Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

مكافئات الأنسجة البشرية التحريضية ثلاثية الأبعاد للثة

doi: 10.3791/57157 Published: April 3, 2018

Summary

وهدف البروتوكول بناء نموذج التهاب لثة بشرية في المختبر. هذا نموذج الأنسجة المزروعة شارك ثلاثة أنواع من الخلايا البشرية والخلايا الكيراتينيه هاكات والليفية اللثة والضامة THP-1، تحت ظروف ثلاثي الأبعاد. يمكن تطبيق هذا النموذج على التحقيق في أمراض اللثة، مثل التهاب اللثة والتهاب اللثة.

Abstract

أمراض اللثة (مثل التهاب اللثة والتهاب اللثة) هي الأسباب الرئيسية لفقدان الأسنان لدى البالغين. التهاب اللثة هو الفيزيولوجيا المرضية الأساسية لأمراض اللثة. تم إنشاء النماذج التجريبية الحالية لأمراض اللثة في أنواع مختلفة من الحيوانات. الفيزيولوجيا المرضية لنماذج حيوانية غير مختلفة عن البشر، مما يجعل من الصعب تحليل الآليات الجزيئية والخلوية، وتقييم الأدوية الجديدة لأمراض اللثة. نقدم هنا، بروتوكول مفصل لتعمير مكافئات الأنسجة البشرية التهاب اللثة (إيجتي) في المختبر. أولاً نبني مكافئات الأنسجة البشرية من لثة (GTE) باستخدام نوعين من الخلايا البشرية، بما في ذلك الخلايا الليفية اللثة البشرية (هجف) وجلد الإنسان البشرة الكيراتينيه (هاكات)، تحت ظروف ثلاثي الأبعاد. نحن خلق نموذج جرح باستخدام تثقيب أنسجة لكمه ثقب في GTE. يتم حقن وحيدات THP-1 المقبل، البشرية مختلطة مع جل الكولاجين في الحفرة في GTE. قبل أديميستراتيون من 10 نانوغرام/مل phorbol 12-ميريستاتي 13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية) ح 72، THP-1 خلايا متباينة في الضامة للنموذج البؤر الملتهبة في GTE (إيجتي) (إيجتي كما يمكن أن يكون ستوميلاتيد مع 2 ميكروغرام/مل من ليبوبوليساكتشاريديس (LPS) عن 48 ساعة لبدء التهاب ). إيجتي هو أول نموذج في المختبر لالتهاب اللثة باستخدام الخلايا البشرية مع بنية ثلاثية الأبعاد. إيجتي يعكس التغييرات المرضية الرئيسية (اكتيفيشن إيمونوسيتيس، والتفاعلات داخل الخلايا بين فيبريوبلاستس والخلايا الظهارية ووحيدات والضامة) في أمراض اللثة. GTE و GTE الجرحى إيجتي يمكن استخدامها كأدوات متعددة لدراسة التئام الجروح وتجديد الأنسجة والتهاب، التفاعل خلية خلية وشاشة الأدوية المحتملة لأمراض اللثة.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

أمراض اللثة هي السبب الرئيسي لفقدان الأسنان لدى البالغين. التهاب اللثة والتهاب اللثة هي أمراض اللثة الأكثر شيوعاً. كل هذا التغييرات الالتهابات الحادة أو المزمنة بيوفيلم بوساطة في اللثة. التهاب اللثة يتميز بالتهاب حاد، بينما التهاب اللثة ويعرض عادة كالتهاب مزمن. على المستوى النسيجي، مكونات بكتيرية تؤدي إلى تنشيط الخلايا المناعية، مثل الضامة والخلايا الليمفاوية وخلايا البلازما وخلايا ماست1،2. هذه الخلايا المناعية، وبخاصة الضامة، تتفاعل مع الخلايا المحلية (بما في ذلك الخلايا الظهارية اللثة والخلايا الليفية، وخلايا بطانية وخلايا الاوستيوبلاستس) أدى إلى آفات التهاب في أنسجة اللثة3،4. تم إنشاء نماذج تجريبية لأمراض اللثة في أنواع مختلفة من الحيوانات مثل الفئران، الهامستر والأرانب، فرت، الأنياب والرئيسات. الفيزيولوجيا المرضية لنماذج حيوانية غير مختلفة عن البشر، مما يجعل من الصعب تحليل الآليات الجزيئية والخلوية، وتقييم الأدوية الجديدة لأمراض اللثة5. وقد استخدمت المشارك زراعة اللثة البكتيريا والخلايا الظهارية الشفوي البشري أحادي الطبقة التحقيق إليه التهابات اللثة6. ومع ذلك، تفتقر ثقافات أحادي الطبقة من الخلايا عن طريق الفم هندسة الأنسجة سليمة؛ الخلوية ثلاثية الأبعاد (3D) ولذلك، أنهم لا يمكن أن تحاكي الحالة في المختبر .

