 성숙한 두뇌 회로의 검토 유용 합니다.
이 프로토콜 조작 컨디셔닝 패러다임을 사용 하 여 후 각 훈련 한 접근을 제공 합니다. 이 작업에서는 물 박탈 마우스 연결할 물 보상 ("가" 냄새) 한 냄새와 다른 냄새 ("노" 냄새) 시험 제한 시간 처벌 훈련 된다. 2-4 주에 걸쳐 훈련 단계의 등급된 시리즈를 통해 마우스 진행. 마우스 이동 또는 아니오인 냄새 (이동 실험에서 물 보상을 추구 하 고 노 재판에 물 보상을 추구 하지) 이산, 해당 동작에 응답 훈련 완료 되 면 (그림 1A). 교육 완료 후, 화학적으로 비슷한 냄새 쌍 쥐 더 도전 수 있습니다 차별 테스트 또는 전환 될 연구 조사 어떻게 후 각 학습 구조 또는 산부인과의 기능 변경 비록 냄새 차별 작업 이전 설명 되었습니다, 가장 두 odorants9,10사이 킁 수 등 주관적인 측정에 의존 합니다. 또한, 인간의 이러한 작업의 점수에 대 한 필요성은 또한 시간 많이 사용. 이 프로토콜에서 설명 하는 이동/노 가기 후 각 학습 작업 냄새 차별과 후 각 학습의 편견, 직접 측정을 제공 합니다.
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Protocol
모든 마우스는 NIH 표준 베일 러 대학의 약 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 프로토콜에서 사용 되었다. 이 프로토콜에서 사용 하는 마우스 했다 모든 성인 쥐 (> 나이의 6 주) C57BL6/j에 배경 및 남성 및 여성 쥐를 포함. 훈련/준비 작업 후 쥐 집 그들의 감 금 소에 반환 됩니다.
1. 건설 및 조작 학습 상자 (그림 1B, C)를 사용 하기 위한 일반 규칙
- 마우스 챔버 챔버 바닥 조립. 낮은 트래픽, 산만 피하기 위해 어렴풋이 조명된 영역에에서 훈련 상자를 두십시오.
- 각 물 포트 포트 안에 물을 분배 하는 18-게이지 바늘 수 있도록 상단에 작은 구멍을 드릴 합니다.
- Odorant 미네랄 오일 (매주 교체)에 녹아 유리 유리병 채우기 하 고 안전 하 게 뚜껑을 조입니다.
- 실리콘 튜브를 18-게이지 바늘을 연결 합니다. 18-게이지 바늘, 유리 약 병 뚜껑을 뚫 고 냄새 포트의 입구에 실리콘 튜브의 다른 쪽 끝을 연결 합니다.
- 각 실리콘 튜브를 냄새 밸브에 놓습니다.
- 냄새 포트에 진공 라인을 연결 합니다.
- 금속 지주 막대를 2 10 mL 주사기를 연결 하 고 주사기에 튜브를 연결. 18 G 바늘에는 튜브의 다른 쪽을 연결 합니다. 코 구멍이 포트 마우스 챔버에의 드릴된 구멍에 바늘을 맞습니다. 물 밸브 튜브의 다른 쪽 끝을 연결 합니다.
- 쥐 식 수로 두 10 mL 주사기를 채우십시오.
- 공기 흡입구에 공기 흐름 미터를 연결 하 고 3-5 L/분의 공기 흐름을 유지 합니다.
- 2 물 밸브, 2 냄새 밸브, 물 포트 2 개, 냄새 포트 및 전원 USB 인터페이스 시스템에 연결 합니다. 모든 밸브 '출력' 포트, '입력'에 모든 냄새와 물 포트 연결 포트. USB 인터페이스 상자에서 출력 전원을 공급 하 고 마지막으로, 전원에 연결할 USB 인터페이스 상자 모든 장비를 연결 합니다.
- 실험 사이 냄새의 교차 오염을 방지 하는 진공 흡입을 조정 합니다.
- 냄새 전용 튜브를 사용 하 여 챔버에 odorant 튜브를 연결.
2. 마우스 준비: 1-3 일
- 쥐 3 그룹으로 나누어: 제어 (후 각 훈련 필요 없음), 의사 훈련된 (마우스 보상 또는 처벌을 무작위로 받을), 그리고 훈련 그룹. 교육 상자와 냄새 배달 의사 훈련된 쥐 하지만 처벌과 보상의 결과 전달 하는 악취와 임의로 연결 때문에 후 각 훈련을 제공 하지 마십시오.
참고: 의사 훈련된 그룹 "Pseudotraining" 단계에서 교육 패러다임을 통해 갈 것입니다. 훈련 된 쥐 모든 훈련 단계를 완료 합니다. Pseudotraining 실험의 목적은 냄새 차별 또는 학습 행동 차이 대 한 시험을 하는 경우 선택 사항입니다. 여기는 실험 전과 훈련 후 신경의 차이 조사 하고자 하는 경우이 그룹을 추가 제공 하는 프로토콜. Pseudotrained 그룹은 다음 수동 냄새 노출 및 비 후 각 관련된 교육에 대 한 제어 합니다. - 물 제한 40 mL/kg의 쥐에서 시작/일. 고민 (그림 2A)를 피하기 위하여 bodyweight 손실을 보다 큰 동물의 기준선 체중의 20%를 하지 마십시오.
- 그들은 초기 체중의 80% 이상 되도록 매일 쥐를 무게. 마우스가이 임계값 미만으로 떨어지면, 연구에서 마우스를 제거 하 고 물에 자유 접근을 제공.
- 모든 환경 요인 온도, 소음, 그리고 (를 포함 하 여 개인의 신체와 향수/향수/탈취 제 향기) 길 잃은 냄새를 포함 하 여 프로토콜을 통해 지속적인 유지.
참고: 모든 동물 행동 테스트와 마찬가지로 작은 환경 변화 수 크게 영향을 미칠 결과.
3입니다. 모든 단계에 대 한 지침
- 아래 각 단계에 대 한 교육 소프트웨어 코드. 행동 소프트웨어에는 소프트웨어를 실행 합니다.
참고: 모든 단계에 대 한 코딩 추가 코딩 파일에 포함 되어 있습니다. 20도 대 한 데이터 블록에 걸쳐 표시 되는 단일 블록 및 마우스 성능으로 그룹화 됩니다. 또한, 완료 조건이 충족 될 때까지 일 수에 대 한 마우스에 각 단계를 반복할 수 있습니다. - 60 분/일 이상에 대 한 동작 상자에서 생쥐를 유지 하지 마십시오.
- 각 마우스는 감 금 소에 전송 되기 전에 장에서 깨끗 한 마우스 낭비. 스프레이 하 고 마우스 냄새 산만 최소화 하기 위해 70% 에탄올과 챔버를 닦아냅니다.
4. 훈련 1 단계: 연결 물 보상 센터 코 찌, 1-3 일와 함께
- 이 단계에서 쥐 물 보상 물 포트의 탐험에 연결 합니다.
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훈련 1 단계 프로그래밍 지침
- 만 물 전달 포트를 사용 하 여이 단계를 프로그램. 각 코 찌에 대 한 물 보상을 받을 마우스를 하자.
참고: 프로그램 재판의 지속 시간을 출력 하 고 물 총 수 보상 받은 마우스.
- 만 물 전달 포트를 사용 하 여이 단계를 프로그램. 각 코 찌에 대 한 물 보상을 받을 마우스를 하자.
- Pseudotraining 단계 1 훈련 단계 1과 같은 프로그래밍을 설정 합니다.
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박스 구성 및 마우스 설정
- 센터에서 물 포트와 액세스할 수 있는 모든 측면 포트 동작 상자를 구성 합니다. 챔버에 마우스를 놓습니다. 마우스 챔버를 닫고 1 단계 프로그램을 시작 합니다.
- 이 단계를 고려할 때 마우스 달성 60 분 제거 이내 100 재판 완료 후 60 분 또는 100 재판 상공에서 마우스 완료 (그림 2B).
참고: 개별 차이 일부 마우스는 자연스럽 게 참 상자 탐험에서. - 격려가 필요한 경우 수동으로 물 포트에 물을 제공 합니다. 최대 3 일 동안이 단계를 반복 합니다.
참고: 마우스는 이미 훈련을 반복할 수 있습니다 추가 패리티를 유지 하 고 유체 제한에 그들을 유지. 그것은 또한 그룹 평균 100 재판/60 분에 도달 하면 2 단계로 전체 그룹 홍보 수입니다. 이것은 모든 마우스 같은 날 훈련을 계속 있게 됩니다.
