Summary
여기, 우리는 일련의 새로운 전 비켜 실험 및 초기 여자 배아 뇌 비틀림 동안 morphogenesis의 역학을 공부에 대 한 물리적 모델링 접근법을 소개 하는 프로토콜을 제시.
Abstract
배아 개발은 전통적으로 바이오 유전자의 관점에서 하지만 morphogenesis에서 역학의 기본적인 중요성은 점점 더 인식 되 고. 특히,는 미 발달 병아리 마음과 뇌 관, 그들은 개발 형태학 상 변화를 받아야, 총리 후보자 morphogenesis 물리적 힘의 역할을 연구 중입니다. 진보적인 복 부 굽 힘과 관 미 발달 병아리 두뇌의 우 비틀림 기관 수준 좌우 비대칭 병아리 배아 개발에서의 초기 단계에서 발생. Vitelline 막 (VM) 태아의 등 쪽을 구속 하 고 개발 두뇌의 비틀림을 유도 하는 데 필요한 힘 제공에 연루 되어 있다. 여기 새로운 전 비켜 실험의 조합을 뇌 비틀림의 메커니즘을 식별 하기 위해 모델링 물리적 선물이. 햄버거-해밀턴 단계에서 11, 배아는 수확 하 고 교양 비켜 ex (미디어에서). VM 이후에 가져온된 모 세관 튜브를 사용 하 여 제거 됩니다. 액체의 레벨을 제어 하 고 액체 공기 인터페이스에 배아를 쓰는, VM의 기계적 역할을 대체 하는 미디어의 액체 표면 장력을 사용할 수 있습니다. 미세 실험 또한 뇌 비틀림의 카이랄성에 결과 변화를 찾을 수 심장의 위치 변경을 수행 했다. 이 프로토콜에서 결과 morphogenesis 운전 역학의 기본적인 역할을 설명 합니다.
Introduction
현대 개발 생물학 연구는 주로 분자 유전학1,2,,34,,56 의 관점에서 이해 개발에 초점을 맞추고합니다 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. 현상과 morphogenesis에서 중심 역할을 담당할 또는 생물의 생성 형성14,15,,1617; 알려져 있다 그러나, 개발의 특정 기계적 메커니즘 크게 unstudied 남아 있다. 복 부 굴곡 및 원시 뇌 관 후 햄버거 해밀턴 무대 11 (HH 11)18 배아 모양에 기여 하는 두 가지 주요 프로세스의 우 비틀림19,20을 변경 합니다. 특히, 배아 두뇌에 비틀림 개발 기본 물리적 메커니즘 불완전 하 게 이해 남아 있습니다.
병아리 태아에 배아 비틀림 개발에 왼쪽 오른쪽 (L R) 비대칭의 초기 전체적 이벤트 중 하나입니다. L-R 비대칭의 과정을 교란 하는 경우 사이트 inversus, 이성질체또는 heterotaxia 같은 출생 결함21을발생 합니다.
여기 선물이 전 비켜 실험22,23 물리적 모델링 초기 미 발달 두뇌 개발 하는 동안 기계적인 힘의 특성을 결합 하는 프로토콜. 제시 하는 방법의 목표는 기계적인 힘 두뇌와 초기 개발12동안 비틀림의 정도 영향을 주는 요인에 대 한 책임을 식별 하는입니다. Vitelline 막 (VM) 태아의 등 쪽을 구속 하는 실험 관찰을 바탕으로, 우리는 VM 개발 두뇌의 비틀림을 유도 하는 데 필요한 힘을 제공 한다는 가설. 따라서,이 방법에서는, 두뇌 염력에 효과를 뇌 영역을 커버 하는 VM의 일부를 제거 했습니다. 또한, 액체의 표면 장력을 적용 하는 방법은 VM의 기계적 역할을 확인 하 고 이전 수행 하지 않았다면 뇌 염력에 필요한 힘의 견적을 제공 하 사용 되었다. 배아 morphogenesis 동안 힘을 측정 하는 것은 어려운 작업입니다. 특히, 선구적인 연구 Campàs와 동료24 삽입 된 microdroplets를 사용 하 여 셀룰러 스트레스 척도를 새로운 방법을 개발. 그럼에도 불구 하 고,이 방법 세포 수준, 그러므로 힘에서 조직 또는 유기 체 수준 프로브 적용 되지 않습니다에서 세력을 측정을 수 있었습니다. 이 문서에 소개 된 프로토콜은 부분적으로이 갭을 채우기 위해 개발 되었다.
