Summary
여기는 Gomori의 수정된 methanamine 실버 조직학 단면도에서 얼룩의 정량화 하 여 침략 aspergillosis와 쥐에 폐 선 부담을 결정 하는 프로토콜에 설명 합니다. 이 방법의 사용 결과 폐 균 DNA의 양이 많은 PCR에 의해 곰 팡이 부담에 대 한 평가에 비해 적은 동물과 비교 결과.
Abstract
폐 균 부담의 정량화는 면역 보호 및 폐 곰 팡이 감염의 마우스 모델에서 곰 팡이 독성의 상대적 수준의 결정에 대 한 중요 합니다. 여러 메서드는 곰 팡이 부담을 평가 하는 데 사용 됩니다, 하지만 곰 팡이 DNA의 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) 이전 문화 기반 방법에 비해 여러 가지 장점 가진 기술로 떠오르고 있다. 현재, 폐 병 리, 백혈구 신규 모집, 곰 팡이 부담, 및 침략 aspergillosis (IA)와 쥐에 유전자 발현의 포괄적인 평가 실험의 뜻깊은 수 및 제어 동물의 사용을 필요로합니다. 여기 폐 조직학 동물의 감소 된 수를 사용 하 여 곰 팡이 부담을 결정 하기 위해 얼룩의 정량화는 자세히 시험 되었다. 폐 섹션 Gomori의 수정된 methanamine 실버 (GMS) 얼룩 곰 팡이 구조를 규명 얼룩이 있었다. 이미지는 포 르 말린 고정 파라핀 포함 폐 각의 4 개의 개별 분야에서 GMS 스테인드 섹션에서 촬영 됐다. 각 이미지 내의 영역을 스테인드 GMS는 이미지 분석 프로그램을 사용 하 여 계량 했다 그리고이 정량화에서 스테인드 영역의 평균 백분율은 각 샘플에 대 한 결정 했다. 이 전략을 사용 하 여, 전시 eosinophil 불충분 한 쥐 감소 곰 팡이 부담 및 caspofungin 치료, 질병 동안 아이오와 야생-타입 마우스 caspofungin와 함께 개선 되지 않았다. 마찬가지로, 마우스 γ T 세포 부족에 곰 팡이 부담 했다 또한 향상 caspofungin, 정량 및 GMS 정량화로 측정 된. 따라서 GMS 정량화 상대 폐 균 부담 궁극적으로 침략 aspergillosis의 포괄적인 연구에 필요한 실험 동물의 수량을 줄일 수 있는 결정을 위한 방법으로 도입 되었습니다.
Introduction
IA 면역 진압 치료 또는 만성 감염1,2선 천 적 또는 후 천 적인 면역 결핍과 취약 개인에 개발할 수 있는 기회 감염 이다. 1 차 감염 자주 폐, 간, 신장, 심장, Aspergillus fumigatus 의 일부 인스턴스 배포에서 발생 하 고 뇌를 심각한 질병 그리고 높은 함께 균의 광범위 한 조직 내 습의 결과로 발생할 수 있습니다. 사망률1,2의 속도. 또한, 기존 pharmacotherapies의 효능 제한, 그리고 환경3항진균-저항 하는 긴장의 출현에 의해 더 약화 될 수 있습니다. 그것은 그러므로 침략 버섯 모양 질병의 악화 또는 개발을 촉진 하는 곰 팡이 독성 및 병 리의 메커니즘을 이해 하는 것이 중요입니다.
그들은 곰 팡이 독성 유전자의 역할을 평가 하 고 설립과 A. fumigatus vivo에서4,5의 성장에 대 한 면역 이펙터를 호스트 하는 연구자 수 murine 모델 기계적 아이오와 연구에 대 한 중요 한 유지. 따라서, 여러 전략 효과적으로 계량 하거나 비교 실험 동물6,7의 그룹에 게 선 부담 고안 되었습니다. 이러한 전략 문화 기반, 생화학, immunoassay, 또는 정량 방법, 각각 고유한 장점과 단점을 포함 한다. 또한, 이러한 메서드의 각 면역 effector 기능, 유전자 표정 분석 및 비교 histopathology7의 평가 대 한 희생 뿐 아니라 동물의 부분 집합의 헌신을 포함. 따라서, 포괄적인 IA 연구는 종종 상당한 비용 연구 동물의 많은 수를 필요로합니다. 동물의 조직 여러 분석을 이용 하 여 실험 시간, 동물 비용, 및 윤리적인 고려 사항 감소 효과적인 전략은 따라서 매우 귀중 한7.
