Summary
Hier trainen we muizen op een associative Leeropdracht voor het testen van de discriminatie van de geur. Dit protocol voorziet ook in studies over leren-geïnduceerde structurele veranderingen in de hersenen.
Abstract
Olfaction is de overheersende zintuiglijke modaliteit bij muizen en invloeden van vele belangrijke gedragingen, met inbegrip van foerageren, roofdieropsporing, paring en ouderschap. Nog belangrijker is, kunnen de muizen roman geuren koppelen aan specifieke gedrags reacties op inzicht geven in functie van de olfactorische circuit worden opgeleid. Dit protocol een overzicht van de procedure voor de opleiding muizen op een Go/No-Go-Go-Go operante Leeropdracht. In deze benadering muizen zijn opgeleid op honderden geautomatiseerde proeven dagelijks voor 2 tot 4 weken en kunnen vervolgens worden getest op de nieuwe Go/No-Go-Go-Go geur paren te beoordelen olfactorische discriminatie, of worden gebruikt voor studies over hoe geur leren de structuur of functie van de olfactorische verandert circuit. Bovendien, kenmerkt de muis bulbus olfactorius (OB) permanente integratie van neuronen volwassene komaf. Interessant, verhoogt olfactorische leren de overleving en de synaptische Connecties van deze neuronen volwassene komaf. Daarom kan dit protocol worden gecombineerd met andere biochemische, elektrofysiologische en beeldvormende technieken om te studeren leren en activiteit-afhankelijke factoren die neuronale overleving en plasticiteit bemiddelen.
Introduction
De muis OB, waar geur informatie binnenkomt het centrale zenuwstelsel (CNS), biedt een uitstekend model voor het bestuderen van ervaring-afhankelijke structurele veranderingen. OB circuity integreert doorlopend volwassene komaf neuronen in een activiteit-afhankelijke manier. Volwassene-geboren neuron precursoren verdelen af van progenitoren die lijn de subventriculaire zone grenzend aan de laterale ventrikels1. Bij het migreren naar de OB, deze neuronale precursoren overleven, onderscheiden, en integreren als remmende submodule cellen of apoptosis2ondergaan. Selectie voor het lot van de cel wordt beïnvloed door de olfactorische activiteiten, met inbegrip van olfactorische leren3,4,5,6. Na integratie optreden leren-geïnduceerde synaptic veranderingen in de cellen van de submodule tijdens een twee weken durende kritieke periode7,-8. Dus zijn testen voor olfactorische leren nuttig voor de behandeling van hoe ervaring-afhankelijke plasticiteit invloeden structurele en functionele reorganisatie van een volwassen hersenen circuit.
Dit protocol biedt een aanpak voor olfactorische opleiding met behulp van een paradigma Operante conditionering. In deze taak, zijn water-beroofd muizen opgeleid om een geur (de "Go" geur) met een beloning van water en een andere geur (de "No-Go" geur) worden gekoppeld aan een proef timeout straf. De vooruitgang van de muizen door middel van een gesorteerde reeks opleiding fasen in de loop van 2-4 weken. Wanneer de opleiding is voltooid, muizen reageert op de Go of No-Go geur met discrete, bijbehorende gedrag (op zoek naar een beloning van het water op gaan proeven en niet op zoek naar de water beloning op No-Go proeven)(Figuur 1). Na opleiding voltooid, muizen kunnen verder worden aangevochten met chemisch soortgelijke geur paren is te testen van discriminatie of worden overgestapt naar studies onderzoeken hoe olfactorische leren verandert de structuur of functie van de OB. Hoewel de geur discriminatie taken zijn eerder beschreven, meest vertrouwen op subjectieve metingen zoals aantal is tussen twee odorant9,10. Bovendien is de behoefte aan menselijke scoring van dergelijke taken ook tijdrovende. De taak van de Go/No-Go-Go-Go olfactorische leren beschreven in dit protocol biedt een onbevooroordeelde, directe meting van geur discriminatie en olfactorische leren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle muizen werden gebruikt onder een protocol goedgekeurd door het Baylor College van geneeskunde institutionele Animal Care en gebruik Comité NIH maatstaven. Muizen gebruikt in dit protocol werden alle volwassen muizen (> 6 weken oud) C57BL6/j achtergrond en zowel vrouwelijke als mannelijke muizen opgenomen. Na opleiding/enscenering taken, zijn muizen teruggekeerd naar hun kooi.
1. bouw en algemene regels voor het gebruik van operante leren vak (Figuur 1B, C)
- Monteren van een muis-kamer met kamer vloer. Houd het opleiding in een weinig verkeer, slecht verlichte gebied te vermijden van afleiding.
- Boren van elke haven van water met een klein gaatje bovenop dat een 18-gauge naald af te zien van water binnen het havengebied.
- Vul de glazen ampul met odorant opgelost in minerale olie (wekelijks vervangen) en veilig draai het GLB.
- 18-gauge naald verbinden met siliconen slang. Glazen flesje GLB doorboren met 18-gauge naald, en sluit het andere uiteinde van silicone slangen aan de inname van de poorten van de geur.
- Plaats elke silicone slangen in een geur-ventiel.
- De vacuüm lijn sluit aan op de poorten van de geur.
- Twee 10 mL spuiten hecht aan een metaal bedrijf staaf en buis verbinden met de spuiten. Verbind de andere kant van de buis aan een naald 18 G. De naald in het geboorde gat van de neus poke poort op de muis kamer past. Sluit het andere uiteinde van de buis aan de ventiel voor vers water.
- Vul de twee 10 mL spuiten met knaagdier drinkwater.
- Een air-flow meter verbinden met de luchtinlaat en onderhouden van de luchtstroom op 3 – 5 L/min.
- Sluit de 2 kleppen van het water, 2 geur kleppen, 2 water poorten, geur poort, en macht aan het systeem van de interface USB. Sluit alle afsluiters op 'Output' poorten, alle geur en water poorten te 'Input' poorten. Sluit alle apparatuur om de macht van de uitgangen van de USB-interface-box, en tot slot de USB interface box aansluiten aan de macht.
- Aanpassen van de vacuüm zuigkracht Voorkom kruisbesmetting van geuren tussen proeven.
- Gebruik geur-specifieke buis odorant flesjes verbinden met de zaal.
2. muis voorbereiding: 1 – 3 dagen
- Muizen in 3 groepen verdelen: controle (geen olfactorische opleiding noodzakelijk), pseudo-opgeleide (muizen die beloning of straf willekeurig ontvangen), en opgeleide groepen. Pseudo-opgeleide muizen aan de opleiding vak en geur levering bloot, maar bieden geen olfactorische opleiding omdat de uitkomst van beloning ten opzichte van de straf willekeurig geassocieerd met de geur geleverd wordt.
Opmerking: De pseudo-opgeleide groep zal het paradigma van de opleiding onder de "Pseudotraining" stadia doorlopen. Opgeleide muizen voltooit alle stadia van de opleiding. Pseudotraining is facultatief indien het doel van het experiment is te assay voor gedrags verschillen in geur discriminatie of leren. Het protocol bedoeld dat hier voegt u deze groep wil de experimentator sonde voor neuronale verschillen vóór en na de training. De pseudotrained groep zou dan bepalen voor passieve geur blootstelling en niet-olfactorische verwante opleiding. - Beginnen water beperking in muizen tot 40 mL/kg/dag. Vermijd lichaamsgewicht verlies groter is dan 20% van de dieren basislijn gewicht om te voorkomen dat nood(Figuur 2).
- Weeg de muizen dagelijks om ervoor te zorgen zij boven de 80% van het gewicht van de basislijn. Als een muis kleiner is dan deze drempelwaarde, verwijder de muis uit de studie en bieden gratis toegang tot water.
- Houd alle milieufactoren constant in het gehele protocol zoals temperatuur, lawaai en verdwaalde geuren (met inbegrip van persoonlijke lichaam en parfum/Keulen/deodorant geuren).
Opmerking: Zoals met alle dierlijk gedrag testen, kleine veranderingen in het milieu sterk kunnen beïnvloeden resultaten.
3. instructies voor alle stadia
- Code trainingssoftware voor elk stadium hieronder. Voer de software op de gedrags-software.
Opmerking: Codering voor alle stadia zijn opgenomen in de aanvullende codering bestanden. Gegevens voor 20 routes zijn gegroepeerd als een enkel blok en muis prestaties blokken wordt weergegeven. Bovendien kan elke fase worden herhaald op een muis voor een aantal dagen tot voltooiing criteria is voldaan. - Houd muizen niet in het vak behavior voor meer dan 60 min/dag.
- Schone muis afval uit de kooi voordat elke muis is overgebracht naar de kooi. Spuiten en veeg de zaal met 70% ethanol te minimaliseren muis geur afleiding.
4. opleiding-fase 1: Associëren Water belonen met een Center neus Poke, 1-3 dagen
- In dit stadium, koppelen aan muizen een beloning van water op verkenning van de water-poort.
-
Opleiding fase 1 programmering instructies
- Program dit stadium alleen de water levering om poort te gebruiken. Laat de muis een water beloning voor elke zak neus ontvangen.
Opmerking: Het programma zal de uitgang van de duur van de proef en het totale aantal water beloont de muis ontvangen.
- Program dit stadium alleen de water levering om poort te gebruiken. Laat de muis een water beloning voor elke zak neus ontvangen.
- Stel de pseudotraining fase 1 programmeren hetzelfde als opleiding fase 1.
-
Vak configuratie en muis installatie
- Configureer het vak behavior met een water-poort in het midden en met alle kant poorten ontoegankelijk. Plaats een muis in de kamer. Sluit de muis kamer en beginnen met het fase 1 programma.
- Deze fase overwegen als voltooid wanneer de muis 100 proeven binnen 60 min. verwijderen bereikt de muis uit de zaal na 60 min of 100 trials hebben voltooid (Figuur 2B).
Opmerking: Als gevolg van individuele verschillen, sommige muizen zal natuurlijk onthouden uit het verkennen van het vak. - Als aanmoediging nodig is, moet u handmatig water leveren op de water-poort. Herhaal dit stadium maximaal 3 dagen.
Opmerking: Muizen die al zijn getraind kunnen worden herhaald verder om pariteit en om hen te houden op vocht beperking. Het is ook mogelijk om een volledige groep naar fase 2 wanneer het gemiddelde van de groep 100 proeven/60 min bereikt. Dit zal zorgen voor alle muizen te blijven van opleiding op dezelfde dag.
5. de opleiding fase 2: Een beloning van de Water kant poort koppelen aan Center poort neus Poke, 1-5 dagen
- Laat de muizen steken hun neus in de haven centrum en vervolgens onmiddellijk ontvangen een beloning van water op de kant poorten in dit stadium.
-
Vak configuratie en muis installatie
- Configureer dit en elke latere fase met 2 water poorten aan de zijkanten en de geur-haven in het midden. Plaats een muis in de kamer. Sluit de muis kamer en beginnen met de fase 2-programma.
-
Opleiding fase 2 programmering instructies
- Voorzien van de muis een onmiddellijke water beloning aan beide kanten na de neus zak in het midden geur levering haven. Output-parameters ingesteld voor deze fase als de duur van de proef, het aantal experimenten gestart, en het aantal water beloningen ontvangen binnen 5 s van de zak van de neus.
- Stel de pseudotraining fase 2 programmeren hetzelfde als opleiding fase 2.
- Overwegen van deze fase als voltooid wanneer er een minimum van 40 proeven worden uitgevoerd in 60 min, met ten minste 25% van de beloningen van de water ontvangen binnen 5 s van het center zak voor de neus van de poort. Verwijder de muis zodra deze fase is voltooid (Figuur 2C).
Opmerking: De opleiding het percentage berekend van water beloningen ontvangen op een tijdige manier om te bepalen van de voltooiing van deze etappe. Hoewel muizen verschillen in hoe snel zij dit stadium voltooien, de meeste muizen voltooiing criteria zal bereiken binnen 5 dagen. Echter, als een muis heeft deze etappe niet voltooid binnen 5 dagen, niet verder de muis naar de volgende fase. Deze muis zal worden verwijderd uit de cohort.
6. de opleiding fase 3: Associëren een beloning van Water met een specifieke geur en binnen een bepaalde tijd venster, 1-3 dagen
- In deze fase laat de muizen een geur gaan (S+) op de neus zak ontvangen in de haven centrum. Opbrengst vervolgens een beloning van water op de neus zak in de poorten van de water kant binnen 5 s.
-
Opleiding fase 3 programmering instructies
- Leveren de S+ geur in het midden geur poort.
- Leveren van de beloning van water als de muis pokes de kant poorten binnen 5 s van de levering van een geur.
Opmerking: Het programma begint alleen doordat de 100 ms neus zak in de haven centrum een water beloning oplevert. Zodra de muis pokes de center-poort voor de juiste hoeveelheid tijd in 80% van de proeven, de tijdsduur van de neus zak vereist voor een water-beloning met 50 ms zal toenemen tot 400 ms. - Stel de output-parameters identiek aan fase 2.
- Stel de instructies voor het programmeren van fase 3 pseudotraining hetzelfde als opleiding fase 3. Sluit de S+ geur echter niet aan de geur levering controller om ervoor te zorgen dat de geur S+ niet gekoppeld aan een water-beloning is.
-
Vak configuratie en muis installatie
- In stadium 2 dezelfde configuratie instellen
- De geur van S+ verbinden met de geur levering controller. Plaats een muis in de kamer. Sluit de muis kamer en beginnen het fase 3 programma. Zodra deze fase is voltooid, verwijdert u de muis.
- Overweeg dit stadium als voltooid wanneer er meer dan 60 beloningen binnen 60 min (Figuur 2D).
7. fase 4A: associëren No-Go (S-) geur en Time-out straf, 1 – 2 dagen
- In dit stadium, kennismaken met de muizen een No-Go geur (S-). De straf van een time-out geven de muizen die ten onrechte naar de poorten van het water na de no-go geur ruiken.
-
Opleiding fase 4A programmering instructies
- Alleen de S+ odorant leveren in dit stadium in het begin, identiek aan fase 3. Beginnen na de volledige 40 muizen proeven, willekeurige levering van de geuren te nemen zowel S+ en S-geuren. Programmeren 2-s time-out straf als de muis probeert te zoeken naar een water-beloning na de No-Go geur wordt gepresenteerd.
Opmerking: Om te helpen bij het onderscheiden van Go vs. No-Go, de IR kant lichten kunnen worden gemanipuleerd zodat ze op tijdens Go reukstoffen en uitgeschakeld tijdens No-Go odorant. De lichten fungeren als een secundaire cue om hulp van muizen in de initiële opleiding. Zodra muizen zijn opgeleid met de lichten, moeten ze onder gaan trainen zonder lichten te bevestigen dat ze hebben geleerd de taak met geuren. - Stel de output-parameters als duur van de proef, aantal experimenten gestart, aantal proeven voltooid, % juiste en totaal aantal beloningen ontvangen.
- Alleen de S+ odorant leveren in dit stadium in het begin, identiek aan fase 3. Beginnen na de volledige 40 muizen proeven, willekeurige levering van de geuren te nemen zowel S+ en S-geuren. Programmeren 2-s time-out straf als de muis probeert te zoeken naar een water-beloning na de No-Go geur wordt gepresenteerd.
- Instellen van de pseudotraining fase 4A programmering instructies hetzelfde als opleiding podium 4S behalve S+ en S-geuren worden willekeurig gepresenteerd vanaf het begin. Geef water beloning of time-out straffen willekeurig, ongeacht de taakprestaties van de.
-
Vak configuratie en muis installatie
- Stel de configuratie vak hetzelfde als vorige fase 3.
- S+ zowel S-geur verbinden met de geur levering controller. Plaats een muis in de kamer. Sluit de muis kamer en beginnen met de fase 4A programma. Na de volledige 40 proeven van muizen, schakel het programma willekeurig om de geuren. Zodra deze fase is voltooid, verwijdert u de muis.
- Overweeg dit stadium als voltooid wanneer er 40 proeven met > 60% juiste antwoorden.
8. fase 4B: associëren No-Go (S-) geur en time-out straf, 5-11 dagen
-
Opleiding fase 4B programmering instructies
- Identiek aan fase 4A, maken van dit stadium, echter de straf van de time-out voor de poging van een water-beloning na een S-geur 4 is s.
- Stel de pseudotraining fase 4B programmering instructies identiek aan fase 4A, maar water beloning en time-out straf worden willekeurig geleverd per proef.
-
Vak configuratie en muis installatie
- Stel de configuratie vak hetzelfde als vorige fase 4A.
- S+ zowel S-geur verbinden met de geur levering controller. Plaats een muis in de kamer. Sluit de muis kamer en beginnen met de fase 4B programma. Overwegen van deze fase voltooid wanneer er > 100 proeven binnen 60 min met nauwkeurigheid > 85%(Figuur 2)
- Toezicht op het maximum en minimum percentage correct is voor elke sessie van elke muis voortgang in dit stadium. Ongeveer 85-90% van de muizen bereiken voltooiing criteria voor deze fase. Uitsluiten van muizen die voltooiing van deze fase voor de Go/No-Go-Go-Go testfase niet bereiken.
- (Optioneel) Aan het einde van deze etappe, een omkering opleiding, waar de Go/No-Go-Go-Go odorant zijn overgestapt op het platform van de flacon geur van toepassing. Ervoor zorgen dat de muizen niet aan een andere prikkel, zoals het geluid van de kleppen de kant poorten zijn gekoppeld koppelen zijn.
9. Go/No-Go-Go-Go assay taak: 1 dag, 20 Min per muis per dag
- Beschouw dit als de laatste fase om de nauwkeurigheid te identificeren geur verenigingen en leren te discrimineren paren van de geur.
Opmerking: Roman odorant worden gebruikt voor S +/ S-om te testen hoe lang dieren nemen om te leren van nieuwe koppelingen. Structureel vergelijkbare odorant paren worden gebruikt voor het verhogen van de moeilijkheidsgraad van de taak. Voorbeelden zijn 1-Butanol vs. 1-Pentanol, Isoamyl acetaat vs. Isoamyl butyraat, en + Carvone vs. - Carvone. -
Programmering instructies
- Laat de trainingssoftware detecteren de lengte van de zak van de neus. Het programma van de 300 ms neus zak in de haven geur center voor het uitvoeren van de taak.
- Stel de output-parameters identiek aan fase 4B, behalve gebruik niet enig licht geleid signalen.
-
Vak configuratie en muis installatie
- Stel de configuratie vak hetzelfde als vorige fase 4B.
- S+ zowel S-geur verbinden met de geur levering controller. Plaats een muis in de kamer. Sluit de muis kamer en beginnen met de fase Go/No-Go-Go-Go programma. Bloot de muizen die de olfactorische Leeropdracht voor nieuwe paren van chemisch soortgelijke geuren hebben geleerd.
Opmerking: Wildtype muizen met voldoende geur discriminatie bereiken > 85% nauwkeurigheid met roman odorant na ongeveer 10-20 blokken of 200-400 proeven (Figuur 3A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Zodra muizen hebt geleerd de olfactorische Leeropdracht, kunnen nu koppelen aan nieuwe geur paren beloning en straf. Deze getrainde muizen normaal gesproken beginnen met ongeveer 50% nauwkeurigheid op de Go/No-Go-Go-Go taak. Het juiste percentage kan worden uitgezet door proef blok als een leercurve voor roman geur paren (Figuur 3A). Binnen 10 blok proeven, die nemen de meeste muizen minder dan 30 min uit te voeren, kunnen muizen correct onderscheid maken tussen geuren met meer dan 85% nauwkeurigheid (rode lijn). Dit toont aan dat ons protocol met succes wildtype muizen te associëren een geur met een beloning van water en een ander met een timeout straf heeft getraind. Om te beoordelen van de mogelijkheden van de discriminatie tussen twee cohorten, kan deze gegevens verder worden geanalyseerd om te vergelijken het aantal proeven die nodig zijn voor het bereiken van 85% vaardigheid (Figuur 3B) of door de juiste gemiddelde procent na het bereiken van vaardigheid.
Zodra muizen de taak leren, kunnen de geur paren om te vergroten of verkleinen van de moeilijkheidsgraad van de taak worden gewijzigd. Bijvoorbeeld, verhoogt verminderen van de geur-paar concentratie de moeilijkheidsgraad van de taak (Figuur 3C). Deze analyse kan de drempel van detectie voor verschillende muizen cohorten onthullen. Bovendien geur paren kunnen worden gewijzigd om meer structureel vergelijkbare (dat wil zeggen, enantiomeren of één koolstof verschillen). Geur mengsels kunnen ook worden gebruikt om de moeilijkheidsgraad van de taak (dat wil zeggen, 40/60 mengsel vs. 30/70 mengsel).
Er zijn ook muizen kunnen herinneren van vorige geleerde geur paren. Na 7 dagen sinds het leren van de taak te wachten, een rappel test blijkt dat wildtype muizen snel eerder herinneren kunnen geleerd geur verenigingen (Figuur 3D).
Figuur 1 : Go/No-Go-Go-Go opleiding paradigma en apparatuur configuratie. (A) muizen correct reageert door beide verkrijgen water tijdens gaan geur presentatie of door af te zien tijdens presentatie No-Go geur. (B) het gedrag vak is zodanig geconfigureerd dat alleen een enkel water poort toegankelijk tijdens fase 1 is en alle volgende fasen zowel een centrale geur levering poort en twee water-poorten bevatten. Blauwe cirkel: water van de haven. Groene cirkel: geur poort. (C) geur levering is gated door één geur valve voor elke geur. Overdruk luchtinlaat leidt tot een distributeur. Rode pijlen geven aan positieve lucht drukleiding gaan op de flacon bereid geur (rode cirkel). Blauwe pijl geeft lucht/geur mengsel verlaten de geur flacon en passeren een geur ventiel (licht blauwe cirkel) en een witte lucht integratie van vak in te voeren. Oranje pijl geeft positieve druk lucht naar een centrale regelgever klep (oranje cirkel) tot de integrerende box te voorzien in positieve luchtdruk geur/luchtmengsel uit integrator vak om aan te duwen de geur levering poort (onderste zwarte pijl). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Trainingsdata. (A) muizen lichaamsgewicht percentage niet vallen onder de 80% terwijl op vocht beperking. Rode lijn = 80%-drempel. N = 8 muizen. (B) Stage 1 opleiding resultaten Toon het aantal center poort pokes in 60 min water beloning ontvangen. N = 8 muizen. Foutbalken zijn standaardfout van het gemiddelde. (C) fase 2 opleiding resultaten percentage van water beloningen ontvangen binnen 5 tonen s van centrum neus zak. Rode lijn is de drempel van 25%. Dat percentage met grijze highlighting als de standaardfout van het gemiddelde. N = 8 muizen. (D) fase 3 cumulatieve beloont Toon aantal beloningen op dag 1 en dag 2 van de opleiding ontvangen door 8 muizen. Rode lijn is 60 beloning drempels. Foutbalken zijn standaarddeviatie. (E) fase 4B nauwkeurigheid resultaten weergeven de juiste antwoorden percentage voor fase 4B. Rode lijn is 85% van de drempel. Effen zwarte lijn is gemiddelde en grijze markering standaardfout van het gemiddelde. N = 4 muizen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Vertegenwoordiger resultaten voor de taak van de Go/no-go-go-go. (A) Go/No-Go-Go-Go taak voor 2 nieuwe odorant (S+ = isoamyl acetaat/S-= amyl acetaat) nadat muizen werden getraind op eugenol (S+) en eucalyptol (S-). N = 5 muizen, met de standaardfout van gemiddelde in grijs. Groene lijn is 50% nauwkeurigheid, rode lijn is drempel 85% nauwkeurigheid. (B) voorbeeld van Go/No-Go-Go-Go taak voor een muis die zou een snelle leerling versus een langzame leerling muis voor hexanol (S+) en boterzuur (S-). (C) Go/No-Go-Go-Go taak voor verschillende partiële druk van hexanol (S+) en boterzuur (S-). (D) mogelijkheid van muizen te herinneren de geur paar 7 dagen na de training. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De knaagdieren olfactorische systeem biedt een uniek model voor het bestuderen van sensorische afhankelijke plasticiteit. Hier presenteren we een paradigma olfactorische leren om te trainen van muizen voor het koppelen van odorant paren met een beloning of straf. Via deze taak leren kunnen downstream circuit wijzigingen bestudeerd worden in latere experimenten (electrofysiologie, in vivo neuronale beeldvorming, enz.). Na voltooiing leert muizen een eenvoudig geur cued taak als u wilt koppelen een beloning van water met een geur, en de straf van een time-out met een andere geur.
Aangezien dit een gedrags test, wij adviseren gebruik te maken van een gelijke verdeling van leeftijd en geslacht onder experimentele en controlegroepen dierlijke. Het is absoluut noodzakelijk dat de voorwaarden tussen muizen worden gehouden zo constant mogelijk. Er bijvoorbeeld voor zorgen dat de muizen-handler en de lichtcondities ongewijzigd gedurende de opleiding. Als veel muizen niet de taak uitvoert zoals verwacht, controleert u de volgende voorwaarden wordt voldaan: (1) Houd de gedrag setup zo stil mogelijk. (2) water ontnemen de muizen voldoende. Wij vinden dat zelfs na een hele dag van water ontbering, veel muizen niet voldoende genoeg vanuit de haven van het centrum van het fase 1 vak drinken zal tot voltooiing criteria. (3) aan het begin van elke nieuwe muis, Controleer de geur/water kleppen en buizen om de juiste plaatsing. (4) odorant variëren in hun volatiliteit en daarom enkele verdampen sneller dan anderen. Vervangen door meer vluchtige odorant hogere vapor druk dagelijks in plaats van wekelijks, vooral als lagere concentraties worden gebruikt.
Dit protocol kan worden gewijzigd volgens de experimentele doel. Als de tijd leren in fase 4B belangrijk is, dan kan het zijn aan te raden om eventuele geuren verwijderen totdat dit stadium. Dit zorgt ervoor dat alle olfactorische leren bij fase 4B begint. Om dit te bereiken, hebben wij uitgevoerd dit protocol door het verwijderen van de geur van fase 3 en fase 4A volledig overslaan. Muizen hebben een moeilijker tijd bereiken van voltooiing criteria met behulp van deze methode, maar dit geeft ook waardevolle informatie voor hoe snel muizen deze taak het eerst leren.
Een beperking van dit protocol is dat de muizen hebben verschillende stadia uitvoeren totdat olfactorische tests kunnen worden uitgevoerd. Daarom, hoewel niet gezien door ons lab, kan een manipulatie cognitie belemmeren dat stadium 4B is consequent niet bereikt. We hebben geprobeerd te ontkennen dit probleem door ervoor te zorgen dat elke fase voldoende lang genoeg opdat de meeste muizen om af te studeren met de volgende stap van de opleiding. Echter als een muis niet voltooiing criteria voor een etappe zelfs na de volledige stage bereiken, verwijderen we die muis uit de cohort. Hierdoor kunnen we blijven de studie zonder te wachten op een individuele muis. Een andere beperking is dat we nog uit te breiden dit protocol andere belangrijke voor het gebied van de reukzin diermodellen. Ratten, zijn bijvoorbeeld instrumenteel in het onthullen van neuronale functie binnen de OB11,12. Vanwege hun intelligentie hebben ratten ook een keer sneller te leren dan muizen13,14. Ondanks deze beperkingen kozen we muizen voor dit protocol vanwege hun genetische werkwillig voor het uitvoeren van cel type specifieke manipulaties en opnames15.
De meeste bestaande protocollen gebruiken verschillen in geur is of tijd doorgebracht naast geuren discriminatie of leren4,6,9,10,16onderling aan te passen. Dit protocol kan direct meten van discriminatie op basis van de proces door proces. Bovendien kan dit meten het exacte aantal proeven die elke muis moet leren van een vereniging. Dit volledig geautomatiseerde aanpak verwijdert elke menselijke vooroordelen uit de data-analyse. Voedsel beroofd dieren hebben ook met succes gebruikt voor olfactorische leren. Water beroofd muizen werden gekozen als gevolg van het toegenomen aantal proeven die een muis over voedsel16met water kunt uitvoeren.
Als implanteerbare activiteit monitoren, zoals Graded-Index (grijns) lenzen en multi-unit elektroden, blijven verbeteren, kunnen we binnenkort kunnen deze technologieën combineren met dit protocol17,18. Door de opname formulier betrokken hersengebieden tijdens olfactorische leren, is het mogelijk om te sonderen hoe neuronale activiteiten wijzigen tijdens associative leren. Dit kan helpen onthullen fundamentele neurowetenschappen vragen, zoals hoe neuronen informatie anders tijdens het leren coderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten en geen concurrerende belangen.
Acknowledgments
Dit protocol is aangepast van eerdere werkzaamheden binnen onze lab (Huang et al. 8). alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comité (ACUC) van Baylor College of Medicine. Het wordt ondersteund door de McNair Medical Institute, NINDS toekenning R01NS078294 aan B.R.A. NIH IDDRC subsidie U54HD083092, NIDDK toekenning F30DK112571 aan JMP en NINDS toekenning F31NS092435 aan CKM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass vial | Qorpak | GLC-01016 | |
| Silicon Tubing | Thermo Scientific | 86000030 | |
| 18 gauge needles | BD | 305196 | |
| 1-Butanol | Sigma Aldrich | 437603 | |
| Propionic Acid | Sigma Aldrich | 402907 | |
| Mouse Chamber | Med Associates | ENV-307W | |
| Chamber Floor | Med Associates | ENV-307W-GFW | |
| Water Port | Med Associates | ENV-313W | Need two |
| Odor stimulus | Med Associates | ENV-275 | Contain 2 valves to gate odor delivery |
| Odor Port | Med Associates | ENV-375W-NPP | |
| USB Interface | Med Associates | DIG-703A-USB | |
| Desktop Computer with Windows 2000, XP, Vista, or 7 | |||
| Flow meter | VWR | 97004-952 | |
| Behavioral software | Med Associates | SOF-735 | This software, which runs each training stage, has now been replaced with Med-PC V |
| Data Transfer software | Med Associates | SOF-731 | This software formats the data to Excel |
| Training Software | Med Associates | DIG-703A-USB | This software is used to program each training stage |
| Water Valve | Neptune Research | 225P012-11 | This valve is used to gate the water delivery. Need Two |
| Odor Valve | Neptune Research | 360P012-42 | This valve is used to gate the odor delivery. Need Two |
References
- Carleton, A., Petreanu, L. T., Lansford, R., Alvarez-Buylla, A., Lledo, P. M. Becoming a new neuron in the adult olfactory bulb. Nat Neurosci. 6 (5), 507-518 (2003).
- Petreanu, L., Alvarez-Buylla, A. Maturation and death of adult-born olfactory bulb granule neurons: role of olfaction. J Neurosci. 22 (14), 6106-6113 (2002).
- Yamaguchi, M., Mori, K. Critical period for sensory experience-dependent survival of newly generated granule cells in the adult mouse olfactory bulb. PNAS. 102 (27), 9697-9702 (2005).
- Rochefort, C., Gheusi, G., Vincent, J. D., Lledo, P. M. Enriched odor exposure increases the number of newborn neurons in the adult olfactory bulb and improves odor memory. J Neurosci. 22 (7), 2679-2689 (2002).
- Arenkiel, B. R., et al. Activity-induced remodeling of olfactory bulb microcircuits revealed by monosynaptic tracing. PloS one. 6 (12), 29423 (2011).
- Alonso, M., Viollet, C., Gabellec, M. M., Meas-Yedid, V., Olivo-Marin, J. C., Lledo, P. M. Olfactory discrimination learning increases the survival of adult-born neurons in the olfactory bulb. J Neurosci. 26 (41), 10508-10513 (2006).
- Quast, K. B., et al. Developmental broadening of inhibitory sensory maps. Nat Neurosci. 20 (2), 189 (2017).
- Huang, L., et al. Task learning promotes plasticity of interneuron connectivity maps in the olfactory bulb. J Neurosci. 36 (34), 8856-8871 (2016).
- Arbuckle, E. P., Smith, G. D., Gomez, M. C., Lugo, J. N. Testing for odor discrimination and habituation in mice. J Vis Sci. (99), e52615 (2015).
- Zou, J., Wang, W., Pan, Y. W., Lu, S., Xia, Z. Methods to measure olfactory behavior in mice. Curr Protoc Toxicol. , 11-18 (2015).
- Uchida, N., Takahashi, Y. K., Tanifuji, M., Mori, K. Odor maps in the mammalian olfactory bulb: domain organization and odorant structural features. Nat Neurosci. 3 (10), 1035 (2000).
- Cang, J., Isaacson, J. S. In vivo whole-cell recording of odor-evoked synaptic transmission in the rat olfactory bulb. J Neurosci. 23 (10), 4108-4116 (2003).
- Parthasarathy, K., Bhalla, U. S. Laterality and symmetry in rat olfactory behavior and in physiology of olfactory input. J Neurosci. 33 (13), 5750-5760 (2013).
- Rajan, R., Clement, J. P., Bhalla, U. S. Rats smell in stereo. Science. 311 (5761), 666-670 (2006).
- Batista-Brito, R., Close, J., Machold, R., Fishell, G. The distinct temporal origins of olfactory bulb interneuron subtypes. J Neurosci. 28 (15), 3966-3975 (2008).
- Sakamoto, M., et al. Continuous postnatal neurogenesis contributes to formation of the olfactory bulb neural circuits and flexible olfactory associative learning. J Neurosci. 34 (17), 5788-5799 (2014).
- Resendez, S. L., Jennings, J. H., Ung, R. L., Namboodiri, V. M. K., Zhou, Z. C., Otis, J. M., Stuber, G. D. Visualization of cortical, subcortical, and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nat Protoc. 11 (3), 566 (2016).
- Park, S., et al. One-step optogenetics with multifunctional flexible polymer fibers. Nat Neurosci. 20 (4), 612 (2017).