5. 훈련 2 단계: 연결 쪽 물 보상 센터 포트 코 찌, 1-5 일
- 이 단계에서는 마우스 센터 포트에 그들의 코를 찌를 송수신 다음 즉시 측면 포트에 물 보상 하자.
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박스 구성 및 마우스 설정
- 양쪽에 2 물 포트와 중간에 냄새 포트가 고 모든 후속 단계를 구성 합니다. 챔버에 마우스를 놓습니다. 마우스 챔버를 닫고 2 단계 프로그램을 시작 합니다.
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훈련 2 단계 프로그래밍 지침
- 제공 마우스는 즉시 물 보상 양쪽에 코 구멍 후 중심으로 냄새 전달 포트. 재판, 재판 시작 수 및 물 보상 5 이내 수의 기간으로이 단계에 대 한 출력 매개 변수를 설정 코 찌의 s.
- Pseudotraining 2 단계 훈련 단계 2와 같은 프로그래밍을 설정 합니다.
- 40 재판의 최소 60 분, 5 이내 물 보상의 25% 이상에서 수행 될 때 완전 한으로이 단계를 고려 센터 포트 코 찌의 s. 이 단계 (그림 2C) 완료 되 면 마우스를 제거 합니다.
참고: 교육 프로그램이 단계의 완성을 결정 하기 위해 적시에 받은 물 보상의 비율을 계산 합니다. 쥐가 얼마나 빨리에 다르지만 그들은이 단계를 완료, 대부분 마우스 5 일 이내 완료 기준에 도달 한다. 그러나, 마우스 5 일 이내에이 단계를 완료 하지 는지 않습니다 하지 사전 마우스 다음 단계로. 이 마우스는 코 호트에서 제거 됩니다.
6. 훈련 3 단계: 연결 물 보상 특정 냄새와 특정 시간대, 1-3 일 이내
- 이 단계에서 코 구멍이 시가 (나가면서) 냄새 센터 포트에서 수신 하는 쥐를 보자. 그 후, 측 물 포트 5 이내에 코 구멍이 시 물 보상을 얻을 s.
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훈련 3 단계 프로그래밍 지침
- 중앙에 나가면서 냄새 냄새 포트를 제공 합니다.
- 마우스 pokes 5 내의 측면 포트 경우 물 보상 제공 냄새 배달의 s.
참고: 프로그램만 물 보상을 센터 포트에 100 ms 코 구멍을 요구 하 여 시작 합니다. 코 구멍의 기간 물 보상 50 ms에 의해 증가 필요한 면 마우스는 정확한 양의 시험의 80%에서 시간에 대 한 센터 포트를 pokes, 최대 400 ms. - 출력 매개 변수 설정 2 단계와 동일 합니다.
- 설정 pseudotraining 3 단계 프로그래밍 지침 같은 훈련 3 단계. 그러나, 나가면서 냄새 물 보상와 연결 되지 않은 되도록 냄새 배달 컨트롤러에 나가면서 냄새를 연결 하지 마십시오.
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박스 구성 및 마우스 설정
- 단계 2에서 동일한 구성을 설정 합니다.
- 나가면서 냄새 냄새 배달 컨트롤러에 연결 합니다. 챔버에 마우스를 놓습니다. 마우스 챔버를 닫고 3 단계 프로그램을 시작 합니다. 이 단계가 완료 되 면 마우스를 제거 합니다.
- 60 분 (그림 2D) 이내 60 보상 보다 큰 경우 완료 된 것으로이 단계를 고려 하십시오.
7. 단계 4A: 아니오인 (S-) 냄새 및 제한 시간 형벌, 1-2 일 연결
- 이 단계에서 노 냄새 (S-)에 쥐를 소개 합니다. 제대로 이동 하지 물 포트 노 냄새 냄새 후 마우스 시간 처벌을 제공 합니다.
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훈련 단계 4A 프로그래밍 지침
- 처음 3 단계와 동일에이 단계에서 나가면서 odorant만을 제공 합니다. 마우스 완전 한 40 재판 후 나가면서 및 S-냄새를 냄새의 임의의 배달을 시작 합니다. 마우스 노 냄새 제시 되 고 후 물 보상을 추구 하려고 하는 경우 2-s 시간 초과 처벌을 프로그램.
참고: 이동 대 아니오인 구별에 투입, IR 측면 조명 조작할 수는 그들이 odorants 동안에 오프 노 odorants 동안. 불 쥐 초기 훈련에서 원조 하는 보조 큐 역할을 합니다. 일단 쥐 불 훈련, 그들은 냄새와 작업 배운 것인지 조명 없이 아래가 서 훈련을 해야 합니다. - 재판, 재판 시작 수, 완료 횟수가, 정확한 % 및 보상 받은 총 수의 기간으로 출력 매개 변수를 설정 합니다.
- 처음 3 단계와 동일에이 단계에서 나가면서 odorant만을 제공 합니다. 마우스 완전 한 40 재판 후 나가면서 및 S-냄새를 냄새의 임의의 배달을 시작 합니다. 마우스 노 냄새 제시 되 고 후 물 보상을 추구 하려고 하는 경우 2-s 시간 초과 처벌을 프로그램.
- 나가면서 제외 하 고 교육 단계 4S로 같은 pseudotraining 단계 4A 프로그래밍 지침을 설정 하 고 S-냄새부터에서 무작위로 표시 됩니다. 게 물 보상 또는 타임 아웃 처벌 무작위로, 작업 성능에.
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박스 구성 및 마우스 설정
- 상자 구성을 설정 같은 이전 단계 3.
- 나가면서와 S-냄새 냄새 배달 컨트롤러에 연결 합니다. 챔버에 마우스를 놓습니다. 마우스 챔버를 닫고 단계 4A 프로그램을 시작 합니다. 마우스 완전 한 40 재판 후 냄새를 무작위로 제공 하는 프로그램을 전환 합니다. 이 단계가 완료 되 면 마우스를 제거 합니다.
- > 60% 올바른 응답 40 재판 때 완전 한으로이 단계를 고려 하십시오.
8. 단계 4B: 연결 아니오인 (S-) 냄새와 시간을 처벌, 5-11 일
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훈련 단계 4B 프로그래밍 지침
- 그러나 S 냄새 후 물 보상을 시도 위한 시간 형벌은 4이이 단계를 단계 4A, 동일 하 게 s.
- 그러나 Pseudotraining 단계 4B 프로그래밍 지침 단계 4A, 동일 물 보상을 설정 하 고 시간을 처벌 무작위로 재판 당 전달 됩니다.
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박스 구성 및 마우스 설정
- 설정 상자 구성 같은 이전 단계 4A.
- 나가면서와 S-냄새 냄새 배달 컨트롤러에 연결 합니다. 챔버에 마우스를 놓습니다. 마우스 챔버를 닫고 단계 4B 프로그램을 시작 합니다. 있을 때이 단계를 완전 한 고려 > 정확도로 60 분 이내 100 재판 > 85% (그림 2E)
- 이 단계에서 각 마우스의 진행 상황을 추적 하기 위해 각 세션에 대 한 올바른 최대 및 최소 백분율을 모니터링 합니다. 쥐의 대략 85-90%는이 단계에 대 한 완료 기준 도달. 이동/노 가기 테스트 단계에 대 한이 무대의 완료를 달성 하지 않는 마우스를 제외 합니다.
- (선택 사항) 이 단계의 끝에, 이동/노 가기 odorants 냄새 유리병 플랫폼에서 전환 되는 반전 훈련을 적용 합니다. 쥐 측면 포트와 연결 된 밸브의 사운드와 같은 다른 자극으로 연결 하지는 확인 하십시오.
9. 이동/노-Go 시험 작업: 1 일, 20 분 하루 마우스 당
- 냄새 연결을 식별 하 고 차별을 냄새 쌍 학습의 정확도 결정 하기 위해 마지막 단계는으로 이것을 고려 하십시오.
참고: 소설 odorants은 S에 대 한 활용 + S-얼마나 동물을 테스트 하려면 새로운 협회를 배울 걸릴. 구조적으로 유사한 odorant 쌍 작업 어려움을 증가 하는 데 사용 됩니다. 1-1-Pentanol, Isoamyl 아세테이트 대 Isoamyl 낙 산 염, 대 Butanol 등 고 대-Carvone Carvone +. -
프로그래밍 지침
- 코 구멍의 길이 감지 하는 훈련 소프트웨어를 하자. 프로그램 실행 작업 센터 냄새 포트에서 300 ms 코 구멍이.
