Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול ללמוד התנהגות גידול הצמח, במיוחד פנוטיפים באופן לשחזור. אנו מראים כיצד לספק משתנה ועל הזמן אותו יציבים לתנאי תאורה. ניתוחים נכונה תלויה מספיקים מדגם והערכות סטטיסטיות בתוקף.
Abstract
צמח ביולוגים בדרך כלל צריכים לצפות את ההתנהגות גידול הגזע שלהם שבחרת. לשם כך, השתילים קבוע סביבתית ויציבות לתנאי תאורה, אשר רצוי משתנה בכמות ובאיכות כך מחקרים תחת setups שונים יכול להתבצע. דרישות אלה הם נפגשו על ידי התא-קיטים הכוללים אור האורות (דיודה) פולטות, אשר – בניגוד נורות ניאון – ניתן להגדיר את אורכי גל שונים. נוריות הם אנרגיה שימור ולשדר כמעט אין חום בכלל בעוצמות אור, אשר לעתים קרובות מהווה בעיה עם מקורות אור אחרים. פרוטוקול הציג מספק הדרכה שלב אחר שלב כיצד לתכנת תא אקלימיים מצויד עם נורות LED משתנה, כמו גם המתאר מספר גישות עבור ניתוח עומק של פנוטיפים צמיחה. בהתאם הסידור ניסיוני מאפיינים שונים של הצמחים הגדלים ניתן להקליט ולצפות במעשיהם מנותח. כאן נתאר כיצד לקבוע משקל טריים, באזור עלה, פעילות פוטוסינתטיים, צפיפות stomatal. נדגים זאת על מנת לקבל נתונים אמינים ולהסיק מסקנות בתוקף שחובה להשתמש מספר מספיק של אנשים עבור הערכות סטטיסטיות. לוקח מעט מדי צמחים לסוג כזה של תוצאות ניתוח שגיאות סטטיסטית גבוהה וכתוצאה מכך בפחות פירושים ברורה של הנתונים.
Introduction
תודרנית לבנה כבר אורגניזם מודל עבור חוקרי הצמחים של עידן מולקולרית במשך יותר משני עשורים. מספר מאפיינים להפוך נציג קטן זה של משפחת כרוב מועמדת אידיאלית ללימודי גנטית ומולקולרית: יש לו גנום קטן יחסית עם רק חמישה כרומוזומים (בהשוואה למשל טבק tabacum עם 24 כרומוזומים) ו הגנום שלו היה רציף לחלוטין בשנת 20001. לבנה א יכול להיות בקלות מהונדסים גנטית על-ידי זיהום Agrobacterium 2 , והוא נוטה? אפילו האחרון גנטי בכלים כגון CRISPR/Cas3. אף קטן, מחזור הצמיחה הוא מהיר מספיק כדי להפוך ריאלי ביוכימיות ניסויים שבו נדרשת כמות גבוהה יותר של חומר. הצמחים גדלים על פלטות אגר או על הקרקע, יכול אפילו להיות מעובד כמו תרבויות נוזלי4. תודרנית ניתן לגדל בתוך הארונות climatically מבוקרת, למשל של פרסיבל, מיכשור או בחממות. כדי שניתן יהיה להשוות התנהגות גדילה ולנתח פנוטיפים של מוטציות חיוני לספק הדירים בבית באותו זמן גמיש צמיחה תנאים5. בהתאם הבעיה המדעית כדי להתייחס אחד ייתכן שיהיה עליך טמפרטורות שונות, לתנאי תאורה קבועה, עוצמות אור מגוונות או איכויות שונות אור בטמפרטורה זהה. אור הוא פרמטר קריטי מאוד לצמיחה צמח ולמד את השפעתה הוא לעיתים קרובות גישות מגוונות6. כדי להבטיח הפארמצבטית comparability של נתונים המתקבלים זה הכרחי להבטיח פלט יציב ליישם את אותו סוג של מקורות אור.
במקורות אור חממות, מיכשור מורכב אדי נתרן או מנורות פלורסנט, לקדם את גדילת הצמח מספק, אך יש מספר חסרונות. ראשית, הם גיל לאורך זמן אשר משנה את הפלט ספקטרלי לא רק בעוצמתם אלא האיכות (תצפיות עצמו). עם זאת, רק עוצמת בדרך כלל נעשה באופן רציף כך בשינוי איכות האור עלול להבחין בהן אך עדיין יש תופעות משמעותיות. שנית, שני סוגי מנורות לייצר חום בעוצמות אור גבוהות יותר, שהוא עצמו יש השפעה פיזיולוגית עמוקה על צימוח, אולי להסוות כל אפקט תלויות אור. שלישית, הפלט ספקטרלי של מקורות אור אלה הוא מחזוריים, בניגוד גמור את אור שמש טבעי7. יש כבר להתגבר על כל החסרונות האלה במקרה של נוריות)8,9,10,11. יש להם חיים ארוכים עם כמעט בלי שינוי פליטה, לא לייצר פסולת חום בכלל בעוצמות אור גבוהות מאוד והם מאוד גמיש בנוגע תפוקתן ספקטרלי.
