Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at studere planter vækst adfærd og især fænotyper på en reproducerbar måde. Vi viser, hvordan til at give variabel og på samme tid stabile lysforhold. Passende analyser afhænger nok prøve tal og gyldige statistiske evalueringer.
Abstract
Plante biologer ofte brug for at observere vækst opførslen af deres valgte arter. Med henblik herpå, at planter har brug for konstant miljømæssige og stabile lysforhold, som helst variabel i kvantitet og kvalitet så der kan foretages undersøgelser under forskellige opsætninger. Disse krav opfyldes af klimatiske kamre byder light emitting dioder (LED) lys, som kan-i modsætning til fluorescerende lys – indstilles til forskellige bølgelængder. Lysdioder er energi bevarelse og afgiver næsten ingen varme selv på lys intensitet, som ofte udgør et problem med andre lyskilder. Den præsenterede protokol indeholder en trinvis vejledning i hvordan man programmerer en klimarum udstyret med variable LED-lys samt beskriver flere metoder for dybtgående analyse af vækst fænotyper. Afhængigt af den eksperimentelle set-up kan forskellige karakteristika af de voksende planter observeres og analyseret. Her beskriver vi at fastsætte frisk vægt, leaf område, fotosyntetiske aktivitet og spalteåbningernes tæthed. Vi viser, at for at få pålidelige data og drage gyldige konklusioner er det obligatorisk at bruge et tilstrækkeligt antal personer til statistisk vurdering. Tager alt for få planter til denne slags analyseresultater i høje statistiske fejl og dermed i mindre klart fortolkninger af dataene.
Introduction
Arabidopsis thaliana har været model organisme for anlægget forskere af den molekylære æra i mere end to årtier. Flere egenskaber gør denne lille repræsentant for slægten Brassica en ideel kandidat til genetiske og molekylære undersøgelser: det har en relativt lille genom med kun fem kromosomer (sammenlignet med fx Nicotiana tabacum med 24 kromosomer) og dens genom blev helt sekventeret i 20001. A. thaliana kan nemt genetisk modificeret af Agrobacterium infektion2 og er åbne over for selv de nyeste genetiske værktøjer som CRISPR/Cas3. Selvom små, er cyklussen hurtig nok til at gøre biokemiske eksperimenter muligt hvor der er behov for en højere mængde af materiale. Planterne vokser på agar plader eller på jord og kan endda være dyrket som flydende kulturer4. Arabidopsis kan dyrkes i klimatisk kontrolleret skabene, fx fra Percival, i klimatiske kamre eller i drivhuse. For at kunne sammenligne vækst adfærd og analysere fænotyper af mutanter er det kritisk at give reproducerbare og på samme tid fleksible vækst betingelser5. Afhængigt af den videnskabelige problem, der er behandles muligvis en forskellige temperaturer og konstant lysforhold, forskellige lys intensitet eller forskellige lys kvaliteter ved samme temperatur. Lys er en meget afgørende parameter i planternes vækst og dens indflydelse er ofte studerede i mangfoldige fremgangsmåder6. For at sikre reproducerbarheden og sammenlignelighed af de fremkomne data er det afgørende at sikre en stabil udgang og anvender den samme slags lyskilder.
De sædvanlige lyskilder i drivhuse og klimatiske kamre består af natrium vapor eller lysstofrør, som fremmer tilfredsstillende plantevækst, men har flere ulemper. Først, de ældes med tiden, som ændrer den spektrale output, ikke kun i intensitet men i kvalitet (egne observationer). Dog overvåges kun intensiteten som regel kontinuerligt, en ændring i let kvalitet kan gå ubemærket hen, men stadig har betydelige virkninger. For det andet begge typer af lamper generere varme ved højere lys intensitet, som selv har en dybtgående fysiologisk indvirkning på planternes vækst og kan maskere eventuelle afhængige lyseffekt. For det tredje er den spektrale output af disse lyskilder uforanderlig og helt i modsætning til naturlige sollys7. Alle disse ulemper er overvundet i tilfælde af lysdioder)8,9,10,11. De har en lang levetid med næsten ingen ændring i emissioner, ikke producerer spildvarme selv ved meget høj lys intensitet og de er meget fleksibel, om deres spektrale output.
Her viser vi hvordan du oprette et klimarum byder på separat LED lys for rød, blå og hvide lys og følge forskellige parametre af planternes vækst over tid. Vi måler frisk vægt, leaf område, spalteåbninger tæthed og fotosyntetiske ydeevne. På samme tid viser vi betydningen af korrekt opsætning af statistiske vurderinger.
Protocol
Denne protokol indeholder nogle eksempler på, hvordan man analysere vækst opførsel af A. thaliana planter.
1. forberedelse
- Før du begynder, foretage en omhyggelig plan om hvor mange planter vil være behov for at gøre en pålidelig statistisk analyse af eksperimenter og derefter udarbejde de relevante mængder af gryder.
Bemærk: Tillad altid mulighed for, at nogle frø ikke kan spire. - Brug et klimarum med forskellige individuelt programmerbare LED for at sammenligne plantevækst på de samme generelle miljømæssige betingelser (materialer tabel).
2. plantebeskyttelsesmidler vækst og Set-up af LED-lys
- Forberede det relevante nummer (afhængigt af forskellige betingelser og/eller mutanter skal analyseres) af 6 x 7 cm gryder med jord og plante et enkelt frø i hver af dem.
Bemærk: I dette tilfælde 36 planter pr. betingelser blev sået. - Vernalize for to dage ved 4 ° C.
- Angive relative luftfugtigheden til 65% og temperatur til 22 ° C/16 ° C for døgnet 16 h / 8 h nat cyklus. Justere lys på alle niveauer til en intensitet på 200 µM/cm2/s1. Gøre dette ved at angive de respektive værdier i et program via touch screen på forsiden af det klimarum. For at sammenligne fire forskellige lys kvaliteter indstillet lysdioder til følgende parametre, som fastsat i tabel 1.
| Identifyier | 395 nm [%] | 440 nm [%] | 3 K [%] | 660 nm [%] | 770 nm [%] |
| "sollys" | 100 | 11 | 100 | 15 | 100 |
| Rød og blå (RB) | 100 | 15 | 25 | 10 | 100 |
| Blå (B) | 100 | 15 | 25 | 2 | 25 |
| Red (R) | 90 | 2 | 25 | 10 | 100 |
Tabel 1: sammensætning af lys intensiteter udsendes fra lysdioder
- Overvåge den spektrale output kontinuerligt, fx ved hjælp af en indbygget kalibreret spektrometer.
- Placere planterne i klimatiske salen på de forskellige niveauer og holde dem dækket med en gennemsigtig top indtil veludviklet kimbladene er synlige. Kontroller, at planterne er tilstrækkeligt udvandet.
- Overvåge og dokumentere planter af øjet og fotografisk så ofte som fornødent afhængigt af hvor hurtigt planterne vokser på de valgte betingelser, f.eks. hver to dage. Sørg for at bruge et stativ til kameraet for at sikre den lige afstand mellem kamera og objekter for alle billeder og dermed muliggøre sammenligninger. Bruge en skalalinjen, når det er relevant.
Bemærk: Termen DAS (dage efter såning) refererer til den faktiske plantning af frø, herunder vernalization.
3. bestemmelse af PSII udbytte
- Bruge en pulse-moduleret fluorimeter. Konfigurere kamerahoved i en passende afstand fra planten så den komplette roset kan ses på den opholde sig rude.
- Når du starter softwaren vises et "Vælg enhed" vindue. Sæt kryds "MINI" og derefter "ok". Vælg farven "blå" i næste pop-up-vinduet. Klik på "ok".
Bemærk: Pulse-moduleret fluorescens måle lys er tændt automatisk. På skærmen vises billedvinduet, viser parameteren fluorescens Ft. En plante, der er placeret under kameraet kan nu ses som et orange billede. - For at fokusere billedet og/eller vælge bestemte områder af anlægget, skifter til Live Video ved at afkrydse boksen "live video" og slå justering ring af formålet objektivet. Luk vinduet LIVE Video ved at klikke på Afslut boksen i øverste højre hjørne.
- For at måle fotosyntetiske parametre, definere et område af interesse (AOI). Brug standardindstillingen for dette, som er en cirkel, som automatisk vises i midten af skærmen. Den røde boks ved siden af det repræsenterer gennemsnit Ft værdien af alle pixel i til AOI. Definere de passende AOI ved at vælge fra AOI boksen i højre panel, hvor forskellige former er tilgængelige. Klik på "Tilføj" under fanen AOI og placere cirklen inden for området blad. Gentag fem gange pr. blad.
- Vedligehold indstillinger (fanen til højre) på standardværdierne fra producenten (tabel 2).
| Ventetid lys | Int. | Frekvens | |
| 1 | 1 | ||
| Act. Lys | Int. | Bredde | |
| 8 | 0 | ||
| Billede korrektioner | MINI | ||
| Billede Transformation | Batteri | ||
| 16.7V | |||
| Gevinst | 5 | ||
| Dæmpning | 1 | ||
| Lør puls | Int. | Nej | Interval Sørensen |
| 8 | 1 | 30 | |
| Langsom induktion | Forsinkelse s | Ur s | Varighed Sørensen |
| 40 | 20 | 315 | |
| Absortivity | Rød forstærkning | Rød intensitet | NIR intensitet |
| 340 | 25 | 13 | |
| Display | Farve | ||
| PS Grænse | 50 | ||
| Inh. Ref. AOI | 1 | ||
| FM-faktor (sæt kryds) | 1,030 |
Tabel 2: standardindstillinger for PAM målinger som fastsat af fabrikanten.
- Anvende en mætte lys flash for at udføre en måling af fotosyntetiske parametre af fluorescerende quenching analyse (mætning puls). Før det, skal du bestemme de dæmper koefficienter ved at måle minimal og maksimal fluorescens udbyttet af en dark-adapted plante. Med henblik herpå, skal du placere planten i mørke (f.eks. i en skuffe eller mørke) for et par min. Derefter placere anlæg under et kamerahoved, indskrive bokse foranstaltningen, og ML (måling af lys), i rækken nedenfor billedet vælge "Fv/Fm" ved stueur ind i cirklen, og klik på Fo, Fm nederst på skærmen.
Bemærk: Fo/Fm repræsenterer PSII udbyttet af en dark-adapted plante. Det er således den værdi, hvortil måling efter anvender lys er normaliseret. Den nuværende Fo/Fm måling vil forblive indtil ny post er aktiveret. Alle F og Fm' værdier bestemmes af mætning pulser er relateret til Fo/Fm og dæmper parametre beregnes i overensstemmelse hermed. - Find disse resultater i rapport fanen og tjekke alle kasser i højre side, der er relevante for eksperimentet (fx. Y(II), qP, qN, osv.).
- Eksportere resultaterne til en analyse software fx. Excel ved at klikke på export-knappen i øverste venstre hjørne og gemme under passende filnavn. Opret mindst fem AOIs pr. blad og måle flere blade af den samme plante (glem ikke at snart mørkt tilpasse anlægget igen efter hver måling), samt flere planter fra én betingelse, der kan derefter statistisk vurderes.
- For statistisk analyse generere middelværdier og standardafvigelser fra alle AOIs og mindst tre uafhængige planter for alle tid point/betingelser og udføre en Students t-test til at vurdere, om dataene er betydelig12. Data evalueres som væsentligt anderledes, når p-værdier er under 0,05.
4. bestemmelse af spalteåbninger tæthed
- Indsamle tre fuldt udvidet roset blade fra tre enkelte planter pr. betingelse i 70% ethanol i et glas petriskål og for at uddrage klorofyl. Inkuber i dette ekstraktionsmiddel natten over ved stuetemperatur eller opbevares ved 4 ° C.
- For fuld clearance fra pigmenter, inkuberes i Kloral hydrat løsning (Kloral hydrat: vand: glycerol = 8: 2: 1 w/v/w) indtil bladene vises helt hvid.
- Tage differential interferens mikroskopi (DIC) billeder af den abaxial overflade på 40 X forstørrelse. Tælle spalteåbninger i synsfeltet og ekstrapolere ved hjælp af skalalinjen til spalteåbninger pr. mm². Gentag denne procedure for mindst 4 blade pr. betingelser. Udføre statistisk analyse ved at beregne den gennemsnitlige værdi for alle bladene på én betingelse, og fra dette beregne den gennemsnitlige fejl.
5. bestemmelse af frisk vægt
- Fjerne alle blade herunder bladstilkene fra rosetter fra seks planter pr. tilstand med et barberblad. Vejer alle blade straks og forbehold statistiske analyser data, som beskrevet ovenfor.
6. bestemmelse af roset blad område
- Bruge billeder fra otte planter pr. betingelse til at analysere området blad grafisk. Kombiner billeder til en tilstand i et enkelt billede og Gem som *.jpeg eller * .tiff.
- Download den relevante software (materialer tabel).
Bemærk: Det er naturligvis muligt at anvende andre programmer i stand til at udføre denne opgave. - Åbne en billedfil. Vælg værktøjet "frie hænder udvalg." Omringe blade herunder bladstilkene af en roset. Klik på "Analyze - sæt målinger" og tjek "Område," "Min. & Max grå værdi," "Integreret tæthed" og "Grå gennemsnitsværdien." Vælge passende decimal steder, bedst er to eller tre og klik "ok."
- For at få mm Brug2 i stedet for pixels kommandoen "set skala". Anvendelse af lineær markeringsværktøjet for at foretage et valg af linie, der svarer til en kendt distance, fx orlov diameter, der er let at beregne fra skalalinjen af billeder, og derefter åbne dialogen sat skala og Indtast denne definerede afstand og enhed måling. Gå derefter tilbage til "analysere" og klik på "foranstaltning."
- Et nyt vindue vises titlen "resultater", som indeholder de relevante data for den aktuelle roset. Gentag denne procedure med alle planter i billedet og initialisere område målinger for hver ny plante med Ctrl + M.
Bemærk: For mindre planter med ikke-overlappende blade "wand tool" kan bruges til at gøre processen lettere og hurtigere. Så snart bladene begynder at dække hinanden, giver dette værktøj ikke pålidelige resultater. - Alternativt kan du afbrød alle blade og placere dem på en måde, en oversigt over billede kan tages og derefter bruge værktøjet tryllestav. Tage i betragtning, når du bruger denne metode, flere planter er nødvendige.
- Vælg "Fil"-"Gem som" i resultatvinduet og generere en passende filnavn og en placering i mappen computer. Filen bliver automatisk gemt i Excel-format.
7. forberedelse af RNA
- Høst tre prøver fra ti individuelle planter for hver betingelse. Uddrag total RNA ved hjælp af en plante RNA udvinding kit ifølge producentens anvisninger. Fastslå RNA koncentration, renhed og integritet ved hjælp af en bioanalyzer. RNA kan derefter bruges til downstream applikationer såsom qRT-PCR eller gene expression analyse af fx RNASeq13.
Representative Results
Observation og analyse af planternes vækst og især fænotyper fra mutant planter er afhængige af stabil og reproducerbar miljøforhold. Disse kan leveres i klimatiske kamre. Lys mængden og især kvalitet afhænger kritisk af erhvervsdrivende lyskilden, der i denne undersøgelse blev leveret af LED-lys.
Figur 1 viser et eksempel på et klimarum udstyret med LED paneler. Figur 1A viser et screenshot af kontrolpanelet hvor alle klimatiske og lys forhold kan justeres. Inden for 24 timer kan du indstille tyve forskellige tidsrammer. I dette eksempel er blevet programmeret lang dag betingelser med 16 lys/8 h mørke. Salen byder på fire niveauer, som kan programmeres separat, så plantevækst på fire forskellige lyssætninger kan studeres under præcis de samme miljøforhold. Øverste venstre niveau er indstillet til en spektral output efterligne sollys så meget som teknisk muligt, de øverste højre niveau repræsenterer forhøjet rød (660 nm) og blå lys (440 nm) med reduceret hvidt lys (3K). Den venstre lavere niveau blev sat til forhøjede blåt lys og den nederste højre niveau til overvejende rødt lys. Figur 1B viser lysdioder på de forskellige indstillinger som en oversigt (midterste panel) og de respektive zoom-ins (ydre små paneler). Forskellen i lys kvaliteter kan let ses af øjet.
En indbygget spektrometer konstant måler, overvåger og justerer den spektrale output. Figur 2 viser spektrum fra det øverste venstre niveau 1.1, som blev sat til at efterligne sollys. I forhold til en standard fluorescerende lys pære er del af UV og blåt lys meget højere7.
I figur 3 eksempel af A. thaliana planter fra alle fire betingelser 10, 13 og 17 dage, henholdsvis efter såning er afbildet. Alle planterne blev fotograferet fra den samme afstand ved at montere kameraet på et stativ. Skalalinjen repræsenterer 1 cm. Efter 10 dage, ikke meget forskel i størrelse eller farve kan være skimtes, men efter 17 dage en hurtigere vækst under rødt lys er indlysende. Ud over denne visuel analyse, blev flere fysiologiske analyser udført.
Figur 4 følger de forskellige trin i PAM målinger, som analyserer fx fotosyntetiske kapacitet. I figur 4A er et screenshot af den opholde sig video vist, som er indstillingen for at bringe anlægget i fokus at sikre optimal kvalitet af målingerne. I stedet for at fokusere på hele planten, kan du også vælge et enkelt blad til at analysere. Figur 4B viser den aktuelle fluorescerende udbytte Ft af en dark-adapted plante inden selve målingen blev startet. I dette tilfælde blev fem cirkulære områder af interesse (AOIs) valgt. Tallene i de røde bokse ved siden af hver AOI giver direkte et numerisk resultat, som også kan gemmes i form af en tabel. For at indlede en måling af fotosyntetiske parametre Fo, skal Fm indstille. Et screenshot af Ft efter at gøre dette er afbildet i figur 4 c. Bemærk, at nu på knappen "Fo, Fm" ikke er aktiv længere. For at starte en ny måling, skal "Ny post" klikkes på for at slette en tidligere normalisering. Endelig viser figur 4D den effektive PSII kvanteudbytte Y(II) efter at have givet en mætte lys puls ("SAT-puls"). Kvantificering af eksemplariske data er vist i figur 5. Planter, der dyrkes under sollys på 200 µM/cm2/s1 (figur 5A) blev analyseret 12, 21 og 28 dage efter såning, henholdsvis. Vores data viser, at PSII udbytte er betydeligt højere i blade fra planter dyrket i tre uger end 12 dage. Forskellen mellem 28 og 12 dage er stadig betydelige, men p-værdi er højere. I figur 4B, blev PSII udbytter fra planter dyrket i to uger fra forskellige lys kvaliteter sammenlignet. Interessant, fører permanent vækst under lys der indeholder en stor del af blåt lys til et væsentligt større udbytte af PSII. En lignende effekt blev observeret for planter, der dyrkes under beriget rødt lys, men stigningen var lidt lavere.
Forskellige lys kvaliteter viste sig at virkning spalteåbninger udvikling14. Derfor, den spalteåbningernes tæthed var undersøgt. Figur 6 viser, hvordan et blad efter pigment udvinding ser ud. Enkelt epidermale celler kan godt skelnes, og stomien kan tælles nemt. I figur er individuelle spalteåbningerne angivet med en asterisk. Detaljerede data om de spalteåbningernes tæthed af planter fra de forskellige lyssætninger kan findes andetsteds9.
Ud over besigtigelse (figur 3) giver friske vægt en god foranstaltning af fremskridt, vækst. I dette eksempel blev blade fra planter dyrket under "sollys" efter 8, 10 og 12 dage efter såning, henholdsvis, vejet. Statistisk vurdering af disse data kan ses i figur 7. Som forventet, stiger den friske vægt med tiden.
Udover frisk vægt er blad-området en god målestok for vækst. Her, blev plante udvikling fulgt fra 10, 13 og 17 dage efter såning (figur 8A). Mindst seks individuelle planter blev rutinemæssigt evalueret for at få pålidelige statistiske data. For at demonstrere vigtigheden af en høj stikprøvestørrelse, procentdel fejl af middelværdien fra analysere to og seks planter, henholdsvis, blev beregnet (fig. 8B). Dvs. procentdelen af standardafvigelsen for middelværdien blev fastsat. Det er helt klart, at i tilfælde af en lille stikprøvestørrelse fejlen er 5-10% højere end for en højere stikprøvestørrelse. Ved at øge antallet af planter, der er evalueret, kan fejlen minimeres, hvilket gør fortolkningen af data meget klarere.
Figur 1: forskellige lys kvaliteter er leveret af lysdioder. A) Screenshot fra kontrolpanelet på LED kammer. Dag længde er indstillet til 16 h (øverste højre hjørne) og lysintensiteten er indstillet til 200 µmol cm-2 s-1. Den let kvalitet er forskellige på alle fire niveauer: 1.1 repræsenterer et spektrum som svarende til sollys som teknisk muligt, 1.2 repræsenterer en høj procentdel af røde og blå bølgelængder (RB) lys, 2.1 ligger overvejende til blå (B), 2.2 repræsenterer primært rød lys (R). B) den midterste panel viser en oversigt over alle niveauer; de udvendige paneler viser de enkelte niveauer i en højere zoom. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: bølgelængde spektrum fra simuleret sollys indstillinger. Et screenshot fra den indbyggede spektrometer i salen, LED er vist, som var placeret på niveau 1.1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: plante udvikling over en uge. Repræsentant A. thaliana planter fra alle fire lysforhold fra 10, 13 og 17 DAS. Planterne blev fotograferet med en digital refleks kamera på et stativ. Skalalinjen repræsenterer 1 cm for alle billeder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Screenshots fra repræsentative trin af PAM målinger af A. thaliana planter. A) Screenshot fra visningen "Live video" hvor billedet fokus kan justeres. B) nuværende fluorescens udbytte Ft før anvendelsen af nogen lysimpulser. C) nuværende fluorescens udbytte Ft efter indstilling af Fo/Fm. D) effektuering PSII kvanteudbytte efter indstilling et mætte lys puls. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: grafisk repræsentation af effektuering PSII kvanteudbytte (YII). A) Data fra planter 12, 21 og 28 dage efter såning og dyrket under 200 µmol/cm2/s1 under simulerede sollys ("sollys") PAM analyseret statistisk blev evalueret. Vist er middelværdier af fem planter og fem AOIs pr. dag. En stjerne angiver en betydelig forskel med en p-værdi < 0,05 i forhold til dag 12, og to stjerner angiver meget betydelige forskelle med en p-værdi < 0,02 efter elevernes t-test. B) Data fra planter dyrket på 200 µmol/cm 2/s1 under simulerede sollys (SL), beriget blå (B) eller rød (R) lys, henholdsvis, blev statistisk evalueret. Vist er middelværdier af fem planter og fem AOIs pr. dag. Betydelige forskelle blev beregnet i forhold til "sollys."
Figur 6: repræsentativt billede af spalteåbninger på den abaxial side af en A. thaliana leaf. Blade tilberedt som beskrevet ovenfor og blev visuelt analyseret under et lysmikroskop med DIC indstillinger på 40 X forstørrelse. Spalteåbninger tælles i det synlige område af mindst 4 blade pr. betingelse. Billedet blev taget med et digitalt kamera tilsluttet mikroskop tubus. Antallet af spalteåbninger pr. mm² beregnes med hjælp af skalalinjen. Stjernerne angiver en enkelt stomi. Skalalinjen repræsenterer 200 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: grafisk repræsentation af frisk vægt fra A. thaliana planter dyrket på simuleret sollys/200 µmol/cm2/s1. Roset bladene blev skåret fra planter, otte, ti og tolv dage efter såning. Gennemsnitlige værdier i mg fra seks planter pr. dag er afbildet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: Statistisk vurdering af A. thaliana blad område fra planter dyrket under forskellige lysforhold. A) blad område fra A. thaliana vokset til 10, 13 og 17 dage var grafisk bestemmes med ImageJ og data fra n = 6 planter var statistisk evalueret. Området blad fra alle seks rosetter fra hver betingelse var opsummerede og divideret med seks og få middelværdien. Med denne værdi, standardafvigelsen var beregnet, og dette er repræsenteret ved fejllinjer. B) blad område var grafisk bestemmes med ImageJ og data fra enten n = 2 eller n = 6 planter, henholdsvis, blev statistisk analyseret som beskrevet for panelet A. Derefter var fejl i procent af gennemsnitsværdien beregnes og afbildet grafisk. Grøn viser den procent fejl fra analyse af n = 6, blå barer fra n = 2 planter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Det første trin i at studere planternes vækst er ved at oprette klimarum de ønskede betingelser. Dette gøres nemt ved at skrive alle variabler i programmet masken af den respektive software (figur 1A). På dette trin, kan mange ændringer gennemføres ved at ændre lys regime og/eller temperatur. Sørg for at hele tiden overvåge temperatur, luftfugtighed og lysforhold (figur 2) for at undgå tekniske fejl fra ødelægge af eksperiment. Dette er et afgørende punkt for at opnå reproducerbare resultater. Selvom dette set-up tilbyder mange variabler og kan justeres fleksibelt, har den sine begrænsninger. I øjeblikket tilgængelige LED-lys kan ikke efterligne sollyset hundrede procent og de klimatiske forhold inde i et klimarum kan aldrig helt afspejler, hvad der foregår uden for15.
I forhold til de anvendte fluorescerende pærer LED lys er mere alsidige, har brug for mindre energi og viser stort set ingen varmestråling. Disse fordele har ført den store industri af indendørs landbrug for at udstyre klimatiske kamre og drivhuse med lysdioder16. I betragtning af de enorme succeser rapporteret i feltet LED teknik vil sikkert finde mange flere programmer.
Når observere fænotype og især for bestemmelse af det blad område er det vigtigt at tage hensyn til efterlader det i ældre planter overlapning (figur 3). Således grafiske evaluering af hele rosetter tendens til at være upræcis. I dette tilfælde er det meget mere præcis at afskære alle blade og gå derfra.
Vurdering af vækst adfærd og især forskelle i vækst og udvikling under forskellige betingelser afhænger af en tilstrækkelig stikprøvestørrelse. I denne undersøgelse, mindst seks planter blev anvendt til bestemmelse af fx fotosyntetiske udbytte (figur 5), friske vægt (figur 7), og blade område (figur 8A) men 30 individuelle frø blev plantet i begyndelsen af undersøgelsen til at sikre at første, tilstrækkelig frøene spire, og for det andet, et udvalg af "typiske" planter kan foretages. Selv inden for samme population, dvs planter i enkelt gryder i den samme skuffe under de nøjagtige samme betingelser, viste varierende fænotyper. Dette er så naturligvis afspejlet i standardafvigelsen under statistisk analyse, men fortolkningen af data er generelt mere pålidelige, når små statistiske fejl er observeret (figur 8).
Måling af fotosyntetiske ydeevne af PAM (figur 4, figur 5) kan gøres for flere parametre. I dette tilfælde var der fokus på PSII udbytte Y(II) som eksempel, men det er muligt også bestemme f.eks. ikke-fotokemisk quenching, kvanteudbytte af regulerede og ikke-regulerede energi varmeafledning eller lys remission. Vigtigt her er at vælge mindst fem AOIs pr. blad er jævnt fordelt over bladets overflade og derefter måle mindst seks blade fra forskellige planter. Ulempen ved denne metode er, at eventuelle virkninger på PSI ikke kan påvises; til dette formål kræves forskelligt udstyr.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
F.S. anerkender støtte fra Rhenac grøn Tec AG gennem dele af denne undersøgelse. J.S. og B.B. modtaget støtte fra DFG (SFB TR175).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Climatic chamber equipped with LED panels | Rhenac Green Tec AG | These chambers are custom made. | |
| Spectrometer | OceanOptics | USB-650 | |
| Imaging PAM | Walz | IMAGING-PAM M-Series | There are several suitable models depending on the broader use. |
| Microscope+ 40x objective | Leica | DM1000 | Other companies also produce suitable microscopes. |
| Software ImageJ | Free download from website | ||
| Plant RNA extraction kit | Qiagen | 74903 | |
| Bioanalyser | Agilent | G2939BA | Needs an additional computer |
References
- Arabidopsis Genome Initiative. Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).
- An, G., Watson, B. D., Chiang, C. C. Transformation of Tobacco, Tomato, Potato, and Arabidopsis thaliana Using a Binary Ti Vector System. Plant Physiology. 81 (1), 301-305 (1986).
- Schiml, S., Fauser, F., Puchta, H. Chromosome and Genomic Engineering in Plants: Methods and Protocols. Murata, M. , Springer New York. New York, NY. 111-122 (2016).
- Rivero, L., et al. Arabidopsis Protocols. Sanchez-Serrano, J. J., Salinas, J. , Humana Press. Totowa, NJ. 3-25 (2014).
- Ubbens, J. R., Stavness, I. Deep Plant Phenomics: A Deep Learning Platform for Complex Plant Phenotyping Tasks. Frontiers in Plant Science. 8 (1190), (2017).
- Cosgrove, D. J. Rapid Suppression of Growth by Blue Light: OCCURRENCE, TIME COURSE, AND GENERAL CHARACTERISTICS. Plant Physiology. 67 (3), 584-590 (1981).
- Seiler, F., Soll, J., Bölter, B. Comparative Phenotypical and Molecular Analyses of Arabidopsis Grown under Fluorescent and LED Light. Plants. 6 (2), 24 (2017).
- Janda, M., et al. Growth and stress response in Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana, Glycine max, Solanum tuberosum and Brassica napus cultivated under polychromatic LEDs. Plant Methods. 11 (1), 31 (2015).
- Olle, M., Viršile, A. The effects of light-emitting diode lighting on greenhouse plant growth and quality. Agricultural and food science. 22 (2), 12 (2013).
- Lin, K. -H., et al. The effects of red, blue, and white light-emitting diodes on the growth, development, and edible quality of hydroponically grown lettuce (Lactuca sativa L. var. capitata). Scientia Horticulturae. 150, 86-91 (2013).
- Castronuovo, D., et al. Light spectrum affects growth and gas exchange of common dandelion and purple coneflower seedlings. International Journal of Plant Biology. , (2016).
- Student, THE PROBABLE ERROR OF A MEAN. Biometrika. 6 (1), 1-25 (1908).
- Database, J. S. E. Essentials of Genetics. RNA-Seq. JoVE. , (2017).
- Klermund, C., et al. LLM-Domain B-GATA Transcription Factors Promote Stomatal Development Downstream of Light Signaling Pathways in Arabidopsis thaliana Hypocotyls. The Plant Cell. 28 (3), 646-660 (2016).
- Annunziata, M. G., et al. Getting back to nature: a reality check for experiments in controlled environments. J Exp Bot. 68 (16), 4463-4477 (2017).
- Palus, S. Japan's Massive Indoor Farm Produces 10,000 Heads of Fresh Lettuce Every Day. Smithonian.com. , (2014).