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Protocol
1입니다. 조직 배양의 준비
- 문화 미디어에 대 한 기반으로 4.5 g/L 포도 당, 나트륨 중 탄산염, 그리고 L-글루타민 0.5 L 병 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM)의 사용 합니다.
- 살 균 층 흐름 후드에서 DMEM의 0.5 l 항생제의 10 mL를 추가 합니다.
- 살 균 피 펫을 사용 하 여 살 균 50 mL 원뿔 튜브 DMEM 항생제 솔루션 50 mL 전송.
- 살 균 후드에 0.5 L 병에서 나머지 DMEM 항생제 솔루션에 병아리 세럼 50 mL를 추가 합니다.
- (라고도 약칭 병아리 문화 미디어 [CCM])-20 ° c.에 50 mL 원뿔 튜브 aliquots에 최종 솔루션 저장
2. 달걀 부 화
- 섬세 한 사용을 70% 에탄올 수정된 특정 병원 체 자유로운 백색 레그 혼 닭 계란을 청소 정리 합니다. 계란 홀더에 세로 방향으로 정렬 합니다.
- 37.5 ° C의 목표 온도 설정 하 고 48-55%에 습도 유지 하는 계란 부 화기를 켭니다. 습도 인큐베이터에 물 적절 한 양의 추가 하 여 제어 됩니다.
- HH11-13, 40-44 h 약을 알을 품 어.
- 계란 살포 / 70% 에탄올으로 청소 하기 전에 약 15-30 분 동안 실내 온도에 냉각 하자.
3. 풀 유리 모 세관
- Micropipette 끌어당기는 사람에는 외부 직경 1.0 m m와 0.5 m m 내부 직경 10 cm 길이의 유리 모 세관 튜브를 탑재 합니다.
- 열을 설정 하 고 각각 750와 400, 매개 변수를 당겨. 얇은 바늘으로 모 세관 튜브를 당겨 단추를 누릅니다.
4. 필터 종이 캐리어 메서드
- 필터 종이에서 직경에서 대략 3 cm의 동그라미를 잘라.
- 사각형 약 1cm를 잘라 2cm 구멍 구멍을 뚫는 사용 하 여 원형에서. 어떤 돌기 제거 또는 날카로운 모서리를 있는지 확인 하십시오.
5. 배아 수확 및 준비
- 바닥에서 계란 균열, 당겨 떨어져 껍질 부드럽게 하 고 신중 하 게 150 m m x 15 mm 페 트리 접시에 내용을 입금. 태아 측이, 그들은 그들을 크래킹 하는 동안 incubated 했다 동일한 방향에서 계란을 계속 합니다.
- 일회용 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 얇은 알 부 민을 제거 합니다.
- 무뚝뚝한 끝난된 집게를 사용 하 여 노 른 자에서 두꺼운 알 부 민을 구분 합니다. 가볍게 무뚝뚝한 끝난된 집게와 노른자위의 상단 된다고 하 여 두꺼운 알 부 민 제거 되었습니다 확인 하십시오.
- 뾰족한 집게를 사용 하 여 센터와 배아, 태아의 긴 축과 링의 긴 축에 일치 하는 필터 종이 반지 장소.
- 가 위로 필터 종이 반지를 둘러싼 노 른 자를.
- 노 른 자 먼저 렸 어디 사이트 쪽으로 비스듬한 방향에서 반지 및 노른자위에서 배아를 당겨.
- 실내 온도 1 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 두 순차 100 mm 요리에 배아를 린스.
- 35 mm 페 트리 접시에 먼저 필터 종이 반지를 놓습니다. 다음 장소 배아 등 쪽을 필터 종이에 이미 35 mm 페 트리 접시에.
- 장소 필터 종이 샌드위치 위에 스테인리스 반지. 태아 손상 되었는지 확인 합니다.
- 각 페 트리 접시를 이전 준비 ccm 3 mL를 추가 합니다.
- 가볍게 태아와 멀리 VM을 필 링, (바로 위에 개) 앞쪽 끝에서 시작 및 notochord (그림 1A)를 진행 상단 가져온된 모 세관 바늘을 감추고 여 각 배아의 VM을 제거 합니다.