כאן אנחנו מדגימים כיצד להגדיר תא אקלימיים ובו נפרד נוריות ה-LED אדום, כחול של אור לבן ופעל פרמטרים שונים של צימוח לאורך זמן. אנחנו מודדים משקל טריים, באזור עלה, צפיפות הפיוניות וביצועים פוטוסינתטיים. במקביל, נדגים את חשיבות הגדרת כהלכה הערכות סטטיסטיות.
Protocol
פרוטוקול זה מכיל מספר דוגמאות כיצד לנתח את התנהגות צמיחה של צמחים לבנה א .
1. הכנה
- לפני שמתחילים, נכין תוכנית זהיר על כמה צמחים יהיה צורך לעשות ניתוח סטטיסטי אמין הניסויים ולאחר מכן להכין את כמויות מתאימות של סירים.
הערה: אפשר תמיד לאפשרות. זרעים מסוימים שאולי לא לנבוט. - השתמש תא אקלים עם רמות שונות של LED לתכנות בנפרד כדי להשוות צימוח תחת לתנאי הסביבה הכללית אותו (טבלת חומרים).
2. הצמח צמיחה ולהגדרה של אורות LED
- הכינו את המספר המתאים (בהתאם לתנאים שונים ו/או מוטציות כדי להיות מנותח) של סירי 6 x 7 ס"מ עם אדמה, לשתול זרע אחד בכל אחד מהם.
הערה: במקרה זה, צמחים 36 לכל התנאים נזרעו. - Vernalize במשך יומיים ב 4 º C.
- הגדר לחות אוויר יחסית 65% ואת הטמפרטורה כדי 22 ° C/16 ° C יום 16 h / 8 שעות בלילה מחזור. להתאים את האור של כל הרמות כדי עוצמה של 200 מיקרומטר/cm2/s1. לעשות זאת על-ידי הזנת הערכים המתאימים לתוכנית באמצעות מסך המגע בחלקו הקדמי של החדר אקלימיים. כדי להשוות בין ארבע תכונות שונות הגדר הנוריות הפרמטרים הבאים כאמור בטבלה 1.
| Identifyier | 395 ננומטר [%] | 440 ננומטר [%] | 3 K [%] | 660 ננומטר [%] | 770 ננומטר [%] |
| "אור השמש" | 100 | 11 | 100 | 15 | 100 |
| אדום וכחול (RB) | 100 | 15 | 25 | 10 | 100 |
| כחול (B) | 100 | 15 | 25 | 2 | 25 |
| Red (R) | 90 | 2 | 25 | 10 | 100 |
טבלה 1: הרכב של עוצמות האור הנפלטים נוריות
- נטר ספקטרלי הפלט ללא הרף, למשל באמצעות ספקטרומטר מכוילת מוכללים.
- מקום הצמחים בבית הבליעה אקלימיים ברבדים שונים ולשמור אותם מכוסה עם גג שקוף עד פסיגי הזרע מפותח גלויים. ודא כי הצמחים הם מספיק להשקות.
- הצג ואת המסמך לפי העין, שאנשים לעיתים קרובות בהתאם, תלוי כמה מהר הצמחים גדלים צמחים בתנאים שבחרת, למשל כל יומיים. הקפד להשתמש חצובה למצלמה כדי להבטיח את המרחק שווה בין המצלמה לבין אובייקטים עבור כל התמונות ולאפשר ובכך השוואות. השתמש בר בקנה מידה בעת הצורך.
הערה: את המונח DAS (ימים לאחר הזריעה) מתייחס נטיעת הזרעים לרבות vernalization בפועל.
3. קביעת התשואה PSII
- השתמש fluorimeter של הדופק-מאופנן. להגדיר את ראש המצלמה המרחק המתאים מצמח כך הרוזטה המלא ניתן לראות על החלון בשידור חי.
- עם הפעלת התוכנה יופיע חלון "יחידה נבחרת". לתקתק "מיני" ולאחר מכן "אישור." לבחור צבע "כחול" בחלון הנפתח הבא. לחץ על "אישור."
הערה: זריחה מאופנן הדופק מדידת אור אוטומטית פעילה. על הצג מופיע החלון מציג את פרמטר קרינה פלואורסצנטית מטרים. עכשיו ניתן לראות צמח תחת המצלמה כתמונה כתום. - כדי למקד את התמונה ו/או לבחור אזורים ספציפיים של הצמח, לעבור לגור וידאו על-ידי מתקתקת בתיבת "שידור חי" ולהפוך את הטבעת ההתאמה של העדשה אובייקטיבי. להפסיק את חלון וידאו חי באמצעות לחיצה על התיבה ' יציאה ' בפינה הימנית העליונה.
- כדי למדוד פרמטרים פוטוסינתטיים, להגדיר אזור התעניינות (AOI). השתמש את הגדרת ברירת המחדל עבור זה, שזה מעגל אשר באופן אוטומטי מופיעה במרכז המסך. התיבה האדומה לצד זה מייצג את הערך מטרים בממוצע של כל הפיקסלים בטווח AOI. הגדר את AOI המתאים על-ידי בחירה בתיבת AOI בלוח הנכון, בו זמינים בצורות שונות. לחץ על "הוסף" בכרטיסיה AOI ומקם את המעגל בתוך אזור עלה. חזור על חמש פעמים לכל עלה.
- לשמור על ההגדרות (הכרטיסיה מימין) ערכי ברירת המחדל שסיפק היצרן (טבלה 2).
| Meas. אור | Int. | תדירות | |
| 1 | 1 | ||
| לפעול. אור | Int. | רוחב | |
| 8 | 0 | ||
| תיקוני תמונה | מיני | ||
| שינוי תמונה | סוללה | ||
| 16.7V | |||
| רווח | 5 | ||
| ריסון | 1 | ||
| הדופק ש' | Int. | לא | מרווח זמן s |
| 8 | 1 | 30 | |
| לאט. אינדוקציה | עיכוב s | שעון s | משך s |
| 40 | 20 | 315 | |
| Absortivity | רווח אדום | עוצמת אדום | ניר בעוצמה |
| 340 | 25 | 13 | |
| התצוגה | צבע | ||
| נ. ב מגבלת | 50 | ||
| מאיזוניאציד. הפניה למעורר AOI | 1 | ||
| Fm פקטור (טיק) | 1,030 |
טבלה 2: הגדרות ברירת מחדל עבור המדידות פאם כפי שנמסרו על ידי היצרן.
- החל הבזק אור saturating לבצע מדידה של פרמטרים פוטוסינתטיים על-ידי פלורסנט שכבתה ניתוח (רוויה פעימה). לפני כן, לקבוע מקדמי quenching על ידי מדידת קרינה פלואורסצנטית מינימלי, מקסימלי התשואה של צמח dark-adapted. לשם כך, מקם הצמח בחושך (למשל , במגירה או תיבת כהה) למשך כמה דקות. ואז למקם את המפעל מתחת לראש מצלמה, סמן את התיבות, מדידת ML (מדידת אור), בשורה מתחת התמונה לבחור "Fv/Fm" על ידי מדידת הזמן למעגל ולחץ Fo, Fm בחלק התחתון של המסך.
הערה: Fo/Fm מייצג את התשואה PSII של צמח dark-adapted. לכן הערך שאליו מנורמל המדידה לאחר החלת אור. המדידה Fo/Fm הנוכחי יישאר עד שיא חדש מופעל. כל F ו- Fm' ערכים נקבעים על-ידי פולסים רוויה קשורים Fo/Fm והם הפרמטרים שכבתה מחושבים בהתאם. - למצוא את התוצאות הללו בכרטיסיה דוח ולבדוק כל תיבות בצד ימין הרלוונטיים הניסוי (למשל. Y(II), qP, qN, וכו ').
- לייצא את התוצאות ניתוח תוכנה למשל. ב- excel על-ידי לחיצה על לחצן ייצוא בפינה השמאלית העליונה ושמור תחת שם הקובץ המתאים. צור AOIs לפחות חמישה לכל עלה ולמדוד כמה עלים של צמח אותו (לא לשכוח זמן קצר כהה להתאים את הצמח שוב אחרי כל מדידה), כמו גם צמחים שונים ממצב אחד, אשר לאחר מכן ניתן מבחינה סטטיסטית להעריך.
- לשם ניתוח סטטיסטי ליצור סטיות תקן וערכי רשע מתוך כל AOIs, לפחות שלושה צמחים עצמאי עבור כל הזמן נקודות/תנאים ולבצע מבחן t של סטודנט כדי להעריך אם הנתונים הם משמעותיים12. נתונים מוערכים כמו שונה באופן משמעותי כאשר ערכי p-להלן 0.05.
4. קביעת צפיפות הפיוניות
- רוזט מורחבת במלואה עלים לאסוף שלושה מצמחים בודדים שלוש לכל תנאי לתוך 70% אתנול בצלוחית זכוכית, כדי לחלץ כלורופיל. דגירה של הממס הזה ללילה בטמפרטורת החדר או חנות ב 4 º C.
- אישור מלא של פיגמנטים, דגירה בפתרון כלורין (קלוראל-הידרייט: מים: גליצרול = 8: 2: 1 w/v/w) עד העלים נראים לבנים לחלוטין.
- קח התערבות דיפרנציאלית מיקרוסקופ (DIC) תמונות של פני השטח abaxial-40 X הגדלה. לספור הפיוניות בתוך שדה הראייה, לשער בעזרת סרגל קנה מידה כדי הפיוניות לכל mm ². חזור על שהליך זה לפחות 4 משאיר לכל התנאים. לבצע ניתוח סטטיסטי על-ידי חישוב את הערך הממוצע עבור כל העלים של תנאי אחד, מפני זה לחשב את השגיאה מרושע.
5. קביעת משקל טריים
- הסר את כל העלים כולל פטוטרות מ רוזטות מצמחים שש לכל תנאי עם סכין גילוח. שוקלים את כל העלים באופן מיידי, נושא את הנתונים ניתוחים סטטיסטיים כפי שתואר לעיל.
6. קביעת באזור עלה רוזט
- השתמש תמונות מתוך שמונה צמחים לכל תנאי כדי לנתח את האזור עלה בצורה גרפית. לשלב את התמונות על תנאי אחד בתמונה אחת ושמור *.jpeg או * .tiff.
- להוריד את התוכנה המתאימה (טבלת חומרים).
הערה: אפשרי, כמובן, ליישם את כל תוכנית אחרת יכולים לבצע משימה זו. - פתח את קובץ תמונה. בחר את הכלי "חופש הבחירה". להקיף עלים כולל פטוטרות של רוזט אחד. לחץ על "נתח - הגדרת המידות" לבדוק "אזור", "מין & מקסימום ערך האפור," "צפיפות משולב", "ערך אפור רשע." בחר עשרוני מתאים מקומות, הטוב ביותר הוא שניים או שלושה ולחץ על "ok".
- כדי לקבל מ מ2 במקום פיקסלים להשתמש בפקודה "לקבוע קנה מידה". החל בכלי בחירה בקו ישר כדי לבצע בחירה הקו המתאים לקוטר לעזוב כי הוא קל לחשב מהבר קנה המידה של התמונות, ולאחר מכן פתח את תיבת הדו-שיח ' קבע קנה מידה ' והזן הזה מרחק מוגדר, יחידת מרחק ידוע, למשל מדידה. ואז לחזור "לנתח" ולחץ על "מידה".
- חלון חדש מופיע רשאי "תוצאות" אשר מכיל את הנתונים הרלוונטיים עבור הרוזטה הנוכחי. חזור על הליך זה עם כל הצמחים בתמונה, לאתחל את אזור מידות עבור כל צמח חדש עם Ctrl + M.
הערה: צמחים קטנים יותר עם עלים שאינם חופפים "הכלי מטה" יכול לשמש כדי להפוך את התהליך לקל ומהיר. ברגע העלים מתחילים לחפות אחד את השני, כלי זה אינו נותן תוצאות אמינות. - לחלופין, לחתוך את כל העלים ומקם אותם בדרך כי תמונה סקירה ניתן לקחת ולאחר מכן להשתמש בכלי מטה. קח בחשבון כי בעת שימוש בשיטה זו, יותר צמחים נדרשים.
- בחרו 'קובץ'-"שמירה בשם" בחלון תוצאות ולהפיק את שם הקובץ המתאים ומיקום ספריה במחשב. הקובץ יישמר באופן אוטומטי בתבנית של Excel.
7. הכנת ה-RNA
- הקציר 3 דגימות צמחים בודדים עשר עבור כל תנאי. תמצית הכולל RNA באמצעות צמח RNA ערכת חילוץ בהתאם להוראות היצרן. לקבוע ריכוז, טוהר ושלמות של RNA באמצעות של bioanalyzer. RNA ואז ניתן עבור יישומי הזרם כגון ניתוח ביטוי לרביעיית-PCR או הגן על ידי למשל RNASeq13.
Representative Results
התבוננות וניתוח של צימוח במיוחד פנוטיפים של צמחים מוטנטים להסתמך על תנאים סביבתיים לשחזור ויציבה. אלה ניתן לספק מיכשור. כמות אור, ובעיקר איכות תלויה באופן ביקורתי על מקור האור מועסקים, אשר במחקר זה סופק על ידי נורות LED.
איור 1 מראה דוגמה של תא אקלימיים מצויד לוחות LED. איור 1A מציג צילום מסך של לוח הבקרה היכן ניתן להתאים כל תנאי אקלים ואור. בתוך 24 שעות ניתן להגדיר עשרים טווחי זמן שונים. בדוגמה זו, יום ארוך תנאים עם h אור/8 16 כהה כבר מתוכנת. החדר הזה כולל ארבע רמות אשר ניתן לתכנת בנפרד, כך שניתן יהיה לחקור צימוח-ארבע הגדרות אור שונות תחת בדיוק באותם תנאים סביבתיים. העליון מצד שמאל רמת מוגדר של פלט ספקטרלי לחקות את אור השמש ככל האפשר מבחינה טכנית, מייצגת נכון ברמה העליונה גבוהות אדום (660 ננומטר), אור כחול (440 ננומטר) עם הקטינה אור לבן (3K). הקומה התחתונה השמאלית הוגדר הרמה הנכונה התחתון בעיקר לאור אדום ואור כחול מוגברות. איור 1B מדגים הנוריות-הגדרות שונות כמו סקירה (לוח האמצעי) ותוספות של בהתאמה הזום (לוחות קטנים החיצוני). ההבדל בין תכונות ניתן לראות בקלות על-ידי העין.
ספקטרומטר מובנה כל הזמן מודד, מפקחת, ומתאים את הפלט ספקטרלי. איור 2 מציג את הספקטרום מהקומה העליונה השמאלית 1.1, אשר נולד כדי לחקות את אור השמש. החלק של UV ואור כחול לעומת נורת פלורסנט רגיל הוא הרבה יותר גבוה7.
איור 3 דוגמה לבנה א צמחים מתוך כל ארבעה תנאים 10, 13, ו- 17 ימים, בהתאמה, לאחר הזריעה מתואר. כל הצמחים צולמו ממרחק זהה על ידי הרכבה את המצלמה על חצובה. סרגל קנה מידה מייצג 1 ס מ. לאחר 10 ימים, אין הרבה הבדל הגודל או הצבע מבחינים, אך לאחר 17 ימים גידול מהיר יותר תחת אור אדום ברור. בנוסף, ניתוח חזותי זה בוצעו מספר ניתוחים פיזיולוגיים.
איור 4 עוקב אחר השלבים השונים של פאם מידות, אשר מנתח למשל פוטוסינתטיים קיבולת. באיור 4A צילום מסך של הווידאו החי מוצג, וזו ההגדרה שהבאת את הצמח להתמקד כדי להבטיח איכות אופטימלית המידות. במקום להתמקד הצמח כולו, ניתן לבחור גם עלה בודד כדי לנתח. איור 4B מדגים את התשואה פלורסנט הנוכחי של צמח dark-adapted מטרים לפני המדידה בפועל הופעל. במקרה זה, נבחרו חמישה תחומי עניין (AOIs) מעגלית. המספרים בתיבות אדום ליד כל AOI ישירות נותן תוצאה מספרית, אשר יכולים להישמר בצורה של טבלה. ליזום מדידה של פרמטרים פוטוסינתטיים Fo, Fm צריכה לקבוע. צילום מסך של מטרים אחרי עושה את זה מתואר ב- 4C איור. שים לב כי עכשיו הכפתור "פואו, Fm" אינו פעיל יותר. כדי להפעיל מידה חדשה, "שיא חדש" צריך ללחיצה למחוק נירמול הקודם. לבסוף, איור 4D מציג את התשואה הקוונטית יעילה PSII Y(II) לאחר שנתן דופק אור saturating ("שבת-פעימה"). כימות הנתונים למופת מוצג באיור5. הצמחים גדלו תחת שמש-200 מיקרומטר/cm2/s1 (איור 5A) נותחו 12, 21, 28 ימים לאחר הזריעה, בהתאמה. הנתונים שלנו להפגין PSII תשואה גבוה משמעותית העלים מן הצמחים גדלו במשך שלושה שבועות מ- 12 ימים. ההבדל בין 28 ל 12 יום הוא עדיין משמעותי, אבל ערך p הוא גבוה יותר. ב- איור 4B, הושוו PSII היבול של הצמחים גדלו לעוד שבועיים תכונות שונות. מעניין, צמיחה קבוע תחת אור המכיל חלק גבוהה של אור כחול מובילה יבול גדול יותר באופן משמעותי של PSII. אפקט דומה נצפתה בצמחים מעובדים תחת אור אדום מועשר, אבל העלייה היה נמוך יותר.
תכונות שונות הוצגו אפקט הפיוניות פיתוח14. לכן, צפיפות stomatal נחקר. איור 6 מדגים איך נראה עלה לאחר החילוץ פיגמנט. תאים באפידרמיס בודדים יכול להיות טוב מכובד, פיונית ניתן לספור בקלות. באיור, הפיוניות בודדים מסומנים באמצעות כוכבית. נתונים מפורטים על הצפיפות stomatal של צמחים מן ההגדרות אור שונים ניתן למצוא במקומות אחרים9.
בנוסף בדיקה ויזואלית (איור 3) המשקל טרי מספק מידה טובה של התקדמות צמיחה. בדוגמה זו נשקלו עלים מן הצמחים גדלו תחת "שמש" לאחר 8, 10 ו- 12 ימים לאחר הזריעה, בהתאמה. הערכות סטטיסטיות של נתונים אלה ניתן לראות באיור 7. כצפוי, המשקל טריים עולה עם הזמן.
מלבד טרי במשקל, האזור עלה הוא מדד טוב לצמיחה. . הנה, התפתחות הצמח עקבו מ- 10, 13, 17 ימים לאחר הזריעה (איור 8A). לפחות שישה צמחים בודדים הוערכו באופן שגרתי כדי לקבל נתונים סטטיסטיים אמין. כדי להדגים את חשיבותה של גודל דגימה גבוהים, מחושב אחוז השגיאה של הערך מרושע, מבדיקת צמחים שני ושש, בהתאמה, (איור 8 ב'). משמעות הדבר היא שהאחוז של סטיית התקן לגבי הערך הממוצע היה נחוש. . זה מאוד ברור כי במקרה של גודל מדגם קטן השגיאה היא 5-10% גבוה יותר מאשר במקרה של גודל דגימה גבוהים יותר. על ידי הגדלת מספר צמחים מוערכים, השגיאה ניתן למזער, מה שהופך את הפרשנות של נתונים הרבה יותר ברור.
איור 1: תכונות שונות הינם מסופקים על ידי נוריות. A) מסך בלוח הבקרה של התא LED. אורך יום מוגדר כ- 16 h (בפינה הימנית העליונה), עוצמת האור מוגדר כ- 200 µmol ס מ-2 s-1. איכות האור שונה על כל ארבע רמות: 1.1 מייצג קשת כמו הדומה לאור השמש כמו טכנית אפשרי, 1.2 מייצג אחוז גבוה של אדום וכחול אורכי גל (רובידיום) אור, 2.1 מוגדר בעיקר כדי כחול (B), 2.2 מייצג בעיקר אדום אור (R). B) הלוח האמצעי מציג סקירה של כל הרמות; הלוחות החיצוניים מציגים רמות הפרט a זום גבוה יותר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: אורך הגל ספקטרום מהגדרות אור השמש- צלם צילום מסך ספקטרומטר מובנה בבית הבליעה LED מוצג, שהוצב ברמת 1.1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: מפעל פיתוח מעל לשבוע. נציג לבנה א צמחים מתוך כל ארבעה תנאים אור 10, 13, 17 DAS. צמחים צולמו עם מצלמת רפלקס דיגיטלית על גבי חצובה. סרגל קנה מידה מייצג 1 ס מ לכל התמונות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: צילומי מסך מצעדי נציג של פאם מדידות של צמחים לבנה א . A) צילום מסך מתוך תצוגת "וידאו חי" שבו ניתן לכוונן את המוקד תמונה. B) התשואה פלורסצנטיות הנוכחי מטרים לפני היישום של כל להבזקי האור. C) התשואה פלורסצנטיות הנוכחי מטרים לאחר שקיעת Fo/Fm. D) PSII שמצריכות קוונטית התשואה לאחר הגדרת דופק אור saturating. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: ייצוג גרפי של PSII שמצריכות קוונטית תשואה (YII). א) נתונים צמחים 12, 21, 28 ימים לאחר הזריעה, מבוגר מתחת 200 µmol/cm2/s1 תחת אור מדומה השמש ("אור השמש") נתון פאם ניתוח הוערכו מבחינה סטטיסטית. מוצגות הערכים אכזרי של 5 מפעלים ו- AOIs 5 לכל יום. כוכבית אחת מצביעה על הבדל משמעותי עם ערך p-< 0.05 בהשוואה יום 12 ולאחר שתי כוכביות מצביעים על הבדלים משמעותיים מאוד עם ערך p-< 0.02 לפי מבחן t של התלמידים. B) נתונים הצמחים גדלו ב- 200 µmol/cm2 /s1 תחת אור השמש (SL), מועשר כחול (B) או אדום (R) אור, בהתאמה, מבחינה סטטיסטית הוערכו. מוצגות הערכים אכזרי של 5 מפעלים ו- AOIs 5 לכל יום. הבדלים משמעותיים חושבו לעומת "אור השמש".
איור 6: תמונת הנציגה של הפיוניות על הצד abaxial של עלה לבנה א . עלים מוכן כמתואר לעיל, נותחו חזותית תחת מיקרוסקופ אור עם הגדרות DIC בהגדלה X 40. הפיוניות נספרים באזור גלוי לפחות 4 עלים בכל מצב. התמונה צולמה במצלמה דיגיטלית מחובר tubus המיקרוסקופ. המספר של הפיוניות לכל mm ² מחושב בעזרת סרגל קנה מידה. כוכבים מצביעים על נשימה אחת. סרגל קנה מידה מייצג 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7: ייצוג גרפי של משקל טריים מצמחים לבנה א גדל מדומה אור השמש/200 µmol/cm2/s1. רוזט עלים נחתכו מצמחים 8, 10 ו-12 ימים לאחר הזריעה. כלומר הערכים במ ג מצמחים 6 ליום מתוארים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 8: הערכות סטטיסטיות של לבנה א באזור עלה מן הצמחים הגדלים בתנאים קלים שונים. A) באזור עלה מ לבנה א גדל 10, 13, 17 ימים נקבע באופן גרפי עם ImageJ ונתונים מ- n = 6 צמחים הוערכו מבחינה סטטיסטית. האזור עלה מתוך כל שישה רוזטות של כל תנאי היה סיכם, מחולק על ידי שש כדי לקבל את הערך הממוצע. עם ערך זה, חושבה סטיית התקן, זה מיוצג על-ידי קווי השגיאה. B) באזור עלה נקבע באופן גרפי עם ImageJ וכן נתונים או n = 2 או n = 6 צמחים, בהתאמה, נותחו סטטיסטית כמתואר עבור לוח א לאחר מכן השגיאה באחוז הערך הממוצע היה מחושב, מתואר בצורה גרפית. מייצגים ירוקים מראים את השגיאה אחוז מניתוח של n = 6, כחול בארים של n = 2 צמחים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
הצעד הראשון בלימוד צימוח מקימה תא אקלימיים בהתאם לתנאי הרצוי. הדבר מתבצע בקלות על-ידי הקלדת כל המשתנים בתוך המסכה תוכנית של התוכנה המתאימים (איור 1 א'). בשלב זה, ניתן ליישם שינויים רבים על-ידי שינוי המשטר אור ו/או טמפרטורה. ודא כי כל הזמן לעקוב אחרי הטמפרטורה, לחות ו לתנאי תאורה (איור 2) כדי למנוע כשלים טכניים הורס את הניסוי. זוהי נקודה קריטית להשגת תוצאות לשחזור. למרות זה מציע משתנים רבים ניתן להתאים בגמישות, יש המגבלות. נוריות ה-LED זמין כרגע לא יכולה לחקות אור השמש מאה אחוז, תנאי האקלים בתוך תא אקלים לא לגמרי יכול לשקף את מה קורה מחוץ15.
לעומת שימוש נרחב אורות פלורסנט נורות LED הם מגוונים, צריך פחות אנרגיה ולהציג כמעט אין חום וקרינה. יתרונות אלה הובילו תעשיית גדול של חקלאות מקורה לצייד מיכשור וחממות עם נוריות16. בהתחשב ההצלחות ענק דיווח בתחום זה, הטכניקה LED בוודאי תמצאו הרבה יישומים נוספים.
בעת התבוננות על פנוטיפ, במיוחד עבור קביעת אזור עלה, חשוב לקחת בחשבון כי צמחים בוגרים עלים חפיפה (איור 3). לפיכך, הערכת גרפי רוזטות כולו נוטה להיות מדויק. במקרה הזה, זה הרבה יותר מדויק כדי לחתוך את כל העלים ונמשיך משם.
הערכת התנהגות גדילה והבדלים במיוחד של צמיחה והתפתחות בתנאים שונים תלוי גודל דגימה מספקת. במחקר זה, לפחות שישה צמחים שימשו לקביעת למשל פוטוסינתטיים תשואה (איור 5), משקל טריים (איור 7), ושתל באזור עלה (איור 8A) אבל 30 זרעים בודדים היו בתחילת המחקר כדי להבטיח כי הראשון, מספיקות זרעים לנבוט, שנית, ניתן לבצע בחירה של צמחים "טיפוסי". אפילו בתוך אותה אוכלוסיה, כלומר צמחים בעציצים יחיד במגש אותו תחת בדיוק את אותם התנאים, הראה פנוטיפים שונים. וזאת לאחר מכן כמובן מתבטא סטיית במהלך ניתוח סטטיסטי, אך הפרשנות של נתונים הוא בדרך כלל אמין יותר כאשר שגיאות קטנות סטטיסטית שנצפו (איור 8 ב').
מדידת ביצועים פוטוסינתטיים מאת PAM (איור 4, איור 5) יכול להיעשות עבור מספר פרמטרים. במקרה זה, הפוקוס היה על התשואה PSII Y(II) כדוגמה אבל זה ניתן גם לקבוע למשל שכבתה ללא פוטו אטמוספרי, התשואה קוונטית של פיזור אנרגיה מוסדר שאינו מוסדר או הפוגה קלה. חשוב זה כדי לבחור לפחות חמישה AOIs לכל עלה מופץ באופן שווה פני העלה ולמדוד אז לפחות שישה עלים של צמחים שונים. החיסרון של שיטה זו הוא כי אין אפשרות לזהות את כל ההשפעות על PSI; לצורך כך נדרש ציוד שונה.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
יצירות מאשר תמיכה של Rhenac גרין טק AG דרך חלקים של מחקר זה. י. ס, בי בי קיבל מימון DFG (SFB TR175).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Climatic chamber equipped with LED panels | Rhenac Green Tec AG | These chambers are custom made. | |
| Spectrometer | OceanOptics | USB-650 | |
| Imaging PAM | Walz | IMAGING-PAM M-Series | There are several suitable models depending on the broader use. |
| Microscope+ 40x objective | Leica | DM1000 | Other companies also produce suitable microscopes. |
| Software ImageJ | Free download from website | ||
| Plant RNA extraction kit | Qiagen | 74903 | |
| Bioanalyser | Agilent | G2939BA | Needs an additional computer |
References
- Arabidopsis Genome Initiative. Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).
- An, G., Watson, B. D., Chiang, C. C. Transformation of Tobacco, Tomato, Potato, and Arabidopsis thaliana Using a Binary Ti Vector System. Plant Physiology. 81 (1), 301-305 (1986).
- Schiml, S., Fauser, F., Puchta, H. Chromosome and Genomic Engineering in Plants: Methods and Protocols. Murata, M. , Springer New York. New York, NY. 111-122 (2016).
- Rivero, L., et al. Arabidopsis Protocols. Sanchez-Serrano, J. J., Salinas, J. , Humana Press. Totowa, NJ. 3-25 (2014).
- Ubbens, J. R., Stavness, I. Deep Plant Phenomics: A Deep Learning Platform for Complex Plant Phenotyping Tasks. Frontiers in Plant Science. 8 (1190), (2017).
- Cosgrove, D. J. Rapid Suppression of Growth by Blue Light: OCCURRENCE, TIME COURSE, AND GENERAL CHARACTERISTICS. Plant Physiology. 67 (3), 584-590 (1981).
- Seiler, F., Soll, J., Bölter, B. Comparative Phenotypical and Molecular Analyses of Arabidopsis Grown under Fluorescent and LED Light. Plants. 6 (2), 24 (2017).
- Janda, M., et al. Growth and stress response in Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana, Glycine max, Solanum tuberosum and Brassica napus cultivated under polychromatic LEDs. Plant Methods. 11 (1), 31 (2015).
- Olle, M., Viršile, A. The effects of light-emitting diode lighting on greenhouse plant growth and quality. Agricultural and food science. 22 (2), 12 (2013).
- Lin, K. -H., et al. The effects of red, blue, and white light-emitting diodes on the growth, development, and edible quality of hydroponically grown lettuce (Lactuca sativa L. var. capitata). Scientia Horticulturae. 150, 86-91 (2013).
- Castronuovo, D., et al. Light spectrum affects growth and gas exchange of common dandelion and purple coneflower seedlings. International Journal of Plant Biology. , (2016).
- Student, THE PROBABLE ERROR OF A MEAN. Biometrika. 6 (1), 1-25 (1908).
- Database, J. S. E. Essentials of Genetics. RNA-Seq. JoVE. , (2017).
- Klermund, C., et al. LLM-Domain B-GATA Transcription Factors Promote Stomatal Development Downstream of Light Signaling Pathways in Arabidopsis thaliana Hypocotyls. The Plant Cell. 28 (3), 646-660 (2016).
- Annunziata, M. G., et al. Getting back to nature: a reality check for experiments in controlled environments. J Exp Bot. 68 (16), 4463-4477 (2017).
- Palus, S. Japan's Massive Indoor Farm Produces 10,000 Heads of Fresh Lettuce Every Day. Smithonian.com. , (2014).
