Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

En objektiv og reproducerbare Test af olfaktoriske læring og diskrimination i mus

Published: March 22, 2018 doi: 10.3791/57142
Automatic Translation
*1,2, *2,3, 1, 2,4, 4, 4, 1,3,4,5
1Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 2Medical Scientist Training Program, Baylor College of Medicine, 3Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine, 4Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 5Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute at Texas Children's Hospital
* These authors contributed equally

Summary

Her tog vi mus på en associative læring opgave at teste lugt forskelsbehandling. Denne protokol tillader også undersøgelser på læring-inducerede strukturelle ændringer i hjernen.

Abstract

Lugtesansen er den fremherskende sensoriske modalitet i mus og påvirker mange vigtige opførsel, herunder fouragering, predator opdagelse, parring og forældrerollen. Vigtigere, kan mus være uddannet til at knytte nye lugte til specifikke adfærdsmæssige reaktioner at give indsigt i olfaktoriske kredsløb funktion. Denne protokol beskriver proceduren for uddannelse mus på en Go/nej-go-go operant indlæring opgave. I denne tilgang, mus er uddannet på hundredvis af automatiserede forsøg dagligt til 2 – 4 uger og kan derefter testes på roman Go/nej-go-go lugt par at vurdere olfaktoriske forskelsbehandling, eller anvendes til undersøgelser på hvordan lugt læring ændrer struktur eller funktion af de olfaktoriske kredsløb. Derudover tilbyder mus olfaktoriske pære (OB) løbende integration af voksen-født neuroner. Interessant, øger olfaktoriske læring synaptiske forbindelser af disse voksen-født neuroner og overlevelse. Denne protokol kan derfor kombineres med andre biokemiske, elektrofysiologiske og Billeddannende teknikker til at studere læring og aktivitet-afhængige faktorer, der mægle neuronal overlevelse og plasticitet.

Introduction

Musen OB, hvor lugt oplysninger først træder det centrale nervesystem (CNS), giver en fremragende model for at studere erfaringer-afhængige strukturelle ændringer. OB circuity integrerer løbende voksen-født neuroner i en aktivitet-afhængige måde. Voksen-født neuron prækursorer opdele fra stamfaderen, denne linje subventricular zonen støder op til den laterale hjertekamre1. Ved overflytning til OB, disse neuronal prækursorer enten overleve, differentiere, integrere som hæmmende granula celler og gennemgå apoptose2. Udvalg for celle skæbne er påvirket af olfaktoriske aktivitet, herunder olfaktoriske læring3,4,5,6. Efter integrationen sker læring-induceret synaptic ændringer i granula celler under en to-ugers kritiske periode7,8. Således er assays til olfaktoriske læring nyttige til at undersøge hvordan erfaring-afhængige plasticitet påvirkninger strukturelle og funktionelle reorganisering af modne hjernens kredsløb.

Denne protokol tilbyder én tilgang til olfaktoriske uddannelse ved hjælp af en operant betingning paradigme. I denne opgave, er vand-berøvet mus uddannet til at knytte en lugt (lugt om "Gå") med en vand belønning og en anden lugt ("No-Go" lugt) med en retssag timeout straf. Mus fremskridt gennem en gradueret serie af uddannelse faser i løbet af 2-4 uger. Når uddannelsen er afsluttet, mus reagerer på Go eller No-Go lugten med diskrete, tilsvarende adfærd (søger en vand belønning på Go forsøg og ikke søger vand belønning på No-Go forsøg) (fig. 1A). Efter træning er færdig, mus kan være yderligere udfordret med kemisk lignende lugt par at teste forskelsbehandling eller blive skiftet til undersøgelser undersøge hvordan olfaktoriske læring ændrer struktur eller funktion af OB. Selv om lugt forskelsbehandling opgaver har været tidligere beskrevet, mest stole på subjektive målinger såsom antal snøfter mellem to Duftenes9,10. Desuden er behovet for menneskelige scoring af sådanne opgaver også tidskrævende. Go/nej-go-go olfaktoriske læring opgaven beskrevet i denne protokol tilbyder en fordomsfri, direkte måling af lugt forskelsbehandling og olfaktoriske læring.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle mus blev brugt under en protokol, der er godkendt af Baylor College af medicin institutionelle Animal Care og brug Udvalget i henhold til NIH standarder. Mus bruges i denne protokol blev alle voksne mus (> 6 uger gamle) på C57BL6/j baggrund og omfattede både mandlige og kvindelige mus. Efter træning/iscenesættelse opgaver, er mus tilbage til deres hjem bur.

