Summary
الأساليب التقليدية لتقييم التمايز أديبوجينيك رخيصة وسهلة الاستخدام، ولكن لا تقتصر على التغيرات في التعبير الجيني. وقد وضعنا مقايسة التحديد الكمي لتمايز الخلايا الوسيطة في adipocytes ناضجة باستخدام علامة محددة نسب. هذا التحليل قد تطبيقات متنوعة عبر البحث الأساسي والطب السريري.
Abstract
صبغات عديدة متاحة حاليا للاستخدام في الكشف عن تمايز الخلايا الوسيطة في adipocytes. الأصباغ، مثل "النفط الأحمر س"، رخيصة وسهلة الاستخدام والاستفادة منها على نطاق واسع بمختبرات تحليل إمكانات أديبوجينيك الخلايا الوسيطة. ومع ذلك، فليست محددة للتغييرات في النسخ الجيني. وقد وضعنا مقايسة المفاضلة الخاصة بالجينات لتحليل عندما تحول خلية الوسيطة مصيرها إلى نسب أديبوجينيك. وضع العلامات المناعية ضد الأحماض الدهنية ملزمة البروتين-4 (FABP4)، علامة خاصة بالنسب للتفريق بين أديبوجينيك، مكن التصور والتقدير الكمي للخلايا المتمايزة. القدرة على تحديد إمكانية التفريق أديبوجينيك الخلايا الوسيطة في شكل 96 ميكروسكوبية جيدا قد آثار تبشر بالخير بالنسبة لعدد من التطبيقات. مئات تجارب السريرية تنطوي على استخدام الخلايا اللحمية الوسيطة الكبار ومن الصعب حاليا لربط النتائج العلاجية داخل، ولا سيما بين تلك التجارب السريرية. هذا الإنزيم FABP4 الفائق بسيطة تنص تحليل كمي لتقييم إمكانات تمايز الخلايا المستمدة من المريض، وهو أداة قوية لمقارنة مختلف أساليب العزل والتوسع. وهذا أهمية خاصة نظراً لتزايد الاعتراف بعدم تجانس الخلايا تدار للمرضى في المنتجات الوسيطة الخلية. أيضا قد المقايسة الفائدة المحتملة في فحص المخدرات عالية الإنتاجية، خاصة في السمنة ومرض السكري قبل البحث.
Introduction
أحد المتطلبات الرئيسية التي أنشأها "المجتمع الدولي" للعلاج الخلوي (إيسكت) لتحديد خلية stromal mesenchymal multipotent أن الخلايا يجب أن يكون لديك القدرة على التفريق في أديبوجينيك، أوستيوجينيك والأنساب تشوندروجينيك 1-الطرق التقليدية لقياس التمايز في هذه السلالات الثلاث تعتمد على الكشف عن منتجات الجزيئات باستخدام الأصباغ الكيميائية1. الأصباغ مثل "النفط س الأحمر" (الذي البقع قطرات الدهون في الخلايا التي خضعت أديبوجينيسيس)، رخيصة وسهلة الاستعمال؛ إلا أنها تفشل في الكشف عن التغييرات المحددة في تعبير الجينات التي تحدث عند التفريق بين الخلايا الوسيطة في كل النسب الخاصة بكل منها2. هنا، وقد وضعنا مقايسة المفاضلة التي يوضحها التعبير البروتين لعلامة خاصة بنسب أديبوجينيك، الأحماض الدهنية ملزمة البروتين-4 (FABP4)3،،من45. FABP4 عثر عليها في البداية في 3T3-L1 مورين adipocytes3 وتبين فيما بعد أن يتم التعبير عنها في الأنسجة الدهنية تحت الجلد البشرية6. هو بروتين سيتوسوليك، التي تعمل بوصفها كوصي لتوجيه امتصاص الأحماض الدهنية من الخلايا وهي تشترك في عملية lipolysis4.
وكانت الخلايا السليفة المستخدمة لفحوصات التمايز المشتقة الوسيطة stromal الخلايا الدهنية (الخزفية)7،8. الخزفية بمشاركة العديد من الخصائص مع المشتقة من نخاع العظام الخلايا الجذعية الوسيطة (بي أم-MSCs)، عدد سكان رئيسية خلية الجذعية الوسيطة في البالغين8،9. الخزفية توفر العديد من المزايا BM-MSCs في تطبيق السريري، كما يمكن أن يكون العائد أكبر من الخلايا المعزولة من أنسجة أكثر سهولة مصادر8،9. يحتاج سكان خلية معزولة للوفاء بمعايير معينة يمكن تحديدها الخزفية. أولاً، يجب أن يظهروا الانضمام إلى السفن البلاستيكية زراعة الأنسجة في الظروف القياسية الثقافة1. يجب أن يظهروا أيضا محددة مستضد السطحي التعبير1. تتميز الخزفية جاهل بتعبير إيجابي للمستضد السطحي CD34، CD73، CD90، منخفضة من التعبير عن CD105 والتعبير السلبي CD45 والدكتور هلا10. الخزفية تنقيته من استزراع البلاستيك لمدة 28 يوما (تمسكا تنقية الخزفية) إظهار التعبير الإيجابي CD73 و CD90 و CD105 والتعبير السلبي CD34، CD45 والدكتور هلا10. وأخيراً، يجب أن تحتفظ الخلايا القدرة على تمييز في مختلف الأنساب1،،من78.
