Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll eine Reihe von neuen Ex-Ovo -Experimente und physical-Modeling-Ansätze für das Studium der Mechanik der Morphogenese während frühen Küken embryonalen Gehirn Torsion.
Abstract
Embryonalentwicklung ist traditionell aus der Perspektive der biomolekularen Genetik studiert, aber die grundlegende Bedeutung der Mechanik in Morphogenese wird zunehmend anerkannt zu werden. Insbesondere die embryonalen Küken Herz und Hirn-Schlauch, der morphologische Veränderungen unterziehen, wie sie sich entwickeln, gehören zu den Hauptkandidaten zur Untersuchung der Rolle von physikalischen Kräfte in Morphogenese. Progressive ventrale biegen und rechts Torsion des Gehirns rohrförmige embryonale Küken passieren in der frühesten Phase der ORGANEBENE links-rechts-Asymmetrie in Küken Embryonalentwicklung. Die dotterhäutchen Membran (VM) schränkt die dorsale Seite des Embryos und hat dabei die Kraft für das sich entwickelnde Gehirn Torsion unabdingbar in Verbindung gebracht. Hier präsentieren wir Ihnen eine Kombination aus neuen Ex-Ovo -Experimente und physikalische Modellierung, um die Mechanik des Gehirns Torsion zu identifizieren. Hamburger-Hamilton Zeitpunkt 11, Embryonen werden geerntet und kultivierten ex Ovo (in den Medien). Die VM ist anschließend mit einer gezogenen Kapillarrohr entfernt. Durch die Steuerung des Niveau der Flüssigkeit und den Embryo eine Flüssigkeit-Luftschnittstelle zu unterwerfen, kann die Flüssigkeit Oberflächenspannung der Medien, die mechanische Rolle des virtuellen Computers zu ersetzen verwendet werden. Mikrochirurgie Experimente wurden auch durchgeführt, um die Position des Herzens die resultierende Änderung in die Chiralität des Gehirns Torsion zu verändern. Ergebnisse aus diesem Protokoll veranschaulichen die grundlegenden Aufgaben der Mechanik in Morphogenese fahren.
Introduction
Modernen Entwicklungsbiologie Forschung konzentriert sich weitgehend auf Verständnis Entwicklung aus der Perspektive der Molekulargenetik1,2,3,4,5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. es ist bekannt, dass physikalische Phänomene eine zentrale Rolle in der Morphogenese spielen oder die Generation von biologischen14,15,16,17 bilden; spezielle mechanische Mechanismen der Entwicklung bleiben jedoch weitgehend unerforschte. 19,20ändern ventrale Biegung und rechts Torsion des primitiven Gehirn Rohres nach dem Hamburger-Hamilton Stufe 11 (HH 11)18 sind die zwei wichtigsten Prozesse, die embryonale Form beitragen. Insbesondere bleibt der physikalische Mechanismus zugrunde liegt die Torsionssteifigkeit Entwicklung im embryonalen Gehirn unvollständig verstanden.
Die embryonale Torsion Küken Embryos gehört zu den frühesten morphogenetischen Ereignissen des Links-Rechts (L-R) Asymmetrie in der Entwicklung. Wenn der Prozess der L-R Asymmetrie gestört ist, treten Geburtsschäden wie Situs Inversus, Isomerieoder Heterotaxie 21.
Hier präsentieren wir ein Protokoll verbindet Ex Ovo Experimente22,23 mit physical-Modeling, mechanische Kräfte während der frühen Entwicklung des embryonalen Gehirns zu charakterisieren. Vorgestellte Methode soll die mechanischen Kräfte verantwortlich für Gehirn Torsion und die Faktoren, die Einfluss auf den Grad der Torsion während der frühen Entwicklung12zu identifizieren. Basierend auf den experimentellen Beobachtung, dass die dotterhäutchen Membran (VM) die dorsale Seite des Embryos einschränkt, vermutet wir, dass die VM liefert die Kraft für das sich entwickelnde Gehirn Torsion unabdingbar. Daher bei dieser Methode entfernt wir den Teil des virtuellen Computers, der den Bereich des Gehirns um herauszufinden, die Auswirkungen auf Gehirn Torsion abdeckt. Darüber hinaus wurde die Methode zur Anwendung von flüssigen Oberflächenspannung zur mechanischen Rolle des virtuellen Computers zu bestätigen und eine Schätzung von der Kraftaufwand für Gehirn Torsion, die zuvor nicht getan haben. Messung der Kräfte während der embryonalen Morphogenese ist eine anspruchsvolle Aufgabe. Vor allem in einer bahnbrechenden Studie entwickelt Campàs und Mitarbeiter24 eine neuartige Methode zur Quantifizierung der zellulären betont mit eingespritzten Microdroplets. Dennoch war diese Methode beschränkt sich auf Kräfte auf zellulärer Ebene, daher gilt nicht für Kräfte auf Gewebe oder Organismus-Ebene Sonde messen. Das Protokoll in diesem Papier präsentiert wurde entwickelt, um diese Lücke teilweise zu füllen.
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Protocol
1. Vorbereitung des Gewebes Nährmedien
- Verwenden Sie eine 0,5 L Flasche von Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) mit 4,5 g/L Glukose, Natriumbicarbonat und L-Glutamin als Basis für die Nährmedien.
- Fügen Sie in einem sterilen Laminar-Flow-Haube 10 mL von Antibiotika bis 0,5 L von DMEM hinzu
- Mit einer sterilen Pipette, 50 mL DMEM-Antibiotika-Lösung auf einem sterilen 50 mL konische Rohr übertragen.
- Die restliche DMEM-Antibiotika-Lösung in der 0,5 L Flasche in der sterilen Haube Küken Serum 50 mL hinzufügen.
- Speichern Sie die endgültige Lösung (genannt jenseits Küken Nährmedien [CCM]) in 50 mL konische Rohr Aliquote bei-20 ° C.
2. Ei Ausbrüten
- Verwendung zarte wischt mit 70 % Ethanol befruchteten bestimmten Pathogen-freies weiße Leghorn Hühnereier zu reinigen. Eier in einer longitudinalen Ausrichtung auf Inhaber zu arrangieren.
- Schalten Sie eine eibrutkasten eine Solltemperatur von 37,5 ° C und die Luftfeuchtigkeit bei 48-55 %. Die Luftfeuchtigkeit wird gesteuert, indem man eine entsprechende Menge an Wasser in den Inkubator.
- Brüten Sie die Eier, HH11-13, ca. 40-44 h.
- Lassen Sie die Eier bei Raumtemperatur für ca. 15-30 min vor dem Sprühen/Reinigung mit 70 % Ethanol abkühlen.
3. ziehen Sie Glaskapillaren
- Montieren Sie eine 10 cm lange Glas-Kapillarröhrchen mit einem äußeren Durchmesser von 1,0 mm und einem Innendurchmesser von 0,5 mm auf einer Mikropipette Abzieher.
- Hitze und Parameter bzw. 750 und 400, zu ziehen. Das Kapillarrohr in dünne Nadeln ziehen mit der Taste ziehen.
(4) Filterpapier Carrier Methode
- Schneiden Sie die Kreise von ca. 3 cm Durchmesser aus Filterpapier.
- Schneiden Sie ein Rechteck etwa 1 cm x 2 cm aus dem Kreis mit einem Loch-Puncher. Achten Sie darauf, entfernen alle hervorstehenden oder scharfe Ecken.
5. Embryo Ernte und Vorbereitung
- Eier von unten, ziehen Sie die Schale vorsichtig auseinander und Zahlen Sie Inhalt sorgfältig auf eine 150 x 15 mm Petrischale ein. Um sicherzustellen, dass der Embryo-Seite nach oben zeigt, halten Sie die Eier in der gleichen Ausrichtung, die sie beim knacken sie inkubiert wurden.
- Entfernen Sie die dünnen Albumin mit einer Einweg-Pasteurpipette.
- Trennen Sie die dicken Albumin aus dem Dotter mit stumpfen Pinzette endete. Sicherstellen Sie, dass die dicken Albumin durch kratzen leicht oben auf das Eigelb mit der stumpfen endete Pinzette entfernt wurde.
- Verwenden Sie feine Spitzen Pinzette zu zentrieren und legen einen Filterpapier Ring über dem Embryo, Abgleich der Längsachse des Ringes mit der Längsachse des Embryos.
- Schneiden Sie das Eigelb, die rund um das Filterpapier-Ring mit einer Schere.
- Ziehen Sie den Ring und Embryo aus dem Eigelb in eine schräge Richtung der Website wo das Eigelb zuerst geschnitten wurde.
- Spülen Sie die Embryonen in zwei sequentielle 100-mm-Gerichte mit Raumtemperatur 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
- Legen Sie einen Filterpapier Ring in einer 35-mm-Petrischale zunächst. Dann stellen Sie die Embryo dorsale Seite nach oben auf das Filterpapier bereits in 35-mm-Petrischale.
- Legen Sie einen Edelstahl-Ring auf das Filterpapier Sandwich. Achten Sie darauf, nicht den Embryo schädigen.
- Jede Petrischale 3 mL der vorbereiteten CCM hinzufügen.
- Entfernen Sie die VM von jedem Embryo durch leicht überfliegen die gezogene Kapillare Nadel am oberen Rand der Embryo und peeling entfernt die VM, ab dem vorderen Ende (rechts oben das Vorderhirn) und Sie fortfahren, um die Chorda (Abbildung 1A).
- Legen Sie acht 35 mm Petrischalen in einer 150 mm-Gericht, das mit Wasser gesättigt heikle Aufgabe Tücher (um die Feuchtigkeit zu erhalten) ausgekleidet war.
- Ort der 150-mm-Petrischale in einem verschließbaren Plastikbeutel füllen Sie den Beutel mit einem Gasgemisch, bestehend aus 95 % O2 und 5 % CO2.
- Den Beutel und legen Sie es in einem Inkubator 37,5 ° C.
- Inkubieren Sie die Embryonen für weitere 27 h bis HH15-HH16 (Abbildung 1 b).
(6) induzieren Oberflächenspannung
- Entfernen Sie die Embryonen aus dem Inkubator und verwenden Sie eine optische Kohärenz Tomographie (OCT) System, um sie Bild. Verwendung OCT Verdrehwinkel des Neuralrohrs (NT) (Abbildung 2) zu bestimmen.
- Transfer der Embryonen zu einem Lichtmikroskop und visualisieren Sie bei 10-facher Vergrößerung. Verwenden Sie eine 200 Mikroliter-Pipette, um inkrementell 0,2 mL von Medien aus der Petrischale zu entfernen.
- Nehmen Sie Hellfeld Bilder bei jedem Intervall, die Auswirkungen der Medien-Luftschnittstelle auf den Embryo zu beobachten.
- Medien zu entfernen, bis die Oberflächenspannung in den Embryo Torsion (Abbildung 1) induziert.
- Bild des Embryos mit dem OCT-System wieder herstellen einer endgültigen Verdrehwinkel zum Vergleich, Embryonen zu kontrollieren. Hinweis: Die Bright-Field-Bilder wurden mit einem sezierenden Mikroskop erworben. Eine optische Kohärenz Tomographie System mit einem angehängten Mikroskop wurde verwendet, um Cross-Sectional Bild Stapel von live Embryonen zu erwerben. Bilder waren in einer 3 x 10 x 3 mm3 Scan Domäne erhalten, dann in eine imaging-Software verarbeitet. Zu guter Letzt wurden die physikalischen modelbilder mit einer digitalen Spiegelreflexkamera aufgenommen.
(7) physikalische Modellierung der Oberflächenspannung/VM Kräfte
- Entwickeln Sie eine vereinfachte 3D Geometrie, die einen Embryo zwischen HH14-17 in kommerziellen Modellierungssoftware (Abbildung 3A) ähnelt.
- Die Negativform der 3D-Geometrie in kommerziellen 3D Computer-Grafik-Software zu entwerfen.
- Verwendung ein 3D-Druckers mit 1,75 mm Acrylnitril Butadien Styrol Filament zu 3D geladen Drucken die Form, in köraform (STL) Format.
- Um die Form gegossen, mischen Sie Silikon-Kautschuk-Elastomer-Komponenten A und B zu gleichen Teilen und Gießen Sie die Mischung in die Form sofort; Legen Sie die Gussform, bei Raumtemperatur für 12 h (Abb. 3 b) zu heilen.
- Markieren Sie das physikalische Modell des Embryos entlang der NT an der dorsalen Seite Torsion zu visualisieren.
- Verwenden Sie ein Deckglas Replizieren der Krafteinwirkung auf das physische 3D-Modell der VM oder Oberflächenspannung (Abbildung 3D) nachahmt.
- Legen Sie eine Reihe von starren Drähte gleichlang auf die Seite des physikalischen Modells. Nachdem das Deckglas eine externe Kraft auf das Gehirn Modell ausübt, werden die Drähte in einem Winkel geneigt, die von der Lage abhängt. Bestimmen Sie den Drehwinkel von Arctan die projizierte Länge über die ursprüngliche Länge jedes Drahtes (Abbildung 3E).
8. ändern die Richtung der Herz-Schleife
- Folgen Sie den Schritten in 3.1 und 3.2, zog Kapillarrohr zu erhalten.
- Folgen Sie den Schritten in 5.1 durch 5.10 Embryos vorzubereiten.
- Verwenden Sie ein paar der Zange, um das Filterpapier zu kippen, so dass der Embryo Ventral-Side-Up wird.
- Verwenden Sie zog Kapillarrohr einen Schlitz in der Splanchnopleure (SPL) Membran aufzuschneiden.
- Verwenden Sie das Kapillarrohr, um eine mechanische Kraft, das Herz von der rechten Seite auf die linke Seite schieben.
- Folgen Sie den Schritten in 5.12 durch 5.15, die Veränderung der Torsion zu beobachten.
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Representative Results
In dieser Studie wurde die VM des Embryos bei HH11 an der thorakalen Biegung vom vorderen Ende entfernt. Die Embryonen wurden durch ein OCT-System abgebildet. In diesem Stadium ist die Torsion des Gehirns Rohr (Abbildung 1A) nicht gestartet. Nach HH15-16 inkubiert werden, stellte Embryonen mit ihrer VM entfernt reduzierte Gehirn Rohr Torsion, ca. 35 Grad (Abbildung 1 b) im Vergleich zur Steuerung von Embryonen, die Torsion von rund 90 Grad aufweisen. Wenn die Medien gesenkt wurde induzieren Oberflächenspannung auf der dorsalen Ende von Embryonen mit ihre VMs entfernt, verdreht die Gehirne auf ein Niveau vergleichbar mit denen in Kontrolle Embryonen (Abbildung 1). Abbildung 2 zeigt ein repräsentatives OCT-Bild eines Embryos HH 13 mit thorakalen Lagewinkel und cranial Lagewinkel gekennzeichnet (Abbildung 2A). Die Winkel werden aus einer senkrechten Position des Querschnitts des NT (Abb. 2 b, C) gemessen. Ergebnisse aus unseren Experimenten vorgeschlagen, dass normale Gehirn Rohr Torsion von äußeren Belastungen auf der dorsalen Ende des Embryos angetrieben wird und dass diese wesentliche Belastung durch die VM20,25versorgt wird. Darüber hinaus folgende Umdrehungen nach links in einen normalen Embryo das Gehirn dreht sich nach rechts, wie die Herz-Schleife auf der rechten Seite geht, während in einem Embryo mit dem Herzen Schleife auf der linken Seite in einem frühen Stadium (d. h.vor HH Stufe 12), das Gehirn auch geschoben ein weiterer 20 h Inkubation (Abbildung 3 c im Ref [12]), darauf hindeutet, dass die Position des Herzens in der Asymmetrie im Gehirn Torsion geführt.
In Experimenten gewonnenen Daten konnten wir eine vereinfachte Geometrie des Küken Embryos ohne VM HH14-17 (Abbildung 3A) zu rekonstruieren. In diesem Rechenmodell wurden richtige geschlungene Herz und als gebogene Stäbe modelliert. Ein Block, der die Splanchnopleure (SPL) Membran darstellt wurde Kontakt mit der Herz-Rute. Durch die Gestaltung einer Negativform aus diesem Rechenmodell, fabriziert 3D Drucken diese Form und die Form mit einem Silikon-Elastomer Gießen, wir ein physikalisches Modell aus der vereinfachten Algorithmische Geometrie (Abb. 3 b-D). Ein Deckglas auf der dorsalen Ende des physikalischen Modells nach unten gedrückt repliziert die mechanische Belastung, die von der VM oder Oberflächenspannung aus unseren Experimenten (Abbildung 3D) zur Verfügung gestellt. Das Modell Exponate vergleichbaren Geometrie und Gehirn Torsion mit einem tatsächlichen Embryo, kultivierten Ex Ovo HH14-17 (Abbildung 3E).
Abbildung 1: Morphologie des Embryos mit VM entfernt und Auswirkungen äußerer Kräfte auf rechts Gehirn Rohr Torsion. (A) Harvested Embryo mit VM bei HH11 entfernt. (B) der gleichen Embryo für 27 h Post VM Entfernung zeigen reduziert Torsion inkubiert. (C) der gleichen Embryo unterzog sich Gehirn Torsion auf Antrag des flüssigen Oberflächenspannung. (D) Kontrolle Embryo mit normalen Gehirn Torsion zu einem vergleichbaren Zeitpunkt. Maßstabsbalken, (A-C) 1 mm, (D) 1 mm. Bilder wurden bei 10 X Vergrößerung gefangen genommen. Adaptiert von Ref [12] mit Erlaubnis. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: OCT-Bild eines Embryos HH13. (A) die Figur hat seine thorakalen Lagewinkel gekennzeichnet (a) und der kranialen Lagewinkel bei (b) gemessen. (B), (C) Einen Querschnitt des NT an Positionen (a) und (b). Winkel werden aus einer senkrechten Position gemessen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: ein physikalisches Modell des Embryos Gehirn Torsion zu demonstrieren. (A) eine vereinfachte Geometrie eines Küken-Embryos ohne VM bei HH14-17 (B) Silikon-Elastomer physikalisches Modell eines Küken-Embryos. (C) dorsale Ansicht des Modells mit dem Herzen auf der rechten Seite. (D) dorsale Ansicht des Modells unter einer externen Kraft angewendet durch ein Deckglas, erste rechts Gehirn Torsion zu zeigen. (E) Chick Embryo kultiviert Ex Ovo beginnen, drehen Sie nach rechts auf HH14 zum Vergleich. Maßstabsbalken, (B-D) 1 cm, (E) 1 mm. Adapted von Ref [12] mit Genehmigung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Während physikalische Phänomene eine wesentliche Rolle in Morphogenese26,27,28,29,30, die spezifischen mechanische Mechanismen sowie die Koordination von mechanischen spielen und Molekulare Mechanismen bleiben weitgehend unerforscht. Es ist bekannt, dass die ventrale Biegung und rechts Torsion des primitiven Gehirns sind zwei zentrale Prozesse, die zur frühen embryonalen Morphogenese18,31,32,33beitragen, 34, aber keine vorherige Studien behandelt die mechanische Ursprünge des Gehirns Torsion, eine der frühesten ORGANEBENE links-rechts-Asymmetrie.
Die wichtigsten Schritte des Protokolls gehören die Entfernung der VM, die mechanische Triebkraft für Gehirn Torsion zu identifizieren und die Anwendung der flüssigen Oberflächenspannung um die Ergebnisse zu bestätigen. Die Problembehandlung von dieser Technik fand in der Anfangsphase zu identifizieren, an der die VM entfernt werden sollte, um bedeutende Veränderungen im Torsion zu bewirken.
Die nach unten passive Kraft der VM wurde gezeigt, zu einer grundlegenden mechanischen Grenzen für die wachsenden embryonalen Gehirn-Röhre. Wenn die VM des Embryos entfernt wurde, das Gehirn nicht mehr Wendungen auf ein normales Maß aber ließe sich an die Steuerungsebene durch die anschließende Anwendung der Oberflächenspannung durch Absenken des Flüssigkeitsspiegels zu verdrehen. Die bekannten Oberflächenspannung von Wasser bei Raumtemperatur ist 72.01 ± 0,1 mN/m, und die Kontaktlänge des Ordens Millimeter ist, die Kraft kann dann berechnet werden. Dabei schätzten wir, dass die VM eine Kraft von ca. 10 Minuten auf die HH 14-17 Embryo12ausgeübt.
Unter Verwendung dieses Protokolls, konnten wir feststellen, dass die VM im embryonalen Gehirn Torsion mechanische eine Schlüsselrolle spielt. Die erzielten Ergebnisse mit diesem neuen Protokoll legt nahe, dass die VM eine wichtige Struktur für das Fortschreiten der normalen Gehirn Torsion während der embryonalen Morphogenese, als es die geometrische Abhängigkeiten und notwendig für die Verdrehung der mechanischen Belastung liefert die Gehirn-35. Die Ergebnisse zeigten auch, dass die Position des Herzens die Richtung des Gehirns Torsion bestimmt. L-R Asymmetrie des Embryos während der Entwicklung führt zu einer Recht geloopt Form des Herzens, die wiederum treibt nach rechts Verdrehen des Gehirns36,37,38,39. Es ist erwähnenswert, dass die mechanische Methode der Verdrängung des Herzens Position unterscheidet sich von anderen Forschern13 entwickelte chemische Methode und besser ist für die Abgrenzung der Rolle der Mechanik in Morphogenese. Unsere Ergebnisse zeigen insgesamt, die fundamentale Rolle der Mechanik beim fahren Torsionssteifigkeit Gehirn Morphogenese in der Küken-Embryos.
In Zukunft kann das Protokoll angewendet werden, um wie genetische und mechanische Faktoren zu identifizieren, gemeinsam regelmäßige embryonalen Torsion und enthüllen, wie diese verschiedenen Faktoren um entsprechende Morphogenese sicherzustellen arbeiten.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Z.C. erkennt die Unterstützung von Dartmouth Gründerfonds und Branco Weiss - Gesellschaft für Wissenschaft Gemeinschaft, verwaltet von der ETH Zürich. Die Autoren danken Dr. Larry A. Taber, Benjamen A. Filas, Qiaohang Guo, sowie Yunfei Shi für hilfreiche Gespräche und die anonyme Gutachter für Kommentare. Dieses Material basiert auf Arbeit, unterstützt von der National Science Foundation Graduate Research Fellowship unter Grant Nr. DGE-1313911. Jede Meinung, Erkenntnisse und Schlussfolgerungen oder Empfehlungen ausgedrückt in diesem Material sind diejenigen der Autoren (s) und spiegeln nicht unbedingt die Ansichten von der National Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized Specific pathogen-free White Leghorn chicken eggs | Charles River | ||
| Optical Coherent Tomography Microscope | Thorlabs | GAN220C1 | |
| Silicone elastomer | Smooth-On, Inc. | EcoFlex 00-50 | |
| Dissecting microscope | Leica | MZ8 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Lonza | 12-604F | |
| Antibiotics | Sigma | P4083 | |
| Chick serum | Sigma | C5405 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-30 | |
| Filter paper | Whatman | 5202-110 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Comsol MultiPhysics | Comsol | ||
| 3D computer graphics software | Rhino 5 | ||
| Microscope attached with OCT | Nikon | FN1 | |
| Digital single-lens reflex camera | EOS | Rebel T3i |
References
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