Summary
Burada, bitki büyüme davranış ve özellikle fenotipleri tekrarlanabilir bir şekilde eğitim için bir iletişim kuralı mevcut. Değişken ve aynı zaman istikrarlı ışık koşulları sağlamak için nasıl gösterir. Uygun analizleri yeterli örnek numaraları ve geçerli istatistiksel değerlendirme bağlıdır.
Abstract
Bitki biyologlar sık sık onların seçilmiş türler büyüme davranışlarını gözlemlemek gerekir. Bu amaçla, bitkiler farklı kurulumları altında çalışmalar yapılabilir hangi miktar ve kalite olarak tercihen değişken sabit çevre ve istikrarlı ışık koşullarında, gerekir. Bu gereksinimleri iklimsel Odalar floresan ışıklar aksine-için farklı dalga boylarında ayarlanabilir ışık yayan diyot (LED) ışıklar featuring tarafından karşılanmaktadır. LED vardır enerji tasarrufu ve sık sık diğer ışık kaynakları ile ilgili bir sorun oluşturan hemen hemen hiçbir ısıda bile ışık yoğunluklarını, yayarlar. Sunulan Protokolü değişken LED ışıkları ile donatılmış hem de büyüme fenotipleri derinlik analizi için çeşitli yaklaşımlar açıklayan bir iklimsel odası programı konusunda adım adım yönergeler sağlar. Bağlı olarak deneysel set-up büyüyen bitkilerin çeşitli özellikleri gözlenen ve analiz. Burada taze ağırlık, yaprak alanı, fotosentetik etkinlik ve stomatal yoğunluğunu belirlemek nasıl açıklar. Biz sırayla güvenilir veri elde etmek ve bu kişilerin yeterli sayıda istatistiksel değerlendirme için kullanmak için zorunludur geçerli sonuçlara göstermek. Çözümleme sonuçlarını bu tür için çok az sayıda bitki yüksek istatistiksel hataları alarak ve sonuç olarak daha az net Yorumlar verilerin içinde.
Introduction
Arabidopsis thaliana model organizma fazla iki yıl için moleküler dönemin bitki araştırmacılar için olmuştur. Çeşitli özellikleri bu küçük temsilcisi Brassica ailesinin genetik ve moleküler çalışmalar için ideal bir aday yapmak: sadece beş kromozomlar ( örneğin tütün için 24 kromozom ile karşılaştırıldığında) ile nispeten küçük bir genom vardır ve genomunu tamamen 20001' sıralı. A. thaliana Agrobacterium enfeksiyon2 tarafından kolayca genetik olarak değiştirilebilir ve mükellef bile en son genetik araçları CRISPR/Cas3gibi. Küçük olmasına rağmen büyüme döngüsünün biyokimyasal deneyler uygun malzeme daha yüksek bir miktar gerektiği yerde yapmak için yeterince hızlı. Bitkiler büyümek Ağar kaplamalar ya da toprak ve hatta sıvı kültürleri4ekili olabilir. Arabidopsis Speed'in kontrollü dolapları, örneğin Percival, üzerinden içinde yetiştirilen iklim odaları veya seralar. Büyüme davranış ve fenotipleri mutantların edebilmek için tekrarlanabilir ve aynı zaman esnek büyüme koşulları5sağlamak için önemlidir. Ele alınması için bilimsel soruna bağlı olarak onlardan farklı sıcaklıklarda ve sabit ışıklı ortamlarda, farklı ışık yoğunluklarda veya farklı ışık nitelikleri aynı sıcaklıkta ihtiyacım olabilir. Işık bitki büyüme çok kritik bir parametredir ve nüfuzunu kez farklı yaklaşımlar6' da okudu. Tekrarlanabilirlik ve karşılaştırılabilir elde edilen veri sağlamak için istikrarlı bir çıkış sağlamak ve ışık kaynakları aynı tür uygulamak önemlidir.
Seralar ve iklimsel chambers her zamanki ışık kaynaklarında sodyum buharı veya floresan lambalar, tatmin edici bitki büyüme teşvik ancak birkaç dezavantajları var oluşur. İlk olarak, onlar sadece yoğunluğu aynı kalitede (kendi gözlemleri) spektral çıkış değiştirir zamanla yaş. Böylece ışık kalitesi bir değişiklik fark edilmeden devam ama hala önemli etkileri vardır ancak, sadece yoğunluğu genellikle sürekli olarak izlenir. İkinci olarak, her iki tür lambalar ısı üretir daha yüksek ışık yoğunluklarını, kendisini bitki büyüme bir derin fizyolojik etkisi vardır ve herhangi bir ışık bağımlı etkisi maske. Üçüncü olarak, alınan spektral bu ışık kaynakları değişmez ve oldukça doğal güneş ışığı7farklı olarak çıktı. Bu sakıncaları LED'ler durumunda üstesinden var)8,9,10,11. Onlar-si olmak uzun ömürlü emisyon ancak herhangi bir değişiklik ile çok yüksek ışık yoğunluklarını, bile atık ısı üretmek değildir ve onların spektral çıkış ile ilgili çok esnektir.