وهنا تنشأ مكافئات 3D الأنسجة البشرية التهاب اللثة (إيجتي) لتمثل أمراض اللثة في المختبر. هذا نموذج ثلاثي الأبعاد من أمراض اللثة تحتل موقعا وسيطة بين الثقافات الخلية أحادي الطبقة ونماذج حيوانية. ثلاثة أنواع من الخلايا البشرية، بما في ذلك الخلايا الكيراتينيه هاكات واللثة الليفية الضامة THP-1، يزرع شارك في جل الكولاجين، وتحفزها المبادرين التحريضية لبناء إيجتي. إيجتي يحاكي عن كثب الأوضاع في فيفو الخلية التمايز والتفاعل خلية خلية التنشيط بلعم في اللثة. هذا النموذج قد العديد من التطبيقات الممكنة للمخدرات فحص واختبار النهج الجديدة الدوائي في أمراض اللثة، وكذلك لتحليل الآليات الخلوية والجزيئية في التئام الجروح والالتهابات، وتجديد الأنسجة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تم تصميم هذا البروتوكول لإنشاء مكافئات أنسجة اللثة البشرية وجرح اللثة نماذج ونماذج التهاب اللثة. وقدمت جلد الإنسان البشرة الكيراتينيه (هاكات) يرجى من البروفيسور نوربرت هاء فوسينيج كريبسفورشونجسزينتروم الألماني (هايدلبرغ، ألمانيا)7. الليفية اللثة البشرية (هجفس) بمعزل عن أنسجة اللثة وفقا للبروتوكولات المنشورة سابقا8. تم الحصول على الموافقة المستنيرة مسبقاً، وتمت الموافقة على الدراسة وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها "لجنة الأخلاقيات"، نيبون الأسنان جامعة مدرسة الحياة طب الأسنان في طوكيو (رقم الترخيص: جامعة سيدة اللويزة-T2012-35). ينبغي القيام بالخطوات 1-3 من البروتوكول في غطاء ثقافة خلية.

1-إعداد معادلات الأنسجة البشرية 3D للثة (GTE) (الشكل 1A)

  1. مزيج الكولاجين النوع-أ جل مع 10% تتركز MEM-ألفا والتعمير 10% المخزن المؤقت (2.2 ز ناكو3 وز 4.47 حبيس في 100 مل 0.05 هيدروكسيد الصوديوم N) في أنبوب عقيم 15 مل من بيبيتينج. يبقى الحل الكولاجين مختلطة على الجليد حتى استخدامها.
  2. مكان إدراج الثقافة 24-جيدا (الحجم 3.0 المسام ميكرومتر) في لوحة 24-جيدا.
  3. إزالة هجفس من على سطح الثقافة باستخدام حل يدتا التربسين 0.25%. تعليق الخلايا في 10 مل متوسط الثقافة (MEM-ألفا + 20% FBS + 1% جلوتاماكس). حساب عدد الخلايا بعداد خلية تورك Bürker.
    1. استخراج الكمية المطلوبة من الخلايا (1-5 x105 خلايا/مل)، ثم الطرد المركزي لمدة 4 دقائق في 190 x ز.
    2. تعليق الخلايا الموجودة في الحل الكولاجين مختلطة. الحفاظ على الجليد الخليط حتى الخطوة التالية.
  4. إضافة 0.5 مل المخلوط الخلية-الكولاجين (0.5-2.5 × 105 خلايا/جيد) في إدراج الثقافة دون إنتاج أي فقاعات. احتضان هذا الخليط لمدة 10-30 دقيقة في جو هوميديفيد بنسبة 5% CO2 في 37 درجة مئوية يتجمد الخليط في جل.
    ملاحظة: إضافة خليط الكولاجين داخل مركز إدراج الثقافة لتجنب تشكيل غير المتكافئ لجل الكولاجين.
  5. أضف 1 مل المتوسطة الثقافة في البئر ومل 0.5 إلى الإدراج. احتضان لوحة الثقافة عن 24 ساعة أو طوال الليل في جو هوميديفيد بنسبة 5% CO2 في 37 درجة مئوية.
  6. إزالة خلايا هاكات من السطح الثقافة باستخدام حل يدتا التربسين 0.25%. تعليق الخلايا في 10 مل متوسطة ب (دميم + 10% FBS + 1% جلوتاماكس) وعدد الخلايا. استخراج الكمية اللازمة من الخلايا (1 – 5 × 105 خلايا/مل) مع ماصة، أجهزة الطرد المركزي لمدة دقيقة 4 في غ. س 190 تعليق الخلايا في المتوسط ب
  7. إزالة المتوسطة من إدراج الثقافة، التي تحتوي على خليط هجف-الكولاجين، بالطموح. إضافة 0.5 مل تعليق خلية هاكات (0.5-2.5 × 105 خلايا/جيد) على رأس هذا الخليط هجف-الكولاجين. احتضان ثقافات ح 24 أو بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: عند هذه النقطة الزمنية، المتوسطة في الثقافة كذلك ينبغي أن يكون بالمتوسط، بينما ينبغي أن تكون المتوسطة في إدراج الثقافة ب المتوسطة
  8. استبدال المتوسطة الثقافة بقصر المتوسطة (المتوسطة ثقافة المشارك) (MEM-ألفا + 15% "خروج المغلوب المصل البديل" + 1% جلوتاماكس) + 5% FBS. إضافة 1 مل المتوسط الثقافة إلى الثقافة جيدا و 0.5 مل في إدراج الثقافة. احتضانها الثقافات من أجل ح 24-48.
  9. استبدال المتوسطة الثقافة بقصر متوسطة + 1% FBS. أضف 1 مل في الثقافة جيدا و 0.5 مل في إدراج الثقافة. احتضان ثقافات ح 24 أو بين عشية وضحاها.
  10. استبدال المتوسطة الثقافة في الثقافة جيدا مع 0.7 – 1 مل قصر المتوسطة. إزالة الوسط تماما من إدراج الثقافة (على سطح الثقافة ينبغي أن تتعرض للهواء). احتضان الثقافات 1 – 2 أسابيع. تغيير وسيلة في ثقافة جيدا مرتين في الأسبوع.
    ملاحظة: لا تدع ارتفاع المستوى المتوسط فوق سطح الثقافة (الطبقة العليا المؤلفة من الخلايا الكيراتينيه). تبقى دائماً على سطح الثقافة الجافة.