이 보고서에서 GMS IA와 쥐의 실험적인 그룹 간의 상대 곰 팡이의 비교를 위해 조직학 단면도에서 얼룩의 정량화를 설명 하는 방법 소개. 곰 팡이 문화에서 감염, 조직 수확 및 처리, 이미지 수집 및 데이터 분석, 각 단계는 자세히 설명 되어 있습니다. 곰 팡이 부담 GMS 정량화 하 여 얻은 정량 IA의 neutropenic 모델에서 그리고 IA8caspofungin 처리 야생-타입 또는 eosinophil 불충분 한 쥐에 비교 되었다. 결과 GMS 정량화와 곰 팡이 DNA의 정량 유사성을 보여. 이것은 GMS 정량화 상대 균 부담 IA와 쥐의 비교의 보조 또는 대체 방법으로 조직학 분석에 종사 하는 연구원에 게 유용 하 고 궁극적으로 비용 및 연구에 있는 동물의 사용을 줄일 수 있습니다. 복잡 한, 기계 연구입니다.
Protocol
모든 동물 절차 동물 관리 및 사용 위원회의 인디애나 주립 대학, 인디애나 대학의과 대학의 호스트 캠퍼스 승인 했다-테 르 오 트.
1. A. fumigatus Conidia 감염에 대 한 준비
- 환기가 증기 두건에서 작업 하는 동안 900 µ L 셀 문화 학년 물 (CCGW) A. fumigatus 293 재고 솔루션의 125 µ L를 추가 합니다. 다음에 맥 아 피 펫을 통해 추출 천 (MEA) 배지 inoculating 루프와 균등 하 게 확산을 솔루션 전송.
- 적어도 14 일 동안과 더 이상 28 일 24 ° C에서 어둠 속에서 곰 팡이 접시를 저장.
- 유리 비즈를 사용 하 여 앞에서 설명한9conidia 수확.
- 접시에 유리 구슬 0.5 m m의 1.5 g를 부 어 부드럽게 그것을 기울이기 앞뒤로 구슬 conidia를 추출 하기 위해 코팅은. 15 mL 원뿔 튜브에 구슬/conidia 혼합물을 수집 합니다. Dulbecco 5 mL의 인산 염 버퍼 식 염 수 (DPBS)와 소용돌이에 일시 중단 합니다.
- Conidia는 hemocytometer를 사용 하 여 하는 DPBS에 상쾌한의 50 배 희석에서을 계산 합니다. 그림 1 에 표시 된 지역에서 conidia의 수를 계산 하 고 방정식 1 를 사용 하 여 농도 계산 하.
#Conidia × 희석 요인 10 ×4= Conidia/mL (식 1)
참고: 추가 4 x 4 사각형 모서리가 영역 수 계산, 방정식 1에 #Conidia로 사용 하는이 분야의 의미와.
그림 1: Hemocytometer 대표 지역 conidia 계산에 사용 (상자, 화살표).
- 당 무 균 식 염 수 (DPBS) 원하는 농도, 5 x 106 conidia/50 µ L. 준비 50 µ L conidia 솔루션의 감염에 대 한 108 conidia/mL x 1.0를 가진 conidia 현 탁 액을 희석 ' n + 2' 계정 pipetting에 감염 되는 쥐 오류가 발생 했습니다.
참고: 표준 균 수확 및 준비/여과 또는 사용된10수 있습니다. 유리 구슬 메서드는 가장 사용 conidia 샘플 최소한의 작은/녹는 hyphal 항을 열망에 대 한 가져온.
2. 면역 억제 및 감염 Murine 모델의
- 7-10-주-오래 된 마우스를 사용 합니다.
참고: BALB/c, C57BL/6 (B6), eosinophil 불충분 한 (ΔdblGATA, BALB/c 배경), 그리고 γ T 세포 결핍 (TCRδ-/-, B6 배경) 쥐가이 연구를 위해 사용 되었다. 각 실험, 나이 및 성별 일치 (남성과 여성 모두) 마우스 각 그룹에 대해 사용 되었다. - 호 중구 통해 복 (IP) 주입 측면 하단 오른쪽 사분면에 45 °에 메 마른 염 분에 0.1 mL (0.5 mg) 안티-mouse-Ly-6 G 항 체의 고갈 (실험 일정 그림 2참조).
- 24 시간 후, 106A. fumigatus conidia 50에 x 5.0 포부 쥐 감염 µ L 살 균 염 분 앞11에서 설명한 (단계 2.4-2.10 참조). 동물의 하위 집합 등이 연구에 사용 하는 DPBS에 5 mg/kg caspofungin diacetate antifungal 에이전트와 함께 주사 감염, 다음 (매일, 그림 2참조).
- 99.9 %isoflurane 수의학 마 취 기계를 사용 하 여 함께 마우스를 anesthetize.
- 대변과 소변을 잡으려고 유도 챔버의 바닥에 종이 타월을 놓습니다.
- 마우스에 유도 챔버, 뚜껑, 보안 고 2 분 및 30에 대 한 5 %isoflurane는 기화 기를 설정 s.
참고: 수 의사 연 고 마 취 총 시간은 5 분 미만 이기 때문에 사용 되지 않습니다. - 30에 대 한 최대 설정의 절반은 기화를 줄일 s.
- 확인 호흡, 운동의 부족 및 발가락 꼬집어 자극에 응답의 부족 둔화 마우스 제대로 관찰 하 여 마 취.
- 유도 약 실 및 경사 보드에 장소에서 마우스를 제거 합니다. 보드에 대 한 그것의 뒤를 가진 마우스를 놓습니다. 그것의 위 앞 니는 고무 밴드와 부드럽게 절제 된 더 낮은 앞 니 부드럽게 금속 와이어와 절제 된 확인 합니다.
- 조심 스럽게 작은 집게와 혀의 기지에서 conidia/PBS 서 스 펜 션의 피 펫 50 µ L 전체 확장에서 혀를 개최.
- 전체 확장; 혀를 잡으십시오 빠른 호흡과 열망의 독특한 클릭 소음을 들어봅니다. 20 동안 s 또는 서 스 펜 션은 완벽 하 게 발음 하는 때까지.
- 경사 보드에서 마우스를 제거 하 고 부드럽게 관찰에 대 한 감 금 소에 배치.
- 포부, 다음 마우스 야 회복 1 분 모니터 내 의식 마우스까지 완벽 하 게 의식 하 고 감 금 소의 주위에 걸을 수 있습니다. 동물 21 ° C에서 지 내게 하 고 폐는가 걷이 될 때까지 두 번 매일 모니터링 해야 합니다.
- 호 중구 (단계 2.2) 24 h 후 감염 (그림 2)의 소모를 반복 합니다.
그림 2: 실험 일정. 이 그림은 이전 게시8에서 수정 되었습니다.
3. 수확 및 조직학 분석을 위한 마우스 폐의 보존
- 깊이 anesthetize 390 mg/ml pentobarbital 나트륨 솔루션 IP의 0.1 ml의 치명적인 복용량을 가진 동물.
- 핀셋으로 자발적인 호흡의 부족 및 사지 자극 반응의 부재를 관찰 하 여 안락사를 확인 합니다. 안락사, 일단 70% 에탄올 소독과 시체를 스프레이.
- 흡수 성 패드로 덮여 폼 보드에 시체를 놓습니다.
참고: 시체 두어야 한다 그것의 뒤에 폼 보드에 모든 4 개의 사지를 고정 하는 핀. - 주의와 위를 사용 하 여 상단의 가슴 구멍을 엽니다. 폐 및 심 혼을 노출 하려면 흉 곽을 떨어져 잘라. 관류 수 있도록 열 등 한 베 나 정 맥을 잘라. 혈관을 절단 하 고 장기를 puncturing 하지 마십시오.
- 천천히 25 G 바늘으로 45 ° 각도에서 심장의 우 심 실에서 차가운 DPBS의 5 mL와 함께 perfuse. 10% 포 르 말린의 5 mL와 관류를 반복 합니다.
- 조심 스럽게 기도 하 고 주변 지방 패드를 분리. 주의 사용 하 고 기도 puncturing 피하십시오. 초과 결합 조직 완전히 진행 하기 전에 기도 시각화 하기 위해 제거를 확인 합니다. 일단 기도 노출 장소 그것을 상승 기도 아래 집게.
- 25 G 바늘을 사용 하 여 위쪽 기도에 작은 구멍 고추.
참고: 구멍 해야 될 배치 전체 정 기도에 맞는. 주의 사용 하 여 기관지 파열 방지. - 정 및 폐 쪽으로 구멍을 통해 삽입 합니다. 기관지 주위에 느슨하게 묶인 수술 실로 정을 보안 합니다.
참고: 기관지 파열 하는 경우는 정 가능한 기도에서 기도 과거 삽입할 수 있습니다. - 주사기를 사용 하는 정 맥을 통해 10% 포 르 말린 버퍼의 1 mL와 함께 폐 부 풀 려. 폐의 인플레이션 볼 수 있는지 확인 합니다. 그렇지 않으면, 카 테 터를 조정 하 고 반복. 폐가 팽창 되 면 신속 하 게 주의 정 맥을 제거 하 고 안전 하 게 봉쇄 기도 스레드 조입니다.
참고: 기관지 파열 폐 팽창 될 수 없는 경우에, 폐 수확 여전히 수 있습니다 하지만이 적절 한 고정 되지 않을 수 있습니다. - 부드럽게 기관지 및 폐에서에서 제거 가슴 신중 하 게 스레드를 잡아 당겨 부드럽게 하는 동안 집게와 기도의 결합 조직을 뽑아야 합니다. 10% 포 르 말린 버퍼의 15 mL 50 mL 원뿔 튜브에 폐와 기관지를 놓습니다. 스레드 튜브 외부의 한쪽 끝을 배치 하 고 뚜껑을 봉인. 완전히 정착 액에 샘플 잠수함 튜브 반전.
- 적어도 24 시간 또는 추가 처리 때까지 실 온에서 샘플을 저장 합니다.
주의: 포 르 말린은 유해. 고글, 얼굴 마스크 등 적절 한 개인 보호 장비를 착용 하십시오. 샘플을 처리할 때 화학 후드 작동 합니다.
4. 수확 및 DNA 곰 팡이 부담에 대 한 마우스의 폐의 보존
- 별도 마우스에 위에서 설명한 단계 3.1-3.5를 수행 합니다.
- 천천히 25 G 바늘으로 45 ° 각도에서 심장의 우 심 실에서 차가운 DPBS의 10 mL와 함께 perfuse.
- 가 위 폐를 소비 세와 레이블이 1.5 mL 튜브에.
- 추가 처리까지-80 ° C에서 폐를 저장 합니다.
- (포함 및 단면)에 설명 된 대로, 제조업체의 프로토콜 ( 재료의 표참조)에 따라 표준 기법을 사용 합니다.
5. 현미경 및 이미징
- 이미징 정량화 프로그램 ( 재료의 표참조).
- 가벼운 현미경을 사용 하 여, 슬라이드 (10 X 목표) 스테인드 GMS의 4 가지 분야를 얻을. 이미지 비슷한 조직 밀도와 폐 내의 감염 된 항공의 대표 인지 확인 합니다.
참고: 밀도 및 hyphal foci의 유통 제어 및 실험 그룹 사이 현저 하 게 다른 경우, 추가 필드 촬영 될 수 있습니다, 또는 전체 폐 섹션의 GMS 지역 몇 군데 있습니다 (4 X 목표). 원하는 경우 hematoxylin와 오신, 스테인드 직렬 폐 섹션에 (동등한 조직 형태 식별) 폐의 같은 영역에의 이미지를 얻을. - 필요한 경우 이미지에 눈금 막대를 추가 하 고 측정할 수에 이미지를 저장. 선택, 편집 > 추가/편집 교정 표시 > 메뉴: 선 두께, 색상 및 스케일 바 크기 선택 > 눈금 막대 배치 하는 대 한 이미지를 클릭 하십시오. 메뉴를 닫고 선택, 편집 > 병합 > 교정 표시 병합 > 파일 이름으로 저장 선택 > 파일의 이름을 지정 하 고 클릭 저장.
6. 곰 팡이 부담 (그림 3)를 계산 하는 이미지 처리 프로그램을 사용 하
- 이미지 처리 프로그램을 엽니다. 파일을 선택 > 계량 샘플 폴더 > 이미지 (그림 3A). 이미지 선택 > 형식 > 변환 "RGB 스택" (그림 3B).
- 3 주어진된 이미지 (그림 3B)의 두 번째를 선택 하려면 오른쪽 화살표 키를 사용 합니다. "컨트롤 + 교체 + T"를 명 중을 "임계값" 메뉴 설정 조절기 (그림 3C). 참고로 원래.tiff 또는.jpg 이미지를 찾아서 이미지 보기 프로그램 (그림 3C)와 열.
- 왼쪽에 있는 모든 방법을 위쪽 슬라이더를 당겨와 (red)에 선택 영역 (일반적으로 이르기까지 130-160에서 슬라이더 (그림 3C)의 오른쪽에 표시 현미경 이미지의 대표 될 때까지 아래쪽 슬라이더를 조정.
- 일단 선택, 눌러 "설정" > "확인" (그림 3D). "분석"을 선택 > "측정 설정" > "지역, 지역 분수, 제한 임계값, 표시 라벨"을 확인 하 고 기본으로 하단 설정 (메뉴 및 소수 자릿수)을 두고 > "확인" (그림 3D).
- 공백 또는 배경 얼룩의 중요 한 영역 선택 영역이 나 다각형 도구로 적절 한 조직에 의해 제외 될 수 있습니다.
- 마지막으로, "분석"을 선택 > "측정" (데이터 창이 나타납니다, 또는 windows 작업 표시줄에 탭 표시, "결과" 표시 됩니다) (그림 3E). 그래프를 위한 데이터 분석 프로그램을 데이터를 전송 및 통계 분석.
- 각 폐 샘플에 대 한 4 개의 영역 비율의 평균을 입력 합니다. 5-8 샘플 그룹 간의 중요 한 차이 검출 하기 위하여 일반적으로 충분 하다. 두 실험 그룹을 비교 하는 경우 수행 하는 짝이 없는 학생의 t-의미를 확인 하려면 테스트.
그림 3: GMS 조직학의 각 단계에 대 한 대표 스크린샷 필드 정량화. (A) 파일 선택 > 계량 샘플 폴더 > 선택 이미지. (B)을 선택 이미지 > 형식 > "RGB 스택" 변환. 3 주어진된 이미지의 두 번째를 선택 하려면 오른쪽 화살표 키를 사용 합니다. (C) 히트 "컨트롤 + 교체 + T" "임계값" 메뉴 설정 조절기를가지고. 참고로 원래.tiff 또는.jpg 이미지를 찾아서 사진 뷰어 프로그램으로 열기. 모든 방법은 왼쪽과 (red)에 선택 영역 (일반적으로에서 이르기까지 130-160으로 슬라이더의 오른쪽에 현미경 이미지의 대표 될 때까지 아래쪽 슬라이더를 조정 가기 슬라이더를 당겨. (D) 선택 된 언론 "설정" > "확인". "분석"을 선택 > "측정 설정" > "지역, 지역 분수, 제한 임계값, 표시 라벨"을 확인 하 고 기본으로 하단 설정 (메뉴 및 소수 자릿수)을 두고 > "확인". (E) "마지막으로 선택 분석" > "측정" (데이터 창이 나타납니다, 또는 windows 작업 표시줄에 있는 탭 "결과" 레이블이 표시 됩니다). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
7. DNA 곰 팡이 부담
- -80 ° C에서 폐를 제거 하 고 적어도 4 h lyophilize (하룻밤 최적입니다) 또는 동결 건조 시스템에 의해 완전히 건조 될 때까지.
- 폐를 건조 하는 동안 DNA 추출 버퍼 (0.1 m M NaCl, 10 mM EDTA pH 8.0, 10 mM Tris HCl pH 8.0 및 0.5 %SDS)를 준비.
- 미리 따뜻하게 60 ° C 물 욕조에 준비 된 DNA 추출 버퍼를 놓습니다. 또한, 페 놀 장소: 클로 프롬: isoamyl 알콜 50 mL 원뿔 튜브에서 (25:24:1) 분리에 대 한 허용.
- 유리 구슬의 0.2 mL 2 mL 스크류 캡 튜브에 동결 건조 된 폐를 놓습니다. 그것은 정밀한 분말을 형성 될 때까지 15-30에 대 한 건조 폐 조직 갈기 구슬 때리는 사용 하 여.
- 각 튜브와 소용돌이를 0.8 mL 따뜻한 DNA 추출 버퍼를 잘 추가 합니다. 추가 15 분 동안 잠복기 전에 각 튜브 65 ° C 비드 목욕 그리고 소용돌이에서 15 분을 품 어. 잠복기, 후 소용돌이 그리고 원심 분리기 튜브 25000 x g 10 분에 합니다.
- 각 샘플에 대 한 1.5 mL 튜브의 3 세트를 분류 하 고 튜브의 1 세트에는 상쾌한의 상위 계층을 전송. 수성 상위 레이어 밖으로 pipetting 동안 주의 사용 하 여 중간 계층을 방해 하지 않도록.
- 페 놀: 클로 프롬: isoamyl 알콜의 동일한 볼륨을 추가 하 고 잘 혼합. 다음 상위 레이어 밖으로 튜브의 두 번째 세트에 pipetting 전에 15 분에 대 한 25000 x g에서 원심.
- 클로 프롬: isoamyl 클로 프롬의 동일한 볼륨을 추가 하 고 잘, 튜브의 3 세트에 10 분 신중 하 게 상위 레이어 밖으로 피 펫에 대 한 25000 x g에서 원심.
- 추가 500 µ L 소 프로 파 놀의 50 µ L NaoAc (pH 5.2), 잘, 그리고 샘플 10 분 동안 실내 온도에 알을 품을 수 있도록. 다음 30 분 동안 25000 x g에서 원심 고는 상쾌한 가만히 따르다.
- 25000 x g. Decant 에탄올에서 얼음 찬 70% 에탄올과 5 분 원심 분리기의 750 µ L로 DNA 펠 릿을 세척 하 고 40 분 동안 증기 두건에 튜브에 공기를 펠 릿 건조 허용.
- 건조 알 약 테 버퍼의 300 µ L에서 resuspend.
참고: DNA 정량까지-20 ° C에서 저장 수 있습니다. - DNA는 분 광 광도 계를 사용 하 여 계량 및 정량 분석에 대 한 각 DNA 샘플의 µ 0.2 µ g/L의 100 µ L를 준비.
- 3 중 1 µ g의 DNA 샘플, 곰 팡이 18S rDNA 입문서와 함께 앞에서 설명한 표준 정량 수행 하 고 수정 된 프로브 끄는 프로브 세트 (5'-/ 56-팸/AGC CAG CGG/선/CCC GCA AAT G/3IABkFQ/3 ')12,13.
- A. fumigatus genomic DNA에서 표준 곡선을 준비 하 고 각 페이지에 곰 팡이 DNA의 농도 계산 평균 기자를 사용 하 여 샘플 염색 Ct 값.
- 플롯은 pg / µ g 균 DNA의 뜻의 표준 오류와 함께. 수행 하는 학생의 t-테스트 의미를 결정 하는 분석.
참고:으로 덜 독성 대안을 여기서 페 놀-클로 프롬 DNA 추출, 열 기반 DNA 추출 키트를 사용할 수 있습니다.
Representative Results
그림 4 는 야생 타입의 생존의 그래프를 포함 또는 IA와 eosinophil 불충분 한 쥐 caspofungin 치료. 결과 표시 eosinophil 불충분 한 쥐는 증가 생존 야생-타입 마우스에 비해 전시 (50% 사망률 100% 사망, 대 각각). 그림 5 는 neutropenic에서 얼룩이 지기 대표 GMS 야생-타입 및 IA와 eosinophil 불충분 한 쥐 취급 또는 caspofungin와 치료. Caspofungin 치료 결과 eosinophil 불충분 한, 하지만 아니 야생-타입 마우스 (오른쪽 패널)에 상대 균 클리어런스, 받지 못한 두 그룹이 caspofungin 비슷한 (왼쪽된 패널). 그림 6 caspofungin 치료에 곰 팡이 부담 비교를 보여줍니다 치료 야생-타입 또는 eosinophil 결핍 마우스를 제어, 균 DNA (그림 6A) 및 대표 GMS의 두 정량 Pcr를 사용 하 여 4 (10 X 목표)의 정량화 (필드 그림 6B)입니다. 두 기술에서 생성 된 결과 caspofungin 치료 결과에 가장 중요 한 곰 팡이 부담 야생-타입 및 eosinophil 불충분 한 쥐 (그림 6A) 사이 감소 보여. 그러나, 치료 쥐만 GMS 정량화 호 산 구는 (그림 6B) 부족 한 쥐에 있는 상당한 감소 결과. 전체 폐 GMS 스테인드 섹션의 의미 영역 계산 때 (4 X 목표), 차이 했다 4 대표 10 필드가, 얻은 결과 유사 하지만 덜 통계적 의미 (그림 6 c). 그림 7 보여줍니다 생존, 대표 GMS 얼룩 (4 10 X 필드)의 이미지와 곰 팡이 부담 정량화 두 방법으로 γ T 세포 결핍 (TCRδKO) 마우스를 제어에 비해 caspofungin로 치료 했다, 쥐를 치료. Caspofungin 치료 향상 된 생존 (그림 7A) 및 TCRδKO 마우스에 곰 팡이 부담 (그림 7B-D). 그림 6의 결과 마찬가지로, 버섯 모양 부담의 결과 GMS 정량화 (그림 ℃) 정량 (그림 7B) 및 대표에 의해 측정 했다 비교.
그림 4: caspofungin와 치료 후 아이오와 eosinophil 불충분 한 (ΔdblGATA) 쥐에 있는 생존을 증가 했다. 15-30 쥐/그룹입니다. 3-6 실험의 요약입니다. p < 0.0001입니다. 이 그림은 이전 게시8에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 야생-타입, eosinophil 결핍, 및 caspofungin 처리 또는 컨트롤에서 GMS 스테인드 폐 섹션의 대표 이미지 치료 아이오와에 있는 쥐 3-4 쥐/그룹의 대표적인입니다. 눈금 막대는 100 µ m. 이 그림은 이전 게시8에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 야생-타입에 곰 팡이 부담, eosinophil 불충분 한 쥐 취급 하는 IA 또는 제어 치료 caspofungin. (A) 곰 팡이 DNA의 정량. 15-30 쥐/그룹, 3-6 실험의 요약. (B) GMS의 정량화 조직학 단면도, GMS 4 필드 (10 x 목표)에서 얼룩의 평균 %. (C) GMS 정량화, 전체 폐 섹션 (4 X 목표)의 평균 % B와 C 5 쥐/그룹의 요약입니다. p < 0.05입니다. p < 0.001입니다. p < 0.0001입니다. 이 그림은 이전 게시8에서 보고 된 데이터를 사용 하 여 생성 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: caspofungin 치료 후 γ T 세포 불충분 한 쥐에 있는 IA의 심각도 감소. (A)의 생존 (B) 곰 팡이 DNA의 정량. (C) GMS 조직학의 정량화. (D) IA, 치료 또는 치료와 함께 caspofungin와 γ T 세포에서 GMS 스테인드 섹션의 대표 이미지. A와 B는 7-10 쥐/그룹 두 실험의 요약. C와 D 4 쥐/그룹의 요약입니다. p < 0.05입니다. p < 0.01입니다. p < 0.001입니다. 이 그림은 이전 게시8에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
이 문서의 목적은 이미지 분석 및 정량화에 대 한 GMS 스테인드 폐 조직학 단면도 이용 하 여 IA와 쥐에 폐 버섯 모양 부담의 결심을 위한 방법을 소개 했다. 이 연구, 치료에에서 β-글 루 칸-합성-대상으로 항진균 약물 caspofungin14 개선 하지 않은 생존 또는 IA8neutropenic 야생-타입 마우스에 곰 팡이 부담. 그러나, 호 산 구는 γ T 세포의 부재, 생존 및 곰 팡이 부담 개선. 우리의 연구 결과 또한 널리 이용 균 DNA 정량 방법6에 비해 GMS 곰 팡이 부담 하 여 비교 결과 얻을 수 있습니다 설명 했다.
GMS 곰 팡이 부담 정량화를 활용 하 여 여러 가지 혜택을 확인 하 고 있습니다. 첫째, 프로세스 따라서 잠재적으로 상당한 차이 확인 하는 데 필요한 실험의 수를 줄이고 기존 조직학 샘플 활용 수 있습니다. 둘째, 본이 연구에서는 적은 동물 GMS 곰 팡이 부담 정량화 (그림 6, 그림 7) 곰 팡이 DNA의 정량에 비해 상당한 차이 달성 하기 위해 필요 했다. 셋째, 정량 하 여 다른 격리에 곰 팡이 부담 비교 ribosomal DNA 복사 번호15에 격리 종속 차이 의해 영향을 받을 수 있습니다. 반면, GMS 정량화는 영향을 받지 복사본 수로 곰 팡이 부담 폐 곰 팡이 성장의 상대적 수준에 의해 결정 됩니다. 따라서, 곰 팡이 부담에 대 한 GMS 정량화를 사용 하 여 척 추가 있는 동물의 사용 줄이고 rDNA 복사 번호의 사전 결정을 필요 하지 않습니다. 마지막으로, 곰 팡이 형태를 수정 하는 것 외에도 caspofungin 치료 곰 팡이 조각화, 증가 하 고 따라서 인위적으로 증가 시킬 수 있습니다 폐 homogenates12,16에서에서 콜로 니 형성 단위의 절연 측정 때 곰 팡이 부담 ,17. 따라서, 곰 팡이 부담 GMS 정량화 다른 일반적으로 사용 되는 방법으로 몇 가지 제한 내재를 방지합니다.
그러나, GMS 정량화 그리고/또한이 연구의 한계는 중요 한 것. 첫째, 저자 각 실험 그룹의 폐에 걸쳐 hyphal 성장의 유사한 분포를 가정 하 고 따라서 4 대표 10에서에서 정량화 객관적인 필드 x으로 사용 대표적인 측정 전체 폐에 곰 팡이 부담에 대 한 (그림 6B)입니다. 그 어떤 경우에 상대 분포, 크기 및 밀도 hyphal foci의 충분히 다 곰 팡이 부담 정량 메서드에서이 메서드 및 해당 다른 표시는 가능 하다. 그러나, 우리의 추가 결과 4 X 객관적인 필드를 사용 하 여 전체 폐 섹션 정량화를 비슷한, 그룹 (그림 6 c) 간의 통계적으로 유의 한 차이 이기는 하지만 덜 보였다. 이 부 량의 표준 오차는이 전략, 목표 및 차선 분야에서 증가 배경 4 감소 hyphal 해상도 때문에 가능성이 증가 되었다. 따라서, 더 높은 확대에 적은 분야의 대표적인 부 량이 좋습니다. 둘째, 단일, 중앙 섹션은 각 샘플에 사용 됩니다. 그것은 가능한, 곰 팡이 분리에 따라 또는 쥐 종자 사용, 일부 연구 hyphal 성장의 고르지 못한 배급에 발생할 수 있습니다. 그 경우에 각 파라핀 블록에 걸쳐 추가 섹션 더 대표 부담을 정량 한다. 셋째, 실험에는 상당한 생산 (즉, 측정 알레르기 bronchopulmonary aspergillosis (ABPA)18 또는 낭 성 섬유 증 (CF)18에 곰 팡이 성장 기도), mucins의와 GMS 반응성 유도 다 당 류-풍부한 mucins19 일반적인 GMS + 결과 하 고 따라서 높은 균 부담에 찬성 하 여 몇 가지 샘플을 기울일 수 있습니다. IA의 neutropenic 모델을만이 연구에 사용 되었다, 다른 면역 능력 또는 진압 모델의 사용 덜 비교 결과에 결과 수 가능 하다. 이러한 경고에도 불구 하 고 GMS 정량화 곰 팡이 부담을 결정 하는 유사한 기술 하며 추가 연구에 지속적인된 사용 유틸리티 일관성, 신뢰성, 그리고 비용 효과적으로이 방법의 유효성을 검사 추가 수 있습니다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구로는 인디애나 대학 학교의 의학 연구 향상 그랜트와 NIH NIAID 1R03AI122127-01에 의해 부분에서 지원 되었다. N.A.는 Immunologists의 미국 협회에서 경력 면역학 친교에 의해이 기간 동안 부분적으로 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aspergillus fumigatus 293 Stock Solution | Fungal Genetics Stock Center | FGSC #A1100 | |
| HyPure Cell Culture Grade Water | Thermo Fisher Scientific | SH30529.03 | |
| Malt Extract | MP Biomedicals | 2155315 | White Powder |
| BD BBL Acidicase Dehydrated Culture Media: Peptone | Fisher Scientific | L11843 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydrous (Granular Powder/Certified ACS) | Fisher Scientific | D16-3 | |
| Fisher BioReagents Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| Auto Dry Cabinet | Shanghai Hasuc Instrument Manufacture Co.,LTD | HSFC160FD | |
| 1300 Series Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific | 1375 | |
| 0.5 mm Glass Beads | BioSpec Products | 11079105 | |
| 15 ml Conical Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339650 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | # 0267110 | |
| Leica Model DME Microscope | Leica | 13595XXX | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662-500 ml | |
| 1.5 ml tubes | Fisher Scientific | # 05-408-129 | |
| BD Precisionglide syringe needles, gauge 27, L 1/2 in. | Sigma-Aldrich | Z192384 | |
| Anti-mouse-Ly-6G antibody | BioXCell | BP0075-1 | Clone 1A8 |
| Caspofungin diacetate | Sigma-Aldrich | SML0425 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 1169567762 | |
| Non-Rebreathing Table Top Veterinary Anesthesia Machine | Supera Anesthesia Innovations | M3000 | |
| Pureline Oxygen Concentrator | Supera Anesthesia Innovations | OC8000 | |
| Slant Board Restraint | Indiana State University Facilities Management | Custom made | |
| Gilson PIPETMAN Classic 200 ml Pipets | Fisher Scientific | F123601G | |
| Pentobarbital Sodium (Fatal-Plus) | Vortech Pharmaceuticals | 0298-9373-68 | |
| General-Purpose Broad-Tipped Forceps | Fisher Scientific | 10-300 | |
| Fisherbrand Standard Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-951-20 | |
| Fisherbrand General-Purpose Curved Forceps | Fisher Scientific | 10-275 | |
| Ethyl Alcohol-200 Proof | PHARMCO-AAPER | 111000200 | |
| Fisherbrand Absorbent Underpads | Fisher Scientific | 14-206-63 | |
| BD Precisionglide syringe needles, gauge 25, L 1 in. | Fisher Scientific | Z192406 | |
| All-Plastic Norm-Ject Syringes | Fisher Scientific | 14-817-30 | |
| IV CATH ANGIOCATH 22GX1GIN 50B | Fisher Scientific | NC9742754 | |
| Formalin Solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | |
| 50 ml Conical Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| Thermo Scientific Shandon Embedding Cassettes II in Tube Packs | Fisher Scientific | B1000729 | |
| Fisherfinest Histoplast Paraffin Wax | Fisher Scientific | 22-900-700 | |
| Disposable Base Molds | Fisher Scientific | 22-363-554 | |
| Reichert Jung Histocut 820 Microtome | Labequip.com | 31930 | |
| Water Bath | Precision Scientific | 66630-23 | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | 116875H | |
| Silver Stain (Modified GMS) Kit | Sigma-Aldrich | HT100A-1KT | |
| Fast Green FCF | Fisher Scientific | AC410530250 | |
| Frosted Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-343 | |
| Fisherfinest Superslip Cover Glass | Fisher Scientific | 12-545-89 | |
| Cytoseal XYL | Fisher Scientific | 22-050-262 | |
| Olympus Provis AX70 Microscope | Olympus | OLYMPUS-AX70 | |
| U-PHOTO Universal Photo System | Olympus | OLYMPUS-U-PHOTO | |
| U-MCB-2 MULTI CONTROL BOX | Olympus | OLYMPUS-U-MCB-2 | |
| U-PS POWER SUPPLY UNIT | Olympus | OLYMPUS-U-PS | |
| FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze Dry System | LABCONCO | 7740020 | |
| Maxima C Plus Vacuum Pump | Fisher Scientific | 01-257-80 | Displacement- 6.1 cfm |
| 1-Butanol | Fisher Scientific | A383-4 | |
| AMRESCO PHENOL-CHLORFORM-OSOAMYL 100ML DFS | Fisher Scientific | NC9573988 | |
| Free-Standing Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | # 02-682-557 | |
| Mini-Beadbeater-24 | BioSpec Products | 112011 | |
| BioSpec ProductsSupplier Diversity Partner 2.3 MM ZIRCONIA BEADS | Fisher Scientific | NC0451999 | |
| Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus | Fisher Scientific | A144S | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate | Fisher Scientific | S311 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), White Powder, Electrophoresis | Fisher Scientific | BP166 | |
| Chloroform/isoamyl alcohol 24:1 | Fisher Scientific | AC327155000 | |
| Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer | Fisher Scientific | 11-120-570 | |
| Thermo Scientific™ ABsolute Blue qPCR Mixes | Fisher Scientific | AB4137A | |
| Hybridization Probe, 5′-FAM-AGCCAGCGGCCCGCAAATG-TAMRA-3′ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Sense Amplification Primer, 5′-GGCCCTTAAATAGCCCGGT-3′ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Antisense Amplification Primer, 5′-TGAGCCGATAGTCCCCCTAA-3′ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Applied Biosystems™ MicroAmp™ Optical 8-Tube Strip, 0.2mL | Fisher Scientific | 43-165-67 | |
| Thermo Scientific Domed and Flat PCR Cap Strips | Fisher Scientific | AB-0386 | |
| Mx3005P QPCR System, 110 Volt | Agilent | 401443 | Stratagene is now owned by Agilent |
| BALB/c mice | The Jackson Laboratory | 000651 | |
| C57BL/6 (B6) mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Eosinophil-deficient (ΔdblGATA, BALB/c background) mice | The Jackson Laboratory | 005653 | |
| γδ T cell-deficient (TCRδ-/-, B6 background) mice | The Jackson Laboratory | 002120 | |
| ImageJ Software | National Institutes of Health | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Spot Advanced Software | Spot Imaging | SPOT53A | http://www.spotimaging.com/software/spot-advanced/ |
| GraphPad Prism 6 | GraphPad Software | N/A | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
| Fisherbrand Absorbent Underpads | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| Step 4.5 | http://www.bdbiosciences.com/sg/resources/protocols/paraffin_sections.jsp ; http://www.jove.com/science-education/5039 ; http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/General_Information/1/ht100.pdf |
References
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