Summary
Här presenterar vi ett protokoll att införa en uppsättning nya ex-ovo experiment och fysisk modellering tillvägagångssätt för att studera mekanik morfogenes under tidig chick embryonala hjärnan vridning.
Abstract
Embryonal utveckling studeras traditionellt ur Biomolekylär genetik, men den grundläggande betydelsen av mekanik i morfogenes är blir alltmer erkänt. I synnerhet embryonala chick hjärta och hjärna röret, som genomgår drastiska morfologiska förändringar eftersom de utvecklas, är bland de två främsta kandidaterna till studerar betydelsen av fysiska krafter i morfogenes. Progressiv ventrala böjning och höger vridning av tubulär embryonala chick hjärnan hända det tidigaste skedet av orgel-nivå vänster höger asymmetri i chick embryonal utveckling. Det vitelline membranet (VM) begränsar ryggsidan av embryot och har varit inblandade i att ge kraften som behövs att inducera vridning av hjärnans utveckling. Här presenterar vi en kombination av nya ex-ovo experiment och fysisk modellering för att identifiera mekaniken i hjärnan vridning. På Hamburger-Hamilton etapp 11, embryon skördas och odlade ex ovo (Media). VM är därefter bort med ett drog kapillärrör. Genom att kontrollera nivån av vätska och att utsätta embryot till en vätska-air interface, kan media flytande ytspänning användas för att ersätta den mekaniska rollen i VM. Mikrokirurgi experimenten utfördes också för att ändra positionen för hjärtat att hitta den resulterande förändringen i kiralitet av hjärnan vridning. Resultaten från detta protokoll illustrerar de grundläggande rollerna av mekanik i körning morfogenes.
Introduction
Modern utvecklingsbiologi forskning fokuserar till stor del på förståelse utveckling från perspektiv av molekylär genetik1,2,3,4,5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. det är känt att fysikaliska fenomen har en central roll i morfogenes eller generering av biologiska bilda14,15,16,17; specifika mekaniska mekanismer för utveckling kvarstår dock till stor del outforskat. Ventrala fotled och höger vridning av primitiva hjärnan röret efter hamburgare-Hamilton etapp 11 (HH 11)18 är de två huvudsakliga processer som bidrar till embryonal form ändra19,20. I synnerhet fortfarande den fysisk mekanism som underliggande torsional utvecklingen i embryonala hjärnan ofullständigt förstådda.
Den embryonala vridning i chick embryo är bland de tidigaste morphogenetic händelserna av vänster-höger (L-R) asymmetri i utveckling. När processen för L-R asymmetri är oroade, sker fosterskador som situs inversus, isomerieller heterotaxia 21.
Här presenterar vi ett protokoll som kombinerar ex-ovo experiment22,23 med fysisk modellering för att karakterisera mekaniska krafter under tidiga embryonala hjärnans utveckling. Målet med metoden presenteras är att identifiera de mekaniska styrkorna som är ansvarig för hjärnan vridning och de faktorer som påverkar graden av vridning under tidig utveckling12. Baserat på experimentella observationen att det vitelline membranet (VM) begränsar ryggsidan av embryot, hypotesen vi att VM ger kraften som behövs att inducera vridning av hjärnans utveckling. Därför i denna metod bort vi del av den virtuella datorn som täcker området hjärnan att ta reda på effekterna på hjärnan vridning. Dessutom användes metoden att använda flytande ytspänning att bekräfta VM mekaniska roll och ge en uppskattning av den kraft som behövs för hjärnan torsion, som inte hade gjort tidigare. Mäta krafter under embryonala morfogenes är en utmanande uppgift. Noterbart i en banbrytande studie utvecklat Campàs och medarbetare24 en ny metod för att kvantifiera de cellulära påfrestningar med injicerade microdroplets. Denna metod var dock begränsad till mäta krafter på cellnivå, därav ej tillämpligt sond styrkor på vävnad - eller organism-nivå. Det protokoll som presenteras i denna uppsats har utvecklats för att delvis fylla denna lucka.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av vävnadsodling Media
- Använd en 0.5 L flaska av Dulbeccos modifierade örnens Medium (DMEM) med 4,5 g/L glukos, natriumvätekarbonat och L-glutamin som bas för kultur media.