- (습도 유지)을 물 포화 섬세 한 작업 잎사귀 줄지어 했다 한 150 mm 접시에 8 35 mm 페 트리 접시를 놓습니다.
- 장소 sealable 비닐 봉지에 150 mm 페 트리 접시 다음 95% O2 , 5% CO2를 이루어져 있는 가스 혼합물으로 가방을 채우십시오.
- 가방을 봉인 하 고 37.5 ° C 인큐베이터에 배치.
- HH15-HH16 (그림 1B)까지 추가 27 h에 대 한 태아를 품 어.
6. 유도 표면 장력
- 인큐베이터에서 배아를 제거 하 고 그들의 이미지를 광학 일관성 단층 촬영 (OCT) 시스템을 사용 하 여. 신경 관 (NT) (그림 2)의 비틀림 각도를 사용 하 여 10 월
- 가벼운 현미경에 배아를 전송 하 고 10 배 확대에서 시각화. 200 microliter 피 펫을 사용 하 여 점진적으로 배양 접시에서 미디어의 0.2 mL를 제거.
- 태아에는 미디어에 어 인터페이스의 효과 관찰 하는 각 간격에서 명시 이미지를 가져가 라.
- 태아에 걸쳐 표면 장력 비틀림 (그림 1C) 유도 될 때까지 미디어를 제거 합니다.
- 배아 배아를 제어 하는 비교에 대 한 최종 비틀림 각도 설정 하려면 다시 한번 OCT 시스템을 사용 하 여 이미지. 참고: 밝은 필드 이미지 해 현미경을 사용 하 여 인수 했다. 광학 일관성 단층 촬영 시스템 연결 된 현미경으로 살아있는 배아의 단면 이미지 스택을 얻으려고 사용 되었다. 이미지 3 x 10 m m x 3 m m3 검색 도메인에서 얻은 다음 이미징 소프트웨어에서 처리. 마지막으로, 실제 모델 이미지는 디지털 싱글 렌즈 리 플렉스 카메라와 함께 찍은 사진.
7. 표면 장력/VM 세력의 물리적 모델링
- 상업적인 모델링 소프트웨어 (그림 3A) HH14-17 사이의 배아 유사한 단순화 된 3D 형상을 개발 합니다.
- 상업적인 3D 컴퓨터 그래픽 소프트웨어에서 3D 형상의 부정적인 형 디자인.
- 3D 프린터 로드 1.75 m m 아크릴로 니트 릴 부 타 디 엔 스틸 렌 필 라 멘 트 3D 사용 하 여 인쇄 stereolithographic (.stl) 형태로 설계 된 금형.
- 캐스팅 금형, 실리콘 고무 탄성 중합체 부품 A와 같은 부분에 B를 혼합 하 고 즉시; 금형에 혼합물을 부 어 12 h (그림 3B)에 대 한 실 온에서 치료 주조 금형을 설정 합니다.
- 비틀림을 시각화 하는 등 측면에서 NT 따라 배아의 실제 모델을 표시 합니다.
- VM 또는 표면 장력 (그림 3D)의 모방을 3 차원 물리 모델에 적용 하는 힘을 복제 하는 coverslip를 사용 합니다.
- 물리적 모델의 측면 길이가 엄밀한 전선의 시리즈를 삽입 합니다. 후는 coverslip 뇌 모델에 외부의 힘을 미치는, 전선 될 위치에 따라 각도에서 기운 다. 각 와이어 (그림 3E)의 원래 길이에 의해 arctan 예상된 길이의 회전 각도 결정 합니다.
8. 심장 루프의 방향 변경
- 3.1 및 3.2 가져온된 모 세관 튜브를 단계를 따릅니다.
- 5.1 5.10 태아 준비를 통해 단계를 따릅니다.
- 집게의 쌍을 사용 하 여 태아 복 부-사이드 업 되도록 필터 종이 플립.
- 가져온된 모 세관 튜브를 사용 하 여 splanchnopleure (SPL) 막에 슬릿 오픈 컷.
- 모 세관 튜브를 사용 하 여 왼쪽을 오른쪽에서 마음을 밀어 기계적인 힘을 발휘 하.
- 5.12 5.15 비틀림의 변화를 관찰 하는 것을 통해의 단계를 따릅니다.
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Representative Results
이 연구에서는 HH11에서 배아의 VM 흉부 굴곡을 앞쪽 끝에서 제거 되었습니다. 배아 10 월 시스템에 의해 몇 군데 있었다. 이 단계에서 뇌 관의 비틀림 하지 (그림 1A)를 시작 했다. HH15-16에는 알을 품 되 고, 후 그들의 VM 제거와 배아 감소 뇌 튜브 비틀림, 약 35도 (그림 1B) 약 90도의 비틀림을 전시 하는 배아를 제어에 비해 전시. 미디어 수준 제거 그들의 vm 배아의 지 느 러 미 끝에 표면 장력을 유발 하는 낮 췄 다, 두뇌 수준 제어 배아 (그림 1C)에 비해 트위스트. 그림 2 는 HH 13 태아 흉부 방향 각도와 두개골 방향 각도 (그림 2A) 표시의 대표 10 월 이미지를 보여준다. 각도 NT (그림 2B, C)의 횡단면의 수직 위치에서 측정 됩니다. 우리의 실험 결과 태아의 등 쪽 끝에 정상적인 뇌 튜브 비틀림 외부 로드에 의해 구동 됩니다이 필수적인 부하 VM20,25제공 제안. 또한, 정상적인 태아 심장 루프가 마음으로 배아에 루프에 밀어 왼쪽 (즉, HH 단계 12 이전), 초기 단계에서 뇌 또한 반면 오른쪽 두뇌 변하기 우 좌 회전 다음 인큐베이션 (그림 3 c 참고 [12])의 또 다른 20 h는 심장의 위치 귀착되 었 다 두뇌 비틀림에서 비대칭 제안.
실험에서 수집한 데이터에서 HH14-17 (그림 3A) VM 없이 병아리 태아의 단순화 된 기하학을 개축 하 사용할 수 있습니다. 이 전산 모델에서 뇌와 오른쪽 반복된 심장 곡선된 봉으로 모델링 했다. Splanchnopleure (SPL) 멤브레인을 나타내는 블록 심장 막대와 접촉 했다. 설계 함으로써이 전산 모델에서 부정적인 형, 곰이 팡이를 인쇄 하 고 주조 금형 실리콘 탄성 중합체와 3D 우리 물리적 모델 (그림 3B-D) 단순된 전산 기하학에서 조작. 물리적 모델의 지 느 러 미 끝에 아래로 누르면 coverslip VM 또는 우리의 실험 (그림 3D)에서 표면 장력에 의해 제공 된 기계 부하를 복제. 모델 전시 유사한 형상 및 뇌 비틀림 실제 태아와 함께, HH14-17 (그림 3E) 교양된 전 비켜 .
그림 1: VM 제거와 배아와 외부 세력의 우 뇌 튜브 비틀림 효과의 형태. (A) Harvested 배아 VM와 HH11에서 제거. (B) 동일한 배아 27 h 게시물 VM 제거 보여주는 감소 염력에 대 한 인 큐베이 팅. (C) 동일한 태아 뇌 염력을, 유체 표면 장력의 응용 프로그램에 따라 받았다. 유사한 단계에서 정상적인 뇌 염력으로 (D) 제어 배아. 스케일 바, (A-C) 1 m m, (D) 1. 이미지는 10 배 확대에 점령 되었다. 허가 함께 참고 [12].에서 적응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: HH13 배아의 OCT 이미지. (A) 그림에 표시 하는 흉부 방향 각도 (a)에서 (b) 그것의 두개골 방향 각도 측정. (B), (C) 위치 (a)와 (b)에서 NT의 단면. 각도 수직 위치에서 측정 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 두뇌 비틀림을 시연 하는 배아의 실제 모델. (A) HH14-17 (B) 실리콘 탄성 중합체는 병아리 태아의 물리적 모델에서 VM 없이 병아리 태아의 단순화 된 기하학. (C) 등 보기 마음으로 모델의 오른쪽에. (D) 우 뇌 비틀림을 보여주기 시작 하는 coverslip로 적용 하는 외부 힘에서 모델의 등 보기. (E) 병아리 태아 교양 전 비켜 을 rightwards HH14에서 비교 시작. 스케일 바, (B-D) 1 cm, (E) 1. 참고 [12].에서 적응 허가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
반면 물리적 현상 morphogenesis26,27,,2829,30, 특정 기계 메커니즘과 함께 기계 조정에에서 중요 한 역할 및 분자 메커니즘, 크게 미개척 남아 있습니다. 그것은 복 부 굴곡와 원시적인 뇌의 우 비틀림 초기 배아 morphogenesis18,31,,3233에 공헌 하는 2 개의 중앙 과정 알려져 34, 하지만 아무 사전 연구 초기 기관 수준 좌우 비대칭 이벤트 중 뇌 비틀림의 기계적인 유래 해결.