2-إعداد الجرحى GTE (الشكل 1B)

  1. إعداد تثقيب أنسجة قطرها 1 – 3 مم. تعقيم أنه مع اﻷوتوكﻻف في 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  2. دفع التثقيب الأنسجة عمودياً إلى GTE عن عميق 300 ميكرون، ولكمه ثقب في الأنسجة لمحاكاة جرح.
  3. في هذه الخطوة، استخدم GTE الجرحى للتحقيق في تجديد الجرح الشفاء والأنسجة. وبدلاً من ذلك، إصلاح GTE استخدام 10% فورمالين محلول عازلة محايدة لإجراء التحليل النسيجي.

3-إعداد التحريضية GTE (إيجتي) (الشكل 1B)

  1. زراعة الخلايا THP-1 وفقا للتقرير السابق9.
  2. مزيج الكولاجين النوع-أ جل مع 10% تتركز 1640 RPMI، المخزن المؤقت لإعادة الإعمار 10% (2.2 ز ناكو3 وز 4.47 حبيس في 100 مل 0.05 هيدروكسيد الصوديوم N) و 10 نانوغرام/مل سلطة النقد الفلسطينية. يبقى الحل الكولاجين مختلطة على الجليد حتى الاستخدام.
  3. العدد 1 – 2 × 106 THP-1 الخلايا وأجهزة الطرد المركزي لمدة دقيقة 4 في غ. س 190 تعليق الخلايا الموجودة في 1 مل الحل الكولاجين مختلطة. الحفاظ على الجليد الخليط حتى الخطوة التالية.
  4. إضافة 10 – 30 ميليلتر THP-1-الكولاجين المخلوط إلى منطقة الجرحى GTE. استبدال ثقافة المتوسط إلى 0.7 – 1 مل قصر المتوسطة التي تحتوي على 10 نانوغرام/مل من سلطة النقد الفلسطينية.
  5. احتضان هذا الخليط في جو هوميديفيد بنسبة 5% CO2 في 37 درجة مئوية ح 72.
  6. استخدم هذا النموذج للتحري عن التهاب اللثة أو أمراض اللثة (على سبيل المثال، إضافة الأدوية المضادة للالتهابات المحتملة إلى إيجتي لمعرفة آثارها على سيتوكين الإصدار10). بدلاً من ذلك، تجاهل ح 72 سلطة النقد الفلسطينية-العلاج وإضافة 2 ميكروغرام/مل من لبس في الثقافة، واحتضان الأنسجة في جو هوميديفيد بنسبة 5% CO2 في 37 درجة مئوية ح 4811،12.