- I en steril LAF, tillsätt 10 mL av antibiotika till 0,5 L av DMEM.
- Med steril pipett över 50 mL av DMEM antibiotika lösningen i en steril 50 mL koniska rör.
- Tillsätt 50 mL chick serum till återstående DMEM antibiotika lösningen i flaskan 0,5 L i sterila huven.
- Lagra den slutliga lösningen (nedan kallade chick kultur media [CCM]) i 50 mL koniska tube alikvoter vid-20 ° C.
2. ägg inkubation
- Användning delikat våtservetter med 70% etanol att rengöra befruktade specifikt patogenfria vit Leghorn kyckling ägg. Ordna ägg i en längsgående orientering på innehavare.
- Aktivera en ägg inkubator att ställa en måltemperaturen 37,5 ° c och bibehålla fuktigheten på 48-55%. Fuktigheten kontrolleras genom att tillsätta en lämplig mängd vatten till inkubatorn.
- Ruva äggen till HH11-13, cirka 40-44 h.
- Låt äggen svalna i rumstemperatur i cirka 15-30 min före sprutning/rengöring med 70% etanol.
3. Dra glas kapillärer
- Montera en 10 cm lång glas kapillärrör med en yttre diameter på 1,0 mm och en inre diameter 0,5 mm på en mikropipett avdragare.
- Ställ in värmen och dra parametrar till 750 och 400, respektive. Tryck på pull för att dra kapillärröret i tunna nålar.
4. filterpapper transportör metod
- Klipp cirklar på ca 3 cm i diameter från filtrerpapper.
- Klipp ut en rektangel ungefär 1 cm 2 cm från cirkeln använder en hålslagare. Se till att ta bort eventuella utskjutande eller skarpa hörn.
5. embryot skörd och beredning
- Knäcka ägg från botten, dra isär skalet försiktigt och noggrant deponera innehållet i en petriskål så 150 x 15 mm. För att säkerställa den embryo Sidan upp, hålla äggen i samma riktning de inkuberades medan sprickbildning dem.
- Ta bort den tunna albumin med en disponibel Pasteur-pipett.
- Separera den tjocka albumin från äggulan med trubbiga slutade pincett. Se till att den tjocka albumin har tagits genom att lätt skrapa upp i äggulan med trubbiga slutade tången.
- Använd spetsig pincett att centrera och placera en filterpapper ring över embryot, matchande längdaxel ringen med den långa axeln av embryot.
- Skära äggulan kring filterpapper ringen med sax.
- Dra ut ringen och embryo av äggulan i sned riktning mot platsen där äggulan sänktes först.
- Skölj embryona två sekventiella 100 mm rätter med rumstemperatur 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Placera en filterpapper ring i en 35 mm petriskål först. Placera sedan embryot ryggsidan upp på filtret papper redan i 35-mm petriskål.
- Placera en rostfritt stål ring ovanpå filterpapper smörgås. Se till att inte skada embryot.
- Tillsätt 3 mL tidigare beredda CCM till varje petriskål.
- Ta bort den virtuella datorn av varje embryo genom lätt skimming drog kapillär nålen över toppen av embryot och peeling VM bort, start från den främre änden (precis ovanför framhjärnan) och fortsätter till ryggsträng (figur 1A).
- Placera åtta 35 mm petriskålar i en 150 mm maträtt som var fodrad med vattenmättat grannlaga uppgift våtservetter (att upprätthålla luftfuktighet).
- Plats 150-mm petriskål i en förslutningsbar plastpåse sedan fylla väskan med en gasblandning som består av 95% O2 och 5% CO2.
- Förslut påsen och placera den i en 37,5 ° C inkubator.
- Inkubera embryon för en ytterligare 27 h tills HH15-HH16 (figur 1B).
6. inducerande ytspänning
- Ta bort embryon från inkubatorn och använda en optisk koherens tomografi (ULT) system till bild dem. Användning okt att bestämma torsional vinkeln av neuralrörsdefekter (NT) (figur 2).
- Överföra embryon till ett ljusmikroskop och visualisera vid 10 X förstoring. Använd 200 mikroliter pipett för att stegvis avlägsna 0,2 mL av media från petriskål.
- Ta brightfield bilder på varje intervall att observera effekterna av gränssnittet media-air på embryot.