1. opførelse og generelle regler for brug af Operant indlæring boks (figur 1B, C)

  1. Samle en mus kammer med kammer gulv. Hold feltet uddannelse i en lav trafik, svagt oplyst område til at undgå distraktioner.
  2. Bore hver vand port med et lille hul øverst for at tillade en 18-gauge kanyle til at dispensere vand inde i havnen.
  3. Fyld hætteglasset med lugtstof opløst i mineralsk olie (erstattet ugentligt), og sikkert stramme hætten.
  4. Tilslut 18-gauge kanyle til silikoneslanger. Gennembore glas hætteglas cap med 18-gauge kanyle, og forbind andre ende af silikoneslanger til indtagelse af lugt-porte.
  5. Placer hver silikoneslanger ind en lugt ventilen.
  6. Tilslut den vakuum linje til lugt-porte.
  7. Tillægger en metal bedrift stang to 10 mL sprøjter, og Tilslut slangen til sprøjter. Tilslut anden siden af slangen til en 18 G nåle. Passe nålen ind i det borede hul i næsen sækken port på musen kammer. Tilslut anden enden af slangen til vand ventilen.
  8. Fyld de to 10 mL-sprøjter med gnaver drikkevand.
  9. Tilslut en luft-flow meter mod luftindtaget og vedligeholde luftstrøm på 3-5 L/min.
  10. Tilslut 2 vand ventiler, 2 lugt ventiler, 2 vand havne, lugt port og power til USB-interface systemet. Tilslut alle ventiler til 'Output' havne, alle lugt og vand havne til 'Input' havne. Tilslut alt udstyr til power output fra boksen USB-interface, og endelig, forbinde USB interface boks til magten.
  11. Justere den vakuum sug for at undgå krydskontaminering af lugte mellem forsøg.
  12. Bruge lugt-specifikke slanger tilsluttes lugtstof hætteglas til salen.

2. mus forberedelse: 1-3 dage

  1. Opdele musene i 3 grupper: kontrol (ingen olfaktoriske uddannelse nødvendigt), pseudo uddannet (mus der modtager belønning eller straf tilfældigt), og uddannet grupper. Udsætte pseudo uddannet mus til uddannelse boks og lugt levering, men giver ikke olfaktoriske uddannelse, fordi resultatet af belønning versus straf er tilfældigt forbundet med lugt leveret.
    Bemærk: Gruppen pseudo uddannede vil gå gennem uddannelse paradigme under "Pseudotraining" stadier. Uddannet mus vil fuldføre alle uddannelse faser. Pseudotraining er valgfri, hvis formålet med forsøget er at assay for adfærdsmæssige forskelle i lugt forskelsbehandling eller læring. Protokollen til rådighed her tilføjer denne gruppe hvis eksperimentatoren ønsker at sende forespørgsler om neuronal forskelle før og efter træning. Den pseudotrained gruppe ville derefter kontrol for passiv lugt eksponering og ikke-olfaktoriske relaterede uddannelse.
  2. Begynder vandet begrænsning i mus til 40 mL/kg/dag. Undgå legemsvægt tab større end 20% af dyrenes baseline vægt for at undgå nød (fig. 2A).
  3. Veje mus dagligt for at sikre, at de er over 80% af baseline vægt. Hvis en mus falder under denne tærskel, fjerne musen fra studiet og giver gratis adgang til vand.
  4. Holde alle miljøfaktorer konstant gennem hele protokollen herunder temperatur, støj og omstrejfende lugte (herunder personlige krop og parfume/cologne/deodorant dufte).
    Bemærk: Som med alle dyrs adfærd test, lille miljømæssige ændringer kan stor indflydelse resultater.

3. vejledning til alle stadier

  1. Kode træningssoftware for hvert trin nedenfor. Køre softwaren på den adfærdsmæssige software.
    Bemærk: Koder for alle faser er indeholdt i supplerende kodning filer. Data for 20 stier er grupperet som en enkelt blok og mus ydeevne vises på tværs af blokke. Desuden kan hver fase gentages på en mus til et antal dage indtil afslutningen kriterier er opfyldt.
  2. Opbevar ikke mus i boksen opførsel for mere end 60 min/dag.
  3. Ren mus affald fra buret før hver mus er overført til buret. Spray og tør kammer med 70% ethanol til at minimere mus lugt distraktion.

4. uddannelse fase 1: Knytte vand belønning med Center næse sækken, 1-3 dage

  1. I denne fase, skal du knytte mus med en vand belønning efter udforskning af havnens vand.
  2. Uddannelse fase 1 programmeringsinstruktioner
    1. Programmere denne fase kun bruge vand levering port. Lad musen modtage en vand belønning for hver næse sækken.
      Bemærk: Programmet vil output varigheden af forsøget og det samlede antal vand belønner musen modtaget.
  3. Sæt den pseudotraining fase 1 programmering det samme som uddannelse fase 1.
  4. Boksen konfiguration og opsætning af mus
    1. Konfigurere boksen adfærd med en vand havn i centrum og med alle side havne utilgængelige. Placer musen ind i kammeret. Luk mus kammer og begynder den fase 1 plan.
  5. Overveje denne fase som fuldført, når musen opnår 100 forsøg inden for 60 min. Fjern musen fra salen efter 60 min eller 100 forsøg have været afsluttet (figur 2B).
    Bemærk: På grund af individuelle forskelle, nogle mus vil naturligvis afstå fra at udforske boksen.
  6. Hvis opmuntring er nødvendigt, manuelt levere vand til vand-porten. Gentag dette trin for op til 3 dage.
    Bemærk: Mus der er allerede uddannet kan gentages yderligere at fastholde paritet og holde dem på flydende begrænsning. Det er også muligt at fremme en hel gruppe til fase 2, når den gruppe gennemsnitlige når 100 forsøg/60 min. Dette vil give mulighed for alle mus til fortsat uddannelse på samme dag.

5. uddannelse fase 2: Knytte en Side Port vand belønning med Center Port næse sækken, 1 – 5 dage

  1. I denne fase, lad mus stikke deres næse i center-port og derefter straks modtage en vand belønning på side havne.
  2. Boksen konfiguration og opsætning af mus
    1. Konfigurere dette og alle efterfølgende trin med 2 vand havne på siderne og lugt port i midten. Placer musen ind i kammeret. Luk mus kammer og starte programmet fase 2.
  3. Uddannelse fase 2 programmeringsinstruktioner
    1. Give musen en umiddelbar vand belønning på begge sider efter næse sækken i midten lugt levering port. Indstille output-parametre for denne fase som varigheden af forsøget, antallet af forsøg indledt og antallet af vand belønninger i hænde senest 5 s af næse sækken.
  4. Sæt den pseudotraining fase 2 programmering det samme som uddannelse fase 2.
  5. Overveje denne fase som fuldført, når et minimum af 40 forsøg udføres i 60 min. med mindst 25% vand belønninger i hænde senest 5 s af center port næse sækken. Fjerne musen, når dette stadie er fuldført (figur 2C).
    Bemærk: Programmet beregner procentdelen af vand belønninger modtaget rettidigt for at bestemme færdiggørelsen af denne fase. Selv om mus varierer i hvor hurtigt de fuldføre denne fase, de fleste mus vil nå afslutningen kriterier inden for 5 dage. Men hvis en mus ikke er fuldført denne fase inden for 5 dage, ikke rykke musen til næste fase. Denne mus vil blive fjernet fra kohorten.

6. uddannelse fase 3: Knytte en vand belønning med en bestemt lugt og inden for et bestemt tidspunkt vindue, 1-3 dage

  1. I denne fase, lad de mus modtage en gå (S+) lugt ved næse sækken i havnens centrum. Senere, give en vand belønning ved næse sækken side vand havne inden for 5 s.
  2. Uddannelse fase 3 programmeringsinstruktioner
    1. Levere S+ lugt i midten lugt port.
    2. Levere vand belønning, hvis musen stikker side havne inden for 5 s af en lugt levering.
      Bemærk: Programmet begynder ved kun at kræve en 100 ms næse sækken i havnens center til at give en vand belønning. Når musen stikker havnens center for korrekte tid i 80% af forsøg, varigheden af næse sækken kræves for en vand belønning vil stige med 50 ms op til 400 ms.
    3. Indstille output-parametre er identiske med fase 2.
  3. Sæt de pseudotraining fase 3 programmeringsinstruktioner det samme som uddannelse fase 3. Men Tilslut ikke S+ lugt til lugt levering controller til at sikre, at S+ lugt ikke er forbundet med en vand belønning.
  4. Boksen konfiguration og opsætning af mus
    1. Sat den samme konfiguration til fase 2.
    2. Tilsluttes lugt levering controller S+ lugt. Placer musen ind i kammeret. Luk mus kammer og starte programmet fase 3. Fjerne musen, når dette stadie er fuldført.
  5. Overveje denne fase som fuldført, når der er større end 60 belønninger inden for 60 min. (figur 2D).

7. etape 4A: knytte No-Go (S-) lugt og timeout straf, 1-2 dage

  1. I denne fase, indføre mus til en No-Go lugt (S-). Give en time-out straf til mus, der fejlagtigt går til vand havne efter duftende no-go lugt.
  2. Uddannelse fase 4A programmeringsinstruktioner
    1. Levere kun S+ lugtstof i denne fase i begyndelsen, identisk med fase 3. Efter mus komplet 40 forsøg, Begynd tilfældig levering af lugte til at omfatte både S+ og S-lugte. Program 2-s tid out straf, hvis musen forsøger at søge en vand belønning efter bliver præsenteret No-Go lugt.
      Bemærk: For at støtte skelne Go vs No-Go, IR sidelys kan manipuleres således, at de er på under Go duftstoffer og off under No-Go duftstoffer. Lysene fungerer som en sekundær cue til at støtte mus i grunduddannelsen. Når musene er uddannet med lys, bør de under go træning uden lys til at bekræfte de har lært opgaven med lugte.
    2. Indstille output-parametre som varigheden af retssagen, antal forsøg indledt, antal forsøg afsluttet, % korrekt og samlede antal belønninger modtaget.
  3. Sæt de pseudotraining fase 4A programmeringsinstruktioner det samme som uddannelse fase 4S undtagen S+ og S-lugte præsenteres tilfældigt fra starten. Give vand belønning eller timeout straffe tilfældigt, uanset opgaven ydeevne.
  4. Boksen konfiguration og opsætning af mus
    1. Sæt boksen konfiguration det samme som forrige fase 3.
    2. Forbinde både S+ og S-lugt til lugt levering controller. Placer musen ind i kammeret. Luk mus kammer og begynder trin 4A program. Efter mus komplet 40 forsøg, skifte program tilfældigt levere lugte. Fjerne musen, når dette stadie er fuldført.
  5. Overveje denne fase som fuldført, når der er 40 forsøg med > 60% rigtige svar.

8. etape 4B: knytte No-Go (S-) lugt og Time Out straf, 5-11 dage

  1. Uddannelse fase 4B programmeringsinstruktioner
    1. Gøre dette stadium identisk fase 4A, dog tid ud straffen for forsøg på en vand belønning efter en S-lugt er 4 s.
  2. Indstille pseudotraining trin 4B programmering instruktioner identisk med trin 4A, men vand belønning og timeout straf leveres tilfældigt pr. forsøg.
  3. Boksen konfiguration og opsætning af mus
    1. Sæt boksen konfiguration det samme som forrige fase 4A.
    2. Forbinde både S+ og S-lugt til lugt levering controller. Placer musen ind i kammeret. Luk mus kammer og begynder trin 4B program. Overveje denne fase komplet, når der er > 100 forsøg inden for 60 min. med nøjagtighed > 85% (figur 2E)
  4. Overvåge den maksimale og minimale procentdel korrekt for hver session for at spore hver mus fremskridt i denne fase. Ca. 85-90% af mus nå afslutningen kriterier for denne fase. Udelukke mus, der ikke opnår færdiggørelsen af denne fase for Go/nej-go-go testfasen.
  5. (Valgfrit) I slutningen af dette stadium anvende en tilbageførsel uddannelse, hvor Go/nej-go-go duftstoffer er tændt lugt hætteglas platform. Sikre, at musene ikke knytter til en anden stimulus, som lyden af ventiler tilknyttet side havne.

9. gå/nej-go-go assay opgave: 1 dag, 20 Min pr. mus pr. dag

  1. Betragte dette som den afsluttende fase at fastslå rigtigheden af at identificere lugt foreninger og lære at diskriminere lugt par.
    Bemærk: Roman duftstoffer er udnyttet for S / S-at teste hvor længe dyrene tage for at lære nye foreninger. Strukturelt lignende lugtstof par bruges til at gøre opgaven sværere. Eksempler kan nævnes 1-Butanol vs 1-Pentanol, Isoamyl acetat vs Isoamyl butyrat, og + carvon vs - carvon.
  2. Programmering instruktioner
    1. Lad uddannelse softwaren registrerer længden af næse sækken. Programmere 300 ms næse sækken i havnens center lugt til at udføre opgaven.
    2. Indstille output-parametre identisk med trin 4B, bortset fra brug ikke nogen lys guidede stikord.
  3. Boksen konfiguration og opsætning af mus
    1. Sæt boksen konfiguration det samme som forrige trin 4B.
    2. Forbinde både S+ og S-lugt til lugt levering controller. Placer musen ind i kammeret. Luk mus kammer og begynder den fase Go/nej-go-go program. Afdække de mus, der har lært opgaven olfaktoriske læring til romanen par af kemisk lignende lugt.
      Bemærk: Vildtype mus med passende lugt forskelsbehandling nå > 85% nøjagtighed med romanen Duftenes efter ca 10-20 blokke eller 200-400 forsøg (fig. 3A).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Når musene har lært opgaven olfaktoriske læring, kan de nu knytte roman lugt par med belønning og straf. Disse uddannet mus normalt begynde med omkring 50% nøjagtighed på Go/nej-go-go opgave. Procent korrekte kan afbildes af retssag blok som en indlæringskurve for romanen lugt par (fig. 3A). Inden for 10 blok forsøg, som tager de fleste mus er mindre end 30 min til at udføre, er mus i stand til korrekt forskelsbehandle lugte med mere end 85% nøjagtighed (rød linje). Dette viser, at vores protokol med succes har uddannet vildtype mus tilknyttes en lugt med en vand belønning og en anden med en timeout straf. For at vurdere forskelsbehandling kapaciteter mellem to kohorter, kan disse data analyseres yderligere for at sammenligne antallet af forsøg, der er nødvendige for at nå 85% færdighed (fig. 3B) eller af den gennemsnitlige procent korrekt efter at have nået færdigheder.

Når mus lærer opgaven, kan lugt par ændres for at forøge eller formindske opgave vanskeligheder. For eksempel, øger faldende lugt-pair koncentration opgave vanskeligheder (figur 3C). Denne analyse kan afsløre tærsklen til registrering af forskellige mus kohorter. Derudover lugt par kan ændres til at blive mere strukturelt lignende (dvs. enantiomerer eller enkelt carbon forskelle). Lugt blandinger kan også bruges til at gøre opgaven sværere (dvs., 40/60 blanding vs 30/70 blanding).

Mus er også i stand til at huske tidligere lærde lugt par. Efter at have ventet 7 dage siden lære opgaven, lært en tilbagekaldelse test viser, at vildtype mus kan hurtigt huske tidligere lugt foreninger (figur 3D).

Figure 1
Figur 1 : Go/nej-go-go uddannelse paradigme og udstyr konfigurationen. (A) mus reagerer korrekt af enten får vand under gå lugt præsentation eller afstå under No-Go lugt præsentation. (B) opførsel boks er konfigureret således, at kun en enkelt vand port er tilgængelig i fase 1 og alle efterfølgende etaper indeholder både en central lugt levering port og to vand havne. Blå cirkel: vand port. Grøn cirkel: lugt port. (C) lugt levering er lukket af en lugt ventil for hver lugt. Overtryk luftindtag fører til en distributør. Røde pile viser positive luft pres linje går til rede lugt hætteglas (rød cirkel). Blå pil angiver luft/lugt blandingen forlader lugt hætteglas og passerer gennem en lugt ventil (lys blå cirkel) og ind i en hvid luft integrere boks. Orange pil angiver overtryk luft vil en central regulator ventil (orange cirkel) til integration for at give mulighed for positiv lufttryk til at skubbe lugt/luft-blanding fra integrator boks til lugt levering port (nederste sort pil). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Træningsdata. (A) mus kropsvægt procent ikke falde til under 80% af flydende begrænsning. Rød linje = 80%-tærsklen. N = 8 mus. (B) etape 1 uddannelse resultaterne viser antallet af center port stikker i 60 min til at modtage vand belønning. N = 8 mus. Fejllinjer er standard fejl af middelværdien. (C) fase 2 træningsresultater vis procentdel vand belønninger i hænde senest 5 s af center næse sækken. Rød linje er tærsklen på 25%. : Procentdel med grå fremhævning som standard fejl af middelværdien. N = 8 mus. (D) fase 3 kumulative belønner Vis antal belønninger modtaget af 8 mus på dag 1 og 2 i uddannelse. Rød linje er 60 belønning tærskler. Fejllinjer er standardafvigelse. (E) fase 4B nøjagtighed resultater vise procent korrekte svar for trin 4B. Rød linje er 85% af tærskelværdien. Solid sort linje er middelværdien og grå fremhævning er standard fejl af middelværdien. N = 4 mus. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Repræsentative resultater af Go/nej-go-go opgave. (A) gå/nej-go-go opgave for 2 roman Duftenes (S+ = isoamyl acetat/S-= amyl acetat) efter mus blev uddannet på eugenol (S+) og eukalyptol (S-). N = 5 mus, med standard fejl af middelværdien i grå. Grøn linje er 50% nøjagtighed, rød linje er tærsklen 85% nøjagtighed. (B) eksempel på Go/nej-go-go opgave for en mus, der ville være et hurtigt lærende versus en langsom lærende musen til hexanol (S+) og smørsyre (S-). (C) Go/nej-go-go opgave for varierende partielle pres hexanol (S+) og smørsyre (S-). (D) evne mus til at huske lugt par 7 dage efter træning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den gnaver olfaktoriske system giver en enestående model for at studere sensoriske afhængige plasticitet. Her præsenterer vi en olfaktoriske læring paradigme for at træne mus tilknyttes lugtstof par med enten en belønning eller straf. Gennem denne læring opgave, kan downstream kredsløb ændringer studeres i senere eksperimenter (Elektrofysiologi, i vivo neuronal billedbehandling, osv.). Ved afslutningen, vil mus lære at udføre en simpel lugt cued opgave for at knytte en vand belønning med en lugt, og en timeout straf til en anden lugt.

Da dette er en adfærdsmæssige assay, vi anbefaler udnytter en ligelig fordeling af alder og køn blandt eksperimentelle og styre dyregrupper. Det er bydende nødvendigt, at forhold mellem mus holdes så konstant som muligt. For eksempel sikre, at mus handleren og lysforhold forbliver konstant under hele uddannelsen. Hvis mange mus ikke udfører opgaven som forventet, sikre, at følgende betingelser er opfyldt: (1) holde opsætningen adfærd så roligt som muligt. (2) vand fratage musene tilstrækkeligt. Vi finder, at selv efter en hel dag af vand afsavn, mange mus ikke vil tilstrækkeligt drikker nok fra havnens centrum af boksen fase 1 at nå afslutningen kriterier. (3) i begyndelsen af hver ny mus, kontrollere lugt/vand ventiler og rør til at sikre korrekt placering. (4) Duftenes varierer i deres volatilitet og derfor nogle fordampe hurtigere end andre. Erstatte mere flygtige duftstoffer med højere damp pres dagligt i stedet for ugentligt, især hvis der anvendes lavere koncentrationer.

Denne protokol kan ændres efter den eksperimentelle formål. Hvis læring tid i trin 4B er vigtig, kan så det være tilrådeligt at fjerne enhver lugt til dette tidspunkt. Dette sikrer, at enhver olfaktoriske læring begynder ved trin 4B. For at opnå dette, har vi udført denne protokol ved at fjerne lugt fra fase 3 og ved at springe trin 4A helt. Musene vil have vanskeligere ved at nå afslutningen kriterier ved hjælp af denne metode, men det giver også værdifulde oplysninger for hvor hurtigt mus lære denne opgave første gang.

En begrænsning af denne protokol er at mus har at fuldføre forskellige faser indtil olfaktoriske test kan udføres. Derfor, selv om ikke set af vores lab, en manipulation kan hindre kognition sådan, at trin 4B konsekvent ikke nås. Vi har forsøgt at negere dette problem ved at sikre, at hver etape er tilstrækkeligt længe nok til at tillade de fleste mus til at opgradere til det næste trin i uddannelsen. Men hvis en mus ikke når afslutningen kriterier for en etape selv efter den fulde uddannelsesperiode, vi fjerne denne mus fra kohorten. Dette gør det muligt for os at fortsætte undersøgelsen uden at vente på nogen individuelle mus. En anden begrænsning er, at vi har endnu til at udvide denne protokol til andre vigtige for feltet af lugtesansen dyremodeller. Rotter, for eksempel, har været medvirkende til afslørende neuronal funktion inden for OB11,12. På grund af deres intelligens har rotter også hurtigere lære gange end mus13,14. På trods af disse begrænsninger valgte vi mus til denne protokol på grund af deres genetiske sporbarhed for at udføre celle type specifikke manipulationer og optagelser15.

De fleste eksisterende protokoller bruge forskelle i lugt snøfter eller tid brugt siden lugte at tilnærme forskelsbehandling eller lære4,6,9,10,16. Denne protokol kan direkte måle forskelsbehandling på grundlag af retssag af retssagen. Derudover kan det måle det nøjagtige antal forsøg hver musen skal lære en forening. Denne fuldt automatiserede tilgang fjerner enhver menneskelig bias fra dataanalyse. Frataget dyr har også held været anvendt til olfaktoriske læring. Vand berøvet mus blev valgt på grund af det øgede antal forsøg en mus kan udføre med vand over mad16.

Som implantabel aktivitet skærme, såsom Graded-indeks (GRIN) linser og multi-enhed elektroder, fortsætte med at forbedre, kan vi snart kunne kombinere disse teknologier med denne protokol17,18. Ved optagelse form relevante hjernen områder under olfaktoriske læring, er det muligt at sonde hvordan neuronal aktiviteter ændring under associative læring. Dette kan hjælpe med at afsløre grundlæggende neurovidenskab spørgsmål, såsom hvordan neuroner indkode oplysninger forskelligt under læring.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter og ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Denne protokol er tilpasset fra tidligere arbejde inden for vores lab (Huang et al. 8). alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af Animal Care og brug udvalg (ACUC) af Baylor College of Medicine. Det er støttet af McNair Medical Institute, NINDS grant R01NS078294 til B.R.A., NIH IDDRC legat U54HD083092, NIDDK grant F30DK112571 til JMP og NINDS grant F31NS092435 til CKM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass vial Qorpak GLC-01016
Silicon Tubing Thermo Scientific 86000030
18 gauge needles BD 305196
1-Butanol Sigma Aldrich 437603
Propionic Acid Sigma Aldrich 402907
Mouse Chamber Med Associates ENV-307W
Chamber Floor Med Associates ENV-307W-GFW
Water Port Med Associates ENV-313W Need two
Odor stimulus Med Associates ENV-275 Contain 2 valves to gate odor delivery 
Odor Port Med Associates ENV-375W-NPP
USB Interface Med Associates DIG-703A-USB
Desktop Computer with Windows 2000, XP, Vista, or 7
Flow meter VWR 97004-952
Behavioral software Med Associates SOF-735 This software, which runs each training stage, has now been replaced with Med-PC V
Data Transfer software Med Associates SOF-731 This software formats the data to Excel
Training Software Med Associates DIG-703A-USB This software is used to program each training stage
Water Valve Neptune Research 225P012-11 This valve is used to gate the water delivery. Need Two
Odor Valve Neptune Research 360P012-42 This valve is used to gate the odor delivery. Need Two