프로토콜의 주요 단계 두뇌 비틀림의 기계적 원동력을 식별 하는 VM의 제거 등 추가 확인 결과 액체 표면 장력의 응용 프로그램입니다. 이 기술은 문제 해결는 염력에 상당한 변화를 유도 하는 VM를 제거 하는 초기 단계를 식별 하기 위해 일어났다.
VM의 아래로 수동 힘 될 성장 배아 두뇌 튜브에 대 한 근본적인 기계 경계 표시 했다. 태아의 VM 제거 되었을 때 뇌 이상 정상적인 정도로 왜곡 하지만 액체 레벨을 낮추는 방법으로 표면 장력의 후속 응용 프로그램을 통해 제어 수준 트위스트를 만들 수 있습니다. 주위 온도에 물의 알려진된 표면 장력은 72.01 ± 0.1 mN/m, 접촉 길이가 밀리미터의 순서, 힘 계산 다음 수 있습니다. 따라서 우리는 VM HH 14-17 배아12에 약 10만의 힘을 발휘 추정.
이 프로토콜을 사용 하는 VM 역할 키 기계 배아 뇌 비틀림에서 확인할 수 있었습니다. 이 새로운 프로토콜을 사용 하 여 얻은 결과 VM 배아 morphogenesis 동안 정상적인 뇌 비틀림의 진행을 위한 중요 한 구조는 기하학적 구속 조건 및 기계적 부하의 왜곡에 필요한 공급 제안에 두뇌35. 결과 또한 심장의 위치 뇌 비틀림의 방향을 결정 다는 것을 가리킨다. 개발 하는 동안 태아의 L-R 비대칭 차례로 우 뇌36,,3738,39의 왜곡 드라이브는 심장의 오른쪽 반복 모양으로 이어집니다. 그것은 심장의 위치를 전치 하는 기계적 방법13 다른 연구원 의해 개발 된 화학 방법에서 차이가 morphogenesis에서 역학의 역할을 묘사 더 나은 언급 가치가 있다. 모두, 우리의 결과 병아리 태아에 비틀림 두뇌 morphogenesis 운전 역학의 기본적인 역할을 보여 줍니다.
미래에 프로토콜 함께 어떻게 유전 및 기계적 요인 식별에 적용할 수 있습니다 일반 배아 비틀림 및 이러한 다른 요인 적절 한 morphogenesis 위해 콘서트에서 작동 하는 방법 공개.
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Disclosures
저자는 관심 없음 충돌 선언합니다.
Acknowledgments
Z.C. 인정 다트머스 시작 기금과 브 랑 쿠와 이즈-과학 원정대, ETH 쮜 리 히에 의해 관리에 대 한 사회에서 지원 합니다. 저자는 박사 래리 A. Taber, Benjamen A. Filas, Qiaohang Guo Yunfei 시 유용한 토론에 대 한 뿐만 아니라 익명 검토자 의견 감사합니다. 이 자료는 국립 과학 재단 대학원 연구 친교 그랜트 번호 아래에서 지 원하는 작업 기반 DGE-1313911입니다. 모든 의견, 결과, 결론 또는 권고가이 자료에서 표현은 저자 (들)의 고 반드시 국립 과학 재단의 의견을 반영 하지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized Specific pathogen-free White Leghorn chicken eggs | Charles River | ||
| Optical Coherent Tomography Microscope | Thorlabs | GAN220C1 | |
| Silicone elastomer | Smooth-On, Inc. | EcoFlex 00-50 | |
| Dissecting microscope | Leica | MZ8 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Lonza | 12-604F | |
| Antibiotics | Sigma | P4083 | |
| Chick serum | Sigma | C5405 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-30 | |
| Filter paper | Whatman | 5202-110 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Comsol MultiPhysics | Comsol | ||
| 3D computer graphics software | Rhino 5 | ||
| Microscope attached with OCT | Nikon | FN1 | |
| Digital single-lens reflex camera | EOS | Rebel T3i |
References
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