أديبوجينيك التمايز البروتوكولات حمل upregulation ضرب من التعبير FABP4 بين جينات أخرى النسب adipocyte، حتى نتمكن من استخدام إيمونوتشيميستري لتصور FABP4 البروتين داخل الخلايا، وثم كمياً FABP4 التعبير على مستوى الخلية الواحدة استخدام مجهر فحص محتوى عالي فلورسنت الآلي. هذا الأسلوب مفيد على الأصباغ التقليدية حيث أنه يمكن تأكيد التمايز adipocyte-نسب محددة للغاية. هذه فحوصات محددة النسب الجينات جنبا إلى جنب مع المحتوى العالي من فحص أساليب أيضا تمكين التحديد الكمي لنسبة الخلايا ضمن تحضير خلية غير متجانسة قادرة على التمايز إلى أسفل نسب معينة. في دراساتنا استخدمنا الإنزيم FABP4 لتأكيد فقدان إمكانية التفريق أديبوجينيك الخزفية طازجة معزولة بعد زراعة الخلايا.
Protocol
1. إعداد الخزفية لفحوصات التمايز
- إعداد الكواشف زراعة الأنسجة والتعامل مع الخلايا الحية في غطاء زراعة الأنسجة عقيمة.
- إعداد متوسطة A0: دولبيكو تعديل النسر المتوسطة ولحم الخنزير في F12 المتوسطة (DMEM/F12)، 1 x جلوتاماكس، 1 x البنسلين/ستربتوميسين.
- إعداد كاملة ASC المتوسطة: DMEM/F12، x glutamax 1، 1 x البنسلين/ستربتوميسين، 10% مصل بقرى الجنين.
- استخدام ملتصقة تنقية الخزفية، توسعت في قارورة ثقافة T75. وتؤكد نقاء الخزفية باستخدام خلية تنشيط fluorescence الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية)10.
- فصل الخلايا عن طريق إزالة المتوسطة كل من قارورة الثقافة T75 وإضافة 2 مل إنزيم تفكك خلية.
- ترك قارورة الثقافة في الحاضنة (37 درجة مئوية، هوميديفيد، 5% CO2) لمدة 5-10 دقائق. تأخذ قارورة الثقافة خارج الحاضنة، واضغط بشدة على الجانب من قارورة. تحقق إذا فصل الخلايا من قارورة ثقافة استخدام مجهر مقلوب.
- إضافة 13 مل من A0 المتوسطة قارورة ثقافة T75.
- نقل 15 مل إلى 15 مل أنبوبة الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ز لمدة 5 دقائق.
- تجاهل المادة طافية وإعادة تعليق بيليه الخلية في 1 مل من إكمال ASC المتوسطة.
- القيام بعدد خلايا استخدام هيموسيتوميتير.
- تمييع تعليق خلية لتركيز خلايا 25,000 مل-1 في إكمال ASC المتوسطة.
- إضافة 200 ميليلتر من A0 المتوسطة لجميع الآبار محيط اللوحة جيدا 96 (مسطحة القاع). وهذا يقلل معدل التبخر من الآبار التي تحتوي على خلايا في المركز.
- نقل 200 ميليلتر من تعليق خلية للوحة ميكروويل لتحقيق كثافة خلية الأخيرة من 5 × 103 خلايا كل بئر. وتلزم أربعة آبار لكل مجموعة العلاج (يكرر ثلاث تقني وعنصر تحكم جسم الابتدائي ليس إيمونوسيتوتشيميستري (المحكمة الجنائية الدولية)).
- اترك لوحة ميكروويل في الحاضنة (37 درجة مئوية، هوميديفيد، 5% CO2) حتى خلايا الوصول إلى التقاء (3-4 أيام).
2-الذي يحفز التمايز الخزفية
- إعداد متوسطة التمايز أديبوجينيك بتكميل المتوسطة ASC كاملة مع 1 ميكرومتر ديكساميثاسومي، 10 ميكرون الأنسولين و 200 ميكرومتر الاندوميتاسين. متوسطة التمايز كاملة مستقرا عند 4 درجات مئوية لمدة شهر واحد، وجعل ذلك فقط كما هو مطلوب للمقايسة 1. مخزن في 4 درجات مئوية، وعند الاقتضاء الحرارة قاسمة إلى 37 درجة مئوية في حمام الماء.
- بعد 3-4 أيام، تأخذ لوحة ميكروويل خارج الحاضنة واستبدال نصف المتوسط الثقافة مع متوسطة التمايز أديبوجينيك.
- القيام بتغيير متوسطة الحجم كل 2-3 أيام.
ملاحظة: يتطلب التمايز أديبوجينيك الأمثل 14 يوما للثقافة في متوسطة التمايز. ويتم تحليل الخلايا المتمايزة باستخدام الصبغة التقليدية القائمة على البقع والبقع الخاصة بالجينات.
3-تلطيخ للتمايز-الصبغة التقليدية القائمة على البقع
- إعداد 4% فورمالدهايد الحل بتمييع فورمالدهايد 16% مع برنامج تلفزيوني. إضعاف المبلغ اللازم للتجربة ومخزن محكم مختومة في أنبوب الطرد مركزي فقط.
تنبيه: فورمالدهايد هو مادة مسرطنة محتملة ويمكن أن يسبب تهيج للأنف والحنجرة والرئتين عند استنشاقه. القيام بجميع الإجراءات المتصلة والفورمالديهايد في غطاء دخان. - تحضير حل مخزون "النفط الأحمر يا" بتذويب 300 ملغ في 100 مل الكحول.
- أن لوحة ميكروويل خارج الحاضنة. ويمكن تنفيذ الخطوات التالية في بيئة غير معقمة.
- إزالة كافة المتوسطة من الآبار وإصلاح الخلايا مع 4% فورمالدهايد لمدة 30 دقيقة.
- خلال فترة حضانة المرض، يعد الحل العامل "س الأحمر النفط". حل العامل يضم أجزاء 6 "س الأحمر النفط" المخزون مع 4 أجزاء المقطر المياه (dH2س). مزيج جيد والسماح للجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة، قبل تصفية باستخدام 0.2 ميكرون تصفية وحدة. يعمل الحل فقط مستقرة ح 2.
- إزالة فورمالدهايد جميع من الآبار بواسطة بيبيتينج.
- يغسل خلايا مرة واحدة مع الايزوبروبانول 60% وترك الآبار جافة تماما قبل المتابعة.
- إضافة 50 ميليلتر من "النفط الأحمر يا" العامل الحل لكل بئر واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
- إزالة الحل "يا الأحمر النفط" وإضافة فورا dH2يغسل سين مع dH2س 4 مرات قبل العرض تحت المجهر الخفيفة.
4-تلطيخ للتمايز-الأجسام المضادة الخاصة بالجينات
- إعداد المخزون حل تريس مخزنة المالحة (تبس) بإذابة 80 جرام من كلوريد الصوديوم، ز 2 من بوكل و 30 غ من قاعدة تريس إلى 1 لتر من dH2س (pH 8). تحضير حل العامل بتمييع 01:10 باستخدام dH2"مخزن سين" في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد إيمونوبوفير (IB) (1% الجنيني البقري المصل (FBS) في تبس). تسمية الأنبوب الطرد المركزي 15 مل مع التاريخ وتخزينها في 4 درجات مئوية. يمكن استخدام IB لمدة أسبوع واحد من التاريخ.
- تحضير مانع الكازين 0.25% بإذابة 0.5 غ من الكازين و 0.195 ز من أزيد الصوديوم في 200 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). تماما تذوب المكونات بالتحريك بين عشية وضحاها. قاسمة في أنابيب الطرد المركزي 15 مل ومخزن في ثلاجة-20 درجة مئوية. يمكن الاحتفاظ بحلول الكازين المذابة في 4 درجات مئوية لمدة شهر واحد.
- تحضير حل DAPI بإضعاف الأسهم DAPI 1: 200 في مخزن tbs. عند 4 درجة مئوية، محمية من الضوء.
- تحضير حل thimerosal الأسهم (ملغ 10 مل-1) بإذابة thimerosal في برنامج تلفزيوني العقيمة. تخزين في 4 درجات مئوية، وتمييع المبالغ المناسبة إلى 0.4 مغ مل-1 للاستخدام.
- إصلاح وبيرميبيليزي الخلايا التي تحتوي على الميثانول المثلج (لوحة جيدا 96) للحد الأدنى 5 يغسل خلايا مرة واحدة مع 200 ميليلتر من tbs.
- كتلة مع 50 ميليلتر من الكازين 0.25% في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق ويغسل مرة واحدة مع tbs.
- إضافة 50 ميليلتر من الأجسام المضادة الأساسي المخفف في المكتب الدولي (انظر الجدول 1 لتفاصيل جسم) واحتضان مع أغطية مغلقة ح 1.
- أغسل مرة واحدة مع 200 ميليلتر تبس, وبعد ذلك 3 مرات مع TBS لمدة 5 دقائق مع هزاز لطيف.
- إضافة 50 ميليلتر من الأجسام المضادة الثانوية المخفف في المكتب الدولي (انظر الجدول 2 للحصول على تفاصيل جسم) مع 1:2000 DAPI في كل مجال، احتضان مع أغطية مغلقة حاء 1 غطاء اللوحة مع إحباط لمنع تبييض الصورة.
- أغسل مرة واحدة مع TBS، ومن ثم مرتين مع TBS لمدة 15 دقيقة مع هزاز لطيف.
- إزالة جميع TBS وإضافة 200 ميليلتر لحل thimerosal.
- تخزين اللوحة عند 4 درجة مئوية، محمية من الضوء حتى التصوير.
5-تصوير الخلايا باستخدام "المجهر" الفائق
- تحليل الخلايا ملطخة بأجسام مضادة محددة الجينات و fluorophore أضداد الثانوي مترافق (الفلورة) استخدام مجهر فحص محتوى عالية يسيطر مع المصاحبة للبرنامج.
- تحميل لوحة ميكروويل إلى مرحلة المجهر. على اقتناء لوحة التحكم، حدد الصورة بتكبير متوسطة المدى (10 X عدسة الهدف). تأكد من أن يتم أخذ صور من وسط كل بئر، مع 50 ميكرومتر التباعد بين كل موقع للتأكد من أن خلية واحدة لا تظهر في حقلين متجاورة.
- تحديد الآبار الصورة.
- حدد تركيبات القناة الملائمة وزمن التعرض للضوء ومعلمات z-الإزاحة. الرجوع إلى الجدول 3 للحصول على معلومات أكثر تفصيلاً لكل المرشحات (تكميلية الجدول 2).
- الحصول على التحليل استخدام معالج اقتناء (يتم تخزين الصور تلقائياً إلى ملقم قاعدة البيانات).
- استخدام تركيبات قناة بديلة للحصول على لوحات ملطخة "الأحمر النفط" سين (تكميلية الجدول 3).
6-تحليل الصورة المكتسبة
ملاحظة: بعد الوصول إلى قاعدة بيانات ملقم تمكن سهلة وسريعة التقييم الصور المكتسبة واستخدام برمجيات تحليل الصورة.
- فتح "خلية سجل" وحدة على البرمجيات التحليل.
- الكشف عن نواة الخلية باستخدام DAPI قناة (العلامة النووي) ونوى قطعة من الفائدة مع المعلمات المعرفة من قبل المستخدم لحجم وإشارة كثافة فوق الخلفية.
- الكشف عن إشارة FABP4 باستخدام قناة فيتك. تقسيم الخلايا المتمايزة مع المعلمات المعرفة من قبل المستخدم لكثافة حجم والإشارات أعلاه معلومات أساسية لتحديد جميع المناطق الإيجابية FABP4 في كل صورة.
- فتح الوحدة النمطية ترانسفلور في البرنامج التحليل إلى تحليل لوحات ملطخة "الأحمر النفط" o.
- تحديد حجم وكثافة "النفط س الأحمر" الملون المناطق ك 'الحفر'.
Representative Results
في هذه الدراسة تم قياس إمكانات التمايز أديبوجينيك الخزفية مع 3 طرق مختلفة. وسم إيمونوفلوريسسينت من FABP4، وأظهرت أن هذه العلامة مترجمة إلى السيتوبلازم للتمييز بين الخلايا، ووسم تتداخل مع أنوية المسمى DAPI (الشكل 1A). وكشف تحليل الصور الآلي زيادة إضعاف 24.6 في المائة من خلايا FABP4 إيجابية في مجموعة متباينة في خلايا المرور المبكر مقارنة بزيادة إضعاف 6.9 في أواخر مرور الخلايا (الشكل 1B). النفط تلطيخ "س الأحمر" كان المترجمة إلى قطرات الدهون المنتشرة في جميع أنحاء سيتوسول الخلايا المتمايزة، ووسم نادراً ما تتداخل مع أنوية المسمى DAPI؛ ومع ذلك هناك من التفتيش البصري، أقل نوى الخلايا المرتبطة "النفط الأحمر يا" قطرات الدهون في الخلايا مرور وقت متأخر مقارنة بأوائل مرور الخلايا (الشكل 2A). وكشف تحليل الصور الآلي زيادة إضعاف 11.1 في مجال "النفط الأحمر يا" تلطيخ كل خلية في وقت مبكر مرور الخلايا وزيادة إضعاف 53.9 في تلوين المساحة لكل خلية في وقت متأخر مرور الخلايا (الشكل 2). تصوير كل البقع قد أنجز، وثم كمياً باستخدام "خلية التسجيل" (FABP4) أو ترانسفلور (الزيت الأحمر س) الوحدة النمطية في البرنامج (التكميلية الرقم 1، والتكميلية الجدول 2-5). وأكد أوبريجوليشن التعبير FABP4 تحليل لطخة غربية (الشكل 3، تكميلية الشكل 5). جميع أساليب تحليل 3 كشفت أن أوائل مرور الخزفية أعلى تمايز أديبوجينيك المحتملة من أواخر مرور الخلايا. التفريق بين أديبوجينيك لم يؤثر على عدد خلية الإجمالي لكل بئر (التكميلي رقم 2، 3). ومع ذلك، كان حجم نويات الخلايا FABP4-الإيجابية التي ميزت أصغر بكثير من الخلايا التحكم لتأخر مرور الخزفية فقط (التكميلية الرقم 3)-
أظهرنا أن خلايا تم التوسع في الثقافة، أو باساجيد، النسبة المئوية للخلايا داخل ثقافة قادرة على التمايز أديبوجينيك انخفاض، بما يتفق مع البيانات المنشورة سابقا11. من المهم أن نلاحظ أن عوامل مثل السن، ومؤشر كتلة الجسم أو التاريخ الطبي السابق12 يمكن أن لا تسيطر عليها في هذه الدراسة ويرجح أن ساهم التغير الملاحظ بين عينات مختلفة من الجهات المانحة (تكميلية الجدول 1).
الشكل 1 : إيمونولابيلينج FABP4 يبين أن أوائل مرور الخلايا التمايز أكبر المحتملة من بعد مرور الخلايا. A) تظهر الصور الممثل لمرور المبكرة والمتأخرة وخلايا متمايزة المسمى مع DAPI (النووية وصمة عار) و FABP4 جنبا إلى جنب مع دمج وتقسيم الصور. تجزئة عرض صور متباينة الخلايا بتراكب أخضر وخلايا غير متمايزة بتراكب حمراء. ب) زيادة كبيرة في FABP4 التعبير عن الخلايا لوحظ مع التمايز أديبوجينيك في خلايا المرور المبكرة والمتأخرة، بيد أن أوائل مرور الخلايا أظهرت زيادة أكبر بكثير في التمايز من أواخر مرور الخلايا (مان ويتني اختبار * يدل ف < 0.05 و * * * يدل ف < 0.001). البيانات المعروضة هو المتوسط عبر ممر المبكر (p4; n = 8) أو مرور وقت متأخر (p10; n = 4) عينات المانحين، ± sem. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 : "س الأحمر" النفط تلطيخ يبين أن أوائل مرور الخلايا التمايز أكبر المحتملة من بعد مرور الخلايا. أ) وترد صور الممثل DAPI (النووية وصمة عار) والنفط الأحمر يا (رمادي والدهن الحبرية وصمة عار) جنبا إلى جنب مع دمج وتقسيم الصور. الصور تجزئة تصور جميع الأنوية مع تراكب الخضراء و "النفط الأحمر يا" الملون قطرات الدهن بتراكب حمراء. ب) ولوحظ مع التمايز أديبوجينيك زيادة كبيرة في مجال "النفط الأحمر يا" المصبوغة. وأظهرت أوائل مرور الخلايا مساحة أكبر من وصمة عار "زيت الأحمر يا" كل خلية بالمقارنة مع أواخر مرور الخلايا. يتم استخدام مجال "النفط الأحمر يا" تلطيخ كل خلية (ميكرو2) هنا كمقياس للتفريق أديبوجينيك المحتملة. البيانات المعروضة هو المتوسط عبر ممر المبكر (p4; n = 8) أو مرور وقت متأخر (p10; n = 4) عينات المانحين، ± ووزارة شؤون المرأة (اختبار "مان ويتني" * يدل ف = < 0.05 و * * * يدل ف = < 0.001). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : تحليل لطخة غربية لمستوى التعبير البروتين FABP4 المرور متمايزة المبكر والمتأخر الخزفية. تحليل شبه كمي للكثافة البصرية لعصابات FABP4 كنسبة من مجموع البروتين تحميل عنصر التحكم، بيتا أكتين (أكتب)، وأظهرت أن إيمونولابيلينج FABP4 قد زادت كثيرا في سن مبكرة وإلى ممر أواخر أقل درجة متباينة الخلايا. البيانات المعروضة هو المتوسط عبر ممر المبكر (p4; n = 8) أو مرور وقت متأخر (p10; n = 4) عينات المانحين، ± ووزارة شؤون المرأة (اختبار "مان ويتني" * يدل ف = < 0.05 و * * * يدل ف = < 0.001). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| مستضد الهدف | ايستب (استنساخ) | الأنواع | تمييع |
| FABP4 | [بولكلونل] | الأرنب | 1: 100 |
الجدول 1: جسم الأولية
| استهداف جسم | تسمية فلوروفوري | الأنواع | تمييع |
| مفتش الأرنب | مخفضات أليكسا 488 | ماعز | 1: 200 |
الجدول 2: جسم الثانوية
التكميلية الرقم 1: نظرة عامة على بيئة ظاهرية تحليل الصورة. تم تصويرها الخلايا الملون باستخدام مجهر فلوري الآلي، الفائق لتجنب أي مصدر للتحيز. الصور المكتسبة باستخدام XLS مايكرو إيماجيكسبريس، وحفظها مباشرة إلى قاعدة بيانات إدارة البيانات مدكستوري، ومتاحة للعرض من خلال اتصالات سطح المكتب الظاهري، الذي استخدام المستخدمين لتحسين واختبار تحليل محدد المعلمات الخاصة بهم. وجرى تحليل الصور مع مثيل مخصص 'التشغيل التلقائي' الذي يتيح لعدة مستخدمين مختلفة لإرسال 'وظائف' إلى قائمة انتظار التشغيل التلقائي. يمكن للمستخدمين استرداد البيانات الخاصة بهم عن طريق المثيل الافتراضي بمجرد الانتهاء من 'عملهم'. اضغط هنا لتحميل هذا الرقم-
التكميلية رقم 2: مقارنة بين مجموع الخلية عد كل من التحكم جيدا ومتباينة الآبار لمرور المبكرة والمتأخرة الخزفية، باستخدام FABP4 الملون لوحة. البيانات المعروضة هو المتوسط عبر ممر المبكر (p4; n = 8) أو مرور وقت متأخر (p10; n = 4) عينات المانحين، ± sem. كان هناك لا فرق معتد به إحصائيا بين التحكم وخلايا متمايزة لمرور المبكرة والمتأخرة على حد سواء الخزفية. وهناك المزيد من الخلايا الواحدة وكذلك لخلايا المرور المبكر مقارنة بأواخر مرور الخلايا. اضغط هنا لتحميل هذا الرقم-
التكميلية رقم 3: مقارنة بين مجموع الخلية عد كل من عنصر التحكم جيدا ومتباينة، الآبار لمرور المبكرة والمتأخرة الخزفية، استخدام "النفط س الأحمر" الملون لوحة. البيانات المعروضة هو المتوسط عبر ممر المبكر (p4; n = 8) أو مرور وقت متأخر (p10; n = 4) عينات المانحين، ± sem. كان هناك لا فرق معتد به إحصائيا بين التحكم وخلايا متمايزة لمرور المبكرة والمتأخرة على حد سواء الخزفية. اضغط هنا لتحميل هذا الرقم-
التكميلية الرقم 4: كان الخلايا المتمايزة التي كانت FABP4 الإيجابية في فقرات لاحقة، منطقة نوى أصغر بكثير من الخلايا في آبار المراقبة. كان هناك لا اختلاف مهم إحصائيا في المجال النوى بين خلايا متمايزة والتحكم في سن مبكرة. البيانات المعروضة هو المتوسط عبر ممر المبكر (p4; n = 8) أو مرور وقت متأخر (p10; n = 4) عينات المانحين، ± sem. (test. تي مزاوج * * * يدل ف = < 0.001). تظهر يعني ± ووزارة شؤون المرأة). اضغط هنا لتحميل هذا الرقم-
التكميلية الرقم 5: "الصور الغربية" لطخة المواد الهلامية. قناة الأحمر يصور بيتا-أكتين. قناة الأخضر يصور إيمونولابيلينج FABP4. اضغط هنا لتحميل هذا الرقم-
التكميلية الجدول 1: معلومات كلينيكوباثولوجيكال من الجهات المانحة اضغط هنا لتحميل هذا الجدول.
التكميلية الجدول 2: تصوير الإعدادات (FABP4) اضغط هنا لتحميل هذا الجدول.
التكميلية الجدول 3: التصوير الإعدادات (الزيت الأحمر س) اضغط هنا لتحميل هذا الجدول.
التكميلية الجدول 4: جدول تحليل البارامترات المستخدمة (FABP4). خلية سجل الوحدة النمطية. اضغط هنا لتحميل هذا الجدول.
التكميلية الجدول 5: جدول تحليل المعلمات المستخدمة (الزيت الأحمر س). فلور عبر الوحدة النمطية. اضغط هنا لتحميل هذا الجدول.
Discussion
هذه الورقة تبين جدوى ومزايا إيمونولابيلينج FABP4 لدقة كشف وتحديد adipocytes ناضجة المستمدة من الخلايا اللحمية الوسيطة. FABP4 قادراً على الكشف عن التغييرات في التعبير عن نسب البروتين محددة3،4،5 في adipocytes ناضجة، خلافا للبعض يشيع استخدام الأصباغ التي تسمية الجزيئات التغييرات13،14 مثل "النفط الأحمر س"15و "النيل الأحمر"16 و "الأسود السودان"17. إيمونولابيلينج FABP4 يسمح لتصور وتحليل التغيرات في مورفولوجيا الخلوية. هذه هي ميزة مميزة على الأساليب المذكورة سابقا باستخدام النسخ العكسي الكمي PCR (RT-qPCR) الذي يحلل التغييرات على مستوى النص دون أي التخيل5،18،19 ،20، أو التدفق الخلوي التي تتطلب الخلايا في تعليق20، أو الغربية النشاف التي تتطلب الخلايا أن تفكيك لعزل بروتين19،20. إيمونولابيلينج FABP4 هو مستقر في الخلايا الثابتة وعدم تسرب في الحل ويجري بروتين سيتوسوليك عندما وصفت في أحادي الطبقة ملتصقة من الخلايا، وتداخل مع نواة السماح للتصور سهلة وأضاف الدقة في التحليل الآلي.
فحص المحتوى السامي مفيد لأنها سريعة ودقيقة، واستنساخه وموضوعية. فإنه يوفر منبرا لاستخدام فعالة من حيث التكلفة من الكواشف ووقت الباحث، نظراً للحصول على الصور، وتحليل تتطلب الحد الأدنى من التلاعب اليدوي وتعتمد على المعالجة التلقائية للصك. وتم تحديد عدة عوامل ذات أهمية حاسمة للدقة وإمكانية تكرار نتائج الفحص عالية المحتوى فحوصات31. التحديد الكمي للتعبير مستضد يعتمد على جودة الصورة. لتحليل الصور الناجحة، يجب أن يكون في التركيز الصور من كل قناة لكل بئر وتقع ضمن مجموعة ديناميكية أمثل لقيم الرمادي (كشف تلقائي إعدادات مثالية). للخروج من التركيز أو الصور المشبعة تؤدي إلى نتائج خاطئة.
فيما يلي بعض القيود المحتملة من الطرق الموضحة في هذه المقالة. الشرط للبرمجيات المتخصصة والمعدات وتحليل التصوير. بينما خارج نطاق هذه المقالة، يمكن استخدام خيارات البرامج البديلة المفتوحة المصدر (على سبيل المثال، إيماجيج،من3233، فيجي34،32،سيلبروفيلير35) القيام بتجزئة الصورة مماثلة المهام؛ إلا أنها تتطلب مهارات أما تحميل وتكييف وحدات الماكرو المتوفرة على الإنترنت أو كتابة وحدات الماكرو/أوامر لأنابيب تحليل خاص بهم. الملازمة لأنابيب تحليل التصوير الآلي كل شيء مستوى الضوضاء الخلفية. وهذا يمكن أن يعزى إلى حد كبير إلى الحطام، خطأ الصورة رديئة النوعية أو التحليل، وإذ تشدد على الحاجة إلى إعداد نموذج دقيق وإعداد دقيق منهاج التصوير والتحليل. تم العثور على التسمية FABP4 في الفئران للكشف عن30من فروعه غير متمايزة؛ بينما الضوابط في هذه الدراسة (التي تتكون من خلايا غير متمايزة) خالية من تلطيخ FABP4 محددة. هذا عشرات الأطفال دون سن الخامسة متمايز ضرورة تدقيق التعبير FABP4 فروعه في كل سياق البيولوجية التي يعمل فيها المقايسة.
أجل مقارنات صحيحة بين العلامات FABP4 و "يا الأحمر النفط" تلطيخ، قياسات الناتج من تحليل الصور التي ينبغي أن تكون ذات صلة بيولوجيا. ونتيجة لذلك، استخدمت القياس، '% إيجابية الخلايا' FABP4، وكان يستخدم 'منطقة لتلوين كل خلية' للنفط الأحمر سين جدير بالذكر أن هذا التدبير '% إيجابية الخلايا' لا يستخدم "النفط س الأحمر" المسمى الخلايا في دراستنا لأنه لم يكن من الممكن عزو قطرات الدهون توسم بدقة إلى نواة معينة؛ قطرات الدهون تختلف كثيرا في الحجم والعدد والتوزيع عبر جسم الخلية، ونادراً ما تتداخل مع النواة. O الأحمر النفط تلطيخ تقلب موجودة بين الخلايا المستمدة من مصادر مختلفة من الأنسجة؛ بينما % إيجابية التدبير الخلايا لم يكن مناسباً للدراسة الحالية، مجموعة أخرى قد استخدمت بنجاح لقياس adipocytes المستمدة من الخلايا الجذعية البشرية الغدة22 تلطيخ "س الأحمر النفط" حيث ظهرت كأحد الحبرية الدهون الكبيرة التي امتدت السيتوبلازم ومتراكب مع نويات والبيانات التمكينية لتقديمها كخلايا % إيجابية.
وفي المقابل، يتسق مورفولوجية إيمونولابيلينج FABP4 في adipocytes المستمدة من مجموعة من الأنسجة المختلفة المصادر23،،من2425. القدرة على قياس نسبة الخلايا ضمن ثقافة قادرة على التمايز يحتوي على عدد من التطبيقات. الكبار الخلايا اللحمية الوسيطة تبشر هامة لمجموعة متنوعة من الأغراض العلاجية. مسألة من المسائل هامة التي نشأت مع الترجمة السريرية هو التغير المتأصلة في قدرة هذه الخلايا بين المرضى26، بين مواقع لعزل27،28، وبين الأساليب لعزل12 ، وتوسيع نطاق الخلية الأرقام12 للاستخدام العلاجي. قد تبين سابقا أن ثقافات خلايا اللحمية ملتصقة غالباً غير متجانسة، مع بعض الخلايا قادرة على التمايز وليس بعض 12،17 كما لدينا FABP4 يوضح تحليل للثقافات ASC. فحوصات مثل هذا، جنبا إلى جنب مع تقنيات التخصيب، وسيساعد على تحديد السكان الفرعية داخل الثقافات غير متجانسة قادرة على التمايز النسب المحددة. ويوفر طريقة بسيطة للمقارنة بين كل من هذه المتغيرات، والقدرة على تقييم النتائج العلاجية داخل وبين التجارب السريرية بعد مقايسة موحدة، قابلة للقياس، مثل هذا الفحص FABP4.
يمكن التحديد الكمي ل FABP4 بطريقة شبه إليه الموضوعية وإمكانية تكرار نتائج التحليل عبر العديد من الحالات المانحين وعينات. وعلاوة على ذلك كما التسمية هيولى، فإنه يحتمل أن يمكن استخدامها لتحليل تضخم (توسيع حجم adipocyte) بالإضافة إلى تضخم (زيادة في عدد adipocyte)، تمييزاً له أهمية كبيرة في أبحاث السمنة، حيث تضخم يرتبط ارتباطاً قويا بخلل الدهنية في21من الأفراد يعانون من السمنة المفرطة. وقد حفزت وباء السمنة قدرا كبيرا من الاهتمام في تحديد الأدوية قادرة على السيطرة على تخزين الدهون. كما يوفر هذا التحليل FABP4 قراءات بسيطة لفحص آلاف مركبات لقدرتها على منع تراكم الدهون.
Disclosures
الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ونحن ممتنون للجهات المانحة من الأنسجة الدهنية والمهنيين البحث الذي جمع وتوفير هذه الموارد بالنسبة لنا لاستخدام البحث. ونود أن نعترف بتمويل دعم Allergan. ونحن ممتنون أيضا لجامعة أوكلاند، وكلية الطب والعلوم الصحية على أساس أداء صندوق أبحاث لتمويل تكلفة videoing والتحرير لتقديم هذه المادة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris Base | Invitrogen | 15504-020 | Tris buffered saline |
| Sodium Chloride | Merck | 1064041000 | Tris buffered saline |
| Potassium Chloride | Merck | 1049360500 | Tris buffered saline |
| Sodium Azide | Scharlau | SO0091 | Casein blocker solution |
| Casein | Sigma | C7078-500G | Casein blocker solution |
| PBS tablet | Sigma | P4417-100TAB | Phosphate buffered saline |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | Cell culture |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Cell culture |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | Cell culture |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10091-148 | Cell culture |
| TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red | Gibco | 12563-029 | Cell dissociation enzyme |
| 96 well plate (flat bottom) | Falcon | FAL353072 | Cell culture equipment |
| T75 culture flask, with filter cap | Greiner | 658175 | Cell culture equipment |
| Insulin | Sigma | 19278-5ML | Adipogenic differentiation media |
| dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | Adipogenic differentiation media |
| indomethacin | sigma | I7378-5G | Adipogenic differentiation media |
| Oil-Red O | Sigma | O-0625 | Classic stain for adipogenesis |
| Isopropanol | Merck | 1.09634 | Classic stain for adipogenesis |
| 16% formaldehyde | Pierce | 28908 | Cell fixation |
| Acetone | Merck | 100983 | Cell fixation |
| DAPI | Sigma | D9542 | Immunocytochemistry |
| Anti rabbit IgG alexa 488 | Molecular Probes | A11008 | Immunocytochemistry |
| Thimerosal | Sigma | T5125-10G | Immunocytochemistry |
| Rabbit anti-human fatty acid binding protein 4 (FABP4) antibody | Cayman Chemicals | 10004944 | Marker of adipogenesis |
| Centrifuge tubes (15mL) | Greiner | GR188271 | General |
| Centrifuge tubes (50mL) | Greiner | GR227261-P | General |
| ImageXpress Micro XLS | Molecular Devices | high content screening machine | |
| MetaXpress | Molecular Devices | high content screening software, version 5.4.01 |
References
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Proescher, F. Oil Red O Pyridin, A Rapid Fat Stain. Biotech Histochem. 2 (2), 60-61 (1927).
- Matarese, V., Bernlohr, D. a Purification of murine adipocyte lipid-binding protein. Characterization as a fatty acid- and retinoic acid-binding protein. J Biol Chem. 263 (28), 14544-14551 (1988).
- Lafontan, M., Langin, D. Lipolysis and lipid mobilization in human adipose tissue. Prog Lipid Res. 48 (5), 275-297 (2009).
- Sekiya, I., Larson, B. L., Vuoristo, J. T., Cui, J. C., Prockop, D. J. Adipogenic Differentiation of Human Adult Stem Cells From Bone Marrow Stroma (MSCs). J Bone Min Res. 19 (2), 256-264 (2004).
- Baxa, C., et al. Human adipocyte lipid-binding protein: purification of the protein and cloning of its complementary DNA. Biochemistry. 28 (22), 8683-8690 (1989).
- Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: A joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International So. Cythotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
- Zuk, P., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
- Orbay, H., Tobita, M., Mizuno, H. Mesenchymal stem cells isolated from adipose and other tissues: Basic biological properties and clinical applications. Stem Cells Int. 2012, (2012).
- Feisst, V., Brooks, A. E. S., Chen, C. J. J., Dunbar, P. R. Characterization of mesenchymal progenitor cell populations directly derived from human dermis. Stem Cells Dev. 23 (6), 631-642 (2014).
- Mitterberger, M. C., Lechner, S., Mattesich, M., Zwerschke, W. Adipogenic differentiation is impaired in replicative senescent human subcutaneous adipose-derived stromal/progenitor cells. Journals Gerontol - Ser A Biol Sci Med Sci. 69 (1), 13-24 (2014).
- Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: Tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells Int. , (2012).
- Xu, S., et al. Evaluation of foam cell formation in cultured macrophages: An improved method with Oil Red O staining and DiI-oxLDL uptake. Cytotechnology. 62 (5), 473-481 (2010).
- Hopkins, P. M., et al. Oil red O stain of alveolar macrophages is an effective screening test for gastroesophageal reflux disease in lung transplant recipients. J Hear Lung Transplant. 29 (8), 859-864 (2010).
- Dragunow, M., Cameron, R., Narayan, P., O'Carroll, S. Image-based high-throughput quantification of cellular fat accumulation. J Biomol Screen. 12 (7), (2007).
- Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).
- Muraglia, A., Cancedda, R., Quarto, R. Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model. J Cell Sci. 113 (Pt 7), 1161-1166 (2000).
- Neubauer, M., et al. Basic fibroblast growth factor enhances PPARgamma ligand-induced adipogenesis of mesenchymal stem cells. FEBS Lett. 577 (1-2), 277-283 (2004).
- Janderova, L., McNeil, M., Murrell, A. N., Mynatt, R. L., Smith, S. R. Human mesenchymal stem cells as an in vitro model for human adipogenesis. Obes Res. 11 (1), 65-74 (2003).
- Aldridge, A., Kouroupis, D., Churchman, S., English, A., Ingham, E., Jones, E. Assay validation for the assessment of adipogenesis of multipotential stromal cells--a direct comparison of four different methods. Cytotherapy. 15 (1), 89-101 (2013).
- Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nat Med. 19 (10), 1338-1344 (2013).
- Gorjup, E., Peter, L., Wien, S., von Briesen, H., Schmitt, D. Automated microscopic quantification of adipogenic differentiation of human gland stem cells. Ann Anat. 191 (1), 13-22 (2009).
- Wojciechowicz, K., Gledhill, K., Ambler, C. A., Manning, C. B., Jahoda, C. A. B. Development of the mouse dermal adipose layer occurs independently of subcutaneous adipose tissue and is marked by restricted early expression of FABP4. PLoS One. 8 (3), e59811 (2013).
- Sandhu, M. A., Jurek, S., Trappe, S., Kolisek, M., Sponder, G., Aschenbach, J. R. Influence of Bovine Serum Lipids and Fetal Bovine Serum on the Expression of Cell Surface Markers in Cultured Bovine Preadipocytes. Cells Tissues Organs. 204 (1), 13-24 (2017).
- LaRosa, P. C., et al. Trans-10, cis-12 conjugated linoleic acid activates the integrated stress response pathway in adipocytes. Physiol Genomics. 31 (3), 544-553 (2007).
- Sen, A., et al. Adipogenic potential of human adipose derived stromal cells from multiple donors is heterogeneous. J Cell Biochem. 81 (2), 312-319 (2001).
- Zuk, P. A., et al. Human Adipose Tissue Is a Source of Multipotent Stem Cells. Mol Biol Cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).
- Russo, V., Yu, C., Belliveau, P., Hamilton, A., Flynn, L. E. Comparison of Human Adipose-Derived Stem Cells Isolated from Subcutaneous, Omental, and Intrathoracic Adipose Tissue Depots for Regenerative Applications. Stem Cells Transl Med. 3 (2), 206-217 (2014).
- Tilg, H., Moschen, A. R. Adipocytokines: mediators linking adipose tissue, inflammation and immunity. Nat Rev Immunol. 6 (10), 772-783 (2006).
- Shan, T., Liu, W., Kuang, S. Fatty acid binding protein 4 expression marks a population of adipocyte progenitors in white and brown adipose tissues. FASEB J Off Publ Fed Am Soc Exp Biol. 27 (1), 277-287 (2013).
- Narayan, P. J., Dragunow, M. High content analysis of histone acetylation in human cells and tissues. J Neurosci Methods. 193 (1), (2010).
- Buchser, W., et al. Assay Development Guidelines for Image-Based High Content Screening, High Content Analysis and High Content Imaging. Assay Guid Man. , 1-80 (2004).
- Abràmofff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Part II. Biophotonics Int. 11 (7), 36-43 (2005).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).
