Summary
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di fornire una tecnica altamente riproducibile per la valutazione in vivo della perturbazione barriera emato - encefalica nei modelli del ratto del colpo ischemico.
Abstract
Ictus ischemico conduce a edema cerebrale di vasogenic e successive cranico primario, che è mediata attraverso la distruzione della barriera sangue - cervello (BBB). Ratti con il colpo ischemico indotto sono stati stabiliti e usati come modelli in vivo per studiare l'integrità funzionale della BBB. Rilevazione spettrofotometrica di blu di Evans (EB) nei campioni di cervello con lesione ischemica potrebbe fornire giustificazione affidabile per la ricerca e lo sviluppo delle modalità terapeutiche novelle. Questo metodo genera risultati riproducibili ed è applicabile in qualsiasi laboratorio senza necessità di attrezzature speciali. Qui, presentiamo una guida di riferimento tecnico e visualizzato sulla rilevazione di stravaso di EB dopo induzione del colpo ischemico in ratti.
Introduction
L'edema vasogenic cervello dovuto rottura della barriera emato - encefalica (BBB) rimane una complicazione importante dell'ictus ischemico e un elemento determinante del tasso di sopravvivenza in pazienti ictus1,2. L'emato - encefalica (BBB), che è formata da cellule endoteliali dei capillari del cervello (BCECs) e composto da componenti distinti neurovascular (ad es., giunzioni strette tra BCECs, periciti, astroglial e cellule neuronali3), fornisce un specializzata e dinamica interfaccia tra il sistema nervoso centrale (SNC) e la circolazione del sangue periferico4,5. Insulti come lesioni di ischemia-riperfusione potrebbero compromettere l'integrità funzionale della BBB e portare alla successiva penetrazione di leucociti circolanti nel parenchima del cervello che attivano in definitiva l'infiammazione cerebrale e lesioni cerebrali primari 6 , 7. modelli animali sono necessari per l'esatta individuazione della disfunzione di BBB seguendo l'occorrenza di un oggetto stroke. Tali modelli sono di grande importanza per lo studio di base dei meccanismi fisiopatologici e introducendo nuove strategie neuroprotettive. In vitro modelli cellulari basati sulla cultura della BBB sono stati altamente sviluppati e utilizzati per lo studio molecolare del BBB fisiopatologia8,9,10. Tuttavia, in vivo modelli animali, che producono un danno ischemico della BBB simili a condizioni cliniche umane, sono anche molto utili a questo proposito. La determinazione quantitativa dello stravaso di blu di Evans (EB) è una tecnica ben accettata e sensibile che è stata utilizzata per la valutazione dell'integrità BBB e funzione nelle malattie neurodegenerative, tra cui ictus ischemico11, 12 , 13 , 14. questo metodo è conveniente, fattibile, riproducibile e completamente applicabile in qualsiasi laboratorio sperimentale. Sua attuazione non richiede attrezzature avanzate, come traccianti radioattivi15 o risonanza magnetica (MRI)16, che sono prerequisiti per altri metodi. In questo articolo, dimostriamo completamente base processi tecnici di valutazione BBB utilizzando lo stravaso EB nei modelli del ratto del colpo ischemico.
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Protocol
Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con le linee guida di Ardabil University of Medical Sciences Research Council per lo svolgimento di studi sugli animali (numero ordine etico: IR ARUMS. REC.1394.08). In questo studio visualizzato in quel momento, abbiamo usato ratti Sprague-Dawley maschio adulto (300-350 g) ottenuti da pascolo Institute (Teheran, Iran).
1. anestesia e flussometria
- Inducono anestesia utilizzando 4% isoflurane e mantenerla con isoflurano (1-1,5%) in una miscela di protossido di azoto (70% v/v) e ossigeno (30% v/v) per la durata dell'intervento chirurgico.
- Posizionare un animale anestetizzato in postura prona su una coperta di riscaldamento controllo retroazionato e mantenere la temperatura corporea a 37±0.5 ° C per mezzo di una sonda rettale collegata a questa unità di riscaldamento.
- Applicare una piccola quantità di pomata oftalmica su entrambi gli occhi per prevenire la secchezza.
- Radere la regione chirurgica sul lato sinistro del cranio con i tagliatori elettrici. Utilizzare la soluzione di betadine con un tampone di garza per disinfettare la pelle. Risciacquare questa regione con un tampone sterile contenente etanolo al 70% e ripetere i due passaggi per tre cicli17.
- Per analgesia, iniettare 0,2 mL di bupivacaina 0,5% per via sottocutanea nella regione chirurgia17.
- Fare un'incisione di pelle lunga 1 cm sulla sommità del cranio (che si estende dal canthus laterale dell'occhio di sinistra alla base dell'orecchio sinistro) e sezionare il muscolo di temporalis sinistra per esporre il cranio. Quindi, creare una piccola bava foro 5 mm laterale al e 1 mm posteriore al bregma18 per facilità di posizionamento della punta della sonda Doppler flowmeter matita.
- Girare il ratto dall'incline alla posizione supina e poi mettere la sonda di matita laser nel foro cieco del cranio precedentemente forati per monitorare il flusso sanguigno cerebrale regionale (rCBF).
- Registrare rCBF basale di ogni animale e considerare questo come 100%. In particolare, l'occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) viene avviato ogni volta che una diminuzione nel rCBF di più dell'80% è riconosciuto19,20.
2. induzione dell'ischemia focale Cerebra
- Rasatura della regione del collo e disinfettare la cute con betadine soluzione e 70% di etanolo. Iniettare 0,2 mL di bupivacaina 0,5% per via sottocutanea nel sito di chirurgia per l'analgesia17.
- Fare un'incisione lungo chirurgica di 2 cm nella superficie ventrale del collo per accedere l'arteria carotide comune sinistra (LCCA). Isolare il LCCA dalla fascia confinante e il nervo vago per accedere la biforcazione dell'arteria carotica esterna (ECA) e l'arteria carotica interna (AIC).
- Lega i permanentemente LCCA o ECA che impiegano una sutura seta 5 / 0 e sezionare ICA gratis al livello dell'arteria pterygopalatine.
- Posto senza stringere un legame del 5-0 suturare di seta intorno LCCA, e quindi temporaneamente ICA morsetto con un micro-clip vascolare.
- Praticare una piccola incisione sulla LCCA prima la cravatta allentata precedentemente posizionata e quindi inserire una sutura in nylon rivestito di silicone 4-0 nello spazio luminal di ICA e serrare la sutura intorno LCCA per proteggere la sutura in nylon e per impedire la fuoriuscita di sangue.
- Rimuovere la micro-clip vascolare dall'ICA. Quindi, è possibile avanzare un filamento di intraluminal rivestito di silicone fino a osservando un profondo declino nel rCBF che indica l'occlusione dell'origine MCA. Alla fine del periodo ischemico (90 min), avviare riperfusione ritirando la sutura intraluminal21.
3. della vena giugulare ed Evans Blue (EB) iniezione
- Fare un'incisione longitudinale di 1 cm nel collo sul lato sinistro della linea mediana e quindi senza mezzi termini sezionare via fascia superficiale per accedere il ramo esterno della vena giugulare di sinistra (LGV). Quindi, definitivamente legare fine cranica del LGV con sutura seta 5-0. Posto senza bloccare due legami intorno alla vena e quindi bloccare temporaneamente fine cardiaca del LGV con un micro-clamp vascolari.
- Praticare una piccola incisione sulla LGV fra due punti di sutura e quindi inserire catetere eparinizzato siero riempito lo spazio luminal di LGV e avanzare di circa 10 mm. in seguito, stringere le legature intorno alla vena per fissare il catetere e prevenire le emorragie. Iniettare piccole quantità di siero per evitare la compressione della vena.
- All'inizio del periodo di riperfusione, iniettare lentamente tintura EB (1 mL/kg di soluzione EB 2% in soluzione salina) per un periodo di 5 min. Successivamente, lavare la cannula, iniezione di 0,5 mL di salino normale e ritirare la cannula di iniezione da vena12,22.
- Infine, suturare le incisioni del collo e della testa e iniettare la buprenorfina 0,05 mg/kg per via intraperitoneale (IP) e ripetere l'iniezione ogni 6-8 h durante il periodo di riperfusione per l'analgesia post-operatoria17.
- Iniettare 5 mL di saline(IP) pre-riscaldato per fornire idratazione a gabbia recupero17.
- Posto l'animale in una gabbia speciale recupero equipaggiato con controllo di temperatura e aria condizionata e monitorare il recupero dell'animale dall'anestesia.
4. valutazione della permeabilità della barriera sangue del cervello
- Dopo 24 h di riperfusione, profondamente anestetizzare l'animale con sodio thiopental. Quindi, aprire la cavità toracica praticando un piccolo foro sotto lo sterno.
- Fare una piccola apertura nell'atrio di destra e iniettare 250 mL di soluzione fisiologica 0,9% pre-riscaldata (37 ° c) ad una pressione di 110 mmHg attraverso il ventricolo sinistro per 15 min lavare EB lontano la circolazione fino a quando le uscite di saline normale dall'atrio diventa incolore23.
- Immediatamente rimuovere il cervello dal cranio e posizionarlo nella matrice del cervello. Sezionare il bulbo olfattivo e del cervelletto, e quindi utilizzando una lama di rasoio pulita, separare l'emisfero destro del cervello da sinistra (Lesioned) lungo la linea mediana.
- Pesare ogni emisfero omogeneizzarle separatamente in 2,5 mL di soluzione fisiologica tamponata con fosfato e questo mix con 2,5 mL di acido tricloroacetico (60%) per 2 min, utilizzando una macchina di vortice.
- Centrifugare i campioni di cervello a 1.322 x g per 30 minuti e consentire ai campioni di raffreddare in frigorifero 4 ° C per 10 min.
- Utilizzare i surnatanti di stimare l'assorbanza di EB da uno spettrofotometro a 610 nm23.
- Calcolare le concentrazioni di EB contro una curva standard e risultati rapidi come µ g/g del tessuto cerebrale.
5. produzione della curva Standard EB
- Preparare 10 esempi di soluzioni di EB con concentrazioni di 1-10 µ g di EB in 5 mL di tampone fosfato salino.
- Misurare i valori di assorbanza di ciascun campione a 610 nm utilizzando uno spettrofotometro.
- Fare un grafico a dispersione utilizzando un foglio di calcolo e le concentrazioni di EB presenti sull'asse X e i valori di assorbanza sull'asse Y (Figura 1).
- Definire una linea di tendenza lineare della curva con la sua equazione. Quindi, di utilizzarlo per ottenere la concentrazione di EB di campioni.
- Segnalare i risultati finali di stravaso EB come µ g/g del peso del tessuto cerebrale.
6. operazione finta
- Eseguire lo stesso processo chirurgico con i ratti nel gruppo sham-operated (compresi facendo un'incisione nella regione del collo e iniezione di EB) ma escludere il MCAO.
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Representative Results
Non c'era differenza significativa nei livelli EB nell'emisfero destro rispetto all'emisfero sinistro dei ratti falsità-azionati (1,06 ± 0.1 µ g/g e 1,1 ± 0.09 µ g/g, rispettivamente). Come mostrato nelle figure 2A-2B, induzione di ischemia transitoria (90 min di ischemia / riperfusione 24 h) ha causato una differenza significativa nei livelli di EB (10,41 ± 0.84 µ g/g, p < 0,001) nell'emisfero sinistro di ratti ischemici, rispetto al rispettivo emisfero nei ratti falsità-azionati. Collettivamente, questi risultati indicano che in condizioni normali, EB non può facilmente attraversare la BBB nel parenchima cerebrale e insulti ischemici cerebrali inducono lo stravaso di EB attraverso una maggiore permeabilità della BBB (figure 2A e 2B).
Figura 1 : La curva standard è utilizzata per determinare la concentrazione di EB dai valori di assorbanza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Valutazione della perturbazione di BBB da stravaso EB 24 ore dopo il colpo ischemico. La fotografia dei cervelli degli animali falsità-azionati e ischemico (A). L'intensità di stravaso di EB nel tessuto cerebrale (colore blu) nasce dall'entità della perturbazione BBB dell'emisfero leso. Concentrazione di EB in campioni preparati da sinistra (leso) e gli emisferi del cervello negli animali falsità-azionati e ischemici (B) a destra (n = 6, *p< 0,001 rispetto all'emisfero sinistro nel gruppo finto, p< 0,001 rispetto al emisfero ipsilateral del gruppo stesso). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Finora, vari metodi come l'autoradiografia e rilevamento dei traccianti radioattivi24,25, microscopia di immunofluorescenza26,27ed EB stravaso tecnica20, 23 sono stati usati per valutare il danno della barriera emato - encefalica. Tintura EB è fortemente in grado di legarsi all'albumina del siero e viene utilizzata come tracciante per la rilevazione di perdita vascolare e quantificare il BBB ripartizione11,28,29. Come un metodo altamente accettato e affidabile, la tecnica di stravaso EB fornisce una stima diretta all'integrità della barriera emato-encefalica che è affetto da lesioni cerebrali differenti compreso l'ictus ischemico.
Valutazione in vivo della BBB permette ai ricercatori di studiare i meccanismi patofisiologici possibili dell'edema vasogenic cervello ischemia indotta e di trovare nuovi interventi terapeutici. Questo modello non richiede attrezzature speciali e può produrre risultati credibili con un alto tasso di successo in esperimenti (più dell'80%)13,20. Con accesso diretto al tessuto cerebrale, questo modello permette la altamente accurata valutazione dell'integrità BBB ma è limitato a studi a lungo termine.
Le mutazioni patologiche nel BBB causata da ictus ischemico si sviluppano in tre fasi: acuta (entro ore), sub-acute (da ore a giorni) e croniche (da giorni a mesi)30,31. Ovviamente, i primi interventi terapeutici producono effetti protettivi importanti nella fase patologica acuta. Dosaggio EB e il punto del tempo di iniezione sono due parametri fondamentali per ottenere risultati affidabili a causa della natura dinamica della BBB dopo insulti ischemici. Quindi, iniezione della tintura EB lentamente tramite una cannula di vena usando la dose appropriata (1 mg/kg di soluzione EB 2% in soluzione salina) dopo l'inizio del periodo di riperfusione è un fattore importante e consente lo studio delle modificazioni fisiopatologiche nelle fasi iniziali della corsa .
Sono stati introdotti diversi metodi sperimentali per studiare il colpo ischemico. In questo modello sperimentale, abbiamo usato MCAO con il metodo di filamento intraluminal che crea condizioni simili a ictus umano21,32. Questa tecnica è semplice e affidabile; Tuttavia, l'esecuzione deve prendere in considerazione alcuni punti tecnici per migliorare le prestazioni della tecnica e garantire l'accuratezza. Temperatura corporea deve rimanere all'interno della gamma fisiologica durante l'intervento chirurgico, mentre la pressione sanguigna e gas del sangue deve essere monitorato33,34,35. Costante di registrazione di rCBF con un flussometro Doppler laser e utilizzando un preparato adatto siliconato filamento può non solo aumentare il tasso di successo MCAO, ma anche ridurre il tasso di mortalità.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori sono grati al Vice Cancelliere per la ricerca della Ardabil University of Medical Sciences (Ardabil, Iran) per il sostegno finanziario (concedere No: 9607).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Piramal | AWN 34041100 | 20 - 25 °C |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Molekula | 31216368 | 4 years |
| Sprague–Dawley rats | Pasture Institute (Tehran, Iran) | 300-350g | |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | 314-13-6 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | 76-03-9 | 2 years |
| Bupivacaine HCl (0.5%) | Delpharm Tours | below 25 °C | |
| Bupernorphine | Exir (Iran) | ||
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich | 497-19-8 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Di- Sodium hydrogen phosphate | EMD Millipore | 231-448-7 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| silicone(Xantopren) | Heraeus | EN ISO 4823 | |
| Activator universal plus | Heraeus | 66037445 | |
| Micro-Dissecting forceps | Stoelting | 52100-41 | |
| Spring Scisors | Stoelting | 52130-00 | |
| Operating Scissors | Roboz | 52140-70 | |
| Brain matrix | Stoelting | 51390 | |
| Anesthesia Machine for Small Animals | | Kent Scientific | SS-01 | |
| Power Lab system | AD Instruments | ML880 | |
| Laser Doppler flowmeter | AD Instruments | ML191 | |
| Heating feed back system | Harvard Appratus | 72-7560 | |
| Vascular micro clamp | FineScience Tools | 18055-03 | |
| Silk 5-0 suture thread | Ethicon | 682G | |
| Ethilon 4-0 suture thread | Ethicon | EH6740G |
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