Summary
Aquí, presentamos un protocolo de introducción de un conjunto de nuevos experimentos ex ovo y enfoques de modelado físico para el estudio de la mecánica de la morfogénesis durante temprano chick cerebro embrionario la torsión.
Abstract
Desarrollo embrionario tradicionalmente es estudiado desde la perspectiva de la genética biomolecular, pero la importancia fundamental de la mecánica en la morfogénesis se está reconociendo cada vez más. En particular, el tubo embrionario chick corazón y el cerebro, que sufren cambios morfológicos drásticos que se desarrollan, están entre los principales candidatos a estudiar el papel de las fuerzas físicas en la morfogénesis. Progresiva flexión ventral y la torsión hacia la derecha de la cerebro de pollo embrionario tubular ocurren en la etapa más temprana de órgano nivel de izquierda a derecha asimetría en el desarrollo embrionario del pollo. La membrana vitelina (VM) limita el lado dorsal del embrión y se ha implicado en la prestación de la fuerza necesaria para inducir la torsión del cerebro en desarrollo. Aquí presentamos una combinación de nuevas experiencias de ex ovo y modelado para identificar los mecanismos de torsión del cerebro físico. En etapa de Hamburger-Hamilton 11, embriones son cosechados y cultivados ex ovo (en los medios de comunicación). La VM se elimina posteriormente mediante un tubo capilar tirado. Controlar el nivel del líquido y someter al embrión a una interfaz de aire líquido, el líquido tensión superficial de los medios de comunicación puede utilizarse para reemplazar el papel mecánico de la máquina virtual. También se realizaron experimentos de microcirugía para alterar la posición del corazón para encontrar el cambio resultante en la quiralidad de la torsión del cerebro. Resultados de este protocolo ilustran las funciones fundamentales de la mecánica en la morfogénesis que conduce.
Introduction
Investigación de la biología moderna del desarrollo se centra en gran medida en el desarrollo de la comprensión desde la perspectiva de la genética molecular1,2,3,4,5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. se sabe que fenómenos físicos juegan un papel central en la morfogénesis, o la generación de biológico forma14,15,16,17; sin embargo, mecanismos mecánicos específicos de desarrollo siguen siendo en gran medida estudiados. Flexión ventral y la torsión hacia la derecha del tubo cerebro primitivo después de Hamburger-Hamilton etapa 11 (HH 11)18 son los dos principales procesos que contribuyen a la forma embrionaria de cambian19,20. En particular, el mecanismo físico subyacente el desarrollo torsional en el cerebro embrionario sigue incompleto entendido.
La torsión embrionaria en embrión de pollo es uno de los primeros eventos morfogenéticos de asimetría (L-R) de izquierda a derecha en desarrollo. Cuando es perturbado el proceso de la asimetría de izq. a der., defectos de nacimiento como situs inversus, isomerismoo heterotaxia ocurrirá21.
Aquí presentamos un protocolo que combina ex ovo experimentos22,23 con modelado físico para caracterizar las fuerzas mecánicas durante el desarrollo temprano del cerebro embrionario. El objetivo del método presentado es identificar las fuerzas mecánicas responsables de torsión del cerebro y los factores que afectan el grado de torsión durante el temprano desarrollo12. Basado en la observación experimental de que la membrana vitelina (VM) limita el lado dorsal del embrión, presumimos que el VM proporciona la fuerza necesaria para inducir la torsión del cerebro en desarrollo. Por lo tanto, en este método, hemos eliminado la parte de la VM que cubre el área del cerebro para averiguar los efectos de torsión de cerebro. Además, el método de aplicación de fluidos tensión superficial fue utilizado para confirmar el papel mecánico de la máquina virtual y proporcionar una estimación de la fuerza necesaria por torsión del cerebro, que no se había hecha anteriormente. Medición de las fuerzas durante la morfogénesis embrionaria es una tarea difícil. En particular, en un estudio pionero, Campàs y colaboradores24 desarrolló un novedoso método para cuantificar el estrés celular utilizando inyección de microgotas. Sin embargo, este método se limita a medir fuerzas en el nivel celular, por lo tanto no aplicable para sondear las fuerzas en el nivel organismo o tejido. El protocolo presentado en este trabajo se desarrolló para llenar parcialmente este vacío.
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Protocol
1. preparación de medios de cultivo de tejidos
- Utilice una botella de 0,5 L de medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM) con 4,5 g/L glucosa, bicarbonato de sodio y L-glutamina como la base para los medios de cultivo.
- En una campana de flujo laminar estéril, añadir 10 mL de antibióticos a lo 0,5 L de DMEM.
- Con una pipeta estéril, transferir 50 mL de la solución de antibióticos DMEM a un tubo cónico estéril 50 mL.
- Añadir 50 mL de suero de pollo a la solución de antibióticos DMEM restante en la botella de 0,5 L en la campana estéril.
- Almacenar la solución final (denominada en adelante medios de cultivo de garbanzos [CCM]) en alícuotas de tubo cónico de 50 mL a-20 ° C.
2. incubación de los huevos
- Toallitas de uso delicado con etanol al 70% para limpiar concreto libre de patógeno White Leghorn pollo huevos fertilizados. Arreglar huevos en una orientación longitudinal en los titulares.
- Encienda una incubadora de huevo para fijar una temperatura de 37.5 ° C y mantener la humedad en % de 48-55. La humedad se controla mediante la adición de una cantidad apropiada de agua a la incubadora.
- Incubar los huevos a HH11-13, aproximadamente de 40 a 44 h.
- Dejar que enfríen los huevos a temperatura ambiente durante aproximadamente 15-30 min antes de la fumigación y limpieza con etanol al 70%.
3. Tire de Capillares de vidrio de
- Montar un 10 tubos capilares de vidrio cm de largo con un diámetro externo de 1,0 mm y un diámetro interno de 0,5 mm en un tirador de la micropipeta.
- Ajuste el calor y tire parámetros a 750 y 400, respectivamente. Presione el botón de extracción para extraer el tubo capilar en finas agujas.
4. papel de filtro portador método
- Cortar círculos de aproximadamente 3 cm de diámetro de papel de filtro.
- Cortar un rectángulo de aproximadamente 1 cm por 2 cm del círculo utilizando una perforadora. Asegúrese de quitar cualquier salientes o esquinas.
5. embrión cosecha y preparación
- Romper huevos en la parte inferior, separe la cáscara con suavidad y con cuidado depositar contenidos en un plato de petri de 150 x 15 mm. Para asegurar que la parte del embrión es, mantenga los huevos en la misma orientación que se incubaron mientras se les agrieta.
- Eliminar la albúmina fina utilizando una pipeta de Pasteur desechable.
- Separar la albúmina gruesa de la yema de huevo con unas pinzas terminadas embotadas. Asegúrese de que la albúmina gruesa se ha quitado raspando suavemente la parte superior de la yema con el fórceps terminó contundente.
- Use pinzas de punta fina para centrar y colocar un anillo de papel de filtro sobre el embrión, que el eje largo del anillo con el eje longitudinal del embrión.
- Cortar la yema de huevo que rodea el anillo de filtro de papel con las tijeras.
- Tire el anillo y el embrión de la yema en una dirección oblicua hacia el sitio donde primero fue cortar la yema de huevo.
- Enjuague los embriones en dos platos de 100 mm secuenciales con temperatura 1 x de tampón fosfato salino (PBS).
- Coloque primero un anillo de papel de filtro en un plato de petri de 35 mm. Luego coloque el lado dorsal del embrión hacia arriba sobre el papel de filtro ya en plato de petri de 35 mm.
- Coloque un anillo de acero inoxidable en la parte superior el sándwich de papel de filtro. Asegúrese de no dañar el embrión.
- Añadir 3 mL del CCM previamente preparado a cada caja Petri.
- Retirar la VM de cada embrión rozando ligeramente la aguja capilar tirada en la parte superior del embrión y la VM a la peladura, a partir del extremo anterior (sobre el forebrain) y proceder a la notocorda (figura 1A).
- Lugar ocho platos de Petri de 35 mm en un plato de 150 mm que fue alineado con agua saturada de tarea delicada toallitas (para mantener la humedad).
- Lugar el plato de petri de 150 mm en una bolsa de plástico sellable entonces llenar la bolsa con una mezcla de gas compuesta por 95% O2 y 5% CO2.
- Selle la bolsa y colocarlo en una incubadora de 37,5 ° C.
- Incubar los embriones para un adicional 27 h hasta HH15-HH16 (figura 1B).
6. inducción de tensión superficial
- Eliminar los embriones del incubador y utiliza un sistema de tomografía de coherencia óptica a los de la imagen. Usar OCT para determinar el ángulo de torsión del tubo neural (NT) (figura 2).
- Transfiera los embriones a un microscopio óptico y visualizar con 10 aumentos. Utilice una pipeta de 200 microlitros para quitar progresivamente 0,2 mL de medios de comunicación de la caja Petri.
- Tomar imágenes de brightfield en cada intervalo para observar los efectos de la interfaz de aire de los medios de comunicación sobre el embrión.
- Quitar los medios de comunicación hasta que la tensión superficial en el embrión induce torsión (figura 1).
- La imagen del embrión usando el sistema de OCT una vez más para establecer un ángulo de torsión final de comparación para el control de embriones. Nota: Las imágenes del brillante-campo fueron adquiridas mediante el uso de un microscopio de disección. Un sistema de tomografía de coherencia óptica con un microscopio Unido fue utilizado para adquirir pilas de imágenes transversales de embriones vivos. Imágenes fueron obtenidas en un dominio de exploración de3 de 3 x 10 mm x 3 mm, luego procesadas en un software de proyección de imagen. Por último, las imágenes de modelo físico fueron tomadas con una cámara réflex digital de objetivo único.
7. física modelo de fuerzas de tensión superficial/VM
- Desarrollar una geometría 3D simplificada que se asemeja a un embrión entre HH14-17 en software de modelado comercial (Figura 3A).
- Diseñar el molde negativo de la geometría 3D de software de gráficos de computadora 3D comercial.
- Usar una impresora 3D cargada de 1,75 mm acrilo butadieno estireno del filamento a 3D imprimir el molde del diseño, en formato stereolithographic (.stl).
- Para realizar el molde, mezclar componentes de elastómero de caucho de silicona A y B en partes iguales y verter la mezcla en el molde rápidamente; Coloque el molde de fundición para curar a temperatura ambiente durante 12 horas (figura 3B).
- La marca el modelo físico del embrión a lo largo de el NT en el lado dorsal visualizar torsión.
- Utilizar un cubreobjetos para replicar la fuerza ejercida sobre el modelo físico 3D que imita el de la VM o tensión de superficie (figura 3D).
- Introducir una serie de cables rígidos de longitud igual al lado del modelo físico. Después de que el cubreobjetos ejerce una fuerza externa en el modelo de cerebro, los cables se convierten en inclinado en un ángulo que depende de la ubicacion. Determinar el ángulo de rotación por arctan de la longitud proyectada sobre la longitud original de cada cable (figura 3E).
8. alteración de la dirección del bucle de corazón
- Siga los pasos en 3.1 y 3.2 para obtener un tubo capilar tirado.
- Siga los pasos de 5.1 a través de 5.10 a preparar el embrión.
- Utilice un par de pinzas para voltear el papel de filtro para que el embrión se convierte en ventral lado hacia arriba.
- Utilizar el tubo capilar se corte una abertura en la membrana del splanchnopleure (SPL).
- Utilizar el tubo capilar para ejercer una fuerza mecánica para empujar el corazón de la derecha a la izquierda.
- Siga los pasos de 5.12 a 5.15 para observar la evolución de la torsión.
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Representative Results
En este estudio, la VM del embrión en HH11 fue quitada desde el extremo anterior a la flexión torácica. Los embriones fueron reflejados por un sistema de OCT. En esta etapa, la torsión del tubo de cerebro no ha iniciado (figura 1A). Después de ser incubados a HH15-16, embriones con su VM quitados expuesto cerebro reducido tubo torsión, aproximadamente 35 grados (figura 1B) en comparación con el control de embriones, que exhiben la torsión de alrededor de 90 grados. Cuando el nivel de los medios de comunicación se redujo para inducir la tensión superficial en el extremo dorsal de los embriones con sus VMs quitados, los cerebros retorcidos a niveles comparables a los de embriones de control (figura 1). La figura 2 muestra una imagen representativa del OCT de un embrión de 13 HH con su ángulo de orientación torácica y el ángulo de orientación craneal marcado (figura 2A). Los ángulos se miden desde la posición vertical de la sección transversal del NT (figura 2B, C). Resultados de nuestros experimentos sugirieron que la torsión tubo normal del cerebro es conducida por carga externa en el extremo dorsal del embrión y que esta carga esencial es suministrada por la VM20,25. Por otra parte, en un embrión normal el cerebro gira hacia la derecha como el lazo del corazón va hacia la derecha mientras que en un embrión con el corazón lazo empujó a la izquierda en una etapa temprana (es decir, antes de etapa HH 12), el cerebro también vueltas hacia la izquierda siguiendo otro 20 h de incubación (Figura 3 c en Ref. [12]), lo que sugiere que la posición del corazón dio lugar a la asimetría en la torsión del cerebro.
Datos recopilados en experimentos nos permitieron reconstruir una geometría simplificada del polluelo que el embrión sin la VM HH14-17 (Figura 3A). En este modelo computacional, el cerebro y el corazón bucle derecho se modelaron como barras curvas. Un bloque que representa la membrana splanchnopleure (SPL) fue el contacto con la barra de corazón. Mediante el diseño de un molde negativo de este modelo computacional, 3D impresión este molde y fundición el molde con un elastómero de silicón, hemos fabricado un modelo físico de la geometría computacional simplificada (figura 3B-D). Un cubreobjetos prensado hacia abajo en el extremo dorsal del modelo físico replican la carga mecánica proporcionada por la VM o tensión de la superficie de nuestros experimentos (figura 3D). El modelo exhibe similar geometría y cerebro torsión con un embrión real, cultivado ex ovo a HH14-17 (figura 3E).
Figura 1: morfología de los embriones con VM quitado y efectos de fuerzas externas en la torsión del tubo de cerebro hacia. (A) embrión de cosechado con VM quitado en HH11. (B) el mismo embrión se incuba durante 27 h post VM eliminación mostrando reducido torsión. (C) el embrión mismo experimentó la torsión del cerebro, en aplicación del líquido tensión superficial. (D) embriones Control con torsión normal del cerebro en una etapa comparable. Barras de escala, (A-C) (D) de 1 mm 1 mm. imágenes fueron capturados con 10 aumentos. Adaptado de ref. [12] con el permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: imagen de OCT de un embrión HH13. (A) la figura tiene su ángulo de orientación torácica marcada en (a) y su ángulo de orientación craneal medido en (b). (B), (C) Una muestra representativa de la NT en las posiciones (a) y (b). Los ángulos se miden desde una posición vertical. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: un modelo físico del embrión demostrando torsión de cerebro. (A) una geometría simplificada de un embrión de pollo sin VM en el modelo físico de HH14-17 (B) silicona elastómero de un embrión de pollo. (C) vista Dorsal del modelo con el corazón en el lado derecho. (D) vista Dorsal del modelo bajo una fuerza externa aplicada por un cubreobjetos, empezando a mostrar torsión hacia la derecha del cerebro. (E) embrión de pollo cultivado ex ovo comienza a girar hacia la derecha en HH14 para comparación. Barras de escala, (B-D) 1 cm, (E) 1 mm. adaptado de ref. [12] con el permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Mientras que los fenómenos físicos juegan un papel integral en la morfogénesis26,27,28,29,30, los mecanismos mecánicos específicos, junto con la coordinación de mecánica y mecanismos moleculares, siguen siendo en gran parte inexplorado. Es sabido que la flexión ventral y la torsión hacia la derecha de cerebro primitivo son dos procesos centrales que contribuyen a la temprana morfogénesis embrionaria18,31,32,33, 34, pero ningún estudio previo tratado el origen mecánico de la torsión del cerebro, uno de los eventos de lo más temprano posible órgano nivel de asimetría izquierda-derecha.
Los pasos clave del protocolo incluyen el retiro de la VM para identificar la fuerza motriz mecánica de torsión del cerebro y la aplicación de la tensión superficial líquida para confirmar aún más los resultados. La solución de problemas de esta técnica llevó a cabo para identificar la etapa inicial en la que la VM debe ser removida para inducir cambios significativos en la torsión.
La fuerza hacia abajo pasiva de la VM fue demostrada para ser un límite mecánico fundamental del tubo embrionario cerebro creciente. Cuando se retiró la VM del embrión, el cerebro ya no tuerce en un grado normal pero podría hacer retorcer al nivel de control a través de la aplicación posterior de la tensión superficial disminuyendo el nivel de líquido. La conocida tensión superficial del agua a temperatura ambiente es 72.01 ± 0,1 mN/m y la longitud de contacto es del orden de milímetros, entonces se puede calcular la fuerza. Tal modo se estimó que la VM ejerce una fuerza de aproximadamente 10 mN en el embrión HH 14-1712.
Mediante este protocolo, pudimos determinar que VM juega el papel fundamental de la mecánico en torsión del cerebro embrionario. Los resultados obtenidos utilizando este nuevo protocolo sugiere que la VM es una estructura fundamental para la progresión de torsión normal del cerebro durante la morfogénesis embrionaria, como fuentes las restricciones geométricas y carga mecánica necesaria para el giro de la cerebro de35. Los resultados también indicaron que la posición del corazón determina la dirección de la torsión del cerebro. Asimetría de L-R del embrión durante el desarrollo conduce a una forma bucle derecho del corazón, que a su vez conduce a torcer hacia la derecha del cerebro36,37,38,39. Cabe mencionar que el método mecánico de desplazar la posición del corazón difiere del método químico desarrollado por otros investigadores13 y es mejor para delinear el papel de la mecánica en la morfogénesis. En conjunto, nuestros resultados muestran el papel fundamental de la mecánica en la morfogénesis del cerebro torsional que conduce en el embrión de pollo.
En el futuro, el protocolo se puede aplicar para identificar factores como genéticos y mecánicos a torsión embrionaria normal y conocer cómo funcionan estos diferentes factores en conjunto para asegurar la apropiada morfogénesis.
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Disclosures
Los autores no declaran conflictos de interés.
Acknowledgments
Z.C. reconoce el apoyo del fondo de inicio de Dartmouth y el Branco Weiss - sociedad para la beca de ciencia, administrada por ETH Zurich. Los autores agradecen a los Drs. Larry A. Taber, Benjamen A. Filas, Qiaohang Guo y Yunfei Shi de discusiones útiles, así como los revisores anónimos por comentarios. Este material está basado en trabajo apoyado por la nacional ciencia Fundación graduados beca de investigación bajo la subvención no. DGE-1313911. Cualquier opinión, resultados y conclusiones o recomendaciones expresadas en este material son las de los autores (s) y no reflejan necesariamente las opiniones de la National Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized Specific pathogen-free White Leghorn chicken eggs | Charles River | ||
| Optical Coherent Tomography Microscope | Thorlabs | GAN220C1 | |
| Silicone elastomer | Smooth-On, Inc. | EcoFlex 00-50 | |
| Dissecting microscope | Leica | MZ8 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Lonza | 12-604F | |
| Antibiotics | Sigma | P4083 | |
| Chick serum | Sigma | C5405 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-30 | |
| Filter paper | Whatman | 5202-110 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Comsol MultiPhysics | Comsol | ||
| 3D computer graphics software | Rhino 5 | ||
| Microscope attached with OCT | Nikon | FN1 | |
| Digital single-lens reflex camera | EOS | Rebel T3i |
References
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