Summary
El objetivo general de este procedimiento es proporcionar una técnica muy reproducible para evaluación en vivo de la interrupción de la barrera blood - brain en modelos de rata de accidente cerebrovascular isquémico.
Abstract
Accidente cerebrovascular isquémico conduce a edema cerebral vasogénico y lesión cerebral primaria posterior, que es mediada a través de la destrucción de la barrera blood - brain (BBB). Ratas con ictus isquémico inducido fueron establecidas y utilizadas como modelos en vivo para investigar la integridad funcional de la BBB. Detección espectrofotométrica de azul de Evans (EB) en las muestras de cerebro con lesión isquémica podría proporcionar justificación confiable para la investigación y desarrollo de nuevas modalidades terapéuticas. Este método genera resultados reproducibles y es aplicable en cualquier laboratorio sin necesidad de equipo especial. Presentamos una pauta técnica y visualizada en la detección de la extravasación de EB tras inducción de movimiento isquémico en ratas.
Introduction
Edema cerebral de vasogenic debido a la interrupción de la barrera blood - brain (BBB) sigue siendo una complicación importante de ictus isquémico y un determinante de la tasa de supervivencia en los pacientes de accidente cerebrovascular1,2. La barrera blood - brain (BBB), que está formada por células endoteliales capilares del cerebro (BCECs) y compuesta de neurovascular distintos componentes (por ejemplo, uniones estrechas entre células neuronales3, BCECs, pericitos y astroglial), proporciona un especializada y dinámica interfaz entre el sistema nervioso central (SNC) y la circulación de la sangre periférica4,5. Insultos tales como lesiones de isquemia-reperfusión podrían interrumpir la integridad funcional de la BBB y conducen a la penetración posterior de leucocitos que circulan en el parénquima cerebral que finalmente desencadenan la inflamación cerebral y lesiones cerebrales primarias 6 , 7. modelos animales son necesarios para la detección exacta de la disfunción del BBB después de ocurrencia de un accidente cerebrovascular. Estos modelos son de gran importancia para el estudio subyacente mecanismos fisiopatológicos y la introducción de nuevas estrategias neuroprotectoras. In vitro de la célula cultura modelos basados en el BBB han sido altamente desarrollados y utilizado para el estudio molecular de la BBB Fisiopatología8,9,10. Sin embargo, en vivo los modelos animales, que producen el daño isquémico de la BBB similar a condiciones clínicas humanas, están también vale la pena en este sentido. Detección cuantitativa de la extravasación de azul de Evans (EB) es una técnica bien aceptada y sensible que se ha utilizado para la evaluación de la integridad BBB y la función en las enfermedades neurodegenerativas, incluyendo accidente cerebrovascular isquémico11, 12 , 13 , 14. este método es rentable, factible, reproducible y totalmente aplicable en cualquier laboratorio experimental. Su aplicación no requiere de equipos avanzados, tales como trazadores radiactivos15 o la proyección de imagen de resonancia magnética (MRI)16, que son requisitos previos para otros métodos. En este artículo demostramos comprensivo procesos técnicos básicos de evaluación de BBB con extravasación de EB en modelos de rata de accidente cerebrovascular isquémico.
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Protocol
Todos los procedimientos fueron realizados siguiendo las directrices de Ardabil Universidad del Consejo de investigación de ciencias médicas para llevar a cabo estudios en animales (número de identificación ética: ir ALCATRACES. Rec.1394.08). en este estudio visualizado, utilizamos adultos hombres ratas Sprague-Dawley (300-350 g) de pasto Instituto (Teherán, Irán).
1. anestesia y flujometría
- Inducir la anestesia con isoflurano 4% y mantenerlo con isoflurano (1-1.5%) en una mezcla de óxido nitroso (70% v/v) y oxígeno (30% v/v) para la duración de la cirugía.
- Colocar un animal anestesiado en la postura propensa en una manta de calentamiento controlado de la retroalimentación y mantener la temperatura corporal a 37±0.5 ° C por medio de una sonda rectal conectada a esta unidad de calefacción.
- Aplique una pequeña cantidad de pomada oftálmica en ambos ojos para evitar la sequedad.
- Afeite la región quirúrgica en el lado izquierdo del cráneo con las podadoras eléctricas. Use solución de betadine con una gasa para desinfectar la piel. Enjuague esta región con un paño estéril que contiene etanol al 70% y repita los dos pasos para tres ciclos17.
- Para la analgesia, inyectar 0,2 mL de bupivacaína 0.5% por vía subcutánea en la región de la cirugía17.
- Realice una incisión de piel largo de 1 cm en el cráneo (que se extiende desde el canto lateral del ojo izquierdo hasta la base del oído izquierdo) y disecar el músculo de los temporalis izquierda para exponer el cráneo. Entonces, de crear un agujero de las rebabas pequeñas 5 mm lateral a y 1 mm posterior a bregma18 para facilitar la colocación de la punta de la sonda de lápiz medidor de flujo Doppler.
- Gire a la rata de los propensos a la posición supina y luego poner la punta de prueba del lápiz de láser en el agujero ciego de cráneo previamente perforados para controlar el flujo de sangre cerebral regional (rCBF).
- Grabar rCBF de línea de base de cada animal y considerar esto como 100%. En particular, oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) se inicia cada vez que una disminución de rCBF de más del 80% es detectado19,20.
2. inducción de la isquemia Focal Cerebra
- Afeitado de la región del cuello y desinfectar la piel con betadine solución y el 70% de etanol. Inyectar 0,2 mL de bupivacaína 0.5% por vía subcutánea en el sitio de la cirugía para analgesia17.
- Hacer una incisión de 2 cm largo quirúrgico en la superficie ventral del cuello a la arteria carótida común izquierda (LCCA). Aislar el LCCA desde la fascia vecina y nervio del nervio vago para acceder a la bifurcación de la arteria carótida externa (CEPA) y la arteria carótida interna (ACI).
- Ligar permanentemente el LCCA o cepa empleando una sutura de seda 5-0 y diseccionar ICA libre al nivel de la arteria pterigopalatina.
- Colocar sin apretar un lazo de sutura de seda 5-0 alrededor de LCCA, y entonces temporalmente ICA Sujete con un clip vascular de micro.
- Realice una pequeña incisión en el LCCA antes la corbata suelta previamente colocado, inserte una sutura de nylon de silicio de 4-0 en el espacio luminal del ICA y apretar la sutura alrededor el LCCA para asegurar la sutura de nylon y evitar fugas de sangre.
- Retire el clip vascular de micro de la ACI. Luego, avanzar un filamento revestido intramural de silicio hasta observar una disminución marcada de rCBF que indica oclusión del origen MCA. Al final del período isquémico (90 min), iniciar la reperfusión retirando la sutura intraluminal del21.
3. vena yugular la canulación y Evans azul (EB) inyección
- Realizar una incisión longitudinal de 1 cm en el cuello en el lado izquierdo de la línea media y luego diseccionar sin rodeos a fascia superficial para acceder a la rama externa de la vena yugular izquierda (LGV). Luego, ligar permanentemente el extremo craneal de la línea de alta velocidad con sutura de seda 5-0. Libremente Ponga dos lazos alrededor de la vena y luego Sujete temporalmente el cardiaco final de la línea de alta velocidad con una abrazadera de micro vascular.
- Realice una pequeña incisión en la línea de alta velocidad entre dos suturas y luego inserte el catéter suero heparinizado llenado en el espacio luminal de la LGV y avanzar aproximadamente 10 mm. después, apriete las ligaduras alrededor de la vena para asegurar el catéter y evitar el sangrado. Inyectar pequeñas cantidades de suero para evitar el colapso de la vena.
- Al principio del período de reperfusión, inyecte lentamente tinte EB (1 mL/kg de solución al EB 2% en solución salina) durante 5 minutos. Posteriormente, lavar la cánula de la inyección de solución salina normal 0,5 mL y retirar la cánula de inyección de la vena12,22.
- Por último, suturar las incisiones en cabeza y cuello e inyectar 0,05 mg/kg de buprenorfina por vía intraperitoneal (IP) y repetir la inyección cada 6-8 h durante el período de reperfusión para analgesia postoperatoria de17.
- Inyectar 5 mL de saline(IP) precalentado para proporcionar la hidratación en la jaula de recuperación17.
- El animal en una jaula de recuperación equipado con control de temperatura y aire acondicionado y supervisar la recuperación del animal de la anestesia.
4. evaluación de la permeabilidad de la barrera sangre cerebro
- Después de 24 h de la reperfusión, profundamente anestesiar el animal con tiopental sódico. A continuación, abrir la cavidad torácica haciendo un agujero pequeño debajo del esternón.
- Hacer una pequeña apertura en la aurícula derecha e inyectar 250 mL de solución salina 0.9% precalentado (37 ° c) a una presión de 110 mmHg a través del ventrículo izquierdo por 15 min a lavar EB de la circulación hasta que las salidas de solución Salinas normales desde la aurícula llega a ser descolorido23.
- Quitar inmediatamente el cerebro del cráneo y colocarlo en la matriz del cerebro. Disecar el bulbo olfatorio y el cerebelo, y entonces usando una cuchilla de limpiar, separar el hemisferio derecho del cerebro de la izquierda (Lesioned) a lo largo de la línea media.
- Pesan cada hemisferio y homogeneizar por separado en 2,5 mL de tampón fosfato salino y mezclar esto con 2,5 mL de ácido tricloroacético (60%) durante 2 min con una máquina de vórtice.
- Centrifugar las muestras de cerebro durante 30 min a 1.322 x g y permita que las muestras se enfríe en el refrigerador de 4 ° C durante 10 minutos.
- Utilice los sobrenadantes para calcular la absorbancia de EB por un espectrofotómetro a 610 nm23.
- Calcular las concentraciones de EB contra una curva estándar y resultados expresados como μg/g de tejido cerebral.
5. producción de la curva estándar de EB
- Preparar soluciones de muestra 10 de EB con concentraciones de 1-10 μg de EB en 5 mL de tampón fosfato salino.
- Medir la absorbancia de cada muestra a 610 nm usando un espectrofotómetro.
- Hacer un gráfico de dispersión con una hoja de cálculo y presente concentraciones de EB en el eje X y los valores de absorbancia en el eje Y (figura 1).
- Definir una línea de tendencia lineal para la curva con su ecuación. Entonces, se usa para obtener la concentración de la EB de las muestras.
- Informar sobre los resultados finales de la extravasación de EB como μg/g del peso de tejido cerebral.
6. simulacro de operación
- Realizar el mismo proceso quirúrgico con las ratas en el grupo sham-funcionado (incluyendo haciendo una incisión en la región del cuello y la inyección de EB) pero excluye la MCAO.
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Representative Results
No hubo diferencias significativas en los niveles EB en el hemisferio derecho versus hemisferio izquierdo de las ratas sham-funcionado (1,06 ± 0.1 μg/g y 1,1 ± 0.09 μg/g, respectivamente). Como se muestra en la figuras 2A-2B, inducción de isquemia transitoria (90 min de isquemia / reperfusión de 24 h) causó una diferencia significativa en los niveles de EB (10,41 ± 0.84 μg/g, p < 0.001) en el hemisferio izquierdo de ratas isquémicas, en comparación con el respectivo Hemisferio en las ratas sham-funcionado. Colectivamente, estos resultados indican que bajo condiciones normales, EB fácilmente no puede cruzar el BBB en parénquima cerebral e insultos isquémicos cerebrales inducen la extravasación de EB a través de una mayor permeabilidad de la BBB (figuras 2A y 2B).
Figura 1 : La curva estándar se utiliza para determinar la concentración de EB de los valores de absorbancia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Evaluación de la disrupción de la BBB por extravasación de EB 24 horas después del accidente cerebrovascular isquémico. La fotografía de los cerebros de los animales funcionan sham e isquémicos (A). La intensidad de la extravasación de EB en el tejido cerebral (color azul) se presenta desde el punto de la interrupción de BBB en el hemisferio lesionado. Concentración de EB en muestras preparadas a partir de la izquierda (lesionada) y hemisferios del cerebro en los animales funciona con sham e isquémicos (B) a la derecha (n = 6, *p< 0.001 en comparación con el hemisferio izquierdo en el grupo sham, p< 0.001 comparado Hemisferio ipsolateral del mismo grupo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Hasta el momento, varios métodos tales como autorradiografía y detección de los trazadores radiactivos24,25, inmunofluorescencia microscopía26,27y EB extravasación técnica20, 23 se han utilizado para evaluar el daño de la barrera blood - brain. Tinte EB es fuertemente capaz de atar a la albúmina de suero y se utiliza como trazador para detectar fuga vascular y cuantificar el BBB avería11,28,29. Como un método altamente aceptado y confiable, la técnica de extravasación EB proporciona una estimación directa sobre la integridad de la BBB que es afectado por diferentes lesiones cerebrales, incluido el accidente cerebrovascular isquémico.
Evaluación in vivo de la BBB permite a los investigadores a estudiar posibles mecanismos fisiopatológicos de la isquemia inducida vasogenic edema del cerebro y a encontrar nuevas intervenciones terapéuticas. Este modelo no requiere de instalaciones especiales y puede producir resultados creíbles con una alta tasa de éxito en experimentos (más del 80%)13,20. Con acceso directo al tejido cerebral, este modelo permite evaluaciones muy precisas de la integridad BBB pero se limita a estudios a largo plazo.
Cambios patológicos en el BBB causada por accidente cerebrovascular isquémico se desarrollan en tres fases: aguda (en horas), subagudos (horas o días) y crónica (días a meses)30,31. Obviamente, las primeras intervenciones terapéuticas producen valiosos efectos protectores en la fase aguda de la patológica. Dosis EB y el momento de la inyección son dos parámetros cruciales para la obtención de resultados fiables debido a la naturaleza dinámica de la BBB después de insultos isquémicos. Por lo tanto, la inyección del tinte EB lentamente a través de una cánula de la vena utilizando la dosis adecuada (1 mg/kg de solución al EB 2% en solución salina) después de empezar el período de reperfusión es un factor importante y permite el estudio de los cambios fisiopatológicos en las primeras etapas del movimiento .
Se han introducido varios métodos experimentales para estudiar el accidente cerebrovascular isquémico. En este modelo experimental, se utilizaron MCAO con el método de filamento intramural que crea condiciones similares a accidente cerebrovascular humana21,32. Esta técnica es simple y confiable; sin embargo, su ejecución debe tener en cuenta algunos puntos técnicos para mejorar el rendimiento de la técnica y garantizar su exactitud. Temperatura del cuerpo se debe mantener dentro de la gama fisiológica durante la cirugía, mientras que la presión arterial y gases de sangre deben ser monitoreados33,34,35. Constante grabación de rCBF con un flujómetro Doppler laser y utilizando un conveniente preparado filamento recubierto de silicona puede no sólo aumentar la tasa de éxito MCAO, sino también reducir la tasa de mortalidad.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores están agradecidos al Vicerrector de investigación de la Ardabil Universidad de ciencias médicas (Ardabil, Irán) para la ayuda financiera (subsidio No: 9607).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Piramal | AWN 34041100 | 20 - 25 °C |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Molekula | 31216368 | 4 years |
| Sprague–Dawley rats | Pasture Institute (Tehran, Iran) | 300-350g | |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | 314-13-6 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | 76-03-9 | 2 years |
| Bupivacaine HCl (0.5%) | Delpharm Tours | below 25 °C | |
| Bupernorphine | Exir (Iran) | ||
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich | 497-19-8 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Di- Sodium hydrogen phosphate | EMD Millipore | 231-448-7 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| silicone(Xantopren) | Heraeus | EN ISO 4823 | |
| Activator universal plus | Heraeus | 66037445 | |
| Micro-Dissecting forceps | Stoelting | 52100-41 | |
| Spring Scisors | Stoelting | 52130-00 | |
| Operating Scissors | Roboz | 52140-70 | |
| Brain matrix | Stoelting | 51390 | |
| Anesthesia Machine for Small Animals | | Kent Scientific | SS-01 | |
| Power Lab system | AD Instruments | ML880 | |
| Laser Doppler flowmeter | AD Instruments | ML191 | |
| Heating feed back system | Harvard Appratus | 72-7560 | |
| Vascular micro clamp | FineScience Tools | 18055-03 | |
| Silk 5-0 suture thread | Ethicon | 682G | |
| Ethilon 4-0 suture thread | Ethicon | EH6740G |
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