- 동일 단계 4B, 어떤 빛 유도 사용 하지 않는 제외 하 고 출력 매개 변수를 설정 신호.
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박스 구성 및 마우스 설정
- 설정 상자 구성 같은 이전 단계 4B.
- 나가면서와 S-냄새 냄새 배달 컨트롤러에 연결 합니다. 챔버에 마우스를 놓습니다. 마우스 챔버를 닫고 무대 이동/노 가기 프로그램을 시작 합니다. 노출 후 각 학습 작업 화학적으로 유사한 냄새의 새로운 쌍을 배운 쥐.
참고: 적절 한 냄새 차별 Wildtype 쥐 도달 > 약 10-20 블록 또는 200-400 재판 (그림 3A) 후 소설 odorants 85% 정확도.
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Representative Results
일단 쥐 후 각 학습 작업을 배웠습니다, 그들은 지금 보상 및 처벌 소설 냄새 쌍을 연결할 수 있습니다. 이러한 훈련된 마우스는 일반적으로 약 50%로 시작 가/노 가기 작업에 정확도. 올바른 비율 시험 블록에 의해 소설 냄새 쌍(그림 3)에 대 한 학습 곡선으로 그릴 수 있습니다. 대부분의 마우스 보다는 더 적은 수행을 30 분, 10 블록 시험, 마우스 올바르게 85% 정확도 (레드 라인) 보다 더 큰와 냄새 사이 감 별 할 수 있습니다. 이 우리의 프로토콜 성공적으로 훈련 하고있다 물 보상 및 다른 제한 시간 처벌 한 냄새를 연결할 wildtype 쥐 보여준다. 두 동료 사이 차별 기능을 평가 하기 위해 이러한 데이터 추가 능력에 도달 후 정확한 평균 % 또는 85% 능력 (그림 3B)에 도달 하는 데 필요한 시험의 수를 비교 분석할 수 있습니다.
일단 쥐 배울 작업, 작업 어려움을 늘리거나 냄새 쌍을 수정할 수 있습니다. 예를 들어 냄새 쌍 농도 감소 작업 어려움 (그림 3C) 증가 합니다. 이 분석은 다른 마우스 동료에 대 한 탐지의 문 턱을 밝힐 수 있다. 또한, 냄새 쌍 더 구조적으로 비슷한 되도록 변경 될 수 있습니다 (즉, 상체 또는 단일 탄소 차이). 냄새를 섞어 작업 어려움 (즉, 30/70 혼합 대 40/60 혼합물)를 높이기 위해 사용할 수 있습니다.
마우스 이전 배운된 냄새 쌍을 기억할 수 있습니다. 작업을 학습 이후 7 일 후, wildtype 마우스 이전 기억이 신속 하 게 회수 테스트 쇼 냄새 협회 (그림 3D) 배웠습니다.
그림 1 : 이동/노 가기 교육 패러다임 및 장비 구성. (A) 쥐가 냄새 프레 젠 테이 션 중 획득 물 또는 노 냄새 프레 젠 테이 션 동안 자제하 여 올바르게 응답. (B) 동작 상자만 단일 물 포트 액세스할 수 1 단계 이며 모든 후속 단계 중앙 냄새 전달 포트와 2 개의 물 포트 모두 포함 되도록 구성 됩니다. 파란색 원: 포트 물. 녹색 원: 냄새 포트. (C) 냄새 배달 각 냄새 한 냄새 밸브에 의해 문이. 긍정적인 압력 공기 흡입구는 배포자에 리드. 빨간색 화살표는 긍정적인 공기 압력 라인을 준비 냄새 유리병 (빨강 원)으로 나타냅니다. 파란색 화살표는 공기/냄새 혼합물 냄새 유리병을 떠나 냄새 밸브 (밝은 파란색 원)를 통과 하 고 백색 공기 상자 통합 입력을 나타냅니다. 주황색 화살표 긍정적인 공기 압력 냄새 전달 포트 (하단 검은 화살표)을 통합 상자에서 냄새/공기 혼합물을 밀어 수 있도록 통합 상자 중앙 레 귤 레이 터 밸브 (주황색 원)가 긍정적인 압력 공기를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 학습 데이터. (A) 마우스 몸 무게 백분율 유체 제한 동안에 80% 삭제 되지 않습니다. 레드 라인 80% 임계값 =. N = 8 쥐. (B) 1 단계 교육 결과 60 분 물 보상을 받을 수 있는 센터 포트 넘나들며 수 표시. N = 8 쥐. 오차 막대는 뜻의 표준 오차. (C) 단계 2 훈련 결과 표시 5 이내 물 보상의 비율 센터 코 찌의 s. 레드 라인 25% 임계값입니다. 회색 강조는 의미의 표준 오류 비율을 의미 합니다. N = 8 쥐. (D) 단계 3 누적 표시 번호 1 일과 훈련의 2 일에 8 쥐에 의해 받은 보상의 보상. 레드 라인은 60 보상 임계값. 오차 막대는 표준 편차. (E) 단계 4B 정확도 결과 표시 단계 4B에 대 한 올바른 응답 비율. 레드 라인은 임계값의 85% 이다. 검은 실선은 의미 이며 회색 강조는 의미의 표준 오차. N = 4 쥐. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 대표 이동/노 가기 작업에 대 한 결과. (A)가 / 노 가기 작업 2 소설 odorants에 대 한 (나가면서 isoamyl 아세테이트/S =-= 아 아세테이트) 후 마우스 제놀 (나가면서) 및 도매 (S-) 훈련을 했다. N = 5 쥐 회색 의미의 표준 오류와 함께. 그린 라인은 50% 정확도, 운용 임계값 85% 정확도. (B) 마우스 hexanol (나가면서), 그리고 버터 산 (S-)에 대 한 느린 학습자 마우스 대 빨리 배우는 것에 대 한 이동/노 가기 작업의 예입니다. (C)가 / 노 가기 작업 hexanol (나가면서)와 버터의 산 성 (S-)의 다양 한 부분 압력에 대 한. (D) 7 일 훈련 후 냄새 쌍을 마우스의 능력. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
쥐 후 각 시스템 공부 감각 종속 소성 독특한 모델을 제공 합니다. 여기 우리는 보상 또는 처벌 odorant 쌍을 연결 하는 쥐를 훈련 하는 후 각 학습 패러다임 제시. 이 학습 작업을 통해 다운스트림 회로 변경 (전기 생리학, 신경 영상 vivo에서 , 등.) 후속 실험에서 공부 될 수 있다. 완료 되 면, 마우스는 다른 냄새 한 냄새, 물 보상 및 타임 아웃 처벌을 연결할 간단한 냄새 문장을된 작업을 수행 배울 것입니다.
이후이 행동 분석 결과, 연령과 성별 실험 중의 동등한 배급을 이용 하는 것이 좋습니다 하 고 동물 그룹을 제어 합니다. 그것은 절대적으로 마우스 사이의 상태를 유지 가능한 일정. 예를 들어 그 마우스 처리기와 조명 조건을 일정 하 게 유지 훈련을 통해 확인 합니다. 예상 대로 많은 마우스 작업을 수행 하지 않습니다, 경우는 다음과 같은 조건이 충족: (1) 유지 가능한 조용한 동작 설정. (2) 물 쥐를 충분히 박탈. 우리는 물 부족의 전체 하루 후에 많은 쥐 마시지 않을 것 이다 충분히 충분히 도달 완료 기준 1 단계 상자의 센터 포트에서 찾을. (3) 각 새로운 마우스의 시작 부분에 냄새/물 밸브 및 튜브 적절 한 배치 되도록 확인 합니다. (4) Odorants 그들의 휘발성에 변화 하 고 따라서 일부 다른 사람 들 보다 더 빨리 증발. 낮은 농도 사용 하는 경우에 특히 더 휘발성 odorants 매일 주간, 대신 더 높은 증기 압력으로 교체 합니다.
이 프로토콜은 실험 목적에 따라 수정할 수 있습니다. 단계 4B에 학습 시간이 중요 한 경우에, 그것은이 단계까지 모든 냄새를 제거 하는 것이 좋습니다 있을 수 있습니다. 그러면 어떤 후 각 학습 단계 4B에서 시작 됩니다. 이 위해 우리와 완전히 단계 4A를 건너뛰는 하 여 3 단계에서 냄새를 제거 하 여이 프로토콜을 수행 했습니다. 쥐 더 어려운 시간을이 메서드를 사용 하 여 완료 기준에 도달 하지만이 또한 얼마나 빨리 쥐가이 작업 처음으로 배우에 대 한 귀중 한 정보를 제공.
이 프로토콜의 한 가지 한계는 쥐 후 각 테스트를 수행할 수 있습니다 때까지 다른 단계를 완료 해야 합니다. 따라서, 우리의 실험실에 의해 보이지는 않지만 조작 수 있습니다 방해 인식 단계 4B 도달 하지 일관 되도록. 우리는 각 단계는 충분히 충분 대부분 마우스 훈련의 다음 단계로 졸업 함으로써이 문제를 부정 하려고 했습니다. 그러나, 마우스 전체 훈련 기간 후에 무대에 대 한 완료 기준에 도달 하지 않습니다, 우리는 코 호트에서 그 마우스를 제거 합니다. 어떤 개별 마우스에 대기 하지 않고 연구를 계속을 수 있습니다. 또 다른 한계는 우리는 아직 다른 동물 모델 후각이의 분야에 대 한 중요 한에이 프로토콜을 확장입니다. 쥐, 예를 들어 산부인과11,12내 신경 기능을 공개 하는 수단이 되었습니다. 그들의 정보 때문 쥐에도 마우스13,14보다 빠른 학습 시간을 있다. 이러한 제한에도 불구 하 고 우리 셀 유형 특정 조작 및 녹음15을 수행 하기 위한 그들의 유전 추적성 때문에이 프로토콜에 대 한 마우스를 선택 했다.
대부분 기존 프로토콜 사용 냄새 킁에서 차이 또는 시간 동안 옆에 차별 또는4,6,,910,16학습을 냄새. 이 프로토콜 직접 재판 하 여 재판으로 차별을 측정할 수 있습니다. 또한,이 시험 각 마우스 연결을 배울 필요가의 정확한 수를 측정할 수 있습니다. 이 완전 자동화 된 접근 데이터 분석에서 모든 인간의 편견을 제거합니다. 음식 박탈 동물은 또한 성공적으로 사용 되었습니다 후 각 학습. 물 박탈 마우스 마우스 식품16이상 물으로 수행할 수 있는 시험의 증가 수 선정 됐다.
삽입형 활동 모니터로 같은 차등 색인 (미소) 렌즈 멀티 유닛 전극, 지속적으로 개선, 우리가 곧 수 있습니다이 프로토콜17,18그 기술을 결합 하는 것. 후 각 학습 동안 양식 관련 뇌 영역을 기록 하 여 연관 학습 하는 동안 어떻게 신경 활동 변화를 조사 가능 하다. 이 기본적인 신경 과학 질문, 뉴런 학습 동안 다르게 정보를 인코딩 하는 어떻게 공개 도움이 됩니다.
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Disclosures
저자 아무 충돌 없이 경쟁 관심사를 선언합니다.
Acknowledgments
이 프로토콜은 우리의 실험실 (황 외. 내 이전 직장에서 적응 8). 여기에 설명 된 모든 방법을 동물 관리 및 사용 위원회 (ACUC)의 베일 러 대학의과 대학에 의해 승인. 맥 네 어 의료 연구소, NINDS 그랜트 R01NS078294 B.R.A., NIH IDDRC 그랜트 U54HD083092, NIDDK 부여 F30DK112571 JMP, NINDS 그랜트 F31NS092435 CKM 의해 지원 됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass vial | Qorpak | GLC-01016 | |
| Silicon Tubing | Thermo Scientific | 86000030 | |
| 18 gauge needles | BD | 305196 | |
| 1-Butanol | Sigma Aldrich | 437603 | |
| Propionic Acid | Sigma Aldrich | 402907 | |
| Mouse Chamber | Med Associates | ENV-307W | |
| Chamber Floor | Med Associates | ENV-307W-GFW | |
| Water Port | Med Associates | ENV-313W | Need two |
| Odor stimulus | Med Associates | ENV-275 | Contain 2 valves to gate odor delivery |
| Odor Port | Med Associates | ENV-375W-NPP | |
| USB Interface | Med Associates | DIG-703A-USB | |
| Desktop Computer with Windows 2000, XP, Vista, or 7 | |||
| Flow meter | VWR | 97004-952 | |
| Behavioral software | Med Associates | SOF-735 | This software, which runs each training stage, has now been replaced with Med-PC V |
| Data Transfer software | Med Associates | SOF-731 | This software formats the data to Excel |
| Training Software | Med Associates | DIG-703A-USB | This software is used to program each training stage |
| Water Valve | Neptune Research | 225P012-11 | This valve is used to gate the water delivery. Need Two |
| Odor Valve | Neptune Research | 360P012-42 | This valve is used to gate the odor delivery. Need Two |
References
- Carleton, A., Petreanu, L. T., Lansford, R., Alvarez-Buylla, A., Lledo, P. M. Becoming a new neuron in the adult olfactory bulb. Nat Neurosci. 6 (5), 507-518 (2003).
- Petreanu, L., Alvarez-Buylla, A. Maturation and death of adult-born olfactory bulb granule neurons: role of olfaction. J Neurosci. 22 (14), 6106-6113 (2002).
- Yamaguchi, M., Mori, K. Critical period for sensory experience-dependent survival of newly generated granule cells in the adult mouse olfactory bulb. PNAS. 102 (27), 9697-9702 (2005).
- Rochefort, C., Gheusi, G., Vincent, J. D., Lledo, P. M. Enriched odor exposure increases the number of newborn neurons in the adult olfactory bulb and improves odor memory. J Neurosci. 22 (7), 2679-2689 (2002).
- Arenkiel, B. R., et al. Activity-induced remodeling of olfactory bulb microcircuits revealed by monosynaptic tracing. PloS one. 6 (12), 29423 (2011).
- Alonso, M., Viollet, C., Gabellec, M. M., Meas-Yedid, V., Olivo-Marin, J. C., Lledo, P. M. Olfactory discrimination learning increases the survival of adult-born neurons in the olfactory bulb. J Neurosci. 26 (41), 10508-10513 (2006).
- Quast, K. B., et al. Developmental broadening of inhibitory sensory maps. Nat Neurosci. 20 (2), 189 (2017).
- Huang, L., et al. Task learning promotes plasticity of interneuron connectivity maps in the olfactory bulb. J Neurosci. 36 (34), 8856-8871 (2016).
- Arbuckle, E. P., Smith, G. D., Gomez, M. C., Lugo, J. N. Testing for odor discrimination and habituation in mice. J Vis Sci. (99), e52615 (2015).
- Zou, J., Wang, W., Pan, Y. W., Lu, S., Xia, Z. Methods to measure olfactory behavior in mice. Curr Protoc Toxicol. , 11-18 (2015).
- Uchida, N., Takahashi, Y. K., Tanifuji, M., Mori, K. Odor maps in the mammalian olfactory bulb: domain organization and odorant structural features. Nat Neurosci. 3 (10), 1035 (2000).
- Cang, J., Isaacson, J. S. In vivo whole-cell recording of odor-evoked synaptic transmission in the rat olfactory bulb. J Neurosci. 23 (10), 4108-4116 (2003).
- Parthasarathy, K., Bhalla, U. S. Laterality and symmetry in rat olfactory behavior and in physiology of olfactory input. J Neurosci. 33 (13), 5750-5760 (2013).
- Rajan, R., Clement, J. P., Bhalla, U. S. Rats smell in stereo. Science. 311 (5761), 666-670 (2006).
- Batista-Brito, R., Close, J., Machold, R., Fishell, G. The distinct temporal origins of olfactory bulb interneuron subtypes. J Neurosci. 28 (15), 3966-3975 (2008).
- Sakamoto, M., et al. Continuous postnatal neurogenesis contributes to formation of the olfactory bulb neural circuits and flexible olfactory associative learning. J Neurosci. 34 (17), 5788-5799 (2014).
- Resendez, S. L., Jennings, J. H., Ung, R. L., Namboodiri, V. M. K., Zhou, Z. C., Otis, J. M., Stuber, G. D. Visualization of cortical, subcortical, and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nat Protoc. 11 (3), 566 (2016).
- Park, S., et al. One-step optogenetics with multifunctional flexible polymer fibers. Nat Neurosci. 20 (4), 612 (2017).