- Ta bort media tills ytspänning över embryot inducerar vridning (figur 1 c).
- Bild embryot använder OCT systemet återigen för att upprätta en slutlig torsional vinkel för jämförelse att styra embryon. Obs: Bright-fältet bilderna förvärvades av med dissekera Mikroskop. En optisk koherens tomografi system med en bifogad mikroskopet användes att förvärva tvärsnittsdata bildstaplar levande embryon. Bilder erhålls i en 3 x 10 x 3 mm3 skanning domän, då bearbetas i ett bildhanteringsprogram. Slutligen togs fysisk modell bilder med en digital single-lins reflex kamera.
7. fysisk modellering av ytspänning/VM styrkor
- Utveckla en förenklad 3D-geometri som liknar ett embryo mellan HH14-17 i kommersiella modellering programvara (figur 3A).
- Designa den negativa formen av den 3D-geometrin i kommersiella 3D grafik programvara.
- Använd en 3D-skrivare laddad med 1,75 mm akrylnitril butadien styren filament till 3D skriva ut designade mögel, i stereolithographic (.stl) format.
- Om du vill casta mögel, blanda silikon elastomer gummikomponenter A och B i lika delar och Häll blandningen i formen snabbt; Ställ in gjutning mögel att bota i rumstemperatur i 12 h (figur 3B).
- Markera den fysiska modellen av embryot längs NT på ryggsidan att visualisera vridning.
- Använda ett täckglas för att replikera den kraft som anbringas på 3D fysisk modell som härmar som VM eller ytspänning (figur 3D).
- Infoga en rad styva kablar lika långa vid sidan av den fysiska modellen. Efter täckglaset utövar en extern kraft på hjärnan modell, bli trådarna sned vinkel som beror på var. Bestämma rotationsvinkel av arctan projicerade längd över den ursprungliga längden av varje tråd (figur 3E).
8. förändra riktningen av hjärtat slingan
- Följ stegen i 3.1 och 3.2 att erhålla ett drog kapillärrör.
- Följ anvisningarna i 5.1 genom 5.10 att förbereda embryot.
- Använd ett par pincett för att vända pappersfiltret så att embryot blir ventrala-side-up.
- Använd det drog kapillärröret för att skära öppna en skåra i splanchnopleure (SPL) membran.
- Använd kapillärröret för att utöva en mekanisk kraft att pressa hjärtat från höger till vänster sida.
- Följ stegen i 5.12 genom 5.15 att Observera ändringen i vridning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denna studie VM av embryot på HH11 har tagits bort från den främre änden av bröstkorg fotled. Embryona var fotograferad av ett OCT-system. I detta skede, har vridning av hjärnan rör inte startat (figur 1A). Efter att inkuberas till HH15-16, uppvisade embryon med deras VM bort minskad hjärnan tube torsion, cirka 35 grader (figur 1B) jämfört med styra embryon, som uppvisar vridning av runt 90 grader. När media nivån sänktes att inducera ytspänning i dorsala änden av embryon med deras VMs bort, vridna hjärnor till nivåer jämförbara med kontroll embryon (figur 1 c). Figur 2 visar en representativ OCT bild av ett HH 13 embryo med dess bröstkorg orientering vinkel och kraniala orientering vinkel markerad (figur 2A). Vinklarna mäts från vertikalt tvärsnitt av NT (figur 2B, C) olika. Resultat från våra experiment föreslog att hjärnans normala tube vridning drivs av externa lastning på den dorsala änden av embryot och att denna väsentliga belastning levereras av VM20,25. Dessutom i en normal embryo vänder hjärnan åt höger när hjärtat slingan går till höger sida medan i ett embryo med hjärtat loop skjuts till vänster sida i ett tidigt skede (dvs.före HH steg 12), hjärnan också vänder åt vänster efter en annan 20 h inkubation (figur 3 c i Ref. [12]), vilket tyder på att placera av hjärtat resulterade i asymmetrin i hjärnan vridning.
Uppgifter som samlats in i experiment gjort det möjligt att rekonstruera en förenklad geometri av chick embryot utan VM från HH14-17 (figur 3A). I denna beräkningsmodell, var hjärnan och rätt loopas hjärtat modelleras som böjda spön. Ett block som representerar splanchnopleure (SPL) membranet var kontakt med hjärtat stav. Genom att utforma en negativ mögel från denna beräkningsmodell, tillverkade 3D utskrift detta mögel och gjutning formen med en silikonelastomer, vi en fysisk modell från den förenklade computational geometrin (figur 3B-D). Ett täckglas som pressas nedåt på den dorsala änden av den fysiska modellen replikeras den mekaniska belastning som tillhandahålls av den VM eller ytspänning från våra experiment (figur 3D). Den modell utställningar jämförbara geometri och hjärnan vridning med ett faktiska embryo, odlade ex-ovo till HH14-17 (figur 3E).
Figur 1: morfologi embryo med VM bort och inverkan av yttre krafter på höger hjärnan tube vridning. (A) skördade embryo med VM bort på HH11. (B) samma embryot inkuberas i 27 h post VM borttagning visar reducerad vridning. (C) samma embryot genomgick hjärnan torsion, efter ansökan av flytande ytspänning. (D) kontroll embryo med hjärnans normala vridning ett jämförbara skede. Skala barer, (A-C), (D) 1 mm 1 mm. bilder fångades vid 10 X förstoring. Anpassad från Ref. [12] med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: OCT bilden av ett HH13 embryo. (A) figuren har dess bröstkorg orientering vinkel markerad på (a) och dess kraniala orientering vinkel mätt vid (b). (B), (C) Ett tvärsnitt av NT på positioner (a) och (b). Vinklar mäts från vertikalt läge. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: en fysisk modell av embryot visar hjärnan vridning. (A) en förenklad geometri en chick embryo utan VM på HH14-17 (B) silikon elastomer fysisk modell av en chick embryo. (C) dorsala vy av modellen med hjärtat på höger sida. (D) dorsala vy av modellen under en extern kraft som tillämpas av ett täckglas, börjar visa höger hjärnan vridning. (E) Chick embryo odlade ex-ovo börjat snurra åt höger HH14 för jämförelse. Skala barer, (B-D) 1 cm, (E) 1 mm. anpassas från Ref. [12] med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Medan fysikaliska fenomen spelar en viktig roll i morfogenes26,27,28,29,30, om särskilda mekaniska mekanismer, tillsammans med samordning av mekaniska och molekylära mekanismer, förblir i stort sett outforskat. Det är känt att ventrala fotled och höger vridning av den primitiva hjärnan är två centrala processer som bidrar till tidig embryonal morfogenes18,31,32,33, 34, men inga tidigare studier riktat mekaniska ursprunget till hjärnan torsion, en av de tidigaste orgel-nivå vänster höger asymmetri händelse.
De viktigaste stegen i protokollet omfatta avlägsnande av den virtuella datorn att identifiera mekaniska drivkraften för hjärnan vridning och tillämpningen av flytande ytspänning att ytterligare bekräfta resultaten. Felsökning av denna teknik ägde rum att identifiera det inledande skedet där den virtuella datorn bör tas bort för att framkalla betydande förändringar i vridning.
VM nedåt passiva kraft visade sig vara en grundläggande mekaniska gräns för växande embryonala hjärnan röret. När den virtuella datorn av embryot togs bort, hjärnan längre vändningar i normal utsträckning men kunde göras till twist till kontrollnivå genom den senare tillämpningen av ytspänning genom att sänka vätskenivån. Kända ytspänningen i vatten vid rumstemperatur är 72.01 ± 0,1 mN/m, och kontakt längd är i storleksordningen millimeter, kraft kan sedan beräknas. Vi beräknade därmed VM utövade en styrka av ungefärligt 10 mN på HH 14-17 embryo12.
Användning av detta protokoll, kunde vi bestämma att VM spelar den mekaniska nyckelroll i embryonala hjärnan vridning. De resultat som erhålls med hjälp av detta nya protokoll föreslår att VM är en kritisk struktur för utvecklingen av hjärnans normala vridning under embryonala morfogenes, medan det levererar de geometriska begränsningar och mekanisk belastning behövs för vrider på den hjärnan35. Resultaten indikerade också att placeringen av hjärtat bestämmer riktningen av hjärnan vridning. L-R asymmetri av embryot under utveckling leder till en höger-loopas form av hjärtat, vilket i sin tur driver åt höger vrida hjärnan36,37,38,39. Det är värt att nämna att den mekaniska metoden för undantränger hjärtats position skiljer sig från den kemiska metoden som utvecklats av andra forskare13 och är bättre för avgränsar rollen av mekanik i morfogenes. Sammantaget illustrerar våra resultat den grundläggande rollen i mekanik i körning torsional hjärnan morfogenes i chick embryot.
I framtiden, protokollet kan tillämpas för att identifiera hur genetiska och mekaniska faktorer tillsammans regelbunden embryonala vridning och avslöja hur dessa olika faktorer fungerar i samförstånd för att säkerställa lämpliga morfogenes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Z.C. erkänner stöd från Dartmouth start fund och Branco Weiss - Society for Science gemenskap, administreras av ETH Zürich. Författarna tackar Drs. Larry A. Taber, Benjamen A. Filas, Qiaohang Guo, Yunfei Shi för bra diskussioner, samt anonyma granskare för kommentarer. Detta material bygger på arbete stöds av National Science Foundation Graduate Research Fellowship under Grant nr DGE-1313911. Någon åsikt, resultaten och slutsatserna eller rekommendationerna uttryckt i detta material är författarnas (s) och återspeglar inte nödvändigtvis åsikter National Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized Specific pathogen-free White Leghorn chicken eggs | Charles River | ||
| Optical Coherent Tomography Microscope | Thorlabs | GAN220C1 | |
| Silicone elastomer | Smooth-On, Inc. | EcoFlex 00-50 | |
| Dissecting microscope | Leica | MZ8 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Lonza | 12-604F | |
| Antibiotics | Sigma | P4083 | |
| Chick serum | Sigma | C5405 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Model P-30 | |
| Filter paper | Whatman | 5202-110 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Comsol MultiPhysics | Comsol | ||
| 3D computer graphics software | Rhino 5 | ||
| Microscope attached with OCT | Nikon | FN1 | |
| Digital single-lens reflex camera | EOS | Rebel T3i |
References
- Taber, L. A. Biomechanics of Growth, Remodeling, and Morphogenesis. Appl. Mech. Rev. 48, 487-545 (1995).
- Wyczalkowski, M. A., Chen, Z., Filas, B. A., Varner, V. D., Taber, L. A. Computational models for mechanics of morphogenesis. Birth Defects Research Part C - Embryo Today: Reviews. 96, 132-152 (2012).
- Savin, T., et al. On the growth and form of the gut. Nature. 476, 57-62 (2011).
- Gjorevski, N., Nelson, C. M. The mechanics of development: Models and methods for tissue morphogenesis. Birth Defects Research Part C - Embryo Today: Reviews. 90, 193-202 (2010).
- Shyer, A. E., et al. Villification: how the gut gets its villi. Science. 342, 212-218 (2013).
- Ambrosi, D., et al. Perspectives on biological growth and remodeling. Journal of the Mechanics and Physics of Solids. 59, 863-883 (2011).
- Chen, Z., Majidi, C., Srolovitz, D. J., Haataja, M. Tunable helical ribbons. Appl. Phys. Lett. 98, (2011).
- Gerbode, S. J., Puzey, J. R., McCormick, A. G., Mahadevan, L. How the cucumber tendril coils and overwinds. Science. 337, 1087-1091 (2012).
- Armon, S., Efrati, E., Kupferman, R., Sharon, E. Geometry and mechanics in the opening of chiral seed pods. Science. 333, 1726-1730 (2011).
- Filas, B. A., et al. A potential role for differential contractility in early brain development and evolution. Biomech. Model. Mechanobiol. 11, 1251-1262 (2012).
- Xu, G., et al. Axons pull on the brain, but tension does not drive cortical folding. J. Biomech. Eng. 132, 71013 (2010).
- Chen, Z., Guo, Q., Dai, E., Forsch, N., Taber, L. A. How the embryonic chick brain twists. J. R. Soc. Interface. 13, (2016).
- Manca, A., et al. Nerve growth factor regulates axial rotation during early stages of chick embryo development. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 2009-2014 (2012).
- Shi, Y., Yao, J., Xu, G., Taber, L. a Bending of the looping heart: differential growth revisited. J. Biomech. Eng. 136, 1-15 (2014).
- Shi, Y., et al. Bending and twisting the embryonic heart: A computational model for c-looping based on realistic geometry. Front. Physiol. 5, (2014).
- Taber, L. A. Morphomechanics: Transforming tubes into organs. Current Opinion in Genetics and Development. 27, 7-13 (2014).
- Hosseini, H. S., Beebe, D. C., Taber, L. A. Mechanical effects of the surface ectoderm on optic vesicle morphogenesis in the chick embryo. J. Biomech. 47, 3837-3846 (2014).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Dev. Dyn. 88, 49-92 (1951).
- Shi, Y., Varner, V. D., Taber, L. a Why is cytoskeletal contraction required for cardiac fusion before but not after looping begins? Phys. Biol. 12, 16012 (2015).
- Garcia, K. E., Okamoto, R. J., Bayly, P. V., Taber, L. A. Contraction and stress-dependent growth shape the forebrain of the early chicken embryo. J. Mech. Behav. Biomed. Mater. 65, 383-397 (2017).
- Faisst, A. M., Alvarez-Bolado, G., Treichel, D., Gruss, P. Rotatin is a novel gene required for axial rotation and left-right specification in mouse embryos. Mech. Dev. 113, 15-28 (2002).
- Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. a, Butcher, J. T. An ex-ovo chicken embryo culture system suitable for imaging and microsurgery applications. J. Vis. Exp. (44), (2010).
- Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Dev. Dyn. 220, 284-289 (2001).
- Campàs, O., et al. Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues. Nat. Methods. 11, 183-189 (2014).
- Schierenberg, E., Junkersdorf, B. The role of eggshell and underlying vitelline membrane for normal pattern formation in the early C. elegans embryo. Roux's Arch. Dev. Biol. 202, 10-16 (1992).
- Chuai, M., Weijer, C. J. The Mechanisms Underlying Primitive Streak Formation in the Chick Embryo. Current Topics in Developmental Biology. 81, 135-156 (2008).
- Voronov, D. A., Alford, P. W., Xu, G., Taber, L. A. The role of mechanical forces in dextral rotation during cardiac looping in the chick embryo. Dev. Biol. 272, 339-350 (2004).
- Raya, A., Izpisua Belmonte, J. C. Unveiling the establishment of left-right asymmetry in the chick embryo. Mechanisms of Development. 121, 1043-1054 (2004).
- Voronov, D. A., Taber, L. A. Cardiac looping in experimental conditions: Effects of extraembryonic forces. Dev. Dyn. 224, 413-421 (2002).
- Chen, Z., Huang, G., Trase, I., Han, X., Mei, Y. Mechanical Self-Assembly of a Strain-Engineered Flexible Layer: Wrinkling, Rolling, and Twisting. Phys. Rev. Appl. 5, (2016).
- Manner, J., Seidl, W., Steding, G. Formation of the cervical flexure: an experimental study on chick embryos. Acta Anat. (Basel). 152, 1-10 (1995).
- Ware, M., Schubert, F. R. Development of the early axon scaffold in the rostral brain of the chick embryo. J. Anat. 219, 203-216 (2011).
- Ramasubramanian, A., et al. On the role of intrinsic and extrinsic forces in early cardiac S-looping. Dev. Dyn. 242, 801-816 (2013).
- Hoyle, C., Brown, N. a, Wolpert, L. Development of left/right handedness in the chick heart. Development. 115, 1071-1078 (1992).
- Nerurkar, N. L., Ramasubramanian, A., Taber, L. A. Morphogenetic adaptation of the looping embryonic heart to altered mechanical loads. Dev. Dyn. 235, 1822-1829 (2006).
- Levin, M. Left-right asymmetry and the chick embryo. Semin. Cell Dev. Biol. 9, 67-76 (1998).
- Roebroek, A. J., et al. Failure of ventral closure and axial rotation in embryos lacking the proprotein convertase Furin. Development. 125, 4863-4876 (1998).
- Peebles, D. M., et al. Magnetic resonance proton spectroscopy and diffusion weighted imaging of chick embryo brain in ovo. Dev. Brain Res. 141, 101-107 (2003).
- Zhu, L., et al. Cerberus regulates left-right asymmetry of the embryonic head and heart. Curr. Biol. 9, 931-938 (1999).