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carleton, A., Petreanu, L. T., Lansford, R., Alvarez-Buylla, A., Lledo, P. M. Becoming a new neuron in the adult olfactory bulb. Nat Neurosci. 6 (5), 507-518 (2003).
  2. Petreanu, L., Alvarez-Buylla, A. Maturation and death of adult-born olfactory bulb granule neurons: role of olfaction. J Neurosci. 22 (14), 6106-6113 (2002).
  3. Yamaguchi, M., Mori, K. Critical period for sensory experience-dependent survival of newly generated granule cells in the adult mouse olfactory bulb. PNAS. 102 (27), 9697-9702 (2005).
  4. Rochefort, C., Gheusi, G., Vincent, J. D., Lledo, P. M. Enriched odor exposure increases the number of newborn neurons in the adult olfactory bulb and improves odor memory. J Neurosci. 22 (7), 2679-2689 (2002).
  5. Arenkiel, B. R., et al. Activity-induced remodeling of olfactory bulb microcircuits revealed by monosynaptic tracing. PloS one. 6 (12), 29423 (2011).
  6. Alonso, M., Viollet, C., Gabellec, M. M., Meas-Yedid, V., Olivo-Marin, J. C., Lledo, P. M. Olfactory discrimination learning increases the survival of adult-born neurons in the olfactory bulb. J Neurosci. 26 (41), 10508-10513 (2006).
  7. Quast, K. B., et al. Developmental broadening of inhibitory sensory maps. Nat Neurosci. 20 (2), 189 (2017).
  8. Huang, L., et al. Task learning promotes plasticity of interneuron connectivity maps in the olfactory bulb. J Neurosci. 36 (34), 8856-8871 (2016).
  9. Arbuckle, E. P., Smith, G. D., Gomez, M. C., Lugo, J. N. Testing for odor discrimination and habituation in mice. J Vis Sci. (99), e52615 (2015).
  10. Zou, J., Wang, W., Pan, Y. W., Lu, S., Xia, Z. Methods to measure olfactory behavior in mice. Curr Protoc Toxicol. , 11-18 (2015).
  11. Uchida, N., Takahashi, Y. K., Tanifuji, M., Mori, K. Odor maps in the mammalian olfactory bulb: domain organization and odorant structural features. Nat Neurosci. 3 (10), 1035 (2000).
  12. Cang, J., Isaacson, J. S. In vivo whole-cell recording of odor-evoked synaptic transmission in the rat olfactory bulb. J Neurosci. 23 (10), 4108-4116 (2003).
  13. Parthasarathy, K., Bhalla, U. S. Laterality and symmetry in rat olfactory behavior and in physiology of olfactory input. J Neurosci. 33 (13), 5750-5760 (2013).
  14. Rajan, R., Clement, J. P., Bhalla, U. S. Rats smell in stereo. Science. 311 (5761), 666-670 (2006).
  15. Batista-Brito, R., Close, J., Machold, R., Fishell, G. The distinct temporal origins of olfactory bulb interneuron subtypes. J Neurosci. 28 (15), 3966-3975 (2008).
  16. Sakamoto, M., et al. Continuous postnatal neurogenesis contributes to formation of the olfactory bulb neural circuits and flexible olfactory associative learning. J Neurosci. 34 (17), 5788-5799 (2014).
  17. Resendez, S. L., Jennings, J. H., Ung, R. L., Namboodiri, V. M. K., Zhou, Z. C., Otis, J. M., Stuber, G. D. Visualization of cortical, subcortical, and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nat Protoc. 11 (3), 566 (2016).
  18. Park, S., et al. One-step optogenetics with multifunctional flexible polymer fibers. Nat Neurosci. 20 (4), 612 (2017).

Tags

Neurovidenskab sag 133 olfaktoriske kredsløb læring synaptic plasticitet Go/No-Go adfærd operant betingning associative læring
En objektiv og reproducerbare Test af olfaktoriske læring og diskrimination i mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, G., Patel, J. M., Tepe, B.,… More

Liu, G., Patel, J. M., Tepe, B., McClard, C. K., Swanson, J., Quast, K. B., Arenkiel, B. R. An Objective and Reproducible Test of Olfactory Learning and Discrimination in Mice. J. Vis. Exp. (133), e57142, doi:10.3791/57142 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter