Summary
Здесь мы описываем протокол для определения в мышей с инвазивного аспергиллёза легких грибковых бремя путем количественной оценки Gomori в модифицированных methanamine Серебряный пятнать в гистологических срезах. Использование этого метода приводило к сопоставимые результаты с меньше по сравнению с оценки грибковых бремени путем количественного PCR легких грибковых ДНК животных.
Abstract
Количественная оценка легких грибковых бремя имеет решающее значение для определения относительных уровней иммунной защиты и грибковых вирулентности в моделях мыши легочной грибковой инфекции. Хотя несколько методов используются для оценки грибковых бремя, количественные полимеразной цепной реакции (ПЦР) ДНК, грибковых стала техника с несколько преимуществ по сравнению с предыдущими методами на основе культуры. В настоящее время всеобъемлющую оценку патологии легких, лейкоцитарные вербовки, грибковые бремя и экспрессии генов мышей с инвазивного аспергиллеза (IA) требует использования значительное число экспериментальных и контрольных животных. Здесь количественная оценка легких гистологические окрашивания для определения грибковых бремя, используя ограниченное количество животных был рассмотрен подробно. Легких разделы были витражи для выявления грибковых структур с Gomori модифицированных methanamine серебра (GMS) пятнать. Изображения были взяты из разделов GMS-витражи из 4 дискретные поля каждого формалин Исправлена парафин врезанных легких. GMS, окрашенных областей внутри каждого изображения были количественно с помощью программы анализа изображений, и от этой количественной оценки, средний процент окрашенных области было определено для каждого образца. Используя эту стратегию, eosinophil недостаточным мышей выставлены сократилось грибковых бремя и болезней с caspofungin терапией, а мышей дикого типа с IA не улучшится с caspofungin. Аналогично грибковых бремя у мышей, не хватает γδ T клетки также были улучшены, caspofungin, как измеряется ПЦР и GMS количественной оценки. Количественная оценка GMS поэтому вводится как метод для определения относительной легких грибковых бремя, которое в конечном счете может уменьшить количество экспериментальных животных, необходимых для комплексного исследования инвазивного аспергиллёза.
Introduction
IA-это оппортунистическая инфекция, которая может развиться в впечатлительных людей с врожденной или приобретенной иммунной недостатки благодаря иммунной супрессивной терапии или хронической инфекции1,2. Первичная инфекция часто происходит в легкй, хотя в некоторых случаях распространение Aspergillus fumigatus печень, почки, сердце, и может произойти мозга, приводит в обширных тканевых вторжения гифы, сопровождается тяжелой болезни и высокой показатели смертности1,2. Кроме того эффективность существующих фармакотерапия ограничено и может быть ослабило появление противогрибковые резистентных штаммов в окружающей среды3. Поэтому важно понять механизмы грибковых вирулентности и принимающих патологии, которые содействуют развитию или обострение инвазивных грибковых заболеваний.
Мышиных моделях остаются важными механистический IA исследований, поскольку они позволяют исследователям оценить роль генов вирулентности грибковых и принимающих иммунной эффекторов для создания и роста A. fumigatus, в естественных условиях4,5. Следовательно несколько стратегий были разработаны для того, чтобы эффективно количественно оценить или сравнить грибковых бремя в группы подопытных животных6,7. Эти стратегии предусматривают на основе культуры, биохимические, иммуноанализ, или методов ПЦР, каждый с свои преимущества и недостатки. Кроме того каждый из этих методов включают преданность подмножество животных помимо тех, кто пожертвовал для оценки иммунного эффекторные функции, анализ выражения гена, и сравнительные гистопатология7. Таким образом комплексные исследования IA часто требуют значительного числа исследований животных при существенных издержках. Таким образом, эффективные стратегии, уменьшающие экспериментальной время, животное затраты и этические соображения, используя животных тканей для несколько анализа являются чрезвычайно ценным7.
В настоящем докладе вводится метод описания квантификации GMS, пятнать в гистологических срезах для сравнения относительной грибковых бремени между экспериментальной группы мышей с ИА. Подробно описан каждый шаг от грибковые культуры к инфекции, ткани урожая и обработки и захвата изображений и анализа данных. Грибковые бремя, полученные GMS количественной оценки были сопоставлены с ПЦР в модели нейтропенических IA и в caspofungin лечение одичал типа или eosinophil недостаточным мышей с IA8. Результаты показывают сходство с GMS количественной и ПЦР грибковых ДНК. Это предполагает, что GMS количественной оценки может быть полезным для исследователей, занимающихся гистологические анализы как дополнительных или альтернативных метода сравнения относительной грибковых бремени в мышах с IA и в конечном итоге может уменьшить стоимость и использование животных исследования в комплекс, механистических исследования.
Protocol
Все животные процедуры были утверждены животное уход и использование Комитета Индиана государственный университет, принимающей Кампус школы медицины университета Индианы — Терр Хаут.
1. Подготовка A. fumigatus конидий инфекции
- Работая в хорошо проветриваемом Зонта, мкл 125 A. fumigatus 293 Стоковый раствор до 900 мкл клеток культуры качества воды (CCGW). Затем перенесите решение солода экстракт агар (MEA) плита через пипетку и равномерно с пересевать цикла.
- Храните грибковых пластины в темноте при 24 ° C, по крайней мере 14 дней и не более 28 дней.
- Урожай конидий, с использованием стекляруса как описано9.
- Залейте 1,5 г 0,5 мм бисер на пластину и осторожно наклонить ее взад и вперед, пока бисер покрытием для того чтобы извлечь конидий. Собирайте шарик/конидий смесь в 15 мл Конические трубки. Приостановите в 5 мл Дульбекко фосфат амортизированное saline (DPBS) и вихря.
- Граф конидий в разведении 50 x супернатант в DPBS с помощью Горяева. Подсчитать количество конидий в этом районе, показанный на рисунке 1 и использовать уравнение 1 для расчета концентрации.
#Conidia × разрежения фактор4× 10 = конидий/мл (уравнение 1)
Примечание: Дополнительные 4 x 4 квадратных углу области могут учитываться, с виду этих областей, используется в качестве #Conidia в уравнение 1.
Рисунок 1: Горяева представитель область, используемая для подсчета конидий (бокс, стрелка).
- Разбавить конидий подвеска с стерильного физиологического раствора (DPBS) для получения желаемой концентрации, 1,0 x 108 конидий/мл для инфекции с 5 х 106 конидий/50 мкл. подготовить 50 мкл раствора конидий в 'n + 2' мышей, чтобы быть заражены счет для пипетирования ошибка.
Примечание: Стандартные гриб урожая и подготовки/фильтрации может быть также используется10. Стеклянный шарик метод лучше всего использовать для обеспечения что конидий образцы с минимальными малых/растворимые антигены гиф получаются для аспирации.
2. снижение иммунитета и инфекции мышиных модели
- Использование 7-10-week-old мышей.
Примечание: BALB/c, C57BL/6 (B6), eosinophil недостаточным (ΔdblGATA, фон BALB/c) и γδ Т клеток недостаточным (TCRδ-/-, фон B6) мышей были использованы для этого исследования. Для каждого экспериментировать, возраст и пол соответствует (как мужчин, так и женщин) мышах были использованы для каждой группы. - Разрушающим нейтрофилы через внутрибрюшинного (IP) для инъекций 0,1 мл (0,5 мг) антител анти-mouse-Ly - 6G в стерильного физиологического раствора под углом 45° в боковой нижнем правом квадранте (экспериментальный график, см. Рисунок 2).
- 24 часа спустя, заразить мышей путем аспирации с 5.0 x 106A. fumigatus конидий, взвешенных в 50 мкл стерильного физиологического раствора (см. шаги 2.4-2.10) как описано11. После инфекции, внедрить подмножество животных с противогрибковым агентом таких диацетата caspofungin 5 мг/кг в DPBS, используемые в данном исследовании (ежедневно, смотрите Рисунок 2).
- Анестезировать мышей с 99,9% изофлюрановая с использованием ветеринарных анестезия машины.
- Поместите бумажное полотенце на пол индукции палаты поймать калом и мочой.
- Поместите указатель мыши в зале индукции, обеспечить крышку и установите испаритель для 5% изофлюрановая 2 мин и 30 s.
Примечание: Vet мазь не используется потому, что общее время под наркозом составляет менее 5 мин. - Уменьшить испарителя до половины максимального параметра для 30 s.
- Убедитесь, что мышь является должным образом под наркозом, наблюдая замедлился дыхания, отсутствие движения и отсутствие реакции на мыс щепотка стимул.
- Удалите мышь из камеры индукции и место на наклонной доске. Поместите курсор мыши с его спиной против Совета. Убедитесь, что его верхних резцов нежно сдержанной с резинкой и нижних резцов нежно сдержанной с металлической проволокой.
- Тщательно Держите язык на полное расширение с небольшой щипцы и пипеткой 50 мкл суспензии конидий/PBS на базе языка.
- Держите язык на полное расширение; прослушивать учащенное дыхание и собственный щелкая шум аспирации. Подержите 20 s или до тех пор, пока полностью придыханием подвеска.
- Удалите мышь с наклонной доски и осторожно поместите в клетке для наблюдения.
- После аспирации мыши следует восстановить сознание в течение 1 мин Монитор мыши до тех пор, пока полностью сознательного и способен ходить вокруг клетки. Животные должны размещены на 21 ° C и контролировать два раза в день до тех пор, пока легкие собирают.
- Повторите истощение нейтрофилов (шаг 2.2) 24 ч после инфекции (рис. 2).
Рисунок 2: экспериментальный график. Эта цифра была изменена с предыдущей публикации8.
3. сбор и сохранение мыши легких для гистологического анализа
- Глубоко анестезировать животное с смертельную дозу 0,1 мл 390 мг/мл Пентобарбитал натрия решения IP.
- Подтвердите эвтаназии, наблюдая за отсутствия спонтанного дыхания и отсутствие ответа на стимуляцию конечностей с помощью пинцета. После умерщвлены, спрей каркаса с 70% этанола для стерилизации.
- Место тушу на доску пены, покрыт Впитывающим вкладышем.
Примечание: Каркаса должно уделяться его обратно с булавками, обеспечение все четыре конечности, чтобы пена матем. - Откройте верхней грудной полости, используя ножницы с осторожностью. Отрежьте грудной клетки, чтобы разоблачить легких и сердца. Вырежьте нижней полой вены для перфузии. Избегайте резки кровеносных сосудов и проколов органов.
- Медленно perfuse с 5 мл холодного DPBS в правом желудочке сердца под углом в 45° 25-G иглой. Повторите перфузии с 5 мл формалина 10%.
- Тщательно разоблачить трахеи и отсоединение окружающих жировых отложений. Следует соблюдать осторожность и избегать проколов трахеи. Убедитесь, что для того, чтобы полностью визуализировать трахеи прежде удаляется избыток соединительной ткани. Как только подвергается трахеи, место щипцы под трахеи, чтобы поднять его.
- Совать небольшое отверстие в верхней трахеи с помощью иглы 25-G.
Примечание: Отверстия должны быть расположены так, что весь канюля вписывается в трахею. Используйте осторожно, чтобы избежать разрыва трахеи. - Вставьте катетер через отверстие и легких. Закрепите Канюля хирургическая нить, слабо связали вокруг трахеи.
Примечание: Если разрыв трахеи, канюли может быть вставлен мимо трахеи, насколько это возможно в дыхательные пути. - С помощью шприца, надуйте легких с 1 мл 10% формалине буфера через канюлю. Убедитесь, что инфляция легких является видимым. Если нет, то настроить катетер и повторить. Как только легкие завышены, быстро удалить канюлю с осторожностью и затяните потока надежно перекрыть трахеи.
Примечание: Если разрыв трахею и легкие не могут быть завышены, легких все еще могут быть собраны, но это может помешать правильной фиксации. - Аккуратно удалите трахею и легкие от груди, тщательно отсоединив соединительной ткани трахеи с щипцами при аккуратно потянув в потоке. Место легкие и трахею, в 50-мл Конические трубки с 15 мл буфера формалина 10%. Поместите один конец потока за пределами трубки и закрыть крышку. Инвертируйте трубка полностью погружаться в образце в фиксатор.
- Храните при комнатной температуре в течение 24 часов или до дальнейшей обработки образцов.
ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Формалин опасных. Носите надлежащие средства личной защиты, включая защитные очки и маски. Работа под химические вытяжки при обработке образцов.
4. сбор и сохранение мыши легких для грибковых бремя ДНК
- Выполните шаги 3.1-3.5, как описано выше, на отдельной мыши.
- Медленно perfuse с 10 мл холодного DPBS в правом желудочке сердца под углом в 45° 25-G иглой.
- Акцизный легких с ножницами и место в меткой 1,5 мл пробирок.
- Храните легких-80 ° c до дальнейшей обработки.
- Используйте стандартные методы, как описано (внедрение и секционирование) и по данным производителя протоколов (см. Таблицу материалы).
5. микроскопии и изображений
- Открыть программу обработки изображений количественной оценки (см. Таблицу материалы).
- С помощью световой микроскоп, получите по крайней мере 4 различных областях GMS, окрашенных слайды (10 X цель). Убедитесь, что образы, представитель инфицированных дыхательных путей в легких с аналогичными ткани плотностью.
Примечание: Если плотность и распределение гиф очагов заметно отличаться между элементом управления и экспериментальных групп, могут быть приняты дополнительные поля или области GMS секции всей легких может быть imaged (4 X цель). Получите изображения же областей легких (определяется по морфологии эквивалентные ткани) на участке серийный легких окрашивали гематоксилином и эозином, при желании. - Добавить баров масштаба изображения при необходимости и сохранить изображения, чтобы быть количественно. Выберите Правка > Добавить/редактировать калибровки знаки > меню: выберите размер линии толщины, цвета и масштаба бар > нажмите на изображение для где линейки шкалы должен быть помещен. Закройте меню и выберите Правка > слияния > Объединить знаки калибровки > выберите файл сохранить как > имя файла и нажмите Сохранить.
6. Использование программы обработки изображений для вычисления грибковых бремя (рис. 3)
- Откройте программу обработки изображений. Выберите Файл > папка с образцами для количественного определения > изображения (рис. 3A). Выберите изображение > Вид > преобразовать в «RGB стека» (рис. 3B).
- Используйте клавишу со стрелкой вправо, чтобы выбрать второй из трех дано изображения (рис. 3B). Хит «контроль + shift + T» воспитывать «Порог» меню настройки регулятора (рис. 3 c). Найдите исходное изображение .jpg или .tiff как ссылку и открыть с изображением просмотра программы (рис. 3 c).
- Потяните верхний ползунок влево до конца и ползунок внизу, до тех пор, пока площадь выбранного (в красном) является представителем микроскопия image (обычно в диапазоне от 130-160 как указывается справа от ползунка (рис. 3 c).
- После выбора, нажмите «Установить» > «OK» (рис. 3D). Выберите «Анализ» > «Задать измерения» > проверить «Уголок, уголок дроби, предел порога, отображаемая метка» и оставить параметры внизу (раскрывающегося меню и десятичных) по умолчанию > «OK» (рис. 3D).
- Значительные площади пустого пространства или окрашивания фона могут быть исключены путем выбора соответствующей ткани с инструмента области или многоугольник.
- Наконец, выберите «Анализ» > «Мера» (должно появиься окно с данными, или вкладки на панели задач windows появится ярлык, «Результаты») (Рисунок 3E). Передачи данных в программу анализа данных для построения графиков и статистического анализа.
- Введите Среднее процентные четыре области для каждого образца, легких. 5-8 образцы, как правило, достаточно для выявления значимых различий между группами. Если сравнение двух экспериментальных групп, выполнить качестве непарный студента t-тест для определения значимости.
Рисунок 3: представитель скриншоты для каждого шага GMS гистологические поле квантификации. (A) выберите Файл > папка с образцами для количественного определения > выберите изображение. (B) выберите изображение > Вид > преобразовать в «RGB стека». Используйте клавишу со стрелкой вправо для выбора второй из трех данного изображения. (C) хит «контроль + shift + T» довести до регулятора настройки меню «Порог». Найдите исходное изображение .jpg или .tiff как ссылку и открыть с помощью программы просмотра фото. Потяните верхний ползунок до упора слева и ползунок внизу, до тех пор, пока площадь выбранного (в красном) является представителем микроскопия image (обычно начиная от 130-160 как указывается справа от ползунка. (.D) после выбранного нажмите «установить» > «OK». Выберите «Анализ» > «Задать измерения» > проверить «Уголок, уголок дроби, предел порога, отображаемая метка» и оставить параметры внизу (раскрывающегося меню и десятичных) по умолчанию > «OK». (E) наконец выберите «Анализ» > «Мера» (должно появиься окно с данными, или вкладки на панели задач windows будут отображаться с надписью «Результаты»). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
7. ДНК грибковых бремя
- Удаление легких от-80 ° C и lyophilize по крайней мере 4 часа (ночь является оптимальным) или до тех пор, пока полностью высушенного путем замораживания сухой системы.
- В то время как легкие сушка, подготовьте буфера экстракции ДНК (0,1 М NaCl, 10 мм ЭДТА pH 8.0, 10 мм Tris-HCl рН 8.0 и 0,5% SDS).
- Место подготовленный буфер экстракции ДНК в ванну воды 60 ° C для предварительного подогрева. Кроме того, место фенола: хлороформ: изоамиловый спирт (25:24:1) в 50-мл Конические трубки и позволяют для разделения.
- Место лиофилизированные легких в колпачок 2-мл пробирку с 0,2 мл стеклянных шариков. С помощью било шарик, шлифуют сухой легочной ткани для 15-30 s, до тех пор, пока она образует мелкодисперсного порошка.
- Добавьте 0,8 мл теплой экстракции ДНК буфер для каждой трубки и вихревой хорошо. Инкубируйте каждая трубка 15 мин в ванной шарик 65 ° C и затем vortex до инкубации еще 15 мин. После инкубации, вихрь и затем центрифуги трубки на 25000 х g за 10 мин.
- Метка 3 комплекта 1,5 мл пробирок для каждого из образцов и перевести верхний слой супернатант в один набор трубок. Будьте осторожны во время дозирование из верхнего слоя водной избежание тревожные средний слой.
- Добавить одинаковый объем фенола: хлороформ: изоамилового спирта и хорошо перемешать. Затем центрифуги на 25000 х g за 15 мин до закупорить, верхний слой в второй набор трубок.
- Добавить равное количество хлороформ хлороформ: изоамиловый, хорошо перемешать и центрифуги на 25000 х g 10 мин тщательно пипетку вне верхний слой в третий набор трубок.
- Добавьте 500 мкл изопропанол и 50 мкл NaoAc (рН 5.2), хорошо перемешать и позволяют образцы для инкубации при комнатной температуре в течение 10 мин. Затем центрифуги на 25 000 x г за 30 мин и сцеживаться супернатант.
- Помыть лепешка ДНК с 750 мкл лед холодной 70% этанола и центрифуги для 5 минут на 25 000 x g. Decant этанола и позволяют гранулы воздуха сухие пробирки в вытяжных 40 мин.
- Ресуспензируйте сухие гранулы в 300 мкл буфера TE.
Примечание: ДНК может храниться при-20 ° C до тех пор, пока количественно. - Количественного определения ДНК, используя спектрофотометр и подготовить 100 мкл 0.2 мкг/мкл каждого образца ДНК для ПЦР анализа.
- Выполнить стандартное ПЦР в трех экземплярах, как описано ранее с 1 мкг ДНК образца, грибковых 18S рДНК грунт, и зонд наборов с помощью модифицированных зонд утоления (5'- / 56-FAM/СМЖЛ CAG КЭУ/Дзэн/CCC ГЦА AAT G/3IABkFQ /-3')12,13.
- Подготовить калибровочной кривой от A. fumigatus геномной ДНК и рассчитать концентрацию грибковых ДНК в pg в каждом образца с помощью средняя репортер красителя Ct значения.
- Участок pg/мкг грибковых ДНК с Среднеквадратичная ошибка среднего значения. Выполните студента t-тест анализ для определения значимости.
Примечание: как менее токсичных альтернативой экстракции ДНК фенол хлороформ, используемый здесь, столбец на основе экстракции ДНК наборы могут быть использованы.
Representative Results
Рисунок 4 включает в себя график выживания дикого типа или eosinophil недостаточным мышей с IA относились с caspofungin. Результаты показывают, что eosinophil недостаточным мышей выставлены увеличение выживания, по сравнению с мышах одичал типа (50% смертности по сравнению с 100% смертности, соответственно). Рисунок 5 показывает представитель GMS окрашивания нейтропенических одичал тип и eosinophil недостаточным мышей с IA лечить или не лечить с caspofungin. Caspofungin лечение привело к относительной грибковых Распродажа в eosinophil недостаточным, но не одичал типа мыши (правой панели), во время обеих групп, которые не получили caspofungin были аналогичные (левой панели). Рисунок 6 показывает сравнение грибковых бремени в caspofungin лечение и контроль без лечения одичал типа или eosinophil недостаточным мышей, используя оба ПЦР грибковых ДНК (Рисунок 6A) и представитель GMS количественная оценка 4 (10 X цель) полей) Рисунок 6B). Результаты, полученные от обоих методов показывают, что результаты лечения caspofungin в наиболее значимых грибковых бремя уменьшаться между мышей дикого типа и eosinophil недостаточным (рис. 6A). Однако в необработанной мышей, только GMS количественной привело к значительным снижением мышей не хватает эозинофилов (Рисунок 6B). Когда средняя площадь всего легочными GMS-окрашенных участков были рассчитаны (4 X цель), отличия были похожи на результаты, полученные с 4 представителя 10 X поля, хотя и с меньше статистической значимости (рис. 6 c). Рисунок 7 показывает выживания, изображения представитель GMS окрашивание (4 10 X полей) и количественная оценка грибковых бремя обоими методами в γδ дефицит Т клеток (TCRδKO) мышей, которые лечились с caspofungin по сравнению с контролем, лечить мышей. Caspofungin лечение улучшение выживания (рис. 7A) и грибковые бремя (Рисунок 7B-D) в TCRδKO мышей. Аналогичные результаты на рисунке 6, результаты грибковых бремени как измеряется ПЦР (рис. 7B) и представитель GMS количественной (рис. 7 c) были сопоставимыми.
Рисунок 4: увеличение выживания в eosinophil недостаточным (ΔdblGATA) мышах с IA после лечения с caspofungin. 15-30 мышей/группы. Краткое изложение экспериментов 3-6. p < 0,0001. Эта цифра была изменена с предыдущей публикации8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: представитель изображения участков GMS-окрашенных легких от дикого типа, eosinophil недостаточно и caspofungin лечение или управления лечить мышей с НМА Представитель группы по 3-4 мышей /. Линейку эквивалентна 100 мкм. Эта цифра была изменена с предыдущей публикации8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: грибковых бремя в одичал тип eosinophil недостаточным мышей с IA лечить или управления относились с caspofungin. (A) ПЦР грибковых ДНК. 15-30 мышей/группы, изложение экспериментов 3-6. (B) GMS количественная оценка гистологических срезах, средний % GMS окрашивания от 4 полей (10 x цель). (C) GMS количественной оценки, средний % всего легкого секции (4 X цель). Резюме 5 мышей/группы B и C. p < 0,05. p < 0,001. p < 0,0001. Эта цифра была создана с использованием данных, которые были указаны в предыдущем издание8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7: снижение тяжести IA γδ Т клеток недостаточным мышей после лечения caspofungin. Выживание (A). (B) ПЦР грибковых ДНК. (C) GMS количественная оценка гистологии. (D) представитель изображения GMS-окрашенных участков от γδ T клетки с IA, переработанных или непереработанных с caspofungin. A и B являются резюме двух экспериментов с 7-10 мышей/группой. Резюме 4 мышей/группы C и D. p < 0,05. p < 0.01. p < 0,001. Эта цифра была изменена с предыдущей публикации8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Целью этой статьи было внедрить метод для определения грибковых бремя легких у мышей с IA, используя GMS-окрашенных легких Гистологические срезы для анализа изображений и количественной оценки. В этом исследовании, лечение с β-глюканы синтез ориентация противогрибковый препарат caspofungin14 не улучшится выживания или грибковых бремя в мышах одичал тип нейтропенических с IA8. Однако в отсутствие эозинофилов или γδ T клетки, выживания и грибковых бремя улучшилась. Результаты нашего исследования также показали, что сопоставимые результаты могут быть получены путем GMS грибковых бременем по сравнению с широко используется грибковых ДНК ПЦР метод6.
Есть несколько преимуществ использования GMS грибковых бремя количественной оценки. Во-первых этот процесс может использовать существующие гистологические образцы, потенциально уменьшая количество экспериментов необходимо определить существенные различия. Во-вторых в этом исследовании, меньше животных необходимы для количественной оценки GMS грибковых бремя для достижения значительных различий по сравнению с ПЦР грибковых ДНК (рис. 6, рис. 7). В-третьих сравнение грибковых бремени в различные изолятах, ПЦР могут быть затронуты изолировать-зависит от различий в рибосомной ДНК копии номер15. В отличие от этого GMS количественной оценки не зависит от копии номер, как грибковые бремени определяется относительных уровней грибковые роста легких. Таким образом использование GMS количественной оценки для грибковых бремя уменьшает использование позвоночных животных и не требуется предварительное определение числа рДНК копии. Наконец в дополнение к изменению грибковых морфологии, caspofungin терапии увеличивает грибковых фрагментации и таким образом может искусственно увеличить грибковых бремя, когда измеряется изоляции колонии формирования подразделений из легких гомогенатах12,16 ,17. Таким образом GMS количественная оценка грибковых бремя избегает несколько ограничений, присущих с других часто используемых методов.
Однако важно отметить ограничения GMS количественной оценке и/или исследования. Во-первых авторы сопоставимых распределение гиф роста всей легких каждой экспериментальной группы и таким образом количественной оценки от 4 представителя 10 x объективных поля как представитель измерение для грибковых бремя на всей легких (Рисунок 6B). Вполне возможно, что в некоторых случаях относительное распределение, размер и плотность гиф очагов будет достаточно отличаются тем что грибковые бремя будет отличаться с этим методом и эквивалент методом ПЦР. Однако наши дополнительные результаты с квантификацией раздел весь легких с помощью объективных поля 4 X показали аналогичные, хотя и менее статистически значимых различий между группами (рис. 6 c). Стандартная ошибка этой количественной оценки было увеличено с этой стратегией, вероятно из-за снижение гиф резолюции с 4 X объективной и увеличение фон в неоптимальных областях. Таким образом представитель количественную оценку меньшее количество полей на увеличение является предпочтительным. Во-вторых только один центральный раздел был использован для каждого образца. Это возможно, основанный на грибковые изолятов или используется мышей штаммов, что некоторые исследования может привести к неравномерному распределению гиф роста. В тех случаях дополнительных разделов на протяжении каждого блока парафина следует количественно для получения более представительным бремя. В-третьих в экспериментах, которые вызывают значительное производство муцин (т.е., количественного определения сократимость микоз аллергическими заболеваниями бронхолегочной аспергиллеза (ABPA)18 или кистозный фиброз (CF)18), GMS реактивности с полисахарид богатые муцин19 может неспецифической GMS + результаты и таким образом отклонение некоторые образцы пользу выше грибковых бремя. Так как в этом исследовании была использована только модель нейтропенических IA, вполне возможно, что использование других иммунных компетентным или подавляющих моделей могла бы результаты в менее сопоставимые результаты. Несмотря на эти оговорки GMS количественной оценки обеспечивает сопоставимой методику для определения грибковых бремя, и его дальнейшее использование в дополнительных исследованиях далее может проверить полезность этого метода как последовательным, надежным и экономически эффективным.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано в части, Индиана университета школа из медицины исследований повышение Грант и низ-NIAID 1R03AI122127-01. В этот период н.а. частично поддерживается карьеру в области иммунологии стипендий от Американской ассоциации иммунологов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aspergillus fumigatus 293 Stock Solution | Fungal Genetics Stock Center | FGSC #A1100 | |
| HyPure Cell Culture Grade Water | Thermo Fisher Scientific | SH30529.03 | |
| Malt Extract | MP Biomedicals | 2155315 | White Powder |
| BD BBL Acidicase Dehydrated Culture Media: Peptone | Fisher Scientific | L11843 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydrous (Granular Powder/Certified ACS) | Fisher Scientific | D16-3 | |
| Fisher BioReagents Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| Auto Dry Cabinet | Shanghai Hasuc Instrument Manufacture Co.,LTD | HSFC160FD | |
| 1300 Series Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific | 1375 | |
| 0.5 mm Glass Beads | BioSpec Products | 11079105 | |
| 15 ml Conical Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339650 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | # 0267110 | |
| Leica Model DME Microscope | Leica | 13595XXX | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662-500 ml | |
| 1.5 ml tubes | Fisher Scientific | # 05-408-129 | |
| BD Precisionglide syringe needles, gauge 27, L 1/2 in. | Sigma-Aldrich | Z192384 | |
| Anti-mouse-Ly-6G antibody | BioXCell | BP0075-1 | Clone 1A8 |
| Caspofungin diacetate | Sigma-Aldrich | SML0425 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 1169567762 | |
| Non-Rebreathing Table Top Veterinary Anesthesia Machine | Supera Anesthesia Innovations | M3000 | |
| Pureline Oxygen Concentrator | Supera Anesthesia Innovations | OC8000 | |
| Slant Board Restraint | Indiana State University Facilities Management | Custom made | |
| Gilson PIPETMAN Classic 200 ml Pipets | Fisher Scientific | F123601G | |
| Pentobarbital Sodium (Fatal-Plus) | Vortech Pharmaceuticals | 0298-9373-68 | |
| General-Purpose Broad-Tipped Forceps | Fisher Scientific | 10-300 | |
| Fisherbrand Standard Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-951-20 | |
| Fisherbrand General-Purpose Curved Forceps | Fisher Scientific | 10-275 | |
| Ethyl Alcohol-200 Proof | PHARMCO-AAPER | 111000200 | |
| Fisherbrand Absorbent Underpads | Fisher Scientific | 14-206-63 | |
| BD Precisionglide syringe needles, gauge 25, L 1 in. | Fisher Scientific | Z192406 | |
| All-Plastic Norm-Ject Syringes | Fisher Scientific | 14-817-30 | |
| IV CATH ANGIOCATH 22GX1GIN 50B | Fisher Scientific | NC9742754 | |
| Formalin Solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | |
| 50 ml Conical Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| Thermo Scientific Shandon Embedding Cassettes II in Tube Packs | Fisher Scientific | B1000729 | |
| Fisherfinest Histoplast Paraffin Wax | Fisher Scientific | 22-900-700 | |
| Disposable Base Molds | Fisher Scientific | 22-363-554 | |
| Reichert Jung Histocut 820 Microtome | Labequip.com | 31930 | |
| Water Bath | Precision Scientific | 66630-23 | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | 116875H | |
| Silver Stain (Modified GMS) Kit | Sigma-Aldrich | HT100A-1KT | |
| Fast Green FCF | Fisher Scientific | AC410530250 | |
| Frosted Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-343 | |
| Fisherfinest Superslip Cover Glass | Fisher Scientific | 12-545-89 | |
| Cytoseal XYL | Fisher Scientific | 22-050-262 | |
| Olympus Provis AX70 Microscope | Olympus | OLYMPUS-AX70 | |
| U-PHOTO Universal Photo System | Olympus | OLYMPUS-U-PHOTO | |
| U-MCB-2 MULTI CONTROL BOX | Olympus | OLYMPUS-U-MCB-2 | |
| U-PS POWER SUPPLY UNIT | Olympus | OLYMPUS-U-PS | |
| FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze Dry System | LABCONCO | 7740020 | |
| Maxima C Plus Vacuum Pump | Fisher Scientific | 01-257-80 | Displacement- 6.1 cfm |
| 1-Butanol | Fisher Scientific | A383-4 | |
| AMRESCO PHENOL-CHLORFORM-OSOAMYL 100ML DFS | Fisher Scientific | NC9573988 | |
| Free-Standing Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | # 02-682-557 | |
| Mini-Beadbeater-24 | BioSpec Products | 112011 | |
| BioSpec ProductsSupplier Diversity Partner 2.3 MM ZIRCONIA BEADS | Fisher Scientific | NC0451999 | |
| Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus | Fisher Scientific | A144S | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate | Fisher Scientific | S311 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), White Powder, Electrophoresis | Fisher Scientific | BP166 | |
| Chloroform/isoamyl alcohol 24:1 | Fisher Scientific | AC327155000 | |
| Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer | Fisher Scientific | 11-120-570 | |
| Thermo Scientific™ ABsolute Blue qPCR Mixes | Fisher Scientific | AB4137A | |
| Hybridization Probe, 5′-FAM-AGCCAGCGGCCCGCAAATG-TAMRA-3′ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Sense Amplification Primer, 5′-GGCCCTTAAATAGCCCGGT-3′ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Antisense Amplification Primer, 5′-TGAGCCGATAGTCCCCCTAA-3′ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Applied Biosystems™ MicroAmp™ Optical 8-Tube Strip, 0.2mL | Fisher Scientific | 43-165-67 | |
| Thermo Scientific Domed and Flat PCR Cap Strips | Fisher Scientific | AB-0386 | |
| Mx3005P QPCR System, 110 Volt | Agilent | 401443 | Stratagene is now owned by Agilent |
| BALB/c mice | The Jackson Laboratory | 000651 | |
| C57BL/6 (B6) mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Eosinophil-deficient (ΔdblGATA, BALB/c background) mice | The Jackson Laboratory | 005653 | |
| γδ T cell-deficient (TCRδ-/-, B6 background) mice | The Jackson Laboratory | 002120 | |
| ImageJ Software | National Institutes of Health | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Spot Advanced Software | Spot Imaging | SPOT53A | http://www.spotimaging.com/software/spot-advanced/ |
| GraphPad Prism 6 | GraphPad Software | N/A | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
| Fisherbrand Absorbent Underpads | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| Step 4.5 | http://www.bdbiosciences.com/sg/resources/protocols/paraffin_sections.jsp ; http://www.jove.com/science-education/5039 ; http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/General_Information/1/ht100.pdf |
References
- Hohl, T. M., Feldmesser, M. Aspergillus fumigatus: principles of pathogenesis and host defense. Eukaryot Cell. 6 (11), 1953-1963 (2007).
- Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. Aspergillus fumigatus--what makes the species a ubiquitous human fungal pathogen? PLoS Pathog. 9 (12), e1003743 (2013).
- Ostrosky-Zeichner, L., Casadevall, A., Galgiani, J. N., Odds, F. C., Rex, J. H. An insight into the antifungal pipeline: selected new molecules and beyond. Nat Rev Drug Discov. 9 (9), 719-727 (2010).
- Desoubeaux, G., Cray, C. Rodent Models of Invasive Aspergillosis due to Aspergillus fumigatus: Still a Long Path toward Standardization. Front Microbiol. 8, 841 (2017).
- Hohl, T. M. Overview of vertebrate animal models of fungal infection. J Immunol Methods. 410, 100-112 (2014).
- Sheppard, D. C., et al. Comparison of three methodologies for the determination of pulmonary fungal burden in experimental murine aspergillosis. Clin Microbiol Infect. 12 (4), 376-380 (2006).
- Patterson, T. F. The future of animal models of invasive aspergillosis. Med Mycol. 43 Suppl 1, S115-S119 (2005).
- Amarsaikhan, N., et al. Caspofungin Increases Fungal Chitin and Eosinophil and gammadelta T Cell-Dependent Pathology in Invasive Aspergillosis. J Immunol. 199 (2), 624-632 (2017).
- Templeton, S. P., Buskirk, A. D., Law, B., Green, B. J., Beezhold, D. H. Role of germination in murine airway CD8+ T-cell responses to Aspergillus conidia. PLoS One. 6 (4), e18777 (2011).
- Brunel, S. F., et al. Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus. J Vis Exp. (122), (2017).
- Rao, G. V., et al. Efficacy of a technique for exposing the mouse lung to particles aspirated from the pharynx. J Toxicol Environ Health A. 66 (15), 1441-1452 (2003).
- Bowman, J. C., et al. Quantitative PCR assay to measure Aspergillus fumigatus burden in a murine model of disseminated aspergillosis: demonstration of efficacy of caspofungin acetate. Antimicrob Agents Chemother. 45 (12), 3474-3481 (2001).
- Li, H., et al. The small GTPase RacA mediates intracellular reactive oxygen species production, polarized growth, and virulence in the human fungal pathogen Aspergillus fumigatus. Eukaryot Cell. 10 (2), 174-186 (2011).
- Sucher, A. J., Chahine, E. B., Balcer, H. E. Echinocandins: the newest class of antifungals. Ann Pharmacother. 43 (10), 1647-1657 (2009).
- Herrera, M. L., Vallor, A. C., Gelfond, J. A., Patterson, T. F., Wickes, B. L. Strain-dependent variation in 18S ribosomal DNA Copy numbers in Aspergillus fumigatus. J Clin Microbiol. 47 (5), 1325-1332 (2009).
- Kirkpatrick, W. R., Perea, S., Coco, B. J., Patterson, T. F. Efficacy of caspofungin alone and in combination with voriconazole in a Guinea pig model of invasive aspergillosis. Antimicrob Agents Chemother. 46 (8), 2564-2568 (2002).
- Petraitiene, R., et al. Antifungal efficacy of caspofungin (MK-0991) in experimental pulmonary aspergillosis in persistently neutropenic rabbits: pharmacokinetics, drug disposition, and relationship to galactomannan antigenemia. Antimicrob Agents Chemother. 46 (1), 12-23 (2002).
- Cowley, A. C., Thornton, D. J., Denning, D. W., Horsley, A. Aspergillosis and the role of mucins in cystic fibrosis. Pediatr Pulmonol. 52 (4), 548-555 (2017).
- Taylor, M. J., et al. Detection of fungal organisms in eosinophilic mucin using a fluorescein-labeled chitin-specific binding protein. Otolaryngol Head Neck Surg. 127 (5), 377-383 (2002).