4-التثبيت وكله إيمونوستينينج جبل GTE وإيجتي الثقافات

  1. تثبيت الثقافات.
    1. إزالة المتوسطة الثقافة من لوحة 24-جيدا. تغسل الأنسجة 2 مرات مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
    2. أضف 1 مل من محلول عازلة محايدة الفورمالين 10% للإدراج ومل 1 للثقافة جيدا. اترك لوحة 24-جيدا في ثلاجة عند درجة 4 مئوية بين عشية وضحاها.
    3. إزالة الحل عازلة محايدة الفورمالين 10% في اليوم التالي.
    4. لكل جبل إيمونوستينينج، غسل الأنسجة 3-4 مرات مع برنامج تلفزيوني بعد التثبيت.
    5. الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) تلطيخ و immunostaining العادية، المضي قدما في الجفاف وتضمين البارافين وتمزيقها.
      ملاحظة: لكل جبل إيمونوستينينج، يمكن حذف هذه الخطوة.
  2. كله جبل إيمونوستينينج
    ملاحظة: تم تعديل هذا البروتوكول من واحد في مرجع 13.
    1. تغسل الأنسجة 3 x في برنامج تلفزيوني 0.5 – 1% تريتون، 10 – 30 دقيقة في كل مرة.
    2. احتضان الأنسجة مرتين لمدة 30 دقيقة في المخزن المؤقت لحظر (برنامج تلفزيوني 1% تريتون + 10% جيش صرب البوسنة)، في درجة حرارة الغرفة.
    3. أغسل × الأنسجة 2 في المخزن المؤقت لحظر، 5 – 10 دقيقة كل مرة.
    4. إضافة 50 ميليلتر من حل جسم الأولية إلى تدرج في تمييع/التركيز المطلوب. تستخدم فيلم تتشبث بلاستيكية رقيقة للالتفاف إدراج لتجنب جفاف الأنسجة.
    5. احتضان الأنسجة لمدة 1 إلى 2 في 4 درجات مئوية.
    6. غسل الأنسجة 3 مرات، لمدة 30 دقيقة في برنامج تلفزيوني 1% تريتون + 10% من جيش صرب البوسنة. أغسل مرة أخرى 3 مرات، لمدة 5 دقائق في برنامج تلفزيوني 1% تريتون.
    7. إضافة 50 ميليلتر من جسم الثانوية في المخزن المؤقت لحظر (برنامج تلفزيوني 1% تريتون + 10% جيش صرب البوسنة) و 5 ميليلتر من حل هويشت 33342 (خلية يعيش نوكبلوي وصمة عار) لكل إدراج. تستخدم فيلم تتشبث بلاستيكية رقيقة للالتفاف إدراج لتجنب جفاف الأنسجة.
    8. احتضان لمدة 1 إلى 2 في 4 درجات مئوية. التفاف لوحة 24-جيدا في منشفة ورقية رطب ومن ثم وضعه في علبة بلاستيكية لاستخدامها في جميع أنحاء الحضانة.
    9. غسل الأنسجة 3 مرات، لمدة 10 دقائق في برنامج تلفزيوني 1% تريتون
    10. استخدام إبرة حادة لقطع الغشاء لإدراج ثقافة الحصول على الأنسجة. مكان الغشاء إلى شريحة.
      ملاحظة: ينبغي أن تكون الأنسجة على الغشاء.
    11. إضافة 2-3 قطرات من الأسفار جبل المتوسطة. تغطية الأنسجة بتغطية الزجاج ومخزن في 4 درجات مئوية في الظلام حتى التحليل.
    12. عرض الأنسجة بليزر [كنفوكل] الفحص المجهري (LSM).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

عرض هاكات الخلايا keratinocyte نموذجي مورفولوجيا تحت الملاحظة المجهرية المرحلة عالي التباين (الشكل 2A). الماسح الضوئي الإلكترون المجهرية (SEM) الصور أظهرت أن أسطح الخلية هاكات مشمولة بالعديد من زغيبات. كانت وساطة الاتصالات بين الخلايا بين الخلايا هاكات من عمليات غشاء (الشكل 2). وأعرب هاكات خلايا ظهارة اللثة علامة K8/1814، تشير إلى أن الخلايا هاكات تصلح لتعمير اللثة (الشكل 2).

ويبين الشكل 3 ألف مثالاً ناجحاً ل GTE، ويظهر الشكل 3B مثال فاشلة من GTE. بسبب محاكمة غير ناجحة (الشكل 3B) المخلوط جل الكولاجين لا يتم إضافة في وسط إدراج الثقافة. الشكل 3 أظهرت أن نموذج GTE جرح يمكن أن تقدمها إلى اللكم ثقب في الأنسجة مع تثقيب أنسجة. ح & ه تلطيخ (3D الشكل) والصور ووزارة شؤون المرأة (رقم 3E) أظهر أن 19 يوما زراعة، وحوالي 10 – 20 طبقات هاكات خلايا ظهارة النموذج، والكولاجين جزءا لا يتجزأ من جل هجف الخلايا نموذج الصفيحة بروبريا. في بروبريا الصفيحة من GTE أعيد بناؤها، خلايا هجف معارضها المميزة مورفولوجيا الخلايا الليفية (3F الشكل)، وكانت محاطة بالمعالم صفائف من ألياف الكولاجين (الشكل 3). تلوين الفلورة أظهرت أن فيمنتين والشركة المصرية للاتصالات-7 (كل منهما هي علامات تنتجها الخلايا الليفية الجلد15) يتم التعبير عنها في بروبريا الصفيحة من GTE (الشكل 4A و 4B). K19، علامة محددة ظهارة هالة وجيب في16من التهاب اللثة، ضعيفة في الظهارة GTE (الشكل 4)، وهو المعرب عنها بقوة في الظهارة إيجتي (الشكل 4). وتشير البيانات إلى أن الخلايا هاكات يمكن التفريق في الخلايا الظهارية رئيسيا في التهاب اللثة، خاصة بعد التهاب حفز بروبريا الصفيحة.

أمراض اللثة الملتهبة، مثل التهاب اللثة والتهاب اللثة، الأشيع وتتميز بوجود الخلايا الليمفاوية والضامة، ويؤدي إلى التليف والأنسجة نخر17،18. في هذا البروتوكول، استخدمت THP-1 الخلايا كخلايا التهاب إيجتي. كما هو موضح في الشكل 5، دون سلطة النقد الفلسطينية-التحفيز، وعرض الخلايا THP-1 مورفولوجيا مونوسيتيك ومعظمهم من طرحها في الأجل المتوسط (الشكل 5A). على النقيض من ذلك، بعد التعرض لسلطة النقد الفلسطينية 10 نانوغرام/مليلتر بالنسبة ح 72، أكثر من 50% خلايا THP-1 متباينة داخل الخلايا مثل بلعم والتقيد بها على سطح الثقافة (الشكل 5 (ب)). مشابهة ل الخلايا هاكات وهجف8، THP-1 الخلايا نمت جيدا داخل جل الكولاجين في الأجلين المتوسط وثقافة المشارك (قصر المتوسطة)، ومتباينة في بلعم-مثل الخلايا بعد PMA-العلاج (الشكل 5). إيمونوستينينج أظهرت أن الخلايا THP-1 الالتزام بها وأعرب عن CD68 (علامة الضامة19) (الشكل 5) و CD14 (علامة أخرى من الضامة) (الشكل 6). تشكيل إيجتي، وحيدات THP-1 كانت جزءا لا يتجزأ من جل الكولاجين وحقن في حفرة محاكاة جرح (الشكل 5E). في 72 ساعة بعد سلطة النقد الفلسطينية (10 نانوغرام/مل)--تحفيز، خلايا THP-1 متباينة في الضامة (الشكل 5F) داخل الحفرة محاكاة جرح، وأعربت عن CD68 (الشكل 5)، مشيراً إلى أنهم قادرون على شكل البؤر الملتهبة في GTE الجرحى.

كله جبل إيمونوهيستوتشيميستري (الشكل 6) أظهرت أن خلايا THP-1 في حفرة محاكاة جرحا ليس فقط أعربت عن CD14 (علامة أخرى من الضامة)، لكنها أعربت أيضا عن فيمنتين فضلا عن الليفية في حافة الحفرة. فيمنتين أعرب عن نشاط الضامة20. أكدت البيانات أن الضامة THP-1 الوظيفية.

Figure 1
رقم 1: تصاميم تجريبية. الإعداد التجريبية من الأنسجة البشرية 3D مكافئات من لثة (GTE) (A) والتهابات GTE (إيجتي) (ب). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: توصيف هاكات الكيراتينيه. (أ) المرحلة-تباين الصورة المجهرية هاكات الخلايا في الثقافة. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (ب) وزارة شؤون المرأة صورة هاكات الخلايا. (ج) المناعي تلطيخ الخلايا هاكات للخلايا الظهارية اللثة علامة K8/18. الأخضر، K8/18. الأزرق، DAPI. شريط المقياس = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: توصيف معادلات الأنسجة البشرية 3D من لثة (GTE)- (أ) مثال GTE نجاح في الثقافة. الأنسجة في وسط إدراج الثقافة. (ب) مثال GTE الفاشلة: جزء من GTE فصلها عن الأنسجة ومنحرف إلى الجدار (السهم الأحمر). (ج) جرح GTE: السهم الأصفر يشير إلى ثقب اللكم بالتثقيب الأنسجة. (د) ح & ه تلطيخ من GTE المزروعة لمدة 19 يوما (أيام 14 الجوي التعرض). شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (ه) وزارة شؤون المرأة صورة لمقطع عمودي من GTE المزروعة لمدة 19 يوما. (و) المرحلة-تباين الصورة المجهرية من هجف الخلايا في جل الكولاجين التي شكلت بروبريا الصفيحة من GTE. شريط المقياس = 25 ميكرومتر. (ز) وزارة شؤون المرأة صورة من ألياف الكولاجين ضخمة حول الخلايا هجف في بروبريا الصفيحة من GTE. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: التعبير عن فيمنتين، الشركة المصرية للاتصالات-7 و K19 في GTE- تلوين الفلورة ل GTE للصفيحة بروبريا علامات فيمنتين (أ و ب) والشركة المصرية للاتصالات-7 (ب) في GTE، وعلامة البشرة K19 في GTE (ج) و (د) إيجتي. الأحمر وفيمنتين و K19. الأخضر، الشركة المصرية للاتصالات-7. الأزرق، DAPI. ﻫ، البشرة؛ ليرة لبنانية، بروبريا الصفيحة. شريط المقياس = 50 ميكرومتر (ألف، جيم و دال)، 20 ميكرومتر (ب). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: تحديد خصائص الخلايا THP-1- (أ) "غير متمايزة" THP-1 الخلايا في الثقافة. شريط المقياس = 15 متباينة THP-1 الضامة ميكرومتر. (ب). شريط المقياس = 15 ميكرومتر. (ج) خلايا THP-1 كانت جزءا لا يتجزأ من جل الكولاجين في قصر المتوسطة وتعامل مع سلطة النقد الفلسطينية ل h. 24 مقياس بار = 50 ميكرومتر. (د) المناعي تلطيخ من الضامة THP-1 بلعم علامة CD68. الأحمر، CD68. الأزرق، DAPI. شريط المقياس = 5 ميكرومتر. () THP-1-الكولاجين خليط في حفرة الجرحى من HGE في بداية العلاج سلطة النقد الفلسطينية. شريط المقياس = 25 ميكرومتر. (و) THP-1 خلايا متباينة في الضامة (الأسهم الحمراء) في 72 ساعة بعد العلاج سلطة النقد الفلسطينية. شريط المقياس = 25 ميكرومتر. (ز) THP-1 الخلايا بلعم أعرب علامة CD68. خط متقطع الأصفر يشير إلى منطقة ثقب الجرحى في بار ح & مقياس هاء = 100 ميكرومتر. الأحمر، CD68. الأزرق، هويشت 33342. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
رقم 6: توصيف إيجتي. وأجرى كله جبل immunohistochemistry CD14 (الأخضر) وفيمنتين (أحمر) في إيجتي. سلسلة Z-الصور (ج) التي تم التقاطها عن طريق إيجتي (416 ميكرومتر في المجموع. الفريق الأول هو القسم الأول LSM الممسوحة ضوئياً، والفريق 25 الأخيرة. الفاصل الزمني هو مكم 16.64 حوالي بين الأقسام). قدم ممثل قسم (A) (رقم 17 من الصور سلسلة Z)، المتعامد وصورة ثلاثية الأبعاد من Z-المكدس (ب) توزيع 3D الضامة THP المصابات CD14 فيمنتين-1 في حفرة محاكاة جرحا في إيجتي. تتم الإشارة إلى موضع المسح LSM في إيجتي في (د) والزاوية العليا اليسرى في (A). شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الأصفر تشير الخطوط المنقطة إلى منطقة ثقب الجرحى في إيجتي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ويستند هذا البروتوكول أساليب إنشاء معادلات أنسجة اللثة ومكافئات الأنسجة الدهنية تحت الجلد الموصوفة بالتقارير السابقة8،،من2122. على الرغم من أن هذا أسلوب بسيط وسهل، بعض الخطوات تتطلب اهتماما خاصا. على سبيل المثال، ينبغي أن يوضع الخليط الكولاجين على الجليد حتى استخدامها لتجنب تكوين هلام في الحل. عند إضافة خليط الكولاجين في إدراج الثقافة، تأكد من تم حقن الحل في وسط الإدراج لتجنب تشكيل هلام متحيزة (كما هو الحال في الشكل 3). أيضا اللكم حفرة في GTE يأخذ المهارة. التثقيب الأنسجة في بعض الأحيان لا تلتقط الأنسجة إذا كانت الأنسجة رطبة جداً. نظام خزعة نسيج أو زوج من الملقط سيكون مفيداً؛ ومع ذلك، سيتم تغيير أبعاد الموقع الجرحى كثير. من الممكن أيضا استخدام حقنه بإبرة حادة لحقن الخليط خلية الكولاجين THP-1 دون ثقب اللكم (تأكد من الجل لا تسد الإبرة).

الحد من هذا الأسلوب أنه غير قادر على تمثل الظواهر البيولوجية المعقدة من التهاب اللثة والتهاب اللثة، تماما لأن إيجتي يفتقر إلى الأوعية الدموية، والخلايا العصبية، والخلايا المناعية الأخرى، وليس سببه الالتهاب التفاعلات بيوفيلم المضيف. ومع ذلك، أنها فقط في المختبر التهاب اللثة الأنسجة نموذج أدلى به الخلايا البشرية جزئيا يقدم علم الأمراض التهاب اللثة. يمكن تعديل النموذج لتكون أكثر مشابهة لالتهاب اللثة الحقيقية وأمراض اللثة بواسطة 1) شارك زراعة GTE مع بيوفيلم لخلق تفاعلات بيوفيلم المضيف أو تنشيط الاستجابات الالتهابية في إيجتي باستخدام لبس (المركبات في الغشاء الخارجي ل بكتيريا سلبية الغرام وبادئ تحريضية قوية كما اقترحنا في البروتوكول)، 2) بذر الحل هجف الكولاجين في الأسنان المستخرج على شكل مجمعات لثة الأسنان ومراقبة كيف يؤثر التهاب في اللثة الأنسجة الصلبة، و 3) باستخدام الخلايا الظهارية اللثة البشرية لتشكيل البشرة GTE وإيجتي.

مع الأساليب المعروضة هنا، الثقافات GTE وإيجتي يمكن استخدامها كأدوات متعددة لدراسة التئام الجروح وتجديد الأنسجة، والتهاب والتفاعل خلية خلية، وعلى الشاشة الأدوية المحتملة لالتهاب اللثة وأمراض اللثة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح.

Acknowledgments

هذا العمل وأيد جزئيا "مجتمع اليابان" لمعونات النهوض بالعلوم (JSPS) "البحوث العلمية" (ك 26861689 و 17 11813). المؤلف يود أن يشكر السيد ناثانيل غرين لتصحيح التجارب المطبعية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagen type I-A Nitta Gelatin Inc For making dermis of GTE
MEM-alpha Thermo Fisher Scientific 11900073 Cell culture medium
Cell Culture Insert (for 24-well plate), pore size 3.0 μm Corning, Inc. 353096 For tissue culture
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061 Cell culture reagent
DMEM Thermo Fisher Scientific 31600034 Cell culture medium
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828028 Cell culture reagent
Tissue puncher Shibata system service co., LTD SP-703 For punching holes in GTE
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific 31800022 Cell culture medium
BSA Sigma-Aldrich A3294 For immunostaining
Hoechst 33342 (NucBlue Live Cell stain) Thermo Fisher Scientific R37605 For labeling nuclei
Fluorescence mount medium Dako For mounting samples after immunostaining
Anti-Cytokeratin 8+18 antibody [5D3] abcam ab17139 For identifying epithelium
Scaning electron microscope Hitachi, Ltd. HITACHI S-4000 For observing samples' surface topography and composition
Confocal laser scanning microscopy LSM 700; Carl Zeiss Microscopy Co., Ltd. LSM 700 For observing samples' immunofluorescence staining
Anti-Cytokeratin 19 antibody abcam ab52625 For identifying epithelium
Anti-vimentin antibody abcam ab92547 For identifying fibroblasts and activated macrophages
Anti-TE-7 antibody Millipore CBL271 For identifying fibroblasts in the dermis
Anti-CD68 antibody Sigma-Aldrich SAB2700244 For identifying macrophages
Human CD14 Antibody R&D Systems MAB3832-SP For identifying macrophages
Alexa Fluor 594-conjugated secondary goat anti-rabbit antibody Thermo Fisher Scientific A11012 For immunofluorescence staining
Alexa Fluor 488-conjugated secondary goat anti-mouse antibody Thermo Fisher Scientific A11001 For immunofluorescence staining
EVOS FL Cell Imaging System Thermo Fisher Scientific For observing the sample's immunofluorescence staining
THP-1 cells Riken BRC cell bank RCB1189 For making iGTE
PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate) Sigma-Aldrich P8139 For differentiatting THP-1 cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cekici, A., Kantarci, A., Hasturk, H., Van Dyke, T. E. Inflammatory and immune pathways in the pathogenesis of periodontal disease. Periodontology 2000. 64, (1), 57-80 (2014).
  2. Hasturk, H., Kantarci, A., Van Dyke, T. E. Oral Inflammatory Diseases and Systemic Inflammation: Role of the Macrophage. Frontiers in Immunology. 3, 118 (2012).
  3. Koh, T. J., DiPietro, L. A. Inflammation and wound healing: The role of the macrophage. Expert reviews in molecular medicine. 13, e23 (2011).
  4. Mescher, A. L. Macrophages and fibroblasts during inflammation and tissue repair in models of organ regeneration. Regeneration. 4, (2), 39-53 (2017).
  5. Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental Animal Models in Periodontology: A Review. The Open Dentistry Journal. 4, 37-47 (2010).
  6. Han, Y. W., et al. Interactions between Periodontal Bacteria and Human Oral Epithelial Cells: Fusobacterium nucleatum Adheres to and Invades Epithelial Cells. Infection and Immunity. 68, (6), 3140-3146 (2000).
  7. Boukamp, P., Petrussevska, R. T., Breitkreutz, D., Hornung, J., Markham, A., Fusenig, N. E. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J Cell Biol. 106, (3), 761-771 (1988).
  8. Xiao, L., Miwa, N. Hydrogen-rich water achieves cytoprotection from oxidative stress injury in human gingival fibroblasts in culture or 3D-tissue equivalents, and wound-healing promotion, together with ROS-scavenging and relief from glutathione diminishment. Hum Cell. 30, (2), 72-87 (2017).
  9. Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26, (2), 171-176 (1980).
  10. Ara, T., Kurata, K., Hirai, K., Uchihashi, T., Uematsu, T., Imamura, Y., Furusawa, K., Kurihara, S., Wang, P. L. Human gingival fibroblasts are critical in sustaining inflammation in periodontal disease. J Periodontal Res. 44, (1), 21-27 (2009).
  11. Park, E. K., Jung, H. S., Yang, H. I., Yoo, M. C., Kim, C., Kim, K. S. Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli. Inflamm Res. 56, (1), 45-50 (2007).
  12. Sharif, O., Bolshakov, V. N., Raines, S., Newham, P., Perkins, N. D. Transcriptional profiling of the LPS induced NF-kappaB response in macrophages. BMC Immunol. 8, 1 (2007).
  13. Abcam. Whole mount fluorescent immunohistochemistry. Available from: http://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/whole_mount_fluorescent_ihc.pdf (2017).
  14. Shetty, S., Gokul, S. Keratinization and its disorders. Oman Med J. 27, (5), 348-357 (2012).
  15. Klinge, B., Matsson, L., Attström, R. Histopathology of initial gingivitis in humans. A pilot study. J Clin Periodontol. 10, (4), 364-369 (1983).
  16. Nagarakanti, S., Ramya, S., Babu, P., Arun, K. V., Sudarsan, S. Differential expression of E-cadherin and cytokeratin 19 and net proliferative rate of gingival keratinocytes in oral epithelium in periodontal health and disease. J Periodontol. 78, (11), 2197-2202 (2007).
  17. Goodpaster, T., Legesse-Miller, A., Hameed, M. R., Aisner, S. C., Randolph-Habecker, J., Coller, H. A. An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. J Histochem Cytochem. 56, (4), 347-358 (2008).
  18. Langeland, K., Rodrigues, H., Dowden, W. Periodontal disease, bacteria, and pulpal histopathology. Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 37, (2), 257-270 (1974).
  19. Holness, C. L., Simmons, D. L. Molecular cloning of CD68, a human macrophage marker related to lysosomal glycoproteins. Blood. 81, (6), 1607-1613 (1993).
  20. Mor-Vaknin, N., Punturieri, A., Sitwala, K., Markovitz, D. M. Vimentin is secreted by activated macrophages. Nat Cell Biol. 5, (1), 59-63 (2003).
  21. Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. The effect of squalane-dissolved on adipogenesis-accompanied oxidative stress and macrophage in a preadipocyte-monocyte co-culture system. Biomaterials. 31, (23), 5976-5985 (2010).
  22. Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. Highly hydroxylated fullerene localizes at the cytoskeleton and inhibits oxidative stress in adipocytes and a subcutaneous adipose-tissue equivalent. Free Radic Biol Med. 51, (7), 1376-1389 (2011).
مكافئات الأنسجة البشرية التحريضية ثلاثية الأبعاد للثة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xiao, L., Okamura, H., Kumazawa, Y. Three-dimensional Inflammatory Human Tissue Equivalents of Gingiva. J. Vis. Exp. (134), e57157, doi:10.3791/57157 (2018).More

Xiao, L., Okamura, H., Kumazawa, Y. Three-dimensional Inflammatory Human Tissue Equivalents of Gingiva. J. Vis. Exp. (134), e57157, doi:10.3791/57157 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter