Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

घ्राण सीखने और चूहों में भेदभाव का एक उद्देश्य और Reproducible परीक्षण

Published: March 22, 2018 doi: 10.3791/57142
Automatic Translation
*1,2, *2,3, 1, 2,4, 4, 4, 1,3,4,5
1Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 2Medical Scientist Training Program, Baylor College of Medicine, 3Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine, 4Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 5Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute at Texas Children's Hospital
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम एक साहचर्य सीखने कार्य पर चूहों ट्रेन गंध भेदभाव का परीक्षण करने के लिए । यह प्रोटोकॉल भी सीखने पर अध्ययन के लिए अनुमति देता है, मस्तिष्क में संरचनात्मक परिवर्तन प्रेरित ।

Abstract

Olfaction चूहों में प्रमुख संवेदी साधन है और चारा सहित कई महत्वपूर्ण व्यवहार को प्रभावित करता है, शिकारी का पता लगाने, संभोग, और parenting. महत्वपूर्ण बात, चूहों घ्राण सर्किट समारोह में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए विशिष्ट व्यवहार प्रतिक्रियाओं के साथ एसोसिएट उपंयास गंध को प्रशिक्षित किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल के लिए एक जाओ/नो-गो operant लर्निंग कार्य पर प्रशिक्षण चूहों के लिए प्रक्रिया का विवरण । इस दृष्टिकोण में, चूहों स्वचालित परीक्षण के सैकड़ों के लिए दैनिक पर प्रशिक्षित कर रहे है 2-4 सप्ताह और फिर उपंयास जाओ पर परीक्षण किया जा सकता/घ्राण भेदभाव का आकलन करने के लिए, या कैसे गंध सीखने पर अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा घ्राण की संरचना या समारोह में बदल सर्किट. इसके अतिरिक्त, माउस घ्राण बल्ब (ओबी) वयस्क जनित न्यूरॉन्स के चल रहे एकीकरण सुविधाएँ. मजे की बात यह है कि घ्राण लर्निंग इन वयस्क जनित न्यूरॉन्स के अस्तित्व और synaptic कनेक्शन दोनों को बढ़ाता है । इसलिए, इस प्रोटोकॉल अंय जैव रासायनिक, electrophysiological के साथ संयुक्त किया जा सकता है, और इमेजिंग तकनीक सीखने और गतिविधि पर निर्भर कारकों का अध्ययन करने के लिए कि ंयूरॉंस अस्तित्व और प्लास्टिक की मध्यस्थता ।

Introduction

माउस ओबी, जहां गंध जानकारी पहले केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में प्रवेश करती है, अनुभव पर निर्भर संरचनात्मक परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रदान करता है । ओबी सर्किट लगातार एक गतिविधि पर निर्भर तरीके से वयस्क पैदा न्यूरॉन्स को एकीकृत करता है. वयस्क जनित न्यूरॉन पूर्ववर्ती progenitors से विभाजित है कि लाइन subventricular क्षेत्र पार्श्व निलय के निकटवर्ती1. ओबी में पलायन पर, इन न्यूरॉन अग्रदूतों या तो जीवित, अंतर, और निरोधात्मक दाना कोशिकाओं के रूप में एकीकृत, या apoptosis2से गुजरना. सेल भाग्य के लिए चयन घ्राण लर्निंग3,4,5,6सहित घ्राण गतिविधि से प्रभावित है । एकीकरण के बाद, सीखने प्रेरित synaptic परिवर्तन एक दो सप्ताह क्रिटिकल अवधि7,8के दौरान दाना कोशिकाओं में होते हैं । इस प्रकार, घ्राण सीखने के लिए परख कैसे अनुभव पर निर्भर प्लास्टिक के संरचनात्मक और कार्यात्मक एक परिपक्व मस्तिष्क सर्किट के पुनर्गठन को प्रभावित करता है की जांच के लिए उपयोगी होते हैं ।

इस प्रोटोकॉल एक operant कंडीशनिंग प्रतिमान का उपयोग करके घ्राण प्रशिक्षण के लिए एक दृष्टिकोण प्रदान करता है । इस कार्य में, पानी से वंचित चूहों एक पानी इनाम और एक गंध के साथ एक गंध ("जाओ" गंध) सहयोगी के लिए प्रशिक्षित किया जाता है ("नहीं जाना" गंध) एक परीक्षण मध्यांतर सजा के साथ । चूहों 2-4 सप्ताह के पाठ्यक्रम पर प्रशिक्षण चरणों की एक वर्गीकृत श्रृंखला के माध्यम से प्रगति । जब प्रशिक्षण पूरा हो गया है, चूहों जाने के लिए या नहीं, असतत, इसी व्यवहार के साथ जाओ गंध का जवाब (जाओ परीक्षणों पर एक पानी इनाम की मांग और नहीं-परीक्षण जाओ पर पानी इनाम की मांग) (चित्रा 1ए) । प्रशिक्षण के बाद पूरा हो गया है, चूहों आगे रासायनिक समान गंध जोड़े के साथ चुनौती दी जा सकता है भेदभाव का परीक्षण या कैसे घ्राण सीखने की संरचना या ओबी के समारोह में परिवर्तन की जांच के अध्ययन के लिए संक्रमण हो जाते हैं । हालांकि गंध भेदभाव कार्यों पहले से वर्णित किया गया है, ज्यादातर ऐसे दो odorants9,10के बीच सूंघने की संख्या के रूप में व्यक्तिपरक माप पर भरोसा करते हैं । इसके अलावा, इस तरह के कार्यों के मानव स्कोरिंग के लिए की जरूरत भी समय गहन है । जाओ/इस प्रोटोकॉल में वर्णित कोई जाना घ्राण लर्निंग कार्य गंध भेदभाव और घ्राण सीखने के एक निष्पक्ष, प्रत्यक्ष माप प्रदान करता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी चूहों NIH मानकों के अनुसार Baylor कॉलेज ऑफ मेडिसिन संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित एक प्रोटोकॉल के तहत इस्तेमाल किया गया । इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त चूहों सभी वयस्क चूहों थे (> 6 आयु के सप्ताह) C57BL6/जम्मू पृष्ठभूमि पर और दोनों पुरुष और मादा चूहे शामिल थे । प्रशिक्षण/हरिणी कार्यों के बाद, चूहे अपने घर पिंजरे में लौट रहे हैं ।

1. Operant लर्निंग बॉक्स का उपयोग करने के लिए निर्माण और सामान्य नियम (चित्र 1B, C)

  1. चैंबर मंजिल के साथ एक माउस चैंबर इकट्ठा । एक कम यातायात में प्रशिक्षण बॉक्स रखें, dimly जलाया क्षेत्र distractions से बचने के लिए.
  2. एक 18-गेज सुई बंदरगाह के अंदर पानी वितरण करने की अनुमति देने के लिए शीर्ष पर एक छोटे से छेद के साथ प्रत्येक पानी बंदरगाह ड्रिल ।
  3. खनिज तेल में भंग गंध के साथ कांच की शीशी भरें (साप्ताहिक की जगह), और सुरक्षित रूप से टोपी को मजबूत ।
  4. सिलिकॉन टयूबिंग के लिए 18 गेज सुई कनेक्ट । पियर्स 18-गेज सुई के साथ कांच की शीशी टोपी, और गंध बंदरगाहों के सेवन के लिए सिलिकॉन टयूबिंग के दूसरे छोर से कनेक्ट ।
  5. एक गंध वाल्व में प्रत्येक सिलिकॉन टयूबिंग प्लेस ।
  6. गंध बंदरगाहों के लिए वैक्यूम लाइन कनेक्ट ।
  7. एक धातु पकड़े रॉड करने के लिए २ १० मिलीलीटर सिरिंज अनुलग्न करें, और सिरिंजों के लिए टयूबिंग कनेक्ट. एक 18 जी सुई के लिए टयूबिंग के दूसरे पक्ष कनेक्ट । माउस कक्ष पर नाक प्रहार बंदरगाह के ड्रिल्ड छेद में सुई फिट । पानी वाल्व के लिए टयूबिंग के दूसरे छोर से कनेक्ट करें ।
  8. २ १० एमएल सीरिंज को कुतर कर पीने वाले पानी के साथ भरें ।
  9. हवा का सेवन करने के लिए एक हवा प्रवाह मीटर कनेक्ट और 3 में हवा का प्रवाह बनाए रखने-5 L/
  10. कनेक्ट 2 पानी वाल्व, 2 गंध वाल्व, 2 पानी बंदरगाहों, गंध बंदरगाह, और USB अंतरफलक प्रणाली को शक्ति । ' आउटपुट ' बंदरगाहों के लिए सभी वाल्व कनेक्ट, सभी गंध और पानी बंदरगाहों ' इनपुट ' बंदरगाहों के लिए । usb इंटरफ़ेस बॉक्स से पावर आउटपुट के लिए सभी उपकरण कनेक्ट करें, और अंत में, usb इंटरफ़ेस बॉक्स को पावर से कनेक्ट करें ।
  11. परीक्षणों के बीच गंध के पार संदूषण से बचने के लिए वैक्यूम चूषण समायोजित करें ।
  12. कक्ष के लिए गंध शीशियों को जोड़ने के लिए गंध विशिष्ट टयूबिंग का प्रयोग करें ।

2. माउस तैयारी: 1-3 दिन

  1. चूहों 3 समूहों में विभाजित: नियंत्रण (कोई घ्राण आवश्यक प्रशिक्षण), छद्म प्रशिक्षित (चूहों जो यादृच्छिक पर इनाम या सजा प्राप्त), और प्रशिक्षित समूहों. प्रशिक्षण बॉक्स और गंध वितरण करने के लिए छद्म प्रशिक्षित चूहों बेनकाब, लेकिन इनाम बनाम सजा का परिणाम बेतरतीब ढंग से दिया गंध के साथ जुड़ा हुआ है क्योंकि घ्राण प्रशिक्षण प्रदान नहीं करते ।
    नोट: छद्म प्रशिक्षित समूह "Pseudotraining" चरणों के तहत प्रशिक्षण प्रतिमान के माध्यम से जाना जाएगा । प्रशिक्षित चूहों सभी प्रशिक्षण चरणों को पूरा करेगा । Pseudotraining वैकल्पिक है अगर प्रयोग का उद्देश्य गंध भेदभाव या सीखने में व्यवहार मतभेदों के लिए परख है । यहां दिए गए प्रोटोकॉल इस समूह को जोड़ता है यदि प्रयोगकर्ता को प्रशिक्षण के पहले और बाद में ंयूरॉन मतभेदों के लिए जांच करना चाहता है । pseudotrained समूह तो निष्क्रिय गंध जोखिम और गैर घ्राण संबंधित प्रशिक्षण के लिए नियंत्रण होगा ।
  2. चूहों में जल प्रतिबंध शुरू करने के लिए 40 मिलीलीटर/ bodyweight नुकसान से बचने के 20% जानवरों की आधारभूत वजन के लिए संकट से बचने के लिए (चित्रा 2) ।
  3. चूहों दैनिक वजन सुनिश्चित करने के लिए वे आधारभूत वजन के 80% से ऊपर हैं । यदि कोई माउस इस दहलीज से नीचे गिरता है, तो अध्ययन से माउस को हटा दें और पानी तक मुफ्त पहुंच प्रदान करें ।
  4. तापमान, शोर सहित प्रोटोकॉल भर में लगातार सभी पर्यावरणीय कारकों रखें, और आवारा गंध (व्यक्तिगत शरीर और इत्र/कोलोन/
    नोट: के रूप में सभी पशु व्यवहार के परीक्षण के साथ, छोटे पर्यावरण परिवर्तन बहुत परिणाम प्रभावित कर सकते हैं ।

3. सभी चरणों के लिए निर्देश

  1. नीचे प्रत्येक चरण के लिए कोड प्रशिक्षण सॉफ्टवेयर । व्यवहार सॉफ्टवेयर पर सॉफ्टवेयर भागो ।
    नोट: सभी चरणों के लिए कोडिंग पूरक कोडिंग फ़ाइलों में निहित हैं । 20 ट्रेल्स के लिए डेटा किसी एकल खंड के रूप में समूहीकृत होते हैं और ब्लॉक्स में माउस प्रदर्शन प्रदर्शित होता है । इसके अलावा, प्रत्येक चरण पूरा मानदंड से मुलाकात कर रहे हैं, जब तक दिनों की एक संख्या के लिए एक माउस पर दोहराया जा सकता है.
  2. चूहों के व्यवहार बॉक्स में 60 मिनट से अधिक दिन के लिए नहीं रखें ।
  3. पिंजरे से साफ माउस कचरे से पहले प्रत्येक माउस पिंजरे में स्थानांतरित कर रहा है । स्प्रे और 70% इथेनॉल के साथ चैंबर पोंछ माउस गंध व्याकुलता को कम करने के लिए ।

4. प्रशिक्षण चरण 1: एक केंद्र नाक प्रहार, 1-3 दिन के साथ पानी इनाम जोड़

  1. इस चरण में, पानी बंदरगाह के अंवेषण पर एक पानी इनाम के साथ सहयोगी चूहों ।
  2. प्रशिक्षण चरण 1 प्रोग्रामिंग निर्देश
    1. कार्यक्रम इस चरण केवल पानी वितरण बंदरगाह का उपयोग करने के लिए । माउस प्रत्येक नाक प्रहार के लिए एक जल इनाम प्राप्त करते हैं ।
      नोट: कार्यक्रम परीक्षण के समय अवधि और पानी पुरस्कार माउस प्राप्त की कुल संख्या उत्पादन होगा ।
  3. pseudotraining चरण 1 प्रशिक्षण चरण 1 के रूप में ही प्रोग्रामिंग सेट करें ।
  4. बॉक्स कॉन्फ़िगरेशन और माउस सेटअप
    1. व्यवहार बॉक्स में एक पानी पोर्ट के साथ केंद्र और सभी साइड पोर्ट पहुंच योग्य के साथ कॉंफ़िगर करें । चैंबर में एक माउस रखें । माउस कक्ष को बंद करें और चरण 1 प्रोग्राम प्रारंभ करें ।
  5. जब माउस 60 मिनट के भीतर 100 परीक्षणों को प्राप्त पूरा के रूप में इस स्तर पर विचार करें । 60 मिनट या 100 परीक्षणों के बाद चैंबर से माउस को हटा (चित्रा 2बी) पूरा किया गया है ।
    नोट: व्यक्तिगत मतभेदों के कारण, कुछ चूहों स्वाभाविक रूप से बॉक्स की खोज से बचना होगा.
  6. यदि प्रोत्साहन की जरूरत है, स्वयं पानी बंदरगाह में पानी देने । इस अवस्था को 3 दिन तक दोहराएं ।
    नोट: पहले से ही प्रशिक्षित चूहे समता बनाए रखने और उंहें द्रव प्रतिबंध पर रखने के लिए आगे दोहराया जा सकता है । यह भी एक पूरे समूह को बढ़ावा देने के लिए संभव है 2 चरण जब समूह औसत तक पहुंच 100 परीक्षणों/ यह सभी चूहों के लिए एक ही दिन पर प्रशिक्षण जारी रखने के लिए अनुमति देगा ।

5. प्रशिक्षण चरण 2: केंद्र बंदरगाह नाक प्रहार, 1-5 दिनों के साथ एक पक्ष बंदरगाह पानी इनाम जोड़

  1. इस अवस्था में, चूहों को केंद्र के बंदरगाह में उनकी नाक पर प्रहार करते हैं और फिर तुरंत ओर बंदरगाहों पर एक जल पुरस्कार प्राप्त होता है.
  2. बॉक्स कॉन्फ़िगरेशन और माउस सेटअप
    1. इस और हर बाद चरण 2 पक्षों पर पानी बंदरगाहों और बीच में गंध बंदरगाह के साथ कॉंफ़िगर करें । चैंबर में एक माउस रखें । माउस कक्ष को बंद करें और चरण 2 प्रोग्राम प्रारंभ करें ।
  3. प्रशिक्षण चरण 2 प्रोग्रामिंग निर्देश
    1. केंद्र गंध वितरण बंदरगाह में एक नाक प्रहार के बाद दोनों पक्षों पर एक तत्काल पानी इनाम के साथ माउस प्रदान करें । परीक्षण की समयावधि के रूप में इस चरण के लिए आउटपुट पैरामीटर्स सेट करें, प्रारंभ किए गए परीक्षणों की संख्या और नाक के प्रहार के 5 s के भीतर प्राप्त जल पुरस्कारों की संख्या ।
  4. pseudotraining चरण 2 प्रशिक्षण चरण 2 के रूप में ही प्रोग्रामिंग सेट करें ।
  5. पूरा के रूप में इस चरण पर विचार करें जब 40 परीक्षणों की एक ंयूनतम 60 मिनट में प्रदर्शन कर रहे हैं, पानी पुरस्कार के कम से 25% के साथ केंद्र बंदरगाह नाक प्रहार के 5 एस के भीतर प्राप्त की । इस अवस्था के पूर्ण हो जाने पर माउस को निकालें (चित्र 2C) ।
    नोट: प्रशिक्षण कार्यक्रम इस चरण के पूरा निर्धारित करने के क्रम में एक समय पर ढंग से प्राप्त जल पुरस्कार का प्रतिशत की गणना करता है. हालांकि चूहों में भिन्नता कितनी तेजी से वे इस स्तर को पूरा, अधिकांश चूहों 5 दिनों के भीतर पूरा मापदंड तक पहुँच जाएगा. हालांकि, यदि कोई माउस 5 दिनों के भीतर इस चरण पूर्ण नहीं है, तो माउस अगले चरण के लिए अग्रिम नहीं है । यह माउस पलटने से निकाल दिया जाएगा ।

6. प्रशिक्षण चरण 3: एक विशिष्ट गंध के साथ एक पानी इनाम और एक विशिष्ट समय खिड़की के भीतर, 1-3 दिन जोड़

  1. इस चरण में, चूहों केंद्र बंदरगाह में एक नाक प्रहार पर एक जाओ (एस +) गंध प्राप्त करते हैं । इसके बाद, 5 एस के भीतर पक्ष पानी बंदरगाहों में एक नाक प्रहार पर एक पानी इनाम उपज ।
  2. प्रशिक्षण चरण 3 प्रोग्रामिंग निर्देश
    1. केंद्र गंध बंदरगाह में एस + गंध उद्धार ।
    2. पानी इनाम उद्धार अगर माउस एक गंध प्रसव के 5 एस के भीतर की ओर बंदरगाहों प्रहार ।
      नोट: कार्यक्रम केवल केंद्र बंदरगाह में एक 100 एमएस नाक प्रहार की आवश्यकता से शुरू होता है एक पानी इनाम उपज । एक बार माउस परीक्षणों के 80% में समय की सही राशि के लिए केंद्र बंदरगाह प्रहार, एक नाक एक जल इनाम के लिए आवश्यक प्रहार की समय अवधि 50 ms द्वारा 400 ms तक वृद्धि होगी ।
    3. चरण 2 के समान आउटपुट पैरामीटर सेट करें ।
  3. pseudotraining चरण 3 प्रोग्रामिंग निर्देश प्रशिक्षण चरण 3 के रूप में ही सेट करें । हालांकि, एस + गंध एक जल इनाम के साथ संबद्ध नहीं है कि यह सुनिश्चित करने के लिए गंध वितरण नियंत्रक करने के लिए कनेक्ट न करें ।
  4. बॉक्स कॉन्फ़िगरेशन और माउस सेटअप
    1. चरण 2 में एक ही कॉंफ़िगरेशन सेट करें ।
    2. गंध वितरण नियंत्रक के लिए एस + गंध कनेक्ट । चैंबर में एक माउस रखें । माउस कक्ष को बंद करें और चरण 3 प्रोग्राम प्रारंभ करें । एक बार यह अवस्था पूर्ण हो जाने पर माउस निकालें ।
  5. 60 मिनट (चित्रा 2डी) के भीतर 60 से अधिक पुरस्कार हैं जब पूरा के रूप में इस चरण पर विचार करें.

7. स्टेज 4a: नहीं-जाओ (एस-) गंध और समय से बाहर सजा, 1-2 दिन जोड़

  1. इस चरण में, एक नहीं जाना गंध (S-) के लिए चूहों परिचय । एक बार बाहर की सजा चूहों कि गलत ढंग से पानी बंदरगाहों के लिए जाने के लिए नहीं-जाओ गंध गंध के बाद प्रदान करते हैं ।
  2. प्रशिक्षण चरण 4a प्रोग्रामिंग निर्देश
    1. शुरू में इस चरण में केवल एस + गंध उद्धार, 3 चरण के लिए समान । चूहों 40 परीक्षणों को पूरा करने के बाद, दोनों एस शामिल करने के लिए गंध के यादृच्छिक वितरण शुरू + और एस-गंध. कार्यक्रम एक 2-सजा बाहर समय अगर माउस के बाद एक पानी इनाम की तलाश का प्रयास नहीं-जाओ गंध प्रस्तुत किया जा रहा है ।
      नोट: जाने बनाम नहीं जाना भेद में सहायता करने के लिए, IR पक्ष रोशनी में हेरफेर किया जा सकता है कि वे जाओ odorants के दौरान और बंद के दौरान नहीं जाना odorants । रोशनी एक माध्यमिक क्यू के रूप में कार्य करने के लिए प्रारंभिक प्रशिक्षण में चूहों सहायता । एक बार चूहों रोशनी के साथ प्रशिक्षित किया जाता है, वे के तहत रोशनी के बिना प्रशिक्षण जाना चाहिए की पुष्टि के लिए वे गंध के साथ कार्य सीखा है ।
    2. परीक्षण के समय अवधि के रूप में उत्पादन पैरामीटर सेट, शुरू की परीक्षणों की संख्या, पूरा परीक्षण की संख्या,% सही है, और प्राप्त पुरस्कार की कुल संख्या ।
  3. pseudotraining चरण 4a प्रोग्रामिंग निर्देश एस के अलावा प्रशिक्षण चरण 4s के रूप में सेट + और एस-गंध शुरू से ही बेतरतीब ढंग से प्रस्तुत कर रहे हैं । कार्य प्रदर्शन की परवाह किए बिना यादृच्छिक पर पानी इनाम या मध्यांतर सजा दे ।
  4. बॉक्स कॉन्फ़िगरेशन और माउस सेटअप
    1. पिछले चरण 3 के समान बॉक्स कॉंफ़िगरेशन सेट करें ।
    2. गंध वितरण नियंत्रक के लिए दोनों एस + और एस-गंध कनेक्ट । चैंबर में एक माउस रखें । माउस चैंबर बंद करें और चरण 4a कार्यक्रम शुरू करते हैं । चूहों 40 परीक्षणों को पूरा करने के बाद, बेतरतीब ढंग से गंध देने के लिए कार्यक्रम स्विच । एक बार यह अवस्था पूर्ण हो जाने पर माउस निकालें ।
  5. पूर्ण रूप में इस चरण पर विचार करें जब > 60% सही प्रतिक्रियाओं के साथ 40 परीक्षण कर रहे हैं ।

8. स्टेज 4B: नहीं-जाओ (एस-) गंध और समय बाहर सजा, 5-11 दिन जोड़

  1. प्रशिक्षण चरण 4B प्रोग्रामिंग निर्देश
    1. चरण 4a के लिए इस चरण समान बनाओ, लेकिन एक के बाद एक पानी इनाम के प्रयास के लिए सजा बाहर समय एस-गंध 4 एस है ।
  2. चरण 4a के समान pseudotraining स्टेज 4B प्रोग्रामिंग निर्देश सेट करें, लेकिन पानी इनाम और सजा बाहर समय बेतरतीब ढंग से परीक्षण प्रति दिया जाता है.
  3. बॉक्स कॉन्फ़िगरेशन और माउस सेटअप
    1. सेट बॉक्स विंयास पिछले चरण 4a के रूप में ही ।
    2. गंध वितरण नियंत्रक के लिए दोनों एस + और एस-गंध कनेक्ट । चैंबर में एक माउस रखें । माउस कक्ष को बंद करें और चरण 4B प्रोग्राम प्रारंभ करें । इस चरण पर विचार पूरा जब वहां रहे है > 100 सटीकता के साथ ंयूनतम के भीतर परीक्षण > 85% (चित्रा 2ई)
  4. इस अवस्था में प्रत्येक माउस की प्रगति को ट्रैक करने के लिए प्रत्येक सत्र के लिए अधिकतम और ंयूनतम प्रतिशत सही मॉनीटर करें । लगभग 85-90% चूहे इस अवस्था के लिए पूर्णता मानदंड तक पहुंचते हैं । चूहों कि जाने के लिए इस चरण के पूरा होने/नहीं परीक्षण चरण जाओ/
  5. वैकल्पिक) इस चरण के अंत में, एक उलटा प्रशिक्षण लागू करें, जहां go/नो-गो odorants गंध शीशी मंच पर स्विच कर रहे हैं । यह सुनिश्चित करें कि चूहे एक और उत्तेजना के साथ संबद्ध नहीं हैं, जैसे कि पक्ष बंदरगाहों के साथ जुड़े वाल्व की आवाज ।

9. जाओ/कोई जाओ परख कार्य: 1 दिन, 20 प्रति दिन माउस प्रति मिनट

  1. अंतिम चरण के रूप में इस पर विचार गंध संघों की पहचान करने और भेदभाव गंध जोड़े को सीखने की सटीकता निर्धारित करने के लिए ।
    नोट: उपन्यास odorants S +/S-के लिए उपयोग किया जाता है परीक्षण करने के लिए कितनी देर तक जानवरों नई संघों जानने के लिए ले. संरचनात्मक समान गंध जोड़े कार्य कठिनाई को बढ़ाने के लिए उपयोग किया जाता है । उदाहरणों में शामिल है 1-ब्यूटानॉल vs .1-Pentanol, Isoamyl एसीटेट vs. Isoamyl Butyrate, and + कार्वोन vs.-कार्वोन.
  2. प्रोग्रामिंग निर्देश
    1. प्रशिक्षण सॉफ्टवेयर नाक प्रहार की लंबाई का पता लगाने चलो । कार्यक्रम केंद्र गंध बंदरगाह में एक 300 एमएस नाक प्रहार कार्य को निष्पादित करने के लिए ।
    2. किसी भी प्रकाश निर्देशित cues का उपयोग नहीं छोड़कर, चरण 4B के समान आउटपुट पैरामीटर सेट करें ।
  3. बॉक्स कॉन्फ़िगरेशन और माउस सेटअप
    1. पिछले चरण 4B के समान ही बॉक्स कॉंफ़िगरेशन सेट करें ।
    2. गंध वितरण नियंत्रक के लिए दोनों एस + और एस-गंध कनेक्ट । चैंबर में एक माउस रखें । माउस चैंबर को बंद करें और स्टेज जाओ शुरू/ चूहों कि रासायनिक समान गंध के उपंयास जोड़े को घ्राण सीखना कार्य सीखा है बेनकाब ।
      नोट: पर्याप्त गंध भेदभाव के साथ Wildtype चूहों तक पहुंचने > लगभग 10-20 ब्लॉक या 200-400 परीक्षणों के बाद उपंयास odorants के साथ 85% सटीकता (चित्रा 3ए) ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

एक बार चूहों घ्राण सीखने कार्य सीखा है, वे अब पुरस्कार और सजा के साथ उपंयास गंध जोड़े सहयोगी कर सकते हैं । इन प्रशिक्षित चूहों आम तौर पर जाने पर के बारे में 50% सटीकता के साथ शुरू/ सही प्रतिशत उपन्यास गंध जोड़े (चित्रा 3ए) के लिए एक सीखने की अवस्था के रूप में परीक्षण ब्लॉक द्वारा प्लॉट किया जा सकता है । 10 ब्लॉक परीक्षणों, जो सबसे अधिक चूहों 30 मिनट से कम करने के लिए प्रदर्शन के भीतर ले, चूहों को सही ढंग से अधिक से अधिक 85% सटीकता (लाल रेखा) के साथ गंध के बीच भेदभाव करने में सक्षम हैं । यह पता चलता है कि हमारे प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक wildtype चूहों एक पानी इनाम के साथ एक गंध सहयोगी और एक दूसरे को मध्यांतर सजा के साथ प्रशिक्षित किया है । दो साथियों के बीच भेदभाव क्षमताओं का आकलन करने के लिए, इन आंकड़ों को और अधिक 85% प्रवीणता (चित्रा 3बी) तक पहुंचने के लिए आवश्यक परीक्षणों की संख्या की तुलना करने के लिए विश्लेषण किया जा सकता है या औसत प्रतिशत प्रवीणता तक पहुंचने के बाद सही ।

एक बार चूहों कार्य जानने के लिए, गंध जोड़े को बढ़ाने या कार्य कठिनाई को कम करने के लिए संशोधित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, गंध-जोड़ी एकाग्रता कम कार्य कठिनाई (चित्रा 3सी) बढ़ जाती है । यह विश्लेषण विभिन्न चूहों के साथियों के लिए पता लगाने की दहलीज को प्रकट कर सकता है । इसके अलावा, गंध जोड़े को और अधिक संरचनात्मक समान (यानी, enantiomers या एकल कार्बन मतभेद) बनने के लिए बदला जा सकता है । गंध मिश्रण भी कार्य कठिनाई (यानी, 40/60 मिश्रण बनाम 30/70 मिश्रण) को बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

चूहे भी पिछले सीखा गंध जोड़े को याद करने में सक्षम हैं । कार्य सीखने के बाद से 7 दिनों के इंतजार के बाद, एक याद परीक्षण शो है कि wildtype चूहों जल्दी से पहले सीखा गंध संघों (चित्रा 3डी) याद कर सकते हैं ।

Figure 1
चित्र 1 : go/नहीं-जाओ प्रशिक्षण प्रतिमान और उपकरण विंयास । (क) चूहों या तो जाओ गंध प्रस्तुति के दौरान पानी प्राप्त करने या कोई नहीं जाना गंध प्रस्तुति के दौरान परहेज द्वारा सही ढंग से जवाब । (B) व्यवहार बॉक्स कॉंफ़िगर किया गया है जैसे कि केवल एक ही जल पोर्ट चरण 1 के दौरान पहुंच योग्य है और उसके बाद के सभी चरणों में एक केंद्रीय गंध वितरण पोर्ट और दो पानी पोर्ट होते हैं । ब्लू सर्कल: जल बंदरगाह । ग्रीन सर्कल: गंध बंदरगाह । (ग) गंध प्रसव प्रत्येक गंध के लिए एक गंध वाल्व द्वारा gated है । सकारात्मक दबाव हवा का सेवन एक वितरक की ओर जाता है । लाल तीर सकारात्मक हवा के दबाव लाइन तैयार गंध शीशी (लाल वृत्त) में जा रहा संकेत मिलता है । नीले तीर गंध शीशी छोड़ने और एक सफेद हवा को एकीकृत बॉक्स में प्रवेश और एक गंध वाल्व (हल्के नीले रंग के सर्कल) के माध्यम से गुजर रहा है हवा/ नारंगी तीर सकारात्मक दबाव को एकीकृत बॉक्स के लिए एक केंद्रीय नियामक वाल्व (नारंगी सर्कल) के लिए जा रहा इंगित करता है सकारात्मक हवा के लिए गंध डिलीवरी बंदरगाह (नीचे काला तीर) के लिए एकीकृत बॉक्स से गंध/ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : प्रशिक्षण डेटा. (क) चूहों शरीर के वजन प्रतिशत 80% से नीचे नहीं छोड़ करता है, जबकि द्रव प्रतिबंध पर. लाल रेखा = 80% दहलीज । N = 8 चूहों । (ख) चरण 1 प्रशिक्षण परिणाम केंद्र बंदरगाह की संख्या 60 मिनट में प्रहार को पानी इनाम प्राप्त दिखाते हैं । N = 8 चूहों । त्रुटि पट्टियां माध्य की मानक त्रुटि हैं । (ग) चरण 2 प्रशिक्षण परिणाम केंद्र नाक प्रहार के 5 एस के भीतर प्राप्त जल पुरस्कार का प्रतिशत दिखाओ । लाल रेखा 25% थ्रेशोल्ड है । मतलब के मानक त्रुटि के रूप में ग्रे हाइलाइटिंग के साथ प्रतिशत का मतलब है । N = 8 चूहों । (D) चरण 3 संचई पारितोषिक 1 दिन और प्रशिक्षण के दिन 2 पर 8 चूहों द्वारा प्राप्त पुरस्कार की संख्या दिखाओ । रेड लाइन 60 ॰ थ्रेसहोल्ड है । त्रुटि पट्टियां मानक विचलन हैं । (E) चरण 4B शुद्धता परिणाम स्टेज 4B के लिए प्रतिशत सही प्रतिसाद प्रदर्शित करता है । लाल रेखा सीमा के 85% है । ठोस काली रेखा का अर्थ है और धूसर हाइलाइटिंग माध्य की मानक त्रुटि है । N = 4 चूहों । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: go/कोई कार्य के लिए प्रतिनिधि परिणाम । (A) go/2 उपन्यास odorants (s + = isoamyl एसीटेट/s-= amyl एसीटेट) के बाद चूहों को eugenol (s +) और eucalyptol (s-) पर प्रशिक्षित किया गया । N = 5 चूहों, ग्रे में मतलब की मानक त्रुटि के साथ । ग्रीन लाइन 50% सटीकता है, लाल रेखा सीमा 85% सटीकता है । (B) एक माउस के लिए go कार्य का उदाहरण है जो hexanol (s +), और butyric एसिड (s-) के लिए एक धीमी शिक्षार्थी माउस बनाम एक तेजी से शिक्षार्थी होगा । (C) hexanol (s +) और butyric अम्ल (s-) के आंशिक दबावों को अलग करने के लिए कोई जाना-जाना कार्य/ (घ) चूहों के प्रशिक्षण के 7 दिनों के बाद गंध जोड़ी को याद करने की क्षमता । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

कुतर घ्राण प्रणाली संवेदी निर्भर प्लास्टिक का अध्ययन करने के लिए एक अनूठा मॉडल प्रदान करता है । यहाँ हम एक घ्राण सीखने प्रतिमान वर्तमान चूहों को प्रशिक्षित करने के लिए या तो एक इनाम या सजा के साथ सुगंधित जोड़े सहयोगी. इस अधिगम कार्य के माध्यम से, बहाव सर्किट परिवर्तन बाद में प्रयोगों में अध्ययन किया जा सकता है (इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, vivo में ंयूरॉन इमेजिंग, आदि.). पूरा होने पर, चूहों एक सरल गंध cued कार्य करने के लिए एक गंध के साथ एक पानी इनाम सहयोगी, और एक और गंध के साथ एक मध्यांतर सजा करने के लिए सीखना होगा ।

चूंकि यह एक व्यवहार परख है, हम उंर और प्रयोगात्मक और नियंत्रण पशु समूहों के बीच सेक्स के एक समान वितरण का उपयोग करने की सलाह देते हैं । यह जरूरी है कि चूहों के बीच शर्तों को यथासंभव स्थिर रखा जाए. उदाहरण के लिए, सुनिश्चित करें कि चूहों हैंडलर और प्रकाश व्यवस्था की स्थिति प्रशिक्षण के दौरान स्थिर रहते हैं । कई चूहों कार्य अपेक्षा के अनुरूप नहीं करते हैं, तो निम्न स्थितियाँ पूरी हैं सुनिश्चित करें: (1) व्यवहार सेटअप को यथासंभव शांत रखें. (२) पानी चूहों को पर्याप्त रूप से वंचित. हम पाते है कि पानी के अभाव के एक पूरे दिन के बाद भी, कई चूहे पर्याप्त पर्याप्त पीने के चरण 1 बॉक्स के केंद्र बंदरगाह से पूरा मानदंड तक पहुंचने के लिए नहीं होगा । (3) प्रत्येक नए माउस की शुरुआत में, गंध/पानी वाल्व और ट्यूबों की जांच करने के लिए उचित स्थान सुनिश्चित करते हैं । (4) Odorants उनके अस्थिरता में बदलती है और इसलिए कुछ जल्दी से दूसरों की तुलना में लुप्त हो जाना । अधिक अस्थिर odorants के बजाय साप्ताहिक के दैनिक उच्च वाष्प दबावों के साथ बदलें, खासकर अगर कम सांद्रता का उपयोग किया जाता है ।

इस प्रोटोकॉल को प्रायोगिक प्रयोजन के अनुसार संशोधित किया जा सकता है । यदि स्टेज 4B में सीखने का समय महत्वपूर्ण है, तो इस अवस्था तक किसी भी गंध को दूर करना उचित हो सकता है. यह सुनिश्चित करता है कि किसी भी घ्राण लर्निंग चरण 4B में शुरू होता है । यह पूरा करने के लिए, हम मंच 3 से गंध को हटाने और पूरी तरह से चरण 4a लंघन द्वारा इस प्रोटोकॉल का प्रदर्शन किया है । चूहों एक अधिक कठिन समय इस विधि का उपयोग पूरा मानदंड तक पहुँचने होगा, लेकिन यह भी कैसे जल्दी चूहों इस कार्य पहली बार जानने के लिए बहुमूल्य जानकारी देता है.

इस प्रोटोकॉल की एक सीमा है कि चूहों घ्राण परीक्षण किया जा सकता है जब तक विभिंन चरणों को पूरा करने के लिए है । इसलिए, हालांकि हमारी प्रयोगशाला द्वारा नहीं देखा, एक हेरफेर अनुभूति बाधा हो सकती है कि इस तरह के चरण 4B लगातार नहीं पहुंचा है । हम यह सुनिश्चित करना है कि प्रत्येक चरण पर्याप्त लंबे समय के लिए सबसे अधिक चूहों प्रशिक्षण के अगले कदम के लिए स्नातक करने की अनुमति पर्याप्त है द्वारा इस समस्या को नकारने की कोशिश की है । हालांकि, अगर एक माउस पूर्ण प्रशिक्षण अवधि के बाद भी एक मंच के लिए पूरा मानदंड तक पहुंच नहीं है, हम उस चूहे पलटने से दूर । यह हमें किसी भी व्यक्ति माउस पर प्रतीक्षा किए बिना अध्ययन जारी रखने के लिए अनुमति देता है । एक और सीमा है कि हम अभी तक अंय पशु olfaction के क्षेत्र के लिए महत्वपूर्ण मॉडल के लिए इस प्रोटोकॉल का विस्तार है । चूहों, उदाहरण के लिए, ओबी11,12के भीतर ंयूरॉन समारोह खुलासा करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है । अपनी बुद्धि के कारण, चूहों को भी चूहों13,14की तुलना में तेजी से सीखने के समय है । इन सीमाओं के बावजूद, हमने इस प्रोटोकॉल के लिए चूहों को चुना है क्योंकि सेल प्रकार विशिष्ट जोड़तोड़ और रिकॉर्डिंग15प्रदर्शन के लिए उनके आनुवंशिक पथ की वजह से ।

अधिकांश मौजूदा प्रोटोकॉल गंध सूंघ या लगभग भेदभाव या सीखने के लिए गंध के बगल में बिताए समय में अंतर का उपयोग करें4,6,9,10,16। इस प्रोटोकॉल सीधे परीक्षण के आधार पर एक परीक्षण पर भेदभाव माप सकते हैं । इसके अलावा, यह परीक्षण प्रत्येक माउस के लिए एक संबद्धता सीखने की जरूरत की सही संख्या उपाय कर सकते हैं । यह पूरी तरह से स्वचालित दृष्टिकोण डेटा विश्लेषण से किसी भी मानव पूर्वाग्रह को हटा । भोजन से वंचित पशुओं को भी सफलतापूर्वक घ्राण सीखने के लिए इस्तेमाल किया गया है । पानी से वंचित चूहों परीक्षणों की बढ़ी संख्या के कारण चुना गया एक माउस भोजन पर पानी के साथ प्रदर्शन कर सकते हैं16.

के रूप में प्रत्यारोपित गतिविधि पर नज़र रखता है, जैसे वर्गीकृत-सूचकांक (मुस्कराहट) लेंस और बहु इकाई इलेक्ट्रोड, में सुधार जारी है, हम जल्द ही इस प्रोटोकॉल17,18के साथ उन प्रौद्योगिकियों गठबंधन करने में सक्षम हो सकता है । घ्राण सीखने के दौरान फार्म प्रासंगिक मस्तिष्क क्षेत्रों रिकॉर्डिंग से, यह जांच करने के लिए संभव है कि कैसे साहचर्य सीखने के दौरान ंयूरॉंस गतिविधियों बदल जाते हैं । यह इस तरह के रूप में कैसे ंयूरॉंस जानकारी अलग ढंग से सीखने के दौरान मौलिक तंत्रिका विज्ञान के सवालों, प्रकट मदद कर सकते हैं ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखक हित और कोई प्रतिस्पर्धी हितों का कोई टकराव नहीं की घोषणा ।

Acknowledgments

इस प्रोटोकॉल हमारे लैब के भीतर पिछले काम से अनुकूलित है (हुआंग एट अल । 8). यहां वर्णित सभी तरीकों को Baylor कॉलेज ऑफ मेडिसिन की एनिमल केयर एंड फीमेल कमेटी (ACUC) ने अनुमोदित कर दिया है । इसे McNair आयुर्विज्ञान संस्थान, NINDS ग्रांट R01NS078294 को B.R.A., NIH IDDRC ग्रांट U54HD083092, NIDDK ग्रांट F30DK112571 को JMP, और NINDS अनुदान F31NS092435 को CKM से समर्थन प्राप्त है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass vial Qorpak GLC-01016
Silicon Tubing Thermo Scientific 86000030
18 gauge needles BD 305196
1-Butanol Sigma Aldrich 437603
Propionic Acid Sigma Aldrich 402907
Mouse Chamber Med Associates ENV-307W
Chamber Floor Med Associates ENV-307W-GFW
Water Port Med Associates ENV-313W Need two
Odor stimulus Med Associates ENV-275 Contain 2 valves to gate odor delivery 
Odor Port Med Associates ENV-375W-NPP
USB Interface Med Associates DIG-703A-USB
Desktop Computer with Windows 2000, XP, Vista, or 7
Flow meter VWR 97004-952
Behavioral software Med Associates SOF-735 This software, which runs each training stage, has now been replaced with Med-PC V
Data Transfer software Med Associates SOF-731 This software formats the data to Excel
Training Software Med Associates DIG-703A-USB This software is used to program each training stage
Water Valve Neptune Research 225P012-11 This valve is used to gate the water delivery. Need Two
Odor Valve Neptune Research 360P012-42 This valve is used to gate the odor delivery. Need Two

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carleton, A., Petreanu, L. T., Lansford, R., Alvarez-Buylla, A., Lledo, P. M. Becoming a new neuron in the adult olfactory bulb. Nat Neurosci. 6 (5), 507-518 (2003).
  2. Petreanu, L., Alvarez-Buylla, A. Maturation and death of adult-born olfactory bulb granule neurons: role of olfaction. J Neurosci. 22 (14), 6106-6113 (2002).
  3. Yamaguchi, M., Mori, K. Critical period for sensory experience-dependent survival of newly generated granule cells in the adult mouse olfactory bulb. PNAS. 102 (27), 9697-9702 (2005).
  4. Rochefort, C., Gheusi, G., Vincent, J. D., Lledo, P. M. Enriched odor exposure increases the number of newborn neurons in the adult olfactory bulb and improves odor memory. J Neurosci. 22 (7), 2679-2689 (2002).
  5. Arenkiel, B. R., et al. Activity-induced remodeling of olfactory bulb microcircuits revealed by monosynaptic tracing. PloS one. 6 (12), 29423 (2011).
  6. Alonso, M., Viollet, C., Gabellec, M. M., Meas-Yedid, V., Olivo-Marin, J. C., Lledo, P. M. Olfactory discrimination learning increases the survival of adult-born neurons in the olfactory bulb. J Neurosci. 26 (41), 10508-10513 (2006).
  7. Quast, K. B., et al. Developmental broadening of inhibitory sensory maps. Nat Neurosci. 20 (2), 189 (2017).
  8. Huang, L., et al. Task learning promotes plasticity of interneuron connectivity maps in the olfactory bulb. J Neurosci. 36 (34), 8856-8871 (2016).
  9. Arbuckle, E. P., Smith, G. D., Gomez, M. C., Lugo, J. N. Testing for odor discrimination and habituation in mice. J Vis Sci. (99), e52615 (2015).
  10. Zou, J., Wang, W., Pan, Y. W., Lu, S., Xia, Z. Methods to measure olfactory behavior in mice. Curr Protoc Toxicol. , 11-18 (2015).
  11. Uchida, N., Takahashi, Y. K., Tanifuji, M., Mori, K. Odor maps in the mammalian olfactory bulb: domain organization and odorant structural features. Nat Neurosci. 3 (10), 1035 (2000).
  12. Cang, J., Isaacson, J. S. In vivo whole-cell recording of odor-evoked synaptic transmission in the rat olfactory bulb. J Neurosci. 23 (10), 4108-4116 (2003).
  13. Parthasarathy, K., Bhalla, U. S. Laterality and symmetry in rat olfactory behavior and in physiology of olfactory input. J Neurosci. 33 (13), 5750-5760 (2013).
  14. Rajan, R., Clement, J. P., Bhalla, U. S. Rats smell in stereo. Science. 311 (5761), 666-670 (2006).
  15. Batista-Brito, R., Close, J., Machold, R., Fishell, G. The distinct temporal origins of olfactory bulb interneuron subtypes. J Neurosci. 28 (15), 3966-3975 (2008).
  16. Sakamoto, M., et al. Continuous postnatal neurogenesis contributes to formation of the olfactory bulb neural circuits and flexible olfactory associative learning. J Neurosci. 34 (17), 5788-5799 (2014).
  17. Resendez, S. L., Jennings, J. H., Ung, R. L., Namboodiri, V. M. K., Zhou, Z. C., Otis, J. M., Stuber, G. D. Visualization of cortical, subcortical, and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nat Protoc. 11 (3), 566 (2016).
  18. Park, S., et al. One-step optogenetics with multifunctional flexible polymer fibers. Nat Neurosci. 20 (4), 612 (2017).

Tags

तंत्रिका विज्ञान अंक 133 घ्राण सर्किट सीखना synaptic प्लास्टिक जाओ/कोई जाना व्यवहार operant कंडीशनिंग साहचर्य सीखना
घ्राण सीखने और चूहों में भेदभाव का एक उद्देश्य और Reproducible परीक्षण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, G., Patel, J. M., Tepe, B.,… More

Liu, G., Patel, J. M., Tepe, B., McClard, C. K., Swanson, J., Quast, K. B., Arenkiel, B. R. An Objective and Reproducible Test of Olfactory Learning and Discrimination in Mice. J. Vis. Exp. (133), e57142, doi:10.3791/57142 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter