Profilering DNA replikation Timing ved hjælp af zebrafisk som en In Vivo modelsystem.

Summary

Zebrafisk blev for nylig brugt som en in vivo modelsystemet for at studere DNA replikation timing under udvikling. Her er detaljerede protokoller for at bruge zebrafisk embryoner til profil replikering timing. Denne protokol kan tilpasses nemt for at studere replikering timing i mutanter, enkelte celletyper, sygdomsmodeller og andre arter.

Abstract

DNA replikation timing er en vigtig cellulær karakteristiske, udviser betydelige relationer med kromatin struktur, transskription og DNA mutation satser. Forekomme ændringer i replikering timing under udvikling og i kræft, men rolle replikering timing spiller i udvikling og sygdom er ikke kendt. Zebrafisk blev for nylig etableret som en i vivo modelsystem til at studere replikering timing. Her er detaljerede protokoller for at bruge zebrafisk for at bestemme DNA replikation timing. Efter sortering celler fra embryoner og voksen zebrafisk, kan høj opløsning genome-wide DNA replikation timing mønstre konstrueres ved at fastslå ændringer i DNA eksemplarnummer gennem analyse af næste generation sequencing data. Zebrafisk modelsystem giver mulighed for vurdering af replikering timing ændringer, der sker in vivo i hele udvikling, og kan også bruges til at vurdere ændringer i enkelte celletyper, sygdomsmodeller eller mutant linjer. Disse metoder gør det muligt studier undersøger de mekanismer og determinanter for replikering timing etablering og vedligeholdelse under udvikling, rolle replikering timing spiller i mutationer og tumordannelse og virkningerne af prøvningen replikering timing på udvikling og sygdom.

Introduction

For celler at kunne opdele, skal de først præcist og trofast gentage deres hele genom. Genome dobbeltarbejde opstår i en reproducerbar mønster, kendt som DNA replikation timing program¹. DNA replikation timing er korreleret med kromatin organisation, epigenetiske marks og gen expression^2,3. Ændringer i replikering timing opstår i hele udvikling, og er betydeligt relateret til transcriptional programmer og ændringer af kromatin mærker og organisation^4,5. Derudover replikering timing er korreleret med mutationsmønstre frekvenser, og ændringer i tidsplanen overholdes i de forskellige typer af kræft^6,7,8. Trods disse bemærkninger, mekanismer og determinanter for replikering timing etablering og regulering er stadig stort set ukendt, og rollen det spiller i udvikling og sygdom er uafklaret. Derudover indtil for nylig genome-wide replikeringen havde timing forandringer, der sker i hele hvirveldyr udvikling kun undersøgt i celle kultur modeller.

Zebrafisk, Danio rerio, er velegnet til at studere replikering timing i vivo under udviklingen, som en enkelt parring par kan udbytte af hundredvis af embryoner, der udvikler sig hurtigt med mange ligheder med pattedyr udvikling^{9, 10}. Derudover hele zebrafisk udvikling er der ændringer til celle cyklus, kromatin organisation og transcriptional programmer, der deler relationer med DNA replikation timing¹¹. Zebrafisk er også en fremragende genetiske model, som de er særligt åbne over for manipulation ved transgenese, mutagenese og målrettede mutationer, og genetiske skærme har identificeret mange gener kræves for hvirveldyr udvikling¹². Zebrafisk kan derfor bruges til at identificere gener involveret i replikering timing etablering og vedligeholdelse og at observere effekterne af deregulering replikering timing på hvirveldyr udvikling. Transgene linjer kan også bruges til at vurdere replikering timing fra enkelte celletyper isoleret på forskellige udviklingsmæssige timepoints eller i sygdomstilstande. Vigtigere, er der forskellige zebrafisk modeller af menneskers sygdom, der kan bruges til at undersøge rollen af replikering timing i sygdom dannelse og progression^9,13,14.

For nylig, de første replikering timing profiler blev genereret fra zebrafisk, etablere det som et modelsystem til at studere replikering timing i vivo¹⁵. For at opnå dette, blev celler indsamlet fra zebrafisk embryoner i flere faser af udvikling og i en celletype isoleret fra voksen zebrafisk. Celler blev derefter sorteret efter FACS (Fluorescens-aktiveret celle sortering) baseret på DNA indhold at isolere G1 og S fase populationer. Bruger eksemplet G1 som en kopi nummer kontrol, kopiere antal variationer i S fase populationer var bestemt og bruges til at udlede relative replikering timing¹⁶. Ændringer i replikering timing kan derefter sammenlignes direkte mellem forskellige udviklingsmæssige prøver og celletyper og det blev brugt til at bestemme forandringer i replikering timing, der forekommer i vivo hele hvirveldyr udvikling. Denne metode giver flere fordele sammenlignet med andre genomisk metoder, først og fremmest at det ikke kræver mærkning med thymidine analoger eller immunoprecipitation af DNA^4,6.

Her er detaljerede protokoller til profil genome-wide DNA replikation timing på høj opløsning i zebrafisk. Disse protokoller er blevet brugt til at fastslå relationer med genomisk og epigenetiske funktioner i zebrafisk genom, samt profilering ændringer i disse relationer, der opstår i hele udvikling. Disse protokoller er også let tilpasses for at studere ændringer i replikering timing i mutantstammen af zebrafisk og sygdomsmodeller. Derudover disse metoder til at give et fundament, der kan udvides ved for at studere replikering timing i bestemte celletyper, ved første sortering ud de enkelte celletyper fra zebrafisk. For zebrafisk kan tjene som en fremragende i vivo modelsystem til at studere replikering timing og i sidste ende afslører de biologiske funktioner af denne vigtige epigenetiske træk.

Protocol

Alle dyrene blev håndteret i nøje overensstemmelse med protokoller godkendt af Oklahoma Research Foundation institutionelle dyr lægebehandling og brug udvalget.

1. opsætning af voksen zebrafisk til avl

1. Brug en stor kohorte af voksne mandlige og kvindelige zebrafisk af en enkelt stamme til avl. Der er små forskelle i den genetiske makeup af zebrafisk af selv en enkelt stamme, skal du bruge en stor kohorte for at sikre, at resultaterne er repræsentative for den genetiske variation af befolkningen og ikke begrænset til en lille delmængde af populationen.
2. Natten før embryoner vil blive indsamlet, placere snesevis af ynglende voksne i opdræt tanke, bruge ca lige mange hanner og hunner. Afhængigt af eksperimentet, bruge en af følgende strategier for avl.
   1. Avl strategi 1: placere et par mandlige og kvindelige zebrafisk i enkelte opdræt tanke, adskiller mænd fra kvinder med en skillevæg. Hvis denne fremgangsmåde benyttes, opsætning af mange forskellige opdræt tanke og pool embryoner fra hver at sikre den biologiske variation er repræsentative for befolkningen.
   2. Avl strategi 2: kombinere snesevis af mandlige og kvindelige zebrafisk i en stor avl tank. Brug denne strategi så længe der er et tilstrækkeligt stort antal embryoner, det er rimeligt at antage, de kom fra en bred vifte af grundlæggerne og er derfor genetisk repræsentative af befolkningen.

2. timet parringer - indsamling, sortering og boliger zebrafisk embryoner til forsøg

1. Udføre timet parringer, begynder så snart lyset cykler bliver i morgen. Kassér alle embryoner genereret natten over.
2. Tillad fisk at yngle på lavt vand (3-5 cm) i en periode på 10 min, med en falsk bund for embryoner at flygte gennem.
3. Efter 10 min, indsamle embryoner ved at hælde gennem en si og skylning i et 10-cm plade med en vaskeflaske. Pool alle embryoner indsamles på samme tidspunkt, markere dem med tidspunktet for indsamling og sted straks i en inkubator ved 28,5 ° C.
4. Hundredvis af embryoner kan forventes fra en enkelt parring par i en dag. Tillad voksne til at yngle i 10 min cykler indtil antallet af embryoner opnået er mindre end tyve.
5. Ca. 1-1,5 h efter indsamling, sortering embryoner til at fjerne døde og ugoedet embryoner. Hvis du vil sortere embryoner, fjernes fra rugemaskinen og iagttage under et dissekere mikroskop.
   1. Antal embryoner og sted med en tæthed på 100 embryoner pr. 10 cm plade.
   2. Tilføj frisk E3 medium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl₂, 0,33 mM MgSO₄) og returnere embryoner til 28,5 ° C inkubator.

3. Dechorionate, deyolk, og lave zebrafisk embryoner

Bemærk: Dette afsnit af protokollen er designet til embryoner inden 48t post befrugtning (hpf). Der er ingen grund til at fjerne chorions af embryoner i senere faser af udvikling (efter 48 hpf), da de ofte naturligt falder. Der er ingen grund til at deyolk eller fjerne chorions fisk ældre 5 dage efter befrugtningen (dpf).

1. Når embryoner nå ønskede udviklingsmæssige alder, kontrollere passende udviklingstrin morfologisk under et lysmikroskop efter "Stadier af embryonale udvikling af the zebrafisk"¹⁷.
2. Overføre op til 1500 iscenesatte embryoner til en 15 mL konisk slange og vaskes flere gange med E3.
   1. Tilsæt 1 mL af E3 og 20 µL af Pronase løsning (30 mg/mL) for hver 100 embryoner og forsigtigt hvirvel. Op til 1500 embryoner kan være dechorionated i et enkelt rør med 15 mL af E3.
   2. Læg røret på sin side og arrangere embryoner i et jævnt lag til at sikre maksimal overflade til volumen-forholdet. Forsigtigt agitere tube hver 2-3 min. indtil alle chorions er faldet ud af embryoner. Den samlede dechorionation tid vil variere afhængigt af Pronase aktivitet.
3. Fjern supernatanten og forsigtigt skyl embryoner 3 gange med 10 mL af E3. Placer embryoner på is i resten af dette afsnit i protokollen.
4. Fjerne E3 og vaske embryoner med frisklavede iskold deyolking buffer (0,5 x Ginzburg fisk Ringers løsning, uden calcium: 55 mM NaCl, 1,8 mM KCl, 1,25 mM NaHCO₃).
   1. Der tilsættes 1 mL iskold deyolking buffer for op til 500 embryoner.
   2. Ved hjælp af en P1000, forsigtigt afpipetteres embryoner op og ned 5 - 10 gange at forstyrre æggeblomme sæk.
   3. Der overføres 1 mL til en 1,5 mL mikrofuge rør og centrifugeres ved 4 ° C og 500 x g i 5 min.
5. Fjern supernatanten og vask pellet med 1 mL iskold 1 x PBS (fosfatbufferet saltopløsning, pH 7,0) at fjerne Ringers løsning. Der centrifugeres ved 4 ° C og 500 x g i 5 min.
6. Forsigtigt fjerne supernatanten og resuspend celler i 1 mL af 1 x PBS. Placer røret på is.
7. Tilføj 3 mL iskold ethanol (EtOH) til en 15 mL konisk slange. Vortex tube EtOH forsigtigt på lav indstilling.
   1. Ved hjælp af en P1000, langsomt (1 dråbe per sekund) drop zebrafisk embryo cellesuspension til EtOH mens vortexing forsigtigt.
   2. Tilføje en total af 1 mL af embryo cellesuspension for en afsluttende fiksering løsning af 75% EtOH.
8. Efter 1 mL af celle er suspension blevet tilføjet, forsigtigt hvirvel rør til at blande og placere ved-20 ° C i mindst 1 time. Det anbefales at placere rør på deres side at sikre maksimal overflade til volumen-forholdet og reducere antallet af embryoner og celler, der holde sammen. Gemme fosterceller ved-20 ° C i 2-3 uger.

4. farvning DNA og FACS sortering embryoner

Bemærk: Dette afsnit af protokollen er beregnet for embryoner på 1 dpf.

1. Fjerne EtOH-fast fosterceller fra-20 ° C, og der centrifugeres ved 4 ° C 1500 x g i 5 min.
   1. Placer røret på is og omhyggeligt Fjern supernatanten. Bruger en P1000, forsigtigt resuspend celler i 1 mL af frisklavede kolde PBS-BSA (1 x PBS, 1% bovint serumalbumin).
   2. Centrifugeres celler ved 4 ° C og 1500 x g i 5 min og Anbring på is.
2. Fjern supernatanten og resuspend celler i propidium Iodid (PI) farvning løsning (50 µg/mL PI, 100 µg/mL RNase A, PBS, pH 7,0), ved hjælp af 200 µL for hver 1000 embryoner.
   1. Tillad cellerne at udruge i PI løsning for 30 min på is, forsigtigt blandes alle 5 min.
   2. Placer en 40 µm nylon celle si på en 50 mL konisk slange på is. Forsigtigt afpipetteres celler for at blandes og filtreres gennem trådnet.
      Bemærk: Hvis flere rør af embryoner fra samme tidspunkt blev indsamlet i punkt 3 i protokollen, kombinere disse embryoner på dette tidspunkt så de sorteres alle sammen.
   3. Bruger fast inde i slutningen af en sprøjte stemplet, forsigtigt forstyrre enhver resterende klumper af celler på trådnet.
   4. Skyl celler gennem filteret med 500 µL af kolde PBS-BSA i hver 1000 embryoner.
   5. Placer en 40-µm maske over en 15 mL konisk slange på is og filtrere cellesuspension fra 50 mL konisk tube endnu en gang ind i 15 mL rør.
3. Ved hjælp af en passende celle sortering instrument, sat laser excitation til 561-nm og emission påvisning at 610/20 at opdage propidium Iodid.
   1. Mix 15 mL tube af farvede celler kortvarigt ved vortexing og sted i instrument ved 4 ° C.
   2. Køre celler på en langsom flow hastighed, ideelt 1,0 mL/min, for at få en ren cellecyklus profil og undgå at blande G1 eller G2/M celler med S fase befolkning.
   3. Først, gate for FSC-A x SSC-en (forward scatter område af side scatter område) til at fjerne snavs (figur 1A).
      Bemærk: Celler fra embryoner kan varierende størrelser afhængig af typen fase og celle. Filteret med neutral tæthed (ND) skal måske skiftes mellem 1,0 og 1,5 afhængigt af celler nuværende størrelse. Gate et stort område for at indsamle de fleste celler og fjerne snavs.
   4. Andet, gate for SSC-område (SSC-A) af PI-området (PI-A), til at fjerne snavs og celle dubletter (figur 1B).
   5. For det tredje gate for SSC-A af SSC-W (bredde) til at fjerne enhver resterende celle dubletter (figur 1 c).
4. Vise de låge befolkninger på et histogram med cell antal (count) på y-aksen og propidium Iodid området (PI-A) på x-aksen. For 24 hpf embryoner, bør dette give en stereotype cellecyklus profil som i figur 1 d.
   1. Hvis du vil sortere S fase befolkning, angive porten fra højre side af G1 peak til venstre side af G2 peak, herunder kun en minimal mængde af G1 og G2. 24 hpf embryoner, vil dette typisk omfatter ca. 10-15% af befolkningens låge (Se figur 1 d).
   2. Hvis du vil sortere befolkningens G1, skal du angive porten på venstre side af G1 peak, ikke at videregive toppen af top. Justere bredden af G1 gate så smal som muligt (Se figur 1 d).
   3. Tilbage gate G1 og S fase befolkninger til at sikre korrekt indledende gating (figur 1E).
5. Sortere G1 og S fase populationer i 15 mL konisk rør med 3 mL af PBS-BSA. Målet bør være at opnå mellem 500.000 og 1 million eller mere sorteret celler pr. fraktion (G1 og S fase).
6. Når sortering er fuldført, centrifuge rør på 1500 x g og 4 ° C i 10 min.
   Bemærk: Småcellet pellet vil være vanskeligt at se, og det er vigtigt at undgå at forstyrre det, så brug helst en swingende spand rotor over en fast vinkel rotor.
7. Forsigtigt fjerne supernatanten og resuspend pellet med 1 mL af 1 x PBS. Overfør celler til en 1,5 mL mikrofuge rør og centrifugeres ved 6.000 x g og 4 ° C i 5 min.
8. Forsigtigt fjerne alle væske fra rør og fryse tør pellet ved-20 ° C. Gemme pellet ved-20 ° C i 2-3 uger.

5. DNA isolation, RNase behandling og DNA oprensning

1. Fjerne celle pellet fra-20 ° C og sted på is.
   1. Tilføj 400 µL af SDS buffer (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,5% SDS) til pellet og resuspend.
   2. Tilføje proteinase K til en endelig koncentration på 0,2 mg/mL og blandes ved vortexing kort.
   3. Inkuber prøver ved 56 ° C i 2 timer, vortex hver 15 min.
2. Efter 2 h, udføre phenol-chloroform ekstraktion ved at tilføje 400 µL af phenol-chloroform (Phenol: Chloroform: Isoamyl alkohol 25:24:1, mættet med 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA).
   1. Vortex for 20 s og centrifugeres prøve på 16.000 x g for 5 min at adskille faser.
   2. Fjern forsigtigt den øverste vandfasen (400 µL) og overførsel til en 1,5 mL tube.
3. Udføre EtOH nedbør ved at tilføje 40 µL 3M natriumacetat (pH 5,2), 2 µL af glykogen og 1 mL af EtOH.
   1. Vortex blandes grundigt og placere ved-20 ° C natten over til udfældes DNA. Prøven kan også være udfældet ved-80 ° C eller på tøris i 1 time.
   2. Centrifuge prøve ved 4 ° C og 16.000 x g i 30 min pellet DNA.
   3. Fjern supernatanten og vask pellet med 1 mL 70% EtOH. Der centrifugeres ved 4 ° C og 16.000 x g i 5 min.
   4. Kassér supernatanten og lufttørre pellet ved omgivende temperatur i 2-3 min.
4. Opløse pellet i 96 µL autoklaveres vand, og tilsæt 4 µL af RNase A (2 mg/mL).
   1. Bland godt med vortexing og inkuberes ved 37 ° C i 1 time.
5. Udføre phenol-chloroform ekstraktion ved at tilføje 100 µL af phenol-chloroform og fremgangsmåden i trin 5.2.1 - 5.2.2.
6. Udføre EtOH nedbør ved at tilføje 10 µL af 3M natriumacetat, 1 µL glykogen og 250 µL af EtOH og følge fremgangsmåden i trin 5.3.1 - 5.3.5.
7. Resuspend pellet i 60 µL af TE buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA (pH8.0)) og bestemmelse af DNA koncentration ved hjælp af en kvantitativ fluorescens-baseret metode. Store DNA ved-20 ° C.
   Bemærk: Det er vigtigt at kvantificere DNA ved hjælp af fluorescens-baseret DNA bindende farvestoffer, eller på anden måde mere pålidelig end UV spektrometer-baserede metoder.

6. forberedelse af DNA biblioteker og næste generation sequencing

Bemærk: En G1 kopi nummer referenceprøve for hver biologisk kilde er nødvendig for hver sekventering run (dvs. WT, mutant, transgene, cellelinie, osv). Sammenlign alle S fase prøver fra de samme biologiske kilde i den samme sekventering køre på den samme G1 reference. Køre mindst to biologiske replikater af hver prøve at sikre sammenhæng mellem prøver.

1. Fortyndes 1 µg DNA til en endelige rumfang 50 µL og overførsel til en specialiseret tube for sonikering.
2. Shear genomisk DNA avancerer til 250-300 bp i en fokuseret ultrasonicator, ifølge producentens specifikationer og protokol.
3. Kontrollere kvaliteten og størrelsen på vredne genomisk DNA ved hjælp af en automatiseret elektroforese maskine, ifølge producentens specifikationer og protokol. Sikre, at der er et stort højdepunkt på ~ 250-300 bp for den afrevne genomisk DNA.
4. Forberede sekventering biblioteker ved hjælp af en DNA-biblioteket forberedelse kit med multiplex oligos til sekvensering på Illumina platform, efter fabrikantens protokol.
5. Kontrollere kvaliteten af bibliotek prep ved hjælp af automatiserede elektroforese maskine, efter fabrikantens protokol. Sikre, at der er et stort højdepunkt på ~ 400-450 bp, og der er minimal toppe for primer dimerer (80-85 bp) og adapter dimerer (~ 120 bp).
6. Kvantificere biblioteker ved hjælp af en DNA-biblioteket kvantificering kit for næste generations DNA-sekventering, efter fabrikantens protokol.
7. Fortyndet 15 µL af bibliotek til en koncentration på 5 nM og kombinere multipleksede biblioteker, som kræves for at opnå ønsket entydigt kortlægning læse tæller pr. prøve.
   Bemærk: Antallet af unikt kortlægning læser per prøve vil bestemme beslutningen. Brug så få som 5 millioner kortlagt læser for at vurdere replikering timing for zebrafisk genom. Det anbefales at starte med 10-20 millioner læser.
8. Udføre parret-slutningen 100 bp samlede genom DNA sekventering af prøverne på en næste generation sequencing platform, ifølge producentens anvisninger.

7. analyse af sequencing data

Bemærk: Instruktionerne i dette afsnit er beregnet som en retningslinje for analyse. Anvende yderligere metoder til sekvensering justering, filtrering, behandling mv. Dette afsnit af protokollen vil beskæftige sig med den foretrukne metode til analyse i dette arbejde. Hvis der anvendes supplerende metoder, justere parametre og funktioner der passer til disse formål. De kommandoer nedenfor er angivet i Ubutnu eller Mac terminal, med de rette pakker installeret.

1. Få de seneste versioner af zebrafisk genom (danRer10, som da denne protokol blev skrevet) fra UCSC genom browser ved hjælp af følgende kommandoer:
   wget ftp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/danRer10/bigZips/danRer10.fa.gz-O danRer10.fa.gz
   1. Dekomprimer filen fa.gz med følgende kommando:
      gunzip danRer10.fa.gz
   2. Juster sequencing data til genom ved hjælp af BWA-mem ved hjælp af følgende kommandoer:
      BWA mem -t 8 danRer10.fa read_1.fastq read_2.fastq > output.sam
2. Konvertere .sam fil til .bam fil ved hjælp af samtools hos den næste befale:
   samtools Se -bS input.sam > output.bam
   1. Sortere justeret sekventering filer ved hjælp af samtools hos den næste befale:
      samtools sortere output.bam > output_sorted.bam
   2. Indeksere den .bam fil ved hjælp af samtools hos den næste befale:
      samtools indeks output.bam
3. Mark PCR dubletter med Picard ved hjælp af følgende kommandoer:
   Java-Xmx2g-jar picard.jar MarkDuplicates \
   INPUT=input.Bam
   OUTPUT=output.Bam
   REMOVE_DUPLICATES = false
   METRICS_FILE=output_metrics.txt
4. Generere tekstfiler (.txt) af læser for hvert kromosom, ved hjælp af følgende kommando:
   for jeg i {1,25}; gøre krom = "chr" $i; ECHO $CHROM; samtools Se input.bam $CHROM | skære -f 2,4,5,7,8,9 > readsChr$ {i} .txt; gjort
   Bemærk: Kolonnerne i det resulterende .txt fil er Flag, placering, mapQ, parre chr, par placering og fragment størrelse, henholdsvis.
5. Læse .txt-filer ind i Matlab (eller enhver anden lignende software) ved hjælp af funktionen tekster.
   1. Filter til at udelukke lav kortlægning kvalitet læser ved at indstille en mapQ tærskel på 30.
   2. Fjerne læser med flag for ikke primære justering, PCR dubletter eller par tilknytning til et andet kromosom.
   3. Filter til at udelukke enhver læser med deres par ud over en afstand tærskel 2000 bp.
   4. Vurdere statistik af resulterende læser til at bestemme antallet af Læs statistik, dækning, Indsæt størrelse og kvalitet (figur 2).
6. Afgøre Læs dækning i 100 bp fast windows for hver prøve ved at tælle antallet af læsninger i 100 bp intervaller på tværs af længden af hvert kromosom.
   1. Beregne medianen læse tæller for alle vinduer.
   2. Filtrere områder af høj dækning ved at fjerne windows større end 5 standardafvigelser fra medianen.
7. Definere områder for analyse i G1 referenceprøver af at finde segmenter langs hvert kromosom med 200 læsninger ved hjælp af glidende windows.
   1. Afgøre Læs dybde i hver S fase prøve ved at tælle antallet af S fase læsninger i 200-Læs tælle vinduerne defineret for referencen ledsagende G1.
8. Glat de rå data ved hjælp af funktionen csaps i softwaren, med en interpolation faktor (p) af 10^-16.
9. Normalisere glattes data til z-score med en middelværdi på 0 og en standardafvigelse på 1.

Representative Results

Ved hjælp af offentliggjorte replikering tidsmålinger, leveres repræsentative replikering timing profiler og foranstaltninger til kvalitetskontrol¹⁵. De første trin af behandlingen indebærer tilpasse sequencing data til genom, beregne Læs længde og genom dækning statistikker og filtrering af lav kvalitet, uparrede, og PCR dublerede læser. Læs statistikkerne for en typisk zebrafisk sekventering prøve er vist i figur 2. Efter filtrering, Læs tæller bestemmes i variabel størrelse windows og data er glattes og normaliseret. Typiske glattes/normaliseret replikering timing profiler af en repræsentativ zebrafisk kromosom for biologiske replikater er vist i figur 3A. Profiler for biologiske og eksperimenterende replikater bør være visuelt meget lignende (Se figur 3A) og også vise høj korrelation langs længden af kromosom (figur 3B). De bør også vise høj korrelation mellem Synkroniseringsværdier genome-wide (figur 3 c). Autokorrelation, en metode til at vurdere mønster kontinuitet, bør anvendes til at vurdere graden af struktur i datasæt (figur 3D). Autokorrelation for struktureret modne timing programmer skal være høj på korte afstande og gradvist falde som afstanden øges. Prøver, der viser høj reproducerbarhed mellem biologiske og eksperimenterende replikater og en stærk autokorrelation signal bør betragtes som høj kvalitet prøver og kan kombineres for at opnå en højere dækning prøve.

Figur 1: sortering zebrafisk embryoner for replikering timing analysen. (A) Gated befolkning af alle celler sorteret for forward scatter område (FSC-A) af side scatter område (SSC-A). Farverne repræsenterer tæthed placeringer i dot plot med høj til lav tæthed repræsenteret ved farverne spænder fra rød-til-grøn-til-blå. (B) Gated befolkning af FSC x SSC gated celler sorteret SSC-A af propidium Iodid område (PI-A). (C) Gated befolkning af VSK x PI gated celler sorteret SSC-en ved side scatter bredde (SSC-W). (D) Histogram af alle gated populationer viser en stereotype cellecyklus profil. Sorter gates boksede for celler i G1 og S fase vises som grå skygge med sorte streger. (E) Backgated G1 og S fase populationer viser, at den oprindelige gating fangede fleste celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: sekventering læse statistik for en typisk zebrafisk prøve. (A) Reap kortlægning kvalitet fra statistikker af mapQ værdier. (B) Histogram af fordelingen af Indsæt størrelser til alle sekvensering læser. (C) Læs statistikker for samlede tilknyttede læser, læser, der indeholder lav kvalitet flag, læser med par tilknytning til et andet kromosom (par diff chr), læser med par ud over afstand tærskel (Fjern par) og PCR dubletter. (D) repræsentative numre af alt tilknyttet, ikke-tilknyttede og uparret læser, dækning, og læse opløsning for en typisk sekventering køre en zebrafisk prøve. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: repræsentant zebrafisk replikering timing resultater og kvalitetskontrolforanstaltninger. (A) replikering timing langs længden af en repræsentant kromosom for to biologiske replikater af 28 hpf embryoner (Siefert, 2017). (B) korrelation mellem replikering Synkroniseringsværdier i 2 Mb windows langs længden af en repræsentativ kromosom til biologiske replikater af 28 hpf embryoner vist i figur 3A. (C) Genome-wide korrelation mellem replikering Synkroniseringsværdier for biologiske (rep1 og rep2) og eksperimenterende (rep3) replikater af 28 hpf embryoner. Farve kort repræsenterer Pearsons korrelationskoefficient. (D) autokorrelation for en struktureret modne timing program viser høj autokorrelation på korte afstande, der aftager gradvist over stigende længere afstande. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Zebrafisk giver et nyt og unikt i vivo modelsystem at studere DNA replikation timing. Når tidsindstillet parringer er udført som beskrevet i denne forsøgsplan, tusindvis af embryoner kan indsamles i en enkelt dag til eksperimenter. Disse embryoner udvikle synkront gennem netop timet og tydeligt præget faser af udvikling. Zebrafisk kan nemt og præcist iscenesat af morfologi ved hjælp af et stereomikroskop, som zebrafisk embryoner udvikle eksternt og optisk klare. Denne protokol beskriver i detaljer brug af zebrafisk embryoner at studere replikering timing i hele hvirveldyr udvikling.

Den protokol, der kan indebære problemer omfatter synkron udvikling af zebrafisk embryoner, tab af celler under forberedelsen, FACS sortering og bibliotek forberedelse. Timingen af zebrafisk udvikling er temperatur afhængige, derfor brug zebrafisk tilpasset lys/mørke cyklus og har til huse på 28,5 ° C for eksperimenter. For at sikre en synkron udvikling, udføre netop timet parringer og indsamle embryoner i meget små tid-vinduer (10 min eller mindre). Det er afgørende at opretholde embryoner ved 28,5 ° C og sikre, at de bruger minimal tid ved stuetemperatur. Timingen af zebrafisk udvikling er også stærkt afhængige af tætheden af embryoner i et givet område. Det er afgørende at ikke hus embryoner på densitet højere end 100 embryoner pr. 10 cm plade, eller de vil ikke udvikle sig ordentligt. Det optimale tidspunkt at fjerne døde og ugoedet embryoner er når de har udviklet sig til 4-16 celle stadium og kan let identificeres som befrugtede (brug "Stadier af embryonale udvikling af the zebrafisk"¹⁷ som en guide). Døde embryoner typisk vises som sorte kugler og ugoedet embryoner vises som 1-celle. Arbejde så hurtigt som muligt for at reducere tid ved stuetemperatur.

Når dechorionating embryoner, det er vigtigt at sikre, at alle chorions er fjernet fra embryoner. Opbevare embryoner i pronase løsning, indtil de fleste chorions er kommet. Kassér eventuelle resterende embryoner med chorions intakt eller fjerne deres chorions med pincet. Pipette embryoner ved hjælp af en langsom og jævn bevægelse. Ikke afpipetteres hurtigt som det vil underkaste cellerne til unødig stress og resulterer i tab af celler. Det er også vigtigt ikke at bruge en P200, da dette kan medføre øget shear stress, der resulterer i brud af celler. Omvendt, en plastik overførsel pipette kan ikke har en lille nok bar eller give nok shear stress for at tilstrækkeligt forstyrre blomme-sæk og disaggregate celler. Alternative pipetter kunne bruges forudsat boringen og shear ville være svarende til den optimale P1000.

Når FACS sortering 28 hpf, hvis en stereotype celle cyklus profil ikke opnås, justere spænding på PI laser, så G1 peak er centreret omkring 50K. Gevinster for FSC og VSK kan også skal justeres således, at de gating og celle populationer vises svarende til figur 1. Hvis der stadig er vanskeligheder, ND filter bør skiftes, og at FSC og SSC spændinger justeret for at sikre, at fleste celler er inden for porten. Det burde være indlysende, om der er PI farvning, så der bliver et område, der tilnærmer fordobler for PI-A. Histogrammet bør viser to klare toppe, et stort højdepunkt på 2N DNA for G1 celler og en mindre top med dobbelt intensiteten for 4N DNA indhold af G2/M celler. Hvis dette stadig ikke fremkommer der kan enten være lavt antal intakt celler, problemer med PI farvning eller problemer med fiksering og protokollen skal optimeres i overensstemmelse hermed.

Celler fra tidlige embryoner (før 10 hpf) vil ikke give typiske cellecyklus profiler, som en høj procentdel af disse celler er i S fase. Disse prøver kan behandles som S fase prøver og sammenlignet med en G1 reference fra 24 hpf embryoner. Embryoner mellem 10 hpf og 24 hpf kan give mellemliggende celle cyklus profiler og kan sorteres, hvis det ønskes. S-fase befolkning kan også identificeres og sorteret ved at indarbejde thymidine analoger såsom EDU (5-Ethynyl-2'-deoxyuridine) eller BrdU (Bromodeoxyuridine) i korte pulser før fiksering, dette er dog ikke nødvendigt for nøjagtig bestemmelse af replikering timing.

Ideelt bør bibliotek forberedelse startes med 1 µg af DNA. Teoretisk ~ 300.000 sorteret celler ville give ca. 1 µg af DNA (estimering ~3.3 pg/kerne), men der er altid tab hele protokollen. 500.000 til 1 million sorteret celler bør give mere end 1 µg af DNA. En typisk 24 hpf embryo vil have ca 18.000 celler, hvoraf 10-15% vil være i S-fase. Embryoner på tidligere stadier af udvikling vil have betydeligt mindre celler, men vil have højere procentsatser af celler i S-fase.

Udfører korrekt rensning og størrelse udvælgelse ved hjælp af magnetiske perler er kritisk for at fjerne uønskede elementer fra biblioteket forberedelse. Følg producentens anvisninger omhyggeligt og yderligere optimering kan være påkrævet. En lille mængde af PCR dimerer er typisk ikke et stort problem, men adapter dimerer vil sekvens meget effektivt, så de bør minimeres. Dette kan opnås ved at justere den indledende adapter til DNA-forholdet, og udfører nøjagtig størrelse udvalg under bibliotek forberedelse.

Single-ende sekvensering kan også være passende for forskellige eksperimentelle behov. Single-slutningen er billigere og giver de fleste af de krævede oplysninger, da denne tilgang er baseret på optælling læser; parret slutningen giver en højere mulighed for at fjerne PCR og optisk dubletter og løse områder af repetitive sekvenser og andre strukturelle varianter, (som er almindelige i zebrafisk genom). Analyse del nedenfor vil beskæftige sig kun med parret ende sekventering læser. Kortere sekventering læser kan også være hensigtsmæssigt. Dette vil give et højere antal læsninger til en lavere pris, men lyder kan være vanskeligere at kortlægge. Analyse del nedenfor er optimeret til 100 bp læser, og tilpasninger kan være nødvendigt hvis kortere Læs længde bruges.

Denne protokol kan også let tilpasses til yderligere anvendelser af zebrafisk model. Det er allerede blevet anvendt til analyse af zebrafisk tailfin fibroblaster (ZTF celler), en primær celle kultur line isoleret fra voksen zebrafisk tailfin. For at studere isolerede celletyper fra zebrafisk, kan transgene markører bruges til at identificere og isolere enkelte celletyper før farvning og sortering for DNA indhold. En potentiel strategi ville være at bruge en transgene linje at udtrykke en fluorescerende markør drevet af en væv-specifikke promotor, og at første isolerede celler af FACS sortering, fulgt fiksering og sortering for DNA indhold. Derudover kan anvendelsen af celle gennemtrængelig DNA farvestoffer give for samtidige isolering af enkelte celletyper samt G1 og S fase populationer. Disse tilpasninger af denne protokol kan også aktivere replikering timing undersøgelser i andre i vivo modeller.

En spændende mulighed for den fremtidige anvendelse af denne protokol er at undersøge rollen for replikering timing i sygdom. Der er flere kræftmodeller i zebrafisk, nogle spontane og andre inducerbar, der kan bruges til at bestemme, hvornår sker ændringer i replikering timing under oncogenesis. Dette vil give mulighed for vurdering af rolle replikering timing spiller i tumordannelse og sygdom progression. Desuden zebrafisk er en fremragende model for narkotika-screening og kan bruges til at identificere stoffer, der påvirker replikering timing forordning, som har potentiale til brug i kræftbehandling.

For zebrafisk er en lovende ny model til at studere replikering timing. Denne protokol vil råd til mange andre mulighed for at udnytte denne model i at studere rollen af replikering timing i udvikling og sygdom. Denne protokol kan tilpasses til brug med andre i vivo udviklingsmæssige modelsystemer, såsom Drosophila melanogaster og Xenopus laevis, og ser frem til fremtidige resultater fra disse og andre organismer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Fisher Scientific	BP358-10
KCl	Fisher Scientific	P217-500
CaCl2	Fisher Scientific	C79-500
MgSO4	EMD Millipore	MMX00701
NaHCO3	Fisher Scientific	BP328-500
Pronase	Sigma	10165921001	protease solution
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma	D1408
Ethanol (EtOH)	KOPTEC	V1016
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A9647-100G
Propidium Iodide (PI)	Invitrogen	P3566
Tris-HCl	Fisher Scientific	BP153-500
EDTA	Sigma	E9844
SDS	Santa Cruz	sc-24950
Proteinase K	NEB	P8107S
Phenol:Chloroform	Sigma	P3803-100ML
Sodium acetate	J.T.Baker	3470
Glycogen	Ambion	AM9510
RNase A	Thermo Scientific	EN0531
Quanit-iT	Invitrogen	Q33130	Reagents for fluorescence-based DNA quantification
Covaris AFA microTUBE	Covaris	520045	specialized tube for sonication
Covaris E220 Sonicator	Covaris	E220	focused ultrasonicator
Agilent 4200 Tapestation	Agilent	G2991AA	automated electrophoresis machine
D1000 ScreenTape	Agilent	5067-5582	Reagents for automated electrophoresis machine
NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina	NEB	Cat#E7370L	DNA library preparation kit
NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 1)	NEB	Cat#E7335S	multiplex oligos for DNA library preparation kit
NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 2)	NEB	Cat#E7500S	additional multiplex oligos for DNA library preparation kit
NEBNext Library Quant Kit for Illumina	NEB	E7630L	quantification kit for library preparation
Agencourt AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63882	magnetic beads
Illumina HiSeq 2500	Illumina	SY–401–2501	next generation DNA sequencing platform
40 µm Falcon Nylon Cell Strainer	Fisher Scientific	08-771-1
VWR Disposable Petri Dish 100 x 25 mm	VWR	89107-632
6.0 mL Syringe for Nichiryo Model 8100	VWR	89078-446
Posi-Click Tubes, 1.7 mL, Natural Color	Denville Scientific	C2170 (1001002)	Dnase/Rnase free
Vortex Genie 2	Scientific Industries	SI-0236
Wash Bottles	VWR	16650-022	Low-Density Polyethylene, Wide Mouth
Strainer	VWR	470092-440	6.9 cm, fine mesh
Corssing tank	Aquaneering	ZHCT100	individual breeding tank
iSpawn	Techniplast	N/A	large breeding tank
FACSAria II	BD biosciences	N/A	cell sorting machine
Wild M5a steromicroscope	Wild Heerbrugg	N/A	dissecting microscope
Qubit 3 Fluorometer	Thermo Scientific	Q33216	quantitative fluorescence-based method for determining DNA concentration
Matlab	Mathworks	version 2017a
Matlab Statistics Toolbox	Mathworks	version 11.1
Matlab Curve Fitting Toolbox	Mathworks	version 3.5.5