Burada nasıl bir iklimsel odası ayrı LED ışıklar kırmızı, mavi ve beyaz ışık için yer ayarlayın ve bitki büyüme zaman içinde farklı parametreleri takip göstermektedir. Biz taze ağırlık, yaprak alanı, stoma bantlı yoğunluğu ve fotosentetik performansını ölçmek. Aynı zamanda, biz düzgün kadar istatistiksel değerlendirme ayar önemi göstermek.
Protocol
Bu protokolü nasıl A. thaliana bitkiler büyüme davranışlarını analiz etmek için bazı örnekler içerir.
1. hazırlık
- Başlamadan önce kaç bitki deneyler güvenilir bir istatistiksel analizi yapmak için gerekli olacak ve tencere uygun miktarda hazır olun dikkatli bir plan yapın.
Not: Her zaman için değil bazı tohum çimlenme olasılığı sağlar. - İklimsel odası farklı ayrı ayrı programlanabilir LED düzeyleri ile aynı genel çevre koşulları (malzemeler tablo) altında bitki büyüme karşılaştırmak için kullanın.
2. bitki büyüme ve Set-up LED ışıkları
- 6 x 7 cm tencere toprak ile uygun bir sayı (bağlı olarak farklı koşullar ve/veya analiz edilecek mutantlar) hazırlamak ve her birinde tek bir tohum bitki.
Not: Bu durumda, koşullar başına 36 bitkilerin ekili. - 4 ° C'de 2 gündür vernalize
- Göreli hava nemi % 65 ve sıcaklığı 22 ° C/16 ° C 16 h gün / 8 h gündüz döngüsü ayarlayın. 200 µM/cm2/s1bir yoğunluk için her seviyedeki ışığı ayarlayın. Bu iklimsel odası önünde dokunmatik ekran üzerinden bir programa ilgili değerleri girerek yaparsınız. Dört farklı ışık nitelikleri karşılaştırmak için tablo 1'de belirtilenler LED'ler için aşağıdaki parametreleri ayarlayın.
| Identifyier | 395 nm [%] | 440 nm [%] | 3 K [%] | 660 nm [%] | 770 nm [%] |
| "güneş ışığı" | 100 | 11 | 100 | 15 | 100 |
| Kırmızı ve mavi (RB) | 100 | 15 | 25 | 10 | 100 |
| Mavi (B) | 100 | 15 | 25 | 2 | 25 |
| Red (R) | 90 | 2 | 25 | 10 | 100 |
Tablo 1: LED yayılan ışık yoğunluklarını kompozisyon
- Spektral çıktı sürekli olarak yerleşik bir kalibre edilmiş Spektrometre kullanarak örneğin izlemek.
- Bitkiler farklı düzeylerde iklimsel odası yerleştirin ve iyi gelişmiş cotyledons görünür hale gelene kadar ile şeffaf bir üst kapalı tutun. Bitkiler yeterince sulanan emin olun.
- Monitör ve belge bitkiler göz ve olabildiğince sık uygun, fotografik seçilen koşullarda, örneğin her iki gün bağlı olarak ne kadar hızlı bitkiler büyümek. Fotoğraf makinesi ve nesneleri tüm fotoğrafların arasında eşit mesafede sağlamak ve böylece karşılaştırma etkinleştirmek için bir tripod kamera için kullandığınızdan emin olun. Bir ölçek çubuğu uygun olduğunda kullanın.
Not: Terim DAS (Ekim sonra gün) gerçek vernalization de dahil olmak üzere tohumları dikim için anlamına gelir.
3. PSII verim tespiti
- Nabız modülasyonlu fluorimeter kullanın. Uygun bir mesafede kamera kafası kadar bitki tam rozet-ebilmek var olmak seen üstünde belgili tanımlık canlı pencere ayarlayın.
- Yazılım başlangıç üzerine "select birimi" penceresi görüntülenir. Tıkırtı "MINI" ve sonra "Tamam." "Mavi" renk sonraki açılan pencerede seçin. "Tamam."
Not: otomatik olarak darbe modülasyonlu Floresan ışık ölçüm açýlýr. Monitörde, Floresans parametre Ft gösteren görüntü penceresi belirir. Kameranın altında yer bir bitki şimdi turuncu bir resim olarak görülebilir. - Görüntü odak ve/veya belirli bölgeleri bitki seçmek için Video canlı "canlı video" kutusunu işaretleyerek tarafından geçiş ve objektif lens ayar halkası etkinleştirin. Canlı Video penceresinin sağ üst köşesinde çıkış kutusunu tıklatarak çıkın.
- Fotosentetik parametrelerini ölçmek için bir ilgi (AOI) alanı tanımlayın. Bunlar, otomatik olarak ekranın ortasında görüntülenen bir daire için varsayılan ayarı kullanın. Bunun yanında kırmızı bir kutu tüm pikseller AOI içinde ortalama Ft değerini temsil eder. Burada farklı formlarda kullanılabilir sağ panelinden AOI kutusundan seçerek uygun AOI tanımlayın. "Ekle" AOI sekmesini tıklatın ve Daire yaprak içinde yerleştirin. Yaprak beş kez tekrarlayın.
- (Tablo 2) üreticisi tarafından sağlanan varsayılan değerlerinde (sağ sekme) ayarlarını korumak.
| Ölçü birimi ışık | Int. | Frekans | |
| 1 | 1 | ||
| Hareket. Işık | Int. | Genişlik | |
| 8 | 0 | ||
| Resim düzeltmeleri | MINI | ||
| Görüntü dönüştürme | Pil | ||
| 16.7V | |||
| Kazanç | 5 | ||
| Sönümleme | 1 | ||
| Sat darbe | Int. | Hayır | Aralık s |
| 8 | 1 | 30 | |
| Yavaş indüksiyon | Gecikme s | Saat s | Süre s |
| 40 | 20 | 315 | |
| Absortivity | Kırmızı kazancı | Kırmızı yoğunluğu | NIR yoğunluğu |
| 340 | 25 | 13 | |
| Görüntü | Renk | ||
| PS Sınır | 50 | ||
| INH. Ref. AOI | 1 | ||
| FM faktörü (tıkırtı) | 1,030 |
Tablo 2: varsayılan ayarlar olarak üretici tarafından sağlanan PAM ölçümler için.
- Fotosentetik parametrelerinin ölçüm analizi (doygunluk darbe) Şoklama floresan tarafından gerçekleştirmek için doyurarak ışık flaş uygulamak. Bundan önce su verme katsayıları minimal ve maksimal Floresans verim dark-adapted bir bitkinin ölçerek belirlemek. Bu amaçla, bitki karanlıkta (örneğin bir çekmece veya koyu kutu) birkaç dakika yerleştirin. Sonra bitki kamera kafası altında yer, resmi seçin "Fv/Fm" çember içine saatle denetim altındaki satırda ölçü ve ML (ışık ölçüm), kutuları işaretleyin ve Fo, Fm ekranın alt'ı tıklatın.
Not: Fo/Fm PSII verim dark-adapted bir bitkinin temsil eder. Böylece, ışık uygulandıktan sonra ölçüm normalleştirilmiş değeridir. Yeni kayıt etkinleştirilene kadar geçerli Fo/Fm ölçüm kalacaktır. Tüm F ve Fm' doygunluk bakliyat tarafından belirlenen değerleri Fo/Fm ile ilgili ve su verme parametreleri buna göre hesaplanır. - Bu sonuçlar rapor sekmesinde bulmak ve sağ tarafta deney (örn. ilgili tüm kutuları işaretleyin Y(II), qP, qN, vb).
- Sonuçları için bir analiz yazılımı örneğindışa aktarabilirsiniz. Sol üst köşede dışa aktar düğmesini tıklatarak excel ve uygun dosya adı altında kaydedin. Yaprak başına en az beş AOIs oluşturmak ve aynı bitkinin çeşitli yaprakları ölçmek (kısa bir süre için karanlık tekrar her ölçüm sonra bitki uyum unutmayın), yanı sıra çeşitli bitkilerden bir şartla, hangi sonra istatistiksel olarak değerlendirildi.
- İstatistiksel analiz için ortalama değerler ve standart sapmalar oluşturmak tüm AOIs ve tüm için en az üç bağımsız bitki Puan/koşullar zaman ve bir öğrenci t-test verileri önemli12olup olmadığını değerlendirmek için gerçekleştirin. P-değeri 0,05 altında olduğunda veri önemli ölçüde farklı değerlendirilir.
4. stoma bantlı yoğunluk tayini
- Koşul başına üç bireysel bitki toplamak üç tam olarak genişletilmiş rozet yaprakları % 70 etanol cam petri kabına ve klorofil ayıklamak için içine. Bu çözücü gecede oda sıcaklığında veya mağaza 4 ° C'de kuluçkaya
- Kloral hidrat çözümde pigmentler üzerinden tam giriş izni için kuluçkaya (kloral hidrat: su: gliserol = 8: 2: 1 w/v/w) yaprakları tamamen beyaz görününceye kadar.
- Fark girişim mikroskobu (DIC) görüntü abaxial yüzeyinin 40 X büyütme oranında alabilir. Stoma bantlı görme alanı içinde saymak ve stoma bantlı mm² başı için ölçek çubuğu yardımıyla tahmin. Bu yordam için en az 4 koşullar bırakır yineleyin. Bütün yaprakları bir koşul için ortalama değerlerini hesaplayarak istatistiksel çözümleme gerçekleştirme ve bundan kötü hata hesaplamak.
5. taze ağırlık tespiti
- Tüm yaprak sapları rozet koşul bir tıraş bıçağı ile başına altı bitkilerden gelen dahil olmak üzere kaldırın. Bütün yaprakları hemen tartmak bulunmaktadır ve verileri İstatistiksel analizler için yukarıda açıklandığı gibi.
6. rozet yaprak alanı belirlenmesi
- Koşul başına sekiz bitkiler resimlerden yaprak alanı grafik olarak çözümlemek için kullanın. Resimleri tek bir görüntüde bir koşul için birleştirmek ve *.jpeg kaydedin veya * .tiff.
- Uygun yazılımı (malzemeler tablo) indirin.
Not: Bu, tabii ki, bu görev sahip başka bir program uygulamak mümkündür. - Bir görüntü dosyasını açın. "Serbest el seçimi." Aracı'nı seçin Yaprak sapları bir rozet de dahil olmak üzere çevreler. Tıkırtı üstünde "Analiz - set ölçümleri" ve "Alan", "Min ve Max gri değeri," kontrol "Entegre yoğunluk" ve "Ortalama gri değer." Uygun ondalık yerler, en iyi iki ya da üç seçin ve "Tamam."
- 2 piksel yerine mm almak için "ölçek set" komutunu kullanın. Bilinen bir mesafe için örneğin kolay görüntüleri, ölçek çubuğundan hesaplamak o zaman ölçeği ayarla iletişim kutusunu açmak ve bu tanımlanmış mesafe ve birimi girin bırak çapı karşılık gelen satır seçim yapmak için normal amortisman seçim aracını uygulamak ölçüm. "Analiz" ve "ölçü" tıklatın geri dön
- Yeni bir pencere "başlıklı sonuçları geçerli rozet için ilgili verileri içeren" görüntülenir. Görüntüdeki tüm bitkiler ile bu yordamı yineleyin ve alan ölçüleri ile Ctrl + M yeni her bitki için başlatılamıyor.
Not: Üst üste yaprakları ile daha küçük bitkiler için "değnek aracı" daha kolay ve hızlı işlem yapmak için kullanılabilir. Yaprakları birbirine kapsayan başlar başlamaz bu aracı güvenilir sonuçlar vermez. - Alternatif olarak, tüm yaprakları kesti ve bir genel bakış resim alınabilir ve Değnek aracını kullanın bir şekilde pozisyon. Bu yöntemi kullanırken, daha fazla bitkiler ihtiyacı olduğunu göz önünde bulundurun.
- "Dosya"-"Farklı Kaydet" sonuçları penceresinde ve uygun dosya adını ve konumunu bilgisayar Rehberi oluşturmak. Dosyayı otomatik olarak Excel biçiminde kaydedilir.
7. RNA hazırlanması
- Üç örnek her koşul için on bireysel bitkilerden hasat. Toplam RNA bir bitki RNA ekstraksiyon kiti üreticinin talimatlarına göre kullanarak ayıklayın. RNA konsantrasyon, saflık ve bütünlük bir bioanalyzer kullanarak belirleyin. RNA daha sonra aşağı akım kullanma öyle aynı derecede qRT-PCR veya gen ifade analizi için örneğin tarafından RNASeq13kullanılabilir.
Representative Results
Gözlem ve analiz bitki büyüme ve özellikle fenotipleri mutant bitkilerden istikrarlı ve tekrarlanabilir çevresel koşullara güveniyor. Bunlar iklim odasında sağlanabilir. Işık miktarı ve özellikle kalite eleştirel hangi LED ışıklar tarafından sağlanan bu çalışmada istihdam ışık kaynağı bağlıdır.
Şekil 1 LED panelleri ile donatılmış bir iklimsel odası bir örneği gösterilir. Şekil 1A nerede tüm iklim ve ışık koşulları ayarlanabilir kontrol panelinin bir ekran gösterir. 24 saat içinde yirmi farklı zaman dilimlerini ayarlayabilirsiniz. Örneğin, uzun bir günün koşulları 16 ışık/8 h karanlık ile programlanmıştır. Bu odayı bitki büyüme dört farklı ışık ayarları, aynı çevre koşullarında tam olarak okudu hangi ayrı ayrı programlanabilir dört düzeyi özellikleri. Üst düzey sol teknik olarak mümkün olduğu kadar güneş ışığı taklit eden bir spektral çıkış için ayarlanmışsa, üst sağ düzeyi temsil kırmızı yüksek (660 nm) ve mavi ışık (440 nm) az olan beyaz ışık (3 K). Sol alt düzeyine yükseltilmiş mavi ışık ve ağırlıklı olarak kırmızı ışık doğru alt seviyeye ayarlandı. Şekil 1B LED (orta Masası) genel bir bakış ve ilgili zoom-ins (dış küçük paneller) olarak farklı ayarlar gösterilmektedir. Işık nitelikleri farkı kolayca göz tarafından görülebilir.
Dahili bir Spektrometre sürekli ölçer, izler ve spektral çıkış ayarlar. Şekil 2 güneş ışığı taklit etmek için ayarlanan üst sol düzeyindeki 1.1, spektrum gösterir. Standart floresan ampul için karşılaştırıldığında UV ve mavi ışık çok daha yüksek7bölümüdür.
Ekim tasvir sonra şekil 3 ' te A. thaliana örneği tüm dört koşulları 10, 13 ve 17 gün, sırasıyla, bitkiler. Tüm bitkiler aynı mesafede kamera üçayağa monte ederek çekildi. Ölçek çubuğu 1 cm temsil eder. 10 gün sonra boyutu veya rengi pek farkı ayırt edilebilir, ama 17 gün sonra kırmızı ışık altında daha hızlı bir büyüme açıktır. Bu görsel analiz yanı sıra, birçok fizyolojik analizleri yapıldı.
Şekil 4 hangi örneğin fotosentetik kapasiteyi inceliyor PAM ölçümlerin farklı adımlar izlenir. Şekil 4A bir ekran görüntüsü canlı video, hangi bitki odak haline getirmek için ayardır ölçümlerin en iyi kalite için gösterilir. Bütün bitki üzerinde odaklanmak yerine, bir de analiz etmek için tek bir sayfa seçebilirsiniz. Gerçek ölçüm başlamadan geçerli floresan verim Ft dark-adapted bir bitkinin şekil 4B gösterir. Bu durumda, ilgi (AOIs) beş dairesel alanları seçilmiştir. Her AOI yanında kırmızı kutuya sayıları doğrudan bir tablo şeklinde de kaydedilebilmesi için sayısal sonuç verir. Fotosentetik parametreleri Fo ölçüsü başlatmak ayarlamak Fm gerekir. Ft bir ekran görüntüsü-den sonra iş bu rakam 4 ctasvir edilir. Şimdi belgili tanımlık düğme "Fo, Fm" artık etkin değil unutmayın. Yeni bir ölçü başlatmak için "Yeni kayıt" önceki normalleştirme silmek için tıklandığında gerekiyor. Son olarak, şekil 4 d doyurarak hafif darbe ("SAT-darbe") verdikten sonra etkili PSII kuantum verimi Y(II) gösterir. Örnek veri miktar şekil 5' te gösterilen. 200 µM/cm2/s1 (şekil 5A) güneş ışığı altında yetiştirilen bitkileri Ekim, 12, 21 ve 28 gün sırasıyla analiz edildi. Bizim veri PSII verim yaprakları 12 gün üç hafta boyunca yetişen bitkilerden daha yüksek olduğunu göstermektedir. 28 ile 12 gün arasında fark hala önemlidir ama p-değeri yüksektir. Şekil 4B', farklı ışık nitelikleri üzerinden iki hafta boyunca yetişen bitkilerden PSII verimleri karşılaştırıldı. İlginçtir, mavi ışık yüksek bir kısmını içeren ışık altında kalıcı büyüme PSII bir önemli ölçüde daha fazla verim için yol açar. Benzer bir etki için zenginleştirilmiş kırmızı ışık altında yetiştirilen bitkiler gözlendi, ancak artış biraz düşüktü.
Farklı ışık nitelikleri etkisi stoma bantlı geliştirme14' e gösterildi. Bu nedenle, stomatal yoğunluğu araştırılmıştır. Şekil 6 yaprak pigment çıkarma sonra nasıl göründüğünü gösterir. Tek epidermal hücrelerin de ayırt edici olabilir ve stoma kolayca sayılabilir. Bu şekilde, bireysel stoma bantlı bir yıldız işareti ile gösterilir. Farklı ışık ayarları bitkilerden stomatal yoğunluğu hakkında ayrıntılı veriler9başka bir yerde bulunabilir.
Görsel denetleme (şekil 3) yanı sıra taze ağırlık iyi bir ölçü büyüme ilerleme sağlar. Bu örnekte Ekim sonra 8, 10 ve 12 gün sonra sırasıyla, "güneş"ışığı altında yetiştirilen bitkilerin yapraklarından tartıldı. Bu verilerin istatistiksel değerlendirme Şekil 7' de görülebilir. Beklendiği gibi taze ağırlığı zamanla artar.
Taze ağırlık yanı sıra büyüme için iyi bir ölçü yaprak alandır. Burada, bitki geliştirme (şekil 8A) Ekim 10, 13 ve 17 gün gelen izledi. En az altı bireysel bitkiler güvenilir istatistiksel veri elde etmek için düzenli olarak değerlendirildi. Yüksek örnek boyutu önemini göstermek için iki ve altı bitkileri, sırasıyla, analiz üzerinden ortalama değerinin yüzde hatası hesaplanmıştır (şekil 8B). Yani ortalama değeri ile ilgili olarak standart sapma yüzdesi belirlenmiştir. Bir küçük örnek boyutu durumunda hata 5-%10 daha yüksek bir örnek boyutu söz konusu olduğunda daha yüksek olduğu çok açıktır. Değerlendirilen bitkiler sayısını artırarak, hata, hangi veri çok daha net yorumu yapar en aza indirilebilir.
Şekil 1: farklı ışık nitelikleri LED'ler tarafından sağlanmaktadır. A) ekran LED odasının Denetim Masası'ndan. Gün uzunluğu 16 h (sağ üst) için küme ve ışık şiddeti 200 µmol cm-2 s-1için ayarlanır. Işık kalitesi her dört düzeyde farklıdır: 1.1 temsil eden bir spektrum ışığına teknik olarak mümkün benzer olarak, 1.2 temsil eden kırmızı ve mavi dalga boylarında (RB) ışık oranı yüksek, 2.1 mavi (B), 2.2 temsil ağırlıklı olarak kırmızı ağırlıklı olarak ayarla ışık (R). B) orta Masası tüm düzeyleri; özetini gösterir Dış kapı aynası içinde daha yüksek zoom bireysel düzeyleri göster. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: dalga boyu spektrum simüle güneş ışığı ayarlar arasýndan seçim yapýn. 1.1 düzeyinde yerleştirildi dahili Spektrometre LED odasında bir ekran görüntüsü gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: bitki bir hafta içinde gelişme. 10, 13 ve 17 DAS tüm dört ışık koşullarından temsilcisi A. thaliana bitkiler. Bitkiler bir tripod üzerinde bir dijital refleks kamera ile çekildi. Ölçek çubuğu tüm resimler için 1 cm temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: Ekran görüntüleri temsilcisi adımları A. thaliana bitkilerin PAM ölçümlerin. A) nerede görüntü odak ayarlanabilir "canlı video" görünümden ekran görüntüsü. B) geçerli Floresans verim Ft daha önce herhangi bir ışık darbeleri uygulanması. C) geçerli Floresans verim Ft Fo/Fm. ayarladıktan sonra D) etkileyen PSII kuantum verimi doyurarak ışık nabız ayarladıktan sonra. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: grafik gösterimini etkileyen PSII kuantum verimi (YII). A) verilerden sonra Ekim 12, 21 ve 28 gün bitkiler ve PAM analize tabi yetiştirilen küçük 200 µmol/cm2/s1 simüle güneş ışığı altında ("güneş ışığı") istatistiksel olarak değerlendirilmiştir. Beş bitkiler ve günde beş AOIs ortalama değerleri gösterilmiştir. Bir yıldız işareti gösterir bir p-değeri ile önemli bir fark < gün 12 ve iki yıldız belirtmek çok önemli farklılıklar bir p-değeri ile karşılaştırıldığında 0,05 < 0,02 göre Öğrenci t-testi. B) zenginleştirilmiş 200 µmol/cm2 /s1 altında simüle güneş ışığı (SL), mavi yetiştirilen bitkiler (B) veya kırmızı (K) gelen verileri ışık, sırasıyla, istatistiksel olarak değerlendirilmiştir. Beş bitkiler ve günde beş AOIs ortalama değerleri gösterilmiştir. Önemli farklılıklar "güneş ışığı" göre hesaplanmıştır
Şekil 6: stoma bantlı bir A. thaliana yaprak abaxial kenarındaki temsili resim. Yaprakları yukarıda açıklandığı gibi hazırlanmış ve görsel olarak bir ışık mikroskobunda DIC ayarları 40 X büyütme en analiz edildi. Stoma bantlı koşul başına en az 4 yaprak görünür bölgede dikkate alınır. Resmi mikroskop tubus bağlı bir dijital fotoğraf makinesi ile çekilmiş. Stoma bantlı mm² başına ölçek çubuğu yardımı ile hesaplanır. Yıldız tek stoma gösterir. Ölçek çubuğu 200 µm. temsil eden Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7: grafik olarak gösterilmesi, yetiştirilen A. thaliana bitkilerden taze ağırlık simule güneş ışığı/200 µmol/cm2/s1. Rozet yaprakları bitkilerden sekiz, on ve on iki gün sonra Ekim kesilmiş. Mg günde altı bitkilerden ortalama değerleri tasvir edilmektedir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 8: A. thaliana yaprak alanı farklı ışık koşulları altında yetişen bitkilerden istatistiksel değerlendirilmesi. A) A. thaliana 10, 13 ve 17 gün boyunca yetişen yaprak alandan grafik olarak ImageJ ve veri n ile belirlenen = 6 bitkiler istatistiksel olarak değerlendirilmiştir. Her durum tüm altı rozet yaprak alanından özetlenebilir ve altı ortalama değerlerini elde etmek için ayrılmıştır. Bu değer ile standart sapma hesaplanır ve bu hata çubukları tarafından temsil edilir. B) yaprak alanı grafik olarak ImageJ ve her iki n gelen verileri ile belirlenen 2 veya n = = 6 bitkiler, sırasıyla, A. paneli için açıklandığı gibi istatistiksel analiz edildi O zaman hata ortalama değer yüzdesi olarak hesaplanır ve grafik olarak tasvir. Yeşil çubuklarını göster yüzde hata çözümlemesi n = 6, Mavi çubuklar n = 2 bitkiler. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Bitki büyüme okuyan ilk adımı istenen koşullara göre iklimsel odası kurma. Bu kolayca ilgili yazılım (şekil 1A) programı maskeye tüm değişkenleri yazarak yapılır. Bu adımda, ışık rejimi ve/veya sıcaklık değiştirerek birçok değişiklikler uygulanabilir. Sürekli sıcaklık, nem ve ışık koşullarında (teknik deney bozma önlemek için,Şekil 2) izlemek emin olun. Tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için bir kritik nokta bu. Bu kurulum çok değişken sunuyor ve esnek şekilde ayarlanabilir olmasına rağmen kendi sınırlamaları vardır. Şu anda mevcut LED ışıklar güneş ışığı yüzde yüz taklit edemez ve iklimsel odası içinde iklim koşulları asla tamamen dış15tarihinde neler olduğunu yansıtabilir.
Yaygın olarak kullanılan karşılaştırıldığında floresan ampuller LED ışıkları daha çok yönlü, daha az enerji ihtiyacı ve hemen hemen hiçbir ısı radyasyon göstermektedir. Bu avantajları iklim odaları ve LED16seralara donatmak için kapalı tarım büyük sanayi açmıştır. Büyük başarı dikkate alınarak, bu alanda LED tekniği kesinlikle çok daha fazla uygulama bulabilirsiniz bildirdi.
Fenotip gözlemleyerek ve özellikle dikkate almak önemlidir yaprak alanının belirlenmesi için bu büyük bitkilerde örtüşme (şekil 3) bırakır. Böylece, Bütün rozet grafik değerlendirilmesi imprecise olma eğilimindedir. Bu durumda, tüm yaprakları kesip oradan gitmek çok daha doğrudur.
Büyüme davranış değerlendirilmesi ve özellikle farklılıklar büyüme ve gelişme farklı koşullar altında yeterli bir örnek boyutuna bağlıdır. Bu çalışmada en az altı bitkiler örneğin fotosentetik verim (şekil 5), taze ağırlık (Şekil 7), belirlenmesi için kullanılan ve yaprak alanı (şekil 8A) ama 30 bireysel tohum emin olmak için çalışma başlangıcında dikilmiştir ilk, yeterli tohum çimlenme ve ikinci olarak, "tipik" bitkilerin bir seçim yapılabilir. Aynı nüfus, Yani bitkiler tek tencere içinde tam olarak aynı koşullarda, aynı tepsi içinde bile değişen fenotipleri gösterdi. Bu sonra tabii olarak standart sapma istatistiksel çözümleme sırasında yansıtılır, ama küçük istatistiksel hataları (8B rakam) gözlendiğinde veri yorumlanması genellikle daha güvenilirdir.
PAM (şekil 4, şekil 5) tarafından fotosentetik performans ölçümü için birkaç parametre yapılabilir. Bu durumda, PSII verim Y(II) örnek olarak odak oldu ama örneğin olmayan fotokimyasal Şoklama, düzenlenmiş ve sigara düzenlenir enerji dağıtımı veya hafif remisyon kuantum verimi de belirlemek mümkündür. İşte yaprak yaprak yüzeyi boyunca eşit olarak dağıtılmıştır başına en az beş AOIs seçin ve ardından en az altı farklı bitki yapraklarından ölçmek için önemli. Bu yöntemin dezavantajı PSI üzerinde herhangi bir etkileri tespit edilemez olduğunu; Bu amaç için gerekli olan farklı ekipman.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
F.S. destek Rhenac Green Tec AG'nin bu çalışmanın bölümleri kabul eder. JS ve B.B. DFG (SFB TR175) fon aldı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Climatic chamber equipped with LED panels | Rhenac Green Tec AG | These chambers are custom made. | |
| Spectrometer | OceanOptics | USB-650 | |
| Imaging PAM | Walz | IMAGING-PAM M-Series | There are several suitable models depending on the broader use. |
| Microscope+ 40x objective | Leica | DM1000 | Other companies also produce suitable microscopes. |
| Software ImageJ | Free download from website | ||
| Plant RNA extraction kit | Qiagen | 74903 | |
| Bioanalyser | Agilent | G2939BA | Needs an additional computer |
References
- Arabidopsis Genome Initiative. Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).
- An, G., Watson, B. D., Chiang, C. C. Transformation of Tobacco, Tomato, Potato, and Arabidopsis thaliana Using a Binary Ti Vector System. Plant Physiology. 81 (1), 301-305 (1986).
- Schiml, S., Fauser, F., Puchta, H. Chromosome and Genomic Engineering in Plants: Methods and Protocols. Murata, M. , Springer New York. New York, NY. 111-122 (2016).
- Rivero, L., et al. Arabidopsis Protocols. Sanchez-Serrano, J. J., Salinas, J. , Humana Press. Totowa, NJ. 3-25 (2014).
- Ubbens, J. R., Stavness, I. Deep Plant Phenomics: A Deep Learning Platform for Complex Plant Phenotyping Tasks. Frontiers in Plant Science. 8 (1190), (2017).
- Cosgrove, D. J. Rapid Suppression of Growth by Blue Light: OCCURRENCE, TIME COURSE, AND GENERAL CHARACTERISTICS. Plant Physiology. 67 (3), 584-590 (1981).
- Seiler, F., Soll, J., Bölter, B. Comparative Phenotypical and Molecular Analyses of Arabidopsis Grown under Fluorescent and LED Light. Plants. 6 (2), 24 (2017).
- Janda, M., et al. Growth and stress response in Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana, Glycine max, Solanum tuberosum and Brassica napus cultivated under polychromatic LEDs. Plant Methods. 11 (1), 31 (2015).
- Olle, M., Viršile, A. The effects of light-emitting diode lighting on greenhouse plant growth and quality. Agricultural and food science. 22 (2), 12 (2013).
- Lin, K. -H., et al. The effects of red, blue, and white light-emitting diodes on the growth, development, and edible quality of hydroponically grown lettuce (Lactuca sativa L. var. capitata). Scientia Horticulturae. 150, 86-91 (2013).
- Castronuovo, D., et al. Light spectrum affects growth and gas exchange of common dandelion and purple coneflower seedlings. International Journal of Plant Biology. , (2016).
- Student, THE PROBABLE ERROR OF A MEAN. Biometrika. 6 (1), 1-25 (1908).
- Database, J. S. E. Essentials of Genetics. RNA-Seq. JoVE. , (2017).
- Klermund, C., et al. LLM-Domain B-GATA Transcription Factors Promote Stomatal Development Downstream of Light Signaling Pathways in Arabidopsis thaliana Hypocotyls. The Plant Cell. 28 (3), 646-660 (2016).
- Annunziata, M. G., et al. Getting back to nature: a reality check for experiments in controlled environments. J Exp Bot. 68 (16), 4463-4477 (2017).
- Palus, S. Japan's Massive Indoor Farm Produces 10,000 Heads of Fresh Lettuce Every Day. Smithonian.com. , (2014).
