Summary
Poisson zèbre servaient récemment un système de modèle in vivo pour étudier la synchronisation de réplication ADN au cours du développement. Voici détaillées les protocoles d’utilisation des embryons de poisson-zèbre à synchronisation de réplication de profil. Ce protocole peut être facilement adapté pour étudier la synchronisation de la réplication en mutants, types de cellules individuelles, les modèles de maladies et d’autres espèces.
Abstract
Synchronisation de réplication de l’ADN est une caractéristique importante de cellulaire, présentant des relations significatives avec la structure de la chromatine, transcription et taux de mutation de l’ADN. Changements dans le calendrier de réplication se produisent pendant le développement et le cancer, mais la synchronisation de la réplication de rôle joue dans le développement et la maladie ne connaît pas. Poisson zèbre ont été récemment mis en place comme un système de modèle in vivo pour étudier la synchronisation de la réplication. Voici détaillée des protocoles permettant d’utiliser le poisson-zèbre pour déterminer le calendrier de réplication de l’ADN. Après le tri des cellules d’embryons et de poisson-zèbre adulte, haute résolution génome ADN réplication calendrier modèles peuvent être construits par la détermination des changements dans le nombre de copies d’ADN grâce à l’analyse des données de séquençage de génération suivante. Le système de modèle zebrafish permet d’évaluer les modifications de calendrier de réplication qui se produire in vivo au cours du développement et peut également être utilisé pour évaluer les changements dans les types de cellules individuelles, les modèles de maladies ou lignées mutantes. Ces méthodes permettront aux études portant sur les mécanismes et les déterminants de la création de synchronisation de la réplication et l’entretien pendant le développement, la synchronisation de la réplication de rôle joue dans les mutations et tumorigenèse et les effets de perturber synchronisation de réplication sur le développement et la maladie.
Introduction
Pour les cellules de diviser avec succès, ils doivent tout d’abord exactement et fidèlement reproduire leur génome entier. Duplication du génome se produit dans un modèle reproductible, appelé l’ADN réplication calendrier programme1. Synchronisation de réplication de l’ADN est en corrélation avec l’organisation de la chromatine, marques épigénétiques et gene expression2,3. Changements dans calendrier de réplication se produisent au cours du développement et sont significativement liés à la transcription des programmes et modifications de la chromatine marques et organisation4,5. En outre, synchronisation de réplication est corrélée avec des fréquences mutationnelles, et on observe des changements dans le calendrier dans divers types de cancer6,7,8. Malgré ces observations, les mécanismes et les déterminants de la création de synchronisation de la réplication et la réglementation sont encore largement inconnus et le rôle qu’elle joue dans le développement et la maladie n’est pas déterminée. En outre, jusqu'à récemment la réplication du génome calendrier des changements qui se produisent tout au long du développement des vertébrés avait seulement été examinée en modèles de culture de cellules.
Poisson-zèbre, Danio rerio, sont bien adaptés pour étudier la réplication calendrier in vivo au cours du développement, tel qu’un seul couple peut donner des centaines d’embryons qui se développent rapidement avec nombreuses similitudes avec le développement mammifère9, 10. En outre, tout au long du développement du poisson zèbre, il y a des changements pour le cycle cellulaire, organisation de la chromatine et transcriptionnelles programmes qui partagent des relations avec la réplication de l’ADN calendrier11. Poisson zèbre est aussi un excellent modèle génétique, car ils se prêtent particulièrement à la manipulation par transgénèse, mutagénèse et mutations ciblées, et écrans génétiques ont identifié de nombreux gènes requis pour le développement des vertébrés12. Par conséquent, poisson zèbre peut être utilisé pour identifier les gènes impliqués dans l’entretien et la création de synchronisation de réplication et d’observer les effets de la déréglementation "timing" réplication sur du développement des vertébrés. Les lignées transgéniques permet également d’évaluer la synchronisation de la réplication de types de cellules individuelles isolées à différents points du développement ou dans des conditions de maladie. Ce qui est important, il existe divers modèles de poisson-zèbre de maladie humaine qui peut être utilisé pour étudier le rôle de la synchronisation de la réplication en maladie la formation et la progression9,13,14.
Récemment, les profils de synchronisation de réplication premières proviennent du poisson-zèbre, établissant comme un système modèle pour étudier la réplication calendrier in vivo15. Pour ce faire, les cellules ont été prélevés des embryons de poisson-zèbre à plusieurs étapes de développement et dans un type de cellule isolée du poisson-zèbre adulte. Les cellules ont été ensuite triés par FACS (fluorescence-lancée de cellules tri) basée sur la teneur en ADN pour isoler des populations de phase G1 et S. Utilisez l’exemple de G1 comme un contrôle de nombre de copie, copie numéros variations dans les populations de phase S ont été déterminées et utilisées pour déduire la synchronisation de réplication relative16. Changements dans calendrier de réplication peuvent être directement comparés entre les différents échantillons de perfectionnement et de types de cellules, et cela a servi à déterminer au moment de la réplication des changements qui se produisent en vivo tout au long du développement des vertébrés. Cette méthode présente plusieurs avantages par rapport aux autres méthodes de la génomique, surtout qu’il ne nécessite pas d’étiquetage avec les analogues de la thymidine ou immunoprécipitation d’ADN4,6.
Voici détaillées les protocoles au point de la réplication de l’ADN profil Génome-large à haute résolution chez le poisson zèbre. Ces protocoles ont été utilisés pour déterminer les relations avec les caractéristiques génomiques et épigénétiques dans le génome du poisson-zèbre, ainsi que des changements dans ces relations qui se produisent au cours du développement de profilage. Ces protocoles sont également facilement adaptés pour étudier les changements dans le calendrier de réplication chez les souches mutantes de poisson-zèbre et dans des modèles de la maladie. En outre, ces méthodes fournissent une base qui peut être étendue à d’étudier le calendrier de réplication dans les cellules spécifiques, par un premier tri sur les types de cellules individuelles du poisson-zèbre. Le poisson-zèbre peut servir comme un excellent en vivo système modèle pour étudier la synchronisation de la réplication et de révéler au bout du compte les fonctions biologiques de ce caractère épigénétique important.
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Protocol
Tous les animaux ont été traitées en stricte conformité avec les protocoles approuvés par le Comité de l’emploi et de Oklahoma Medical Research Foundation institutionnels animalier.
1. mise en place de poisson-zèbre adulte pour la reproduction
- Utilisez une grande cohorte d’adult poisson-zèbre, mâle et femelle, d’une seule souche d’élevage. Il y a de petites différences dans la composition génétique du poisson-zèbre de même une seule souche, utilisez une grande cohorte pour s’assurer que les résultats sont représentatifs de la variabilité génétique de la population et non pas seulement à un petit sous-ensemble de la population.
- La veille, on recueillera les embryons, placer des dizaines d’adultes reproducteurs dans les réservoirs d’élevage, utiliser des nombres approximativement égaux des mâles et des femelles. Selon l’expérience, utilisez l’une des stratégies de reproduction suivant.
- Reproduction de stratégie 1 : placer quelques zebrafish mâles et femelles dans les réservoirs d’élevage individuel, séparer les mâles des femelles avec un diviseur. Si cette approche est utilisée, configurer plusieurs réservoirs de reproduction différents et mettre en commun les embryons de chacun pour que la variabilité biologique soit représentatif de la population.
- Reproduction de stratégie 2 : combiner des dizaines de poisson-zèbre mâle et femelle dans un réservoir de grand élevage. Utilisez cette stratégie tant qu’il y a un assez grand nombre d’embryons, il est raisonnable de supposer qu’ils provenaient de divers fondateurs et sont donc génétiquement représentatif de la population.
2. timed accouplements - collecte, tri et des embryons de poisson-zèbre pour expériences de logement
- Effectuer les accouplements chronométré, commençant dès que les cycles de la lumière étant le matin. Jeter les embryons générées pendant la nuit.
- Permettre aux poissons de se reproduire dans des eaux peu profondes (3-5 cm) pour une période de 10 min, avec un faux fond pour les embryons de s’échapper à travers.
- Après 10 min, recueillir des embryons en versant à travers une passoire et rincer dans une plaque de 10 cm avec une bouteille de lavage. Piscine tous les embryons prélevés au même moment, les marquer avec le temps de perception et de lieu immédiatement dans un incubateur à 28,5 ° C.
- Des centaines d’embryons peuvent être attendus d’un seul couple dans une journée. Permettez aux adultes pour se reproduire en 10 min de cycles jusqu'à ce que le nombre d’embryons obtenus est inférieure à vingt ans.
- Environ 1 à 1,5 h après la collecte, le tri des embryons pour éliminer les embryons morts et non fertilisés. Pour trier les embryons, retirer de l’incubateur et d’observer sous un microscope à dissection.
- Compter les embryons et le placer à une densité de 100 embryons par plaque de 10 cm.
- Ajouter un milieu frais E3 (5 mM NaCl, KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO40,17 mM) et remettez les embryons dans l’incubateur de 28,5 ° C.
3. Dechorionate, deyolk et fixer des embryons de poisson-zèbre
NOTE : Cette section du protocole est conçue pour les embryons avant 48 h après la fécondation (hpf). Il n’y a aucun besoin d’enlever les chorions des embryons à un stade ultérieur du développement (après 48 hpf), comme ils tombent souvent naturellement. Il n’y a pas besoin de deyolk ou de supprimer les chorions de poissons plus âgés les 5 jours après la fécondation (dpf).
- Quand les embryons atteignent âge développemental désiré, vérifier le bon stade de développement morphologique sous microscope optique selon « Stades du développement embryonnaire de the Zebrafish »17.
- Transfert jusqu'à 1500 embryons mis en scène dans un tube conique de 15 mL et laver plusieurs fois à l’E3.
- Ajouter 1 mL de l’E3 et 20 µL de solution de Pronase (30 mg/mL) pour chaque 100 embryons et agiter doucement. Jusqu'à 1500 embryons peuvent être déchorionés dans un tube unique avec 15 mL de l’E3.
- Déposer le tube sur le côté et organiser des embryons en une couche uniforme pour garantir une surface maximale de rapport volumétrique. Agiter délicatement le tube toutes les 2-3 min jusqu'à ce que tous les chorions sont tombés hors de l’embryon. Le temps total dechorionation variera selon l’activité de la Pronase.
- Éliminer le surnageant et rincer doucement les embryons 3 fois avec 10 mL de l’E3. Placez les embryons sur glace pour le reste de cette section du protocole.
- Enlevez l’E3 et lavez les embryons avec tampon de vitellus glacée fraîchement préparés (0,5 x de Ringer Ginzburg poisson, sans calcium : 55 mM NaCl, KCl, 1,25 mM NaHCO31,8 mM).
- Ajouter 1 mL de tampon de vitellus glacée pour jusqu'à 500 embryons.
- En utilisant un P1000, Pipetez doucement embryons haut et en bas 5 - 10 fois pour perturber le sac vitellin.
- Transférer 1 mL dans un tube de microtubes de 1,5 mL et centrifuger à 4 ° C et 500 x g pendant 5 min.
- Supprimer des granulés surnageant et laver avec 1 mL de PBS glacée 1 x (solution saline tamponnée au phosphate, pH 7,0) pour supprimer une solution de Ringer. Centrifuger à 4 ° C et 500 g pendant 5 min.
- Soigneusement, éliminer le surnageant et remettre en suspension des cellules dans 1 mL de PBS 1 x. Placer le tube sur la glace.
- Ajouter 3 mL d’éthanol glacé (EtOH) dans un tube conique de 15 mL. Tube de Vortex d’EtOH doucement à faible intensité.
- En utilisant un P1000, lentement (1 goutte par seconde) goutte à goutte zebrafish embryon suspension cellulaire en EtOH tout en produisant des tourbillons doucement.
- Ajouter un total de 1 mL de la suspension de cellules d’embryon, une solution de fixation définitive de 75 % EtOH.
- Après 1 mL de cellule suspension a été ajoutée, doucement tube tourbillon à mélanger et placer à-20 ° C pendant au moins 1 h. Il est recommandé de placer les tubes de leur coté pour assurer une surface maximale de rapport volumétrique et réduire le nombre d’embryons et les cellules qui se serrer les coudes. Stocker des cellules d’embryon à-20 ° C pendant 2 à 3 semaines.
4. coloration de l’ADN et FACS trier les embryons
Remarque : Cette section du protocole est conçue pour les embryons au 1 dpf.
- Supprimer des cellules embryonnaires EtOH-correction de-20 ° C et centrifuger à 4 ° C 1500 x g pendant 5 min.
- Placer le tube sur la glace et soigneusement enlever le surnageant. En utilisant un P1000, resuspendre doucement les cellules dans 1 mL de froid fraîchement préparée PBS-BSA (solution 1 PBS x, 1 % d’albumine sérique bovine).
- Centrifuger à 4 ° C et 1500 x g pendant 5 min, les cellules et les placer sur la glace.
- Supprimer surnageant et remettre les cellules en iodure de propidium (PI) coloration solution (50 µg/mL PI, 100 µg/mL RNase A, PBS, pH 7,0), avec 200 µL pour chaque 1000 des embryons.
- Permettre aux cellules d’incubation dans une solution PI pendant 30 minutes sur la glace, en mélangeant doucement toutes les 5 min.
- Placez une passoire de cellule de nylon de 40 µm sur un tube conique de 50 mL sur la glace. Pipetez doucement les cellules pour homogénéiser et filtrer à travers les mailles.
Remarque : Si plusieurs tubes des embryons de la validant même ont été recueillies à l’article 3 du protocole, combiner ces embryons à ce stade alors qu’ils sont tous triés ensemble. - À l’aide de l’appartement à l’intérieur de la fin d’un piston de la seringue, perturber doucement tout autres amas de cellules sur le maillage.
- Rincer les cellules à travers le filtre avec 500 µL de PBS-BSA froid pour chaque 1000 embryons.
- Placer une maille de 40 µm sur un tube de 15 mL conique sur la glace et filtrer la suspension cellulaire du tube conique de 50 mL une seconde fois dans le tube de 15 mL.
- À l’aide d’une cellule appropriée instrument de tri, affectez l’excitation de laser détection 561 nm et d’émission à 610/20 pour détecter l’iodure de propidium.
- Tube de mélange 15 mL de cellules colorées brièvement par l’agitation et le placer dans l’instrument à 4 ° C.
- Exécutez le taux de cellules à un débit lent, idéalement de 1,0 mL/min, afin d’obtenir un profil propre cycle cellulaire et éviter de mélanger G1 ou G2/M cellules avec le S phase population.
- Tout d’abord, la porte pour FSC-A x SSC-A (zone de dispersion vers l’avant par zone de dispersion latérale) pour enlever les débris (Figure 1 a).
NOTE : Cellules des embryons peuvent être différentes tailles selon le type de scène et de la cellule. Le filtre de densité neutre (ND) peut être nécessaire entre 1.0 et 1.5 selon la taille des cellules présentes. Porte une grande surface pour recueillir la plupart des cellules et enlever les débris. - Deuxième, porte pour SSC-zone (SSC-A) de la région de PI (PI-A), d’enlever les doublets de débris et de la cellule (Figure 1 b).
- En troisième lieu, la porte pour SSC-A, par la SSC-L (largeur) pour éliminer tout reste doublets de cellules (Figure 1).
- Afficher les populations fermées sur un histogramme avec le nombre de cellules (comte) sur la zone d’iodure de propidium et de l’axe des ordonnées (PI-A) sur l’axe des abscisses. Pour les 24 embryons hpf, cela devrait donner un profil stéréotypé cycle cellulaire comme dans la Figure 1.
- Pour trier la population de phase S, attribuez la porte du côté droit du pic G1 sur le côté gauche de la crête de G2, dont seulement une quantité minimale des populations G1 et G2. Pour les 24 embryons hpf, cela comprendra généralement environ 10-15 % de la population fermée (voir Figure 1).
- Pour trier la population G1, attribuez la porte sur le côté gauche de la crête de G1, ne pas pour passer le haut de la crête. Ajuster la largeur de la porte G1 aussi restreinte que possible (voir Figure 1).
- Retour porte le G1 et les populations de phase S afin d’assurer la bonne initiale gating (Figure 1E).
- Trier les populations phase G1 et S en tubes coniques 15 mL avec 3 mL de PBS-BSA. L’objectif serait d’obtenir entre 500 000 et 1 million ou plus de cellules triées par fraction (phase G1 et S).
- Après que le tri est terminé, les tubes de centrifugeuse à 1500 x g et 4 ° C pendant 10 min.
Remarque : Le petit culot sera difficile à voir, et il est important de ne pas perturber l’il, donc utiliser de préférence un rotor oscillant de seau sur un rotor à angle fixe. - Avec précaution, retirer le surnageant et Resuspendre le culot avec 1 mL de PBS 1 x. Transférer les cellules dans un tube de microtubes de 1,5 mL et centrifuger à 6 000 x g et 4 ° C pendant 5 min.
- Avec précaution, retirer tout le liquide du tube et geler sec granulé à-20 ° C. Stocker les granulés à-20 ° C pendant 2 à 3 semaines.
5. isolement, RNase traitement et purification de l’ADN
- Enlever le culot cellulaire de-20 ° C et le déposer sur la glace.
- Ajouter 400 µL de tampon de SDS (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,5 % SDS) à pellet et remettre en suspension.
- Ajouter la protéinase K à une concentration finale de 0,2 mg/mL et mélanger brièvement au vortex.
- Incuber les échantillons à 56 ° C pendant 2 h, vortex toutes les 15 min.
- Après 2 h, effectuer l’extraction de phénol-chloroforme en ajoutant 400 µL de phénol-chloroforme (phénol : chloroforme : isoamylique Alcool 25:24:1, imprégnée de Tris, pH 8,0, EDTA 1 mM à 10 mM).
- Vortex pour 20 échantillon s et centrifuger à 16 000 x g pendant 5 min séparer les phases.
- Retirez soigneusement la phase aqueuse supérieure (400 µL) et transférez dans un tube de 1,5 mL.
- Effectuer des précipitations EtOH en ajoutant 40 µL d’acétate de sodium 3M (pH 5,2), 2 µL de glycogène et 1 mL d’éthanol.
- Vortex pour bien mélanger et placer au-20 ° C durant la nuit à précipiter l’ADN. Échantillon peut également être précipité à-80 ° C ou sur la glace sèche pendant 1 h.
- Échantillon de centrifuger à 4 ° C et 16 000 x g pendant 30 min à l’ADN de pellet.
- Défausse pellet surnageant et laver avec 1 mL 70 % EtOH. Centrifuger à 4 ° C et 16 000 x g pendant 5 min.
- Jeter les granulés surnageant et séchage à l’air à température ambiante pendant 2-3 min.
- Dissoudre les granulés dans 96 µL d’eau stérilisés à l’autoclave et ajouter 4 µL de la RNase A (2 mg/mL).
- Mélangez bien au vortex et incuber à 37 ° C pendant 1 h.
- Effectuer l’extraction de phénol-chloroforme en ajoutant 100 µL de phénol-chloroforme et la procédure suivante en étapes 5.2.1 - 5.2.2.
- Effectuer des précipitations EtOH en ajoutant 10 µL d’acétate de sodium 3M, 1 µL glycogène et 250 µL d’EtOH et en suivant la procédure décrite dans les étapes 5.3.1 - 5.3.5.
- Resuspendre le culot dans 60 µL de tampon TE (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA (pH8.0)) et déterminer la concentration d’ADN à l’aide d’une méthode quantitative basés sur la fluorescence. Banque d’ADN à-20 ° C.
Remarque : Il est important de quantifier l’ADN à l’aide de colorants de liaison basés sur la fluorescence de l’ADN ou d’autres moyens plus fiables que les méthodes axées sur le spectromètre UV.
6. préparation de la prochaine génération séquençage et de bibliothèques d’ADN
Remarque : Un échantillon de référence numéro G1 copie pour chaque source biologique est nécessaire pour chaque série de séquençage (c'est-à-dire WT, lignée de cellules mutantes, transgénique, etc.). Comparez tous les échantillons en phase S de la même source biologique dans le séquençage de même courir à la même référence de G1. Courir au moins deux réplicats biologiques de chaque échantillon pour assurer la cohérence entre les échantillons.
- Diluer 1 µg d’ADN pour un volume final de 50 µL et transférez dans un tube spécialisé pour la sonication.
- Cisaillement de l’ADN génomique pour un objectif de 250-300 bp dans une ultrasonicator ciblée, selon les spécifications du fabricant et au protocole.
- Vérifier la qualité et la taille de l’ADN génomique cisaillée à l’aide d’une machine automatisée d’électrophorèse, selon les spécifications du fabricant et au protocole. S’assurer qu’il y a un pic important de ~ 250-300 bp pour l’ADN génomique cisaillé.
- Préparer les bibliothèques de séquençage en utilisant un kit de préparation ADN bibliothèque avec oligos multiplex pour séquençage sur plate-forme Illumina, selon le protocole du fabricant.
- Vérifier la qualité de la préparation de bibliothèque à l’aide de machine automatisée de l’électrophorèse, selon le protocole du fabricant. S’assurer qu’il y a un pic important de ~ 400-450 bp, et il existe des pics minimales pour apprêt dimères (bp 80-85) et dimères d’adaptateur (~ 120 bp).
- Quantifier les bibliothèques à l’aide d’un kit de quantification de l’ADN bibliothèque de séquençage d’ADN de nouvelle génération, selon le protocole du fabricant.
- Diluer 15 µL de bibliothèque à une concentration de 5 nM et combiner multiplexés bibliothèques comme nécessaire pour atteindre désiré unique cartographie lire comptes par exemple.
Remarque : Le nombre de manière unique la cartographie lectures par échantillon déterminera la résolution. Utiliser aussi peu que 5 millions mappé lit pour évaluer la synchronisation de la réplication pour le génome du poisson-zèbre. Il est recommandé de commencer avec 10 millions de lectures. - Effectuer jumelé-fin 100 bp du génome entier séquençage des échantillons sur une nouvelle génération de plates-formes de séquençage, conformément aux instructions du fabricant.
7. analyse des données de séquençage
Remarque : Les instructions de cette section sont destinées comme lignes directrices pour l’analyse. Utiliser des méthodes supplémentaires pour l’alignement de séquençage, filtration, traitement, etc.. Cette section du protocole traitera de la méthode préférée pour analyse dans cet ouvrage. Si les autres méthodes sont utilisées, ajuster les paramètres et les fonctions en fonction de ces besoins. Les commandes ci-dessous sont entrés au Ubutnu ou Mac terminal, avec les packages appropriés installés.
- Obtenir les versions les plus récentes du génome du poisson-zèbre (danRer10, à partir de laquelle le présent protocole a été écrit) du navigateur de génome UCSC en utilisant les commandes suivantes :
wget ftp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/danRer10/bigZips/danRer10.fa.gz-O danRer10.fa.gz- Décompressez le fichier fa.gz avec la commande suivante :
gunzip danRer10.fa.gz - Aligner les données de séquençage de génome à l’aide de BWA-mem en utilisant les commandes suivantes :
BWA mem -t 8 danRer10.fa read_1.fastq read_2.fastq > output.sam
- Décompressez le fichier fa.gz avec la commande suivante :
- Convertir fichier .sam vers .bam en utilisant samtools avec la commande suivante :
samtools Découvre -ÉC input.sam > output.bam- Trier les fichiers de séquençage aligné à l’aide de samtools avec la commande suivante :
samtools Trier output.bam > output_sorted.bam - Index du fichier .bam en utilisant samtools avec la commande suivante :
samtools index output.bam
- Trier les fichiers de séquençage aligné à l’aide de samtools avec la commande suivante :
- Mark PCR doublons avec Picard en utilisant les commandes suivantes :
Java-Xmx2g-jar picard.jar MarkDuplicates \
Input=Input.BAM
Output=output.BAM
REMOVE_DUPLICATES = false
METRICS_FILE=output_metrics.txt - Générer des fichiers texte (.txt) se lit comme suit pour chaque chromosome en utilisant la commande suivante :
car moi dans {1,25} ; faire CHROM = « chr » $i ; echo $CHROM ; samtools Découvre input.bam $CHROM | couper -f 2,4,5,7,8,9 > readsChr$ {i} .txt ; fait
Remarque : Les colonnes dans le fichier .txt qui en résultent sont drapeau, emplacement, mapQ, paire de chr, paire emplacement et taille du fragment, respectivement. - Lire les fichiers .txt dans Matlab (ou tout autre logiciel similaire) à l’aide de la fonction textscan.
- Filtrer les lectures de mappage faible qualité en définissant un seuil mapQ de 30.
- Supprimer des lectures avec des drapeaux pour alignement non primaire, doublons PCR ou le mappage de la paire à un chromosome différent.
- Filtrer les lectures avec leur paire au-delà d’un seuil de distance de 2000 bp.
- Évaluer les statistiques qui en résultent se lit comme suit pour déterminer le nombre de statistiques de lecture, couverture, taille de l’insert et la qualité (Figure 2).
- Établir la couverture en lecture dans 100 windows bp fixée pour chaque échantillon en comptant le nombre de lectures à des intervalles de bp 100 sur toute la longueur de chaque chromosome.
- Calculer que la médiane lu comte pour toutes les fenêtres.
- Filtrer les régions de couverture élevée en supprimant les fenêtres supérieures à 5 écarts-types de la médiane.
- Définir des zones pour l’analyse dans les échantillons de référence G1 en trouvant des segments le long de chaque chromosome avec 200 lectures à l’aide de fenêtres coulissantes.
- Déterminer la profondeur dans chaque échantillon de phase S en comptant le nombre de lectures de phase S dans les fenêtres de 200 lire nombre défini pour la référence G1 qui l’accompagne.
- Lisser les données brutes à l’aide de la fonction csaps dans le logiciel, avec un facteur d’interpolation (p) de 10-16.
- Normaliser les données lissées de z-score, avec une moyenne de 0 et écart type de 1.
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Representative Results
À l’aide de données de calendrier de réplication publiées, les profils de synchronisation de réplication représentatifs et des mesures de contrôle de la qualité sont fournis15. Les premières étapes de transformation impliquent en alignant les données de séquençage pour le génome, calculer la longueur de lecture et les statistiques de couverture du génome et le filtrage de faible qualité, impair et les lectures en double PCR. Statistiques de lecture pour un échantillon de séquençage zebrafish typique sont indiquées à la Figure 2. Après filtrage, lecture chefs d’accusation sont déterminés dans les fenêtres de taille variable et les données sont lissées et normalisé. Profils de synchronisation de réplication de lissé/normalisé typique d’un chromosome zebrafish représentatif des réplicats biologiques sont indiquées dans la Figure 3 a. Les profils de réplicats biologiques et expérimentales doivent être visuellement très similaire (voir Figure 3 a) et affichent également une corrélation élevée sur toute la longueur du chromosome (Figure 3 b). Ils devraient également afficher forte corrélation entre les valeurs de minuterie Génome-large (Figure 3). Autocorrélation, une méthode pour évaluer la continuité du motif, devrait servir à évaluer le degré de structure dans l’ensemble de données (Figure 3D). L’autocorrélation pour les programmes de calendrier mature structuré devrait être élevée à de courtes distances et diminuer progressivement que la distance augmente. Réplique les exemples qui montrent la grande reproductibilité entre biologique et expérimental et un signal de forte autocorrélation devrait être considéré comme des échantillons de haute qualité et peut être combiné pour obtenir un échantillon de couverture plus élevé.
Figure 1 : tri des embryons de poisson-zèbre pour analyse de synchronisation de la réplication. (A) Gated population de toutes les cellules triées pour zone de dispersion vers l’avant (FSC-A) par zone de dispersion latérale (SSC-A). Les couleurs représentent la densité des bacs dans la parcelle de dot avec haute à faible densité, représentée par des couleurs allant du rouge-à-vert-de-bleu. (B) Gated population des cellules x SSC FSC gated triés pour SSC-A de la zone de l’iodure de propidium (PI-A). (C) Gated population du CSD x cellules PI gated triés pour SSC-A de côté largeur de nuages de points (SSC-W). Histogramme (D) de toutes les populations gated affichant un profil stéréotypé cycle cellulaire. Portes de sorte pour les cellules en phase G1 et S sont affichées par le gris dégradé en boîte avec des lignes noires. Les populations de phase (E) Backgated G1 et S montrent que le déclenchement initial capté la majorité des cellules. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : séquençage lire statistiques pour un échantillon typique zebrafish. (A) Reap de cartographie de la qualité des statistiques des valeurs mapQ. (B) histogramme de la distribution des tailles de l’insert pour toutes les lectures de séquençage. (C) statistiques de lecture total mappé lectures, lit contenant l’indicateur de faible qualité, lit avec paires mappage sur un chromosome différent (paire diff chr), lit avec paire au-delà de distance seuil (paire éloignée) et doublons PCR. (D) un nombre représentatif de total mappé, les lectures non mappés et non appariés, couverture et lire la résolution pour une exécution typique de séquençage d’un échantillon de poisson-zèbre. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : résultats de chronométrage représentant zebrafish réplication et mesures de contrôle qualité. (A) réplication de synchronisation sur la longueur d’un représentant du chromosome pour deux réplicats biologiques de 28 embryons hpf (Siefert, 2017). (B) corrélation entre les valeurs de synchronisation de réplication dans windows 2 Mb le long d’un chromosome représentatif pour le biologique réplique de 28 embryons hpf, illustrés à la Figure 3 a. (C) Génome-large corrélation entre les valeurs d’horloge de réplication pour biologique (rep1 rep2) et expérimental (rep3) réplique de 28 embryons hpf. La carte de la couleur représente le coefficient de corrélation de Pearson. Autocorrélation (D) pour un programme structuré mature calendrier affiche autocorrélation élevée à des distances proches qui diminue graduellement sur de plus longues distances. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Poisson zèbre fournissent un système de modèle nouveau et unique le in vivo pour étudier la synchronisation de réplication de l’ADN. Quand chronométrés croisements sont effectués comme détaillé dans le présent protocole expérimental, des milliers d’embryons peuvent être rassemblées en une seule journée pour des expériences. Ces embryons se développent de façon synchrone par précisément chronométrés et nettement caractérisées des stades de développement. Poisson zèbre peut être facilement et précisément mis en scène par morphologie à l’aide d’un stéréomicroscope, comme le poisson-zèbre embryons se développent à l’extérieur et sont transparents. Ce protocole décrit en détail l’utilisation des embryons de poisson-zèbre pour étudier la synchronisation de réplication tout au long du développement des vertébrés.
Le protocole qui peut occasionner des problèmes notamment garantir un développement synchrone des embryons de poisson-zèbre, perte des cellules au cours de la préparation, le tri des FACS et préparation de la bibliothèque. Le calendrier de développement du poisson zèbre est dépendante, donc utilisation zebrafish adapté aux cycles de lumière/obscurité et logé à 28,5 ° C pour des expériences de la température. Pour assurer un développement synchrone, effectuer précisément chronométré accouplements et recueillir les embryons dans un très petit temps-windows (10 min ou moins). Il est essentiel de maintenir les embryons à 28,5 ° C et s’assurer qu’ils passent un minimum de temps à la température ambiante. Le calendrier de développement du poisson zèbre est aussi fortement tributaire de la densité des embryons dans une zone donnée. Il est essentiel d’embryons de maison, pas à une densité supérieure à 100 embryons par plaque de 10 cm, ou ils ne développeront pas correctement. Le meilleur moment pour retirer les embryons morts et non fécondés est quand ils ont évolué vers le stade de cellules 4-16 et peuvent facilement être identifiés comme fécondée (utilisation « Stades du développement embryonnaire de the Zebrafish »17 comme guide). Embryons morts apparaissent généralement comme des ballons noirs et embryons fertilisés apparaissent sous la forme 1-cellule. Travailler aussi rapidement que possible pour réduire le temps à la température ambiante.
Lorsque des embryons de dechorionating, il est important de veiller à que retirer tous les chorions des embryons. Laissez embryons la pronase solution jusqu'à ce que la plupart chorions ont se détache. Jetez toute embryons restants avec chorions intactes ou supprimer leurs chorions avec une pince. Embryons de pipette en utilisant un mouvement lent et doux. Ne pas pipeter rapidement qu’il soumettra les cellules à un stress excessif et résultat dans la perte de cellules. Il est également important de ne pas utiliser un P200, car cela peut causer une augmentation de cisaillement qui se traduit par la rupture des cellules. À l’inverse, une pipette en plastique ne doivent pas avoir un assez petit alésage ou fournir assez de cisaillement pour perturber le sac vitellin adéquatement et de ventiler les cellules. Pipettes de rechange pourraient servir comme fourni l’alésage et cisaillement équivaudrait à P1000 optimale.
Lorsque FACS Trier 28 hpf, si une cellule stéréotypée cycle profil n’est pas obtenu, ajuster la tension sur le laser PI afin que le sommet du G1 est centré autour de 50K. Les gains pour le FSC et le SSC devrez peut-être aussi être ajusté de telle sorte que les populations de blocage et cellule ressemblent à la Figure 1. S’il est toujours difficile, le filtre ND doit être allumé, et les tensions FSC et SSC ajustées afin d’assurer la majorité des cellules sont à la porte. Il devrait être évident qu’il y a PI coloration, comme il y aura une gamme qui se rapproche de doubles pour le PI-A. L’histogramme doit afficher deux pics clairs, un pic important à 2N ADN pour les cellules G1 et un plus petit pic à double l’intensité pour l’ADN 4N contenu de cellules G2/M. Si ce n’est toujours pas obtenu, il peut y avoir non plus faible nombre de cellules intactes, des problèmes avec la coloration de la PI ou problèmes avec fixation et le protocole devra être optimisé en conséquence.
Les cellules d’embryons au stade précoces (avant 10 hpf) ne donnera pas de profils typiques de cycle cellulaire, tel qu’un pourcentage élevé de ces cellules sont en phase S. Ces échantillons peuvent être traités comme des échantillons en phase S et par rapport à une référence G1 de 24 embryons hpf. Embryons entre 10 hpf et 24 hpf peut donner des profils intermédiaires cycle cellulaire et peut être triée si vous le souhaitez. La population de phase S peut également identifier et triée en incorporant des analogues de la thymidine par exemple EDU (5-éthynyl-2'-déoxyuridine) ou BrdU (bromodéoxyuridine) dans brèves impulsions avant fixation, cependant, ce n’est pas nécessaire pour une détermination précise de synchronisation de la réplication.
Idéalement, la préparation de la bibliothèque doit être démarrée avec 1 µg d’ADN. Théoriquement, ~ 300 000 cellules triées produirait environ 1 µg d’ADN (estimation ~3.3 pg/noyau), cependant, il y a toujours des pertes tout au long du protocole. 500 000 à 1 million de cellules triées devraient donner plus de 1 µg d’ADN. Un embryon de hpf 24 typique aura environ 18 000 cellules, dont 10 à 15 % sera en phase S. Embryons aux premiers stades du développement auront beaucoup moins de cellules, mais auront une plus grande proportion de cellules en phase S.
Exécution précise purification et sélection de la taille à l’aide de billes magnétiques est essentielle à l’élimination des éléments indésirables de la préparation de la bibliothèque. Suivez attentivement les instructions du fabricant et une optimisation supplémentaire peut être exigée. Une petite quantité de dimères PCR n’est généralement pas un problème majeur, mais les dimères d’adaptateur seront séquence très efficacement, donc ils devraient être réduits au minimum. Ceci peut être réalisé en ajustant l’adaptateur initiale au rapport ADN et exécuter la sélection de la taille précise au cours de la préparation de la bibliothèque.
Single-end séquençage peut aussi convenir pour différents besoins expérimentaux. Single-end est moins cher et offre la plupart des informations requises car cette approche repose sur le comptage des lectures ; jumelé-fin offre une capacité supérieure à supprimer PCR et doubles optiques et à résoudre de séquences répétitives et autres variations structurales (qui sont courantes dans le génome du poisson zèbre). La partie de l’analyse ci-dessous s’occupera uniquement avec des lectures de séquençage jumelé-fin. Lectures de séquençage plus courts peuvent aussi convenir. Cela fournira un plus grand nombre de lectures à moindre coût, mais les lectures peuvent être plus difficiles à cartographier. La partie de l’analyse ci-dessous est optimisée pour 100 bp lectures et ajustements peuvent être nécessaires si la plus courte longueur de lecture est utilisée.
Ce protocole peut être facilement adapté pour des utilisations supplémentaires du modèle poisson zèbre. Il a déjà été utilisé pour l’analyse des fibroblastes d’empennage de poisson-zèbre (cellules ZTF), une cellule primaire culture ligne isolée du poisson-zèbre adulte empennage. Afin d’étudier les types de cellules isolées du poisson-zèbre, marqueurs transgéniques peuvent être utilisés pour identifier et isoler les types de cellules individuelles avant la coloration et de tri pour la teneur en ADN. Une stratégie possible serait d’utiliser une lignée transgénique exprimant un marqueur fluorescent pilotée par un promoteur spécifique aux tissus et d’abord isolé des cellules par FACS Trier, suivi de fixation et de tri pour la teneur en ADN. En outre, l’utilisation de cellules perméables ADN colorants peut permettre isolement simultanée des types de cellules individuelles ainsi que les populations de phase G1 et S. Ces adaptations au présent protocole pourraient permettre également d’études de synchronisation de réplication sur d’autres modèles in vivo .
Une possibilité passionnante pour l’utilisation future de ce protocole est d’étudier le rôle de la synchronisation de la réplication dans la maladie. Il y a plusieurs modèles de cancer dans le poisson-zèbre, certains spontanée et autres inductible, qui peuvent être utilisées pour déterminer quand les changements dans le calendrier de réplication se produisent au cours de l’oncogenèse. Cela permettra l’évaluation de la synchronisation de la réplication de rôle joue dans la tumorigenèse et maladie la progression. En outre, le poisson-zèbre sont un excellent modèle pour le dépistage des drogues et peut être utilisé pour identifier les médicaments qui affectent le règlement de distribution de réplication, qui ont le potentiel d’utilisation dans le traitement du cancer.
Le poisson-zèbre est un nouveau modèle prometteur pour étudier la synchronisation de la réplication. Ce protocole qu’elle fournira beaucoup d’autres la possibilité d’utiliser ce modèle dans l’étude du rôle de la synchronisation de la réplication dans le développement et la maladie. Ce protocole peut être adapté pour être utilisé avec d’autres systèmes de modèle de développement in vivo , comme Drosophila melanogaster et Xenopus laeviset regard vers futurs résultats de ceux-ci et d’autres organismes.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par National Institute of General Medical Sciences de la National Institutes of Health à travers accorde 5P20GM103636-02 (avec le support de base Flow Cytometry) et 1R01GM121703, ainsi que des prix depuis le centre de l’Oklahoma pour les cellules souches adultes Recherche.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C79-500 | |
| MgSO4 | EMD Millipore | MMX00701 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | protease solution |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D1408 | |
| Ethanol (EtOH) | KOPTEC | V1016 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9647-100G | |
| Propidium Iodide (PI) | Invitrogen | P3566 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| EDTA | Sigma | E9844 | |
| SDS | Santa Cruz | sc-24950 | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Phenol:Chloroform | Sigma | P3803-100ML | |
| Sodium acetate | J.T.Baker | 3470 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| RNase A | Thermo Scientific | EN0531 | |
| Quanit-iT | Invitrogen | Q33130 | Reagents for fluorescence-based DNA quantification |
| Covaris AFA microTUBE | Covaris | 520045 | specialized tube for sonication |
| Covaris E220 Sonicator | Covaris | E220 | focused ultrasonicator |
| Agilent 4200 Tapestation | Agilent | G2991AA | automated electrophoresis machine |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | Reagents for automated electrophoresis machine |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | Cat#E7370L | DNA library preparation kit |
| NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 1) | NEB | Cat#E7335S | multiplex oligos for DNA library preparation kit |
| NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 2) | NEB | Cat#E7500S | additional multiplex oligos for DNA library preparation kit |
| NEBNext Library Quant Kit for Illumina | NEB | E7630L | quantification kit for library preparation |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63882 | magnetic beads |
| Illumina HiSeq 2500 | Illumina | SY–401–2501 | next generation DNA sequencing platform |
| 40 µm Falcon Nylon Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| VWR Disposable Petri Dish 100 x 25 mm | VWR | 89107-632 | |
| 6.0 mL Syringe for Nichiryo Model 8100 | VWR | 89078-446 | |
| Posi-Click Tubes, 1.7 mL, Natural Color | Denville Scientific | C2170 (1001002) | Dnase/Rnase free |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Wash Bottles | VWR | 16650-022 | Low-Density Polyethylene, Wide Mouth |
| Strainer | VWR | 470092-440 | 6.9 cm, fine mesh |
| Corssing tank | Aquaneering | ZHCT100 | individual breeding tank |
| iSpawn | Techniplast | N/A | large breeding tank |
| FACSAria II | BD biosciences | N/A | cell sorting machine |
| Wild M5a steromicroscope | Wild Heerbrugg | N/A | dissecting microscope |
| Qubit 3 Fluorometer | Thermo Scientific | Q33216 | quantitative fluorescence-based method for determining DNA concentration |
| Matlab | Mathworks | version 2017a | |
| Matlab Statistics Toolbox | Mathworks | version 11.1 | |
| Matlab Curve Fitting Toolbox | Mathworks | version 3.5.5 |
References
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