Summary
Qui, presentiamo un protocollo introducendo una serie di nuovi esperimenti di ex-ovo e approcci di modellazione fisica per studiare la meccanica della morfogenesi durante primi torsione cervello embrionale di pulcino.
Abstract
Lo sviluppo embrionale è tradizionalmente studiato dal punto di vista della genetica biomolecolare, ma l'importanza fondamentale della meccanica nella morfogenesi è sempre più riconosciuta. In particolare, il tubo embrionale del pulcino cuore e cervello, che subiscono drastici cambiamenti morfologici come si sviluppano, sono tra i principali candidati per studiare il ruolo delle forze fisiche nella morfogenesi. Progressiva flessione ventrale e torsione verso destra del cervello embrionale tubolare pulcino accadere alle primissime fasi dell'organo-livello sinistra-destra asimmetria nello sviluppo embrionale del pulcino. La membrana vitellina (VM) vincola la parte dorsale dell'embrione ed è stata implicata nel fornire la forza necessaria per indurre torsione di sviluppo del cervello. Qui presentiamo una combinazione di nuovo ex-ovo esperimenti e modelli per identificare i meccanismi di torsione cervello fisici. In fase di Hamburger-Hamilton 11, gli embrioni vengono raccolte e coltivati ex ovo (Media). La macchina virtuale viene successivamente rimosso utilizzando un tubo capillare tirato. Controllando il livello del fluido e sottoporre l'embrione a un'interfaccia liquido-aria, la tensione superficiale liquido dei media può essere utilizzata per sostituire il ruolo meccanico della macchina virtuale. Microchirurgia esperimenti sono stati eseguiti anche per modificare la posizione del cuore per trovare il conseguente cambiamento nella chiralità di torsione cervello. Risultati da questo protocollo illustrano i ruoli fondamentali della meccanica nella morfogenesi di guida.
Introduction
Ricerca moderna biologia inerente allo sviluppo in gran parte si concentra sullo sviluppo di comprensione dal punto di vista di genetica molecolare1,2,3,4,5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. è noto che fenomeni fisici svolgono un ruolo centrale nella morfogenesi, oppure la generazione di biologico forma14,15,16,17; Tuttavia, specifici meccanismi meccanici di sviluppo rimangono in gran parte. Ventrale flessione e torsione verso destra del tubo primitivo cervello dopo Hamburger-Hamilton fase 11 (HH 11)18 sono i due principali processi che contribuiscono alla forma embrionale cambio19,20. In particolare, il meccanismo fisico alla base dello sviluppo torsionale nel cervello embrionale rimane in modo incompleto capito.
La torsione embrionale in embrione di pollo è tra i primi eventi morfogenetici di sinistra-destra (L-R) asimmetria in sviluppo. Quando il processo di asimmetria L-R viene perturbato, difetti di nascita come situs inversus, isomeriao eterotassia verificherà21.
Qui presentiamo un protocollo che unisce ex-ovo esperimenti22,23 con modellazione fisica per caratterizzare le forze meccaniche durante lo sviluppo iniziale del cervello embrionale. L'obiettivo del metodo presentato è quello di identificare le forze meccaniche responsabile torsione cervello e i fattori che influenzano il grado di torsione durante lo sviluppo iniziali12. Basato sull'osservazione sperimentale che la membrana vitellina (VM) vincola la parte dorsale dell'embrione, abbiamo supposto che la VM fornisce la forza necessaria per indurre torsione di sviluppo del cervello. Pertanto, in questo metodo, abbiamo rimosso la parte di VM che copre l'area del cervello per scoprire gli effetti sulla torsione cervello. Inoltre, il metodo di applicazione fluido tensione superficiale è stato utilizzato per confermare il ruolo meccanico della macchina virtuale e fornire una stima della forza necessaria per torsione del cervello, che non era stato fatto in precedenza. Misurare le forze durante la morfogenesi embrionale è un compito impegnativo. In particolare, in uno studio pionieristico, Campàs e collaboratori24 ha sviluppato un nuovo metodo per quantificare lo stress cellulare utilizzando microgocce iniettato. Tuttavia, questo metodo è stato limitato alla misurazione di forze a livello cellulare, quindi non applicabile per sondare le forze a livello del tessuto o organismo. Il protocollo presentato in questo documento è stato sviluppato per parzialmente colmare questa lacuna.
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Protocol
1. preparazione di terreni di coltura del tessuto
- Utilizzare una bottiglia da 0,5 L dell'Aquila per volta di Dulbecco Medium (DMEM) con glucosio 4,5 g/L, bicarbonato di sodio e L-glutamina come base per i terreni di coltura.
- In una cappa a flusso laminare sterile, aggiungere 10 mL di antibiotici al 0,5 l di DMEM.
- Utilizzando una pipetta sterile, trasferire 50 mL della soluzione di antibiotici DMEM in una provetta conica sterile 50 mL.
- Aggiungere 50 mL di siero di pulcino per la soluzione di antibiotici DMEM rimanente nella bottiglia 0,5 L nella cappa sterile.
- Conservare la soluzione finale (denominata di seguito come terreni di coltura pulcino [CCM]) in 50 mL tubo conico aliquote a-20 ° C.
2. l'incubazione delle uova
- Uso delicato pulisce con etanolo al 70% per pulire specifici esenti da patogeni White Leghorn pollo uova fecondate. Disporre le uova in un orientamento longitudinale sui titolari.
- Accendere un'incubatrice per impostare una temperatura di 37,5 ° C e mantenere l'umidità al 48-55%. L'umidità è controllata con l'aggiunta di una quantità appropriata di acqua nell'incubatore.
- Incubare le uova HH11-13 e circa 40-44 h.
- Lasciare che le uova raffreddare a temperatura ambiente per circa 15-30 min prima della spruzzatura/pulizia con etanolo al 70%.
3. tirare tubi capillari in vetro
- Montare un 10 tubi capillari di vetro lungo cm con un diametro esterno di 1,0 mm e un diametro interno di 0,5 mm su un estrattore micropipetta.
- Impostare il calore e tirare i parametri a 750 e 400, rispettivamente. Premere il pulsante di tirare per tirare il tubo capillare in aghi sottili.
4. carta da filtro vettore metodo
- Tagliare cerchi di circa 3 cm di diametro da carta da filtro.
- Tagliare un rettangolo di circa 1 cm di 2 cm dal cerchio utilizzando una perforatrice. Assicurarsi di rimuovere qualsiasi sporgenti o spigoli vivi.
5. embrione raccolta e preparazione
- Rompere le uova dalla parte inferiore, separare il guscio delicatamente e accuratamente depositare contenuto in una capsula Petri 150 x 15 mm. Per assicurarsi che il lato di embrione sia alto, mantenere le uova nello stesso orientamento che essi sono stati incubati mentre li di cracking.
- Rimuovere l'albumina sottile utilizzando una pipetta Pasteur.
- Separare l'albumina spessa dal tuorlo usando il forcipe concluso smussato. Garantire che l'albumina di spessa è stato rimosso da raschiare leggermente la parte superiore del tuorlo con il forcipe smussato si è conclusa.
- Utilizzare pinze a punta fine per centrare e posizionare un anello di carta da filtro sopra l'embrione, corrispondente all'asse lungo dell'anello con l'asse lungo dell'embrione.
- Tagliare il tuorlo che circonda l'anello di carta da filtro con le forbici.
- Tirare l'anello e l'embrione fuori il tuorlo in una direzione obliqua verso il sito dove il tuorlo in primo luogo è stato tagliato.
- Sciacquare gli embrioni in due piatti sequenziale di 100 mm con temperatura ambiente 1 x tamponato fosfato salino (PBS).
- Inserire un anello di carta da filtro in una capsula Petri 35mm prima. Quindi posizionare il lato dorsale dell'embrione fino sulla carta da filtro già in 35mm di Petri.
- Inserire un anello di acciaio sopra il panino di carta da filtro. Assicurarsi di non danneggiare l'embrione.
- Aggiungere 3 mL di CCM precedentemente preparato per ogni scatola di Petri.
- Rimuovere la macchina virtuale di ogni embrione scremando leggermente l'ago capillare tirato attraverso la parte superiore dell'embrione e peeling la VM di distanza, a partire dall'estremità anteriore (proprio sopra il proencefalo) e procedere alla notocorda (Figura 1A).
- Inserire otto 35mm di Petri in un piatto di 150 mm che è stato rivestito con salviettine delicato compito saturata d'acqua (per mantenere umidità).
- Posto di Petri 150mm in un sacchetto di plastica sigillabile quindi riempire la borsa con una miscela di gas composta da 95% O2 e 5% CO2.
- Sigillare il sacchetto e metterlo in un'incubatrice di 37,5 ° C.
- Incubare gli embrioni per un ulteriore 27 h fino a HH15-HH16 (Figura 1B).
6. che induce tensione superficiale
- Rimuovere gli embrioni dall'incubatrice e utilizzare un sistema di tomografia a coerenza ottica a loro immagine. Uso OCT per determinare l'angolo di torsione del tubo neurale (NT) (Figura 2).
- Trasferire gli embrioni per un microscopio chiaro e visualizzare a 10 ingrandimenti. Utilizzare una pipetta 200 microlitro per togliere in modo incrementale 0,2 mL di media di Petri.
- Prendere immagini campo chiaro a ogni intervallo per osservare gli effetti dell'interfaccia multimediale-aria sull'embrione.
- Rimuovere il supporto fino a quando la tensione superficiale attraverso l'embrione induce torsione (Figura 1).
- Immagine dell'embrione utilizzando il sistema OCT ancora una volta per stabilire un angolo di torsione finale per il confronto di controllare gli embrioni. Nota: Le immagini del campo luminoso sono state acquisite utilizzando un microscopio per dissezione. Un sistema di tomografia ottica di coerenza con un microscopio collegato è stato utilizzato per acquisire gli stack di immagine a sezione trasversale degli embrioni dal vivo. Immagini sono stati ottenuti in un dominio di scansione3 3 x 10 x 3 mm, poi trasformati in un software di imaging. Infine, le immagini del modello fisico sono state scattate con una digital single-lens reflex.
7. physical Modelling delle forze di tensione superficiale/VM
- Sviluppare una geometria 3D semplificata che assomiglia ad un embrione tra HH14-17 nel software di modellazione commerciale (Figura 3A).
- La progettazione dello stampo negativo della geometria 3D nel software di grafica computer 3D commerciale.
- Uso una stampante 3D caricata con filamento di 1,75 mm acrilonitrile-butadiene-stirene a 3D stampare lo stampo progettato, in formato stereolithographic (STL).
- Per lanciare lo stampo, mescolare componenti di elastomero di silicone gomma A e B in parti uguali e versare la miscela nello stampo prontamente; impostare lo stampo di colata per curare a temperatura ambiente per 12 h (Figura 3B).
- Contrassegnare il modello fisico dell'embrione lungo il NT dal lato dorsale di visualizzare torsione.
- Utilizzare un vetrino coprioggetto per replicare la forza applicata al modello fisico 3D che imita quella del VM o tensione superficiale (Figura 3D).
- Inserire una serie di fili rigidi di lunghezza uguale al lato del modello fisico. Dopo il coprioggetto esercita una forza esterna sul modello del cervello, i fili diventano inclinati di un angolo che dipende dalla posizione. Determinare l'angolo di rotazione di arctan della lunghezza proiettata sopra la lunghezza originale di ogni filo (Figura 3E).
8. alterare la direzione del ciclo cuore
- Seguire i passaggi in 3.1 e 3.2 per ottenere un tubo capillare tirato.
- Seguire i passaggi in 5.1 attraverso 5.10 per preparare l'embrione.
- Utilizzare un paio di pinze per capovolgere la carta da filtro in modo che l'embrione diventa ventrale-side-up.
- Utilizzare il tubo capillare tirato per tagliare aperto una fessura nella membrana splanchnopleure (SPL).
- Utilizzare il tubo capillare per esercitare una forza meccanica per spingere il cuore dal lato destro al lato sinistro.
- Seguire i passaggi in 5.12 attraverso 5.15 per osservare il cambiamento in torsione.
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Representative Results
In questo studio, la macchina virtuale dell'embrione alle HH11 è stato rimosso dall'estremità anteriore alla flessione toracica. Gli embrioni erano imaged tramite un sistema di OCT. In questa fase, la torsione del tubo del cervello non è avviato (Figura 1A). Dopo essere incubate a HH15-16, embrioni con loro VM rimosso ha esibito riduttrice del cervello tubo torsione, circa 35 gradi (Figura 1B) rispetto per controllare gli embrioni, che esibiscono la torsione di circa 90 gradi. Quando il livello di supporto è stato abbassato a indurre tensione superficiale sul lato dorsale degli embrioni con loro VM rimossa, il cervello contorto a livelli paragonabili a quelli in embrioni di controllo (Figura 1). La figura 2 Mostra un'immagine OCT rappresentativa di un embrione di HH 13 con il suo angolo di orientamento toracico e l'angolo di orientamento cranica contrassegnato (Figura 2A). Gli angoli sono misurati da una posizione verticale della sezione trasversale del NT (Figura 2B, C). Risultati dai nostri esperimenti hanno indicato che la torsione tubo normale del cervello è guidato da carico esterno sul lato dorsale dell'embrione e che questo carico essenziale è fornito dai20,VM25. Inoltre, in un embrione normale cervello gira verso destra, come il ciclo di cuore va a destra mentre in un embrione con cuore inserito ciclo sul lato sinistro in una fase iniziale (cioè, prima tappa HH 12), il cervello anche giri verso sinistra seguendo un altro 20 h di incubazione (Figura 3 c in rif. [12]), suggerendo che la posizione del cuore ha provocato l'asimmetria nella torsione del cervello.
I dati raccolti negli esperimenti ci ha permesso di ricostruire una geometria semplificata dell'embrione pulcino senza VM da HH14-17 (Figura 3A). In questo modello computazionale, cervello e cuore destro loop sono stati modellati come canne curvi. Un blocco che rappresenta la membrana splanchnopleure (SPL) era il contatto con l'asta di cuore. Con la progettazione di uno stampo negativo da questo modello computazionale, 3D stampa questa muffa e il cast lo stampo con un elastomero di silicone, abbiamo fabbricato un modello fisico dalla geometria computazionale semplificata (Figura 3B-D). Un vetrino coprioggetti premuto verso il basso sul lato dorsale del modello fisico replicato il carico meccanico fornito dalla VM o tensione superficiale dai nostri esperimenti (Figura 3D). Il modello esposizioni paragonabili geometria e cervello torsione con un embrione reale, colta ex-ovo a HH14-17 (Figura 3E).
Figura 1: morfologia dell'embrione con VM rimosso ed effetti di forze esterne sulla torsione tubo rightward cervello. (A) raccolte embrione con VM rimosso presso HH11. (B) l'embrione stesso incubate per 27 h post VM rimozione visualizzando ridotta torsione. (C) l'embrione stesso ha subito torsione cervello, all'atto dell'applicazione del fluido tensione superficiale. (D) dell'embrione di controllo con torsione normale del cervello in una fase paragonabile. Barre della scala, (A-C) 1 mm, (D) 1 mm. immagini vennero catturati a 10 ingrandimenti. Adattato da rif. [12] con permesso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: immagine OCT di un embrione HH13. (A) la figura ha relativo angolo di orientamento toracica segnato a (a) e l'angolo di orientamento cranica misurato al punto (b). (B), (C) Una sezione trasversale del NT alle posizioni (a) e (b). Gli angoli sono misurati da una posizione verticale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: un modello fisico dell'embrione dimostrando torsione cervello. (A) una geometria semplificata di un embrione senza VM al modello fisico di elastomero di Silicone di HH14-17 (B) di un embrione di pollo. (C) vista dorsale del modello con il cuore sul lato destro. (D) vista dorsale del modello sotto una forza esterna applicata da un vetrino coprioggetti, comincia a mostrare la torsione verso destra del cervello. (E) embrione coltivato ex-ovo cominciando a torsione verso destra a HH14 per il confronto. Barre della scala, (B-D) 1 cm, (E) 1 mm. Adapted from Ref [12] con permesso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Mentre fenomeni fisici giocano un ruolo integrante nella morfogenesi26,27,28,29,30, i meccanismi meccanici specifici, insieme con il coordinamento della meccanica e meccanismi molecolari, rimangono in gran parte inesplorate. È noto che il ventrale flessione e torsione verso destra del cervello primitivo sono due processi centrali che contribuiscono al precoce morfogenesi embrionale18,31,32,33, 34, ma nessuno studio precedente affrontate le origini meccaniche di torsione cervello, uno degli eventi più presto organo-livello di asimmetria sinistra-destra.
I passaggi chiave del protocollo includono la rimozione di VM per identificare la forza motrice meccanica per torsione cervello e l'applicazione della tensione superficiale fluido per confermare ulteriormente i risultati. La risoluzione dei problemi di questa tecnica, ha avuto luogo per identificare la fase iniziale in cui la macchina virtuale dovrebbe essere rimosso per indurre cambiamenti significativi in torsione.
La forza verso il basso passiva di VM è stata indicata per essere un contorno meccanico fondamentale per il tubo di cervello embrionale crescente. Quando la macchina virtuale dell'embrione è stato rimosso, il cervello non più colpi di scena ad un grado normale ma potrebbe essere fatto a torcere a livello di controllo attraverso l'applicazione di tensione superficiale successiva abbassando il livello del liquido. Il nota tensione superficiale dell'acqua a temperatura ambiente è 72.01 ± 0,1 mN/m e la lunghezza di contatto è dell'ordine di millimetri, la forza può quindi essere calcolata. Quindi abbiamo stimato che la VM esercitata una forza di circa 10 mN sulla HH 14-17 embrione12.
Usando questo protocollo, siamo stati in grado di determinare che VM svolge il ruolo di meccanico chiave nella torsione cervello embrionale. I risultati ottenuti con questo nuovo protocollo suggerisce che la VM è una struttura fondamentale per la progressione di torsione normale del cervello durante la morfogenesi embrionale, mentre fornisce i vincoli geometrici e carico meccanico necessario per la torsione della cervello35. I risultati hanno indicato che la posizione del cuore determina la direzione della torsione cervello. Asimmetria di L-R dell'embrione durante lo sviluppo conduce a una forma di loop di destra del cuore, che a sua volta aziona una torsione verso destra del cervello36,37,38,39. Vale la pena ricordare che il metodo meccanico di spostando la posizione del cuore differisce dal metodo chimico sviluppato da altri ricercatori13 e che è meglio per delineare il ruolo della meccanica nella morfogenesi. Complessivamente, i nostri risultati illustrano il ruolo fondamentale della meccanica nella morfogenesi del cervello torsionale di guida nell'embrione di pulcino.
In futuro, il protocollo può essere applicato per identificare fattori come genetici e meccanici insieme regolare embrionali torsione e svelare come questi diversi fattori funzionano di concerto per garantire adeguata morfogenesi.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Z.C. riconosce il sostegno dal fondo di avvio di Dartmouth e Branco Weiss - Society for Science fellowship, amministrata dal Politecnico federale di Zurigo. Gli autori ringraziano la d. ssa Larry A. Taber, Benjamen A. Filas, Qiaohang Guo e Yunfei Shi per utili discussioni, nonché i revisori anonimi per i commenti. Questo materiale si basa su lavori sostenuta dalla National Science Foundation Graduate Research Fellowship sotto Grant No. DGE-1313911. Opinioni, conclusioni e conclusioni o raccomandazioni espresse in questo materiale sono quelle degli autori (s) e non riflettono necessariamente le opinioni di National Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized Specific pathogen-free White Leghorn chicken eggs | Charles River | ||
| Optical Coherent Tomography Microscope | Thorlabs | GAN220C1 | |
| Silicone elastomer | Smooth-On, Inc. | EcoFlex 00-50 | |
| Dissecting microscope | Leica | MZ8 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Lonza | 12-604F | |
| Antibiotics | Sigma | P4083 | |
| Chick serum | Sigma | C5405 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-30 | |
| Filter paper | Whatman | 5202-110 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Comsol MultiPhysics | Comsol | ||
| 3D computer graphics software | Rhino 5 | ||
| Microscope attached with OCT | Nikon | FN1 | |
| Digital single-lens reflex camera | EOS | Rebel T3i |
References
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