Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Tre-dimensionelle inflammatoriske humant væv ækvivalenter af Gingiva

doi: 10.3791/57157 Published: April 3, 2018

Summary

Målet med protokollen er at opbygge en inflammatorisk menneskelige gingiva model in vitro. Dette væv model dyrker Co tre typer af humane celler, HaCaT keratinocytter, gingival fibroblaster og THP-1 makrofager, tre-dimensionelle betingelser. Denne model kan anvendes til at undersøge parodontale sygdomme, såsom gingivitis og parodontitis.

Abstract

Parodontale sygdomme (såsom gingivitis og parodontitis) er de førende årsager til tandtab hos voksne. Betændelse i gingiva er den grundlæggende Patofysiologi af parodontale sygdomme. Nuværende eksperimentelle modeller af parodontale sygdomme har været etableret i forskellige typer af dyr. Patofysiologi af dyremodeller er dog forskellige fra mennesker, hvilket gør det vanskeligt at analysere cellulære og molekylære mekanismer og vurdere nye lægemidler til parodontale sygdomme. Vi præsenterer her, en detaljeret protokol til rekonstruere menneskelige inflammatorisk væv ækvivalenter af gingiva (iGTE) i vitro. Vi bygger først humant væv ækvivalenter af gingiva (GTE) ved at bruge to typer af humane celler, herunder menneskelige gingival fibroblaster (HGF) og menneskelige hud epidermale keratinocytter (HaCaT), tre-dimensionelle betingelser. Vi skaber en såret model ved hjælp af en væv puncher til punch et hul i GTE. Næste, menneskelige THP-1 monocytter blandet med kollagen gel er sprøjtet ind i hullet i GTE. Ved adimistration af 10 ng/mL phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA) for 72 h, THP-1 celler differentieret til makrofager at form inflammatoriske foci i GTE (iGTE) (IGTE også kan være stumilated med 2 µg/mL af lipopolysaccharides (LPS) for 48 h at indlede betændelse ). IGTE er den første i vitro model af inflammatoriske gingiva ved hjælp af menneskelige celler med en tre-dimensionel arkitektur. IGTE afspejler store patologiske forandringer (immunocytes aktiviteter, intracellulære interaktioner blandt fibryoblasts, epitelceller, monocytter og makrofager) i parodontale sygdomme. GTE, sårede GTE og iGTE kan bruges som alsidige værktøjer til at studere sårheling, vævsregeneration, betændelse, celle-celle interaktion og skærmen potentielle lægemidler til parodontale sygdomme.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Parodontale sygdomme er den hyppigste årsag til tandtab hos voksne. Tandkødsbetændelse og paradentose er de mest almindelige parodontale sygdomme. Begge præsentere biofilm-medieret akut eller kronisk inflammatoriske forandringer i gingiva. Tandkødsbetændelse er karakteriseret ved akut betændelse, hvorimod parodontitis normalt præsenterer som kronisk betændelse. På niveauet histologiske udløser bakteriel komponenter aktivering af immunceller, såsom makrofager, lymfocytter, plasma celler og mastceller1,2. Disse immunceller, især makrofager, interagere med lokale celler (herunder gingival epitel celler, fibroblaster, endotelceller og osteoblaster) resulterer i inflammatoriske læsioner i parodontale væv3,4. Eksperimentelle modeller af parodontale sygdomme har været etableret i forskellige typer af dyr, som rotter, hamstere, kaniner, fritter, hjørnetænder og primater. Patofysiologi af dyremodeller er dog forskellige fra mennesker, hvilket gør det vanskeligt at analysere cellulære og molekylære mekanismer og vurdere nye lægemidler parodontale sygdomme5. Co dyrkning af paradentose bakterier og éncellelag menneskelige mundtlige epitelceller er blevet brugt til at efterforske mekanismen af parodontale infektioner6. Ikke desto mindre mangler éncellelag kulturer af mundtlige celler den tredimensionale (3D) cellulære arkitektur af intakt væv; Derfor kan de efterligner in vitro- situation.

Her, er 3D inflammatoriske humant væv ækvivalenter af gingiva (iGTE) etableret til at repræsentere parodontale sygdomme i vitro. Denne 3D model af parodontale sygdomme indtager en mellemposition mellem éncellelag cellekulturer og dyremodeller. Tre typer af humane celler, herunder HaCaT keratinocytter, gingival fibroblaster og THP-1 makrofager, er co dyrket på kollagen gel og stimuleret af inflammatoriske initiatorer til at bygge iGTE. IGTE simulerer nøje i vivo -betingelserne for Celledifferentiering, celle-celle interaktion og makrofag aktivering i gingiva. Denne model har mange mulige anvendelser for stof screening og afprøvning af nye farmakologiske tilgange i parodontale sygdomme og analysere cellulære og molekylære mekanismer i sårheling, inflammation og væv revitalisering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne protokol er designet til at skabe menneskelige gingival væv ækvivalenter, gingival sår modeller og tandkødsbetændelse modeller. Menneskelige hud epidermale keratinocytter (HaCaT) blev venligt leveret fra Professor Norbert E. Fusenig af Deutsches Krebsforschungszentrum (Heidelberg, Tyskland)7. Menneskelige gingival fibroblaster (HGFs) blev isoleret fra gingival væv ifølge tidligere publicerede protokoller8. Informeret samtykke blev opnået på forhånd, og undersøgelsen blev godkendt i henhold til retningslinjerne, af Udvalget for etik, Nippon Dental Universitet liv Tandlægeskolen på Tokyo (godkendelsesnummer: Rikke-T2012-35). Protokollen trin 1-3 bør udføres i en celle kultur hætte.

1. forberedelse af 3D menneskelige væv ækvivalenter af Gingiva (GTE) (figur 1A)

  1. Mix kollagen type-en gel med 10% koncentreret MEM-alpha og 10% genopbygning buffer (2,2 g NaHCO3 og 4.47 g HEPES i 100 mL 0,05 N NaOH) i en 15 mL sterilt tube af pipettering. Holde blandet kollagen løsning på is indtil anvendes.
  2. Placere 24-godt kultur skær (pore størrelse 3,0 µm) i en 24-godt plade.
  3. Fjerne HGFs fra kultur overfladen ved hjælp af 0,25% trypsin-EDTA-oploesning. Suspendere celler i 10 mL af substratet A (MEM-alpha + 20% FBS + 1% GlutaMAX). Tælle cellerne af en Bürker-Türk celle tæller.
    1. Uddrag den ønskede mængde af celler (1-5 x105 celler/mL), derefter centrifugeres i 4 min ved 190 x g.
    2. Suspendere celler i blandet kollagen løsning. Holde blandingen på køl indtil det næste skridt.
  4. Tilføje 0,5 mL af celle-kollagen-blanding (0,5-2,5 x 105 celler/brønd) i kultur-Indsæt uden producerer alle bobler. Inkuber blanding for 10-30 min i en fugtig atmosfære med 5% CO2 ved 37 ° C til at koagulere blandingen ind i en gel.
    Bemærk: Tilføje kollagen blandingen ind i midten af kultur insert for at undgå ulige dannelsen af kollagen gel.
  5. Tilsættes 1 mL af næringssubstratet i godt og 0,5 mL i indsatsen. Inkuber kultur plade i 24 timer eller natten over i en fugtig atmosfære med 5% CO2 ved 37 ° C.
  6. Fjerne HaCaT celler fra kultur overfladen ved hjælp af 0,25% trypsin-EDTA-oploesning. Suspendere celler i 10 mL af medium B (DMEM + 10% FBS + 1% GlutaMAX) og tælle cellerne. Uddrag det nødvendige antal celler (1-5 x 105 celler/mL) med en pipette, centrifugeres i 4 min ved 190 x g. suspendere celler i medium B.
  7. Fjern mediet fra kultur skær, som indeholder HGF-kollagen blanding, ved aspiration. Tilføje 0,5 mL af HaCaT cellesuspension (0,5-2,5 x 105 celler/brønd) på toppen af HGF-kollagen blanding. Inkuber kulturer i 24 timer eller natten over.
    Bemærk: På dette tidspunkt, medium i kultur godt bør være medium A, mens medium i kultur-Indsæt bør være medium B.
  8. Erstatte næringssubstratet med KSR medium (co næringssubstratet) (MEM-alpha + 15% KnockOut Serum udskiftning + 1% GlutaMAX) + 5% FBS. Der tilsættes 1 mL af næringssubstratet i kultur godt og 0,5 mL i kultur-Indsæt. Inkuber kulturer i 24-48 timer.
  9. Erstatte næringssubstratet med KSR medium + 1% FBS. Tilsæt 1 mL i kultur godt og 0,5 mL i kultur-Indsæt. Inkuber kulturer i 24 timer eller natten over.
  10. Erstatte næringssubstratet i kultur godt med 0,7-1 mL KSR medium. Fjern mediet helt fra den kultur Indsæt (kultur overflade skal udsættes for luft). Inkuber kulturer i 1-2 uger. Ændre medium i kultur godt to gange om ugen.
    Bemærk: Lad ikke den medium niveau stigning over kultur overflade (det øverste lag bestående af keratinocytter). Altid holde kultur overfladen tørre.

2. forberedelse af sårede GTE (figur 1B)

  1. Forberede en 1 – 3 mm diameter væv puncher. Sterilisere den med en autoklavering ved 121 ° C i 20 min.
  2. Skub væv puncher vinkelret ind GTE om 300 µm dyb, og punch et hul i væv til at simulere et sår.
  3. På dette trin, skal du bruge den sårede GTE for at undersøge sår healing og væv revitalisering. Alternativt kan du lave GTE bruger 10% formalin neutral bufferopløsning til at udføre histologiske analyse.

3. forberedelse af inflammatoriske GTE (iGTE) (figur 1B)

  1. Dyrke THP-1 celler i henhold til den tidligere rapport9.
  2. Mix kollagen type-en gel med 10% koncentreret RPMI 1640, 10% genopbygning buffer (2,2 g NaHCO3 og 4.47 g HEPES i 100 mL 0,05 N NaOH) og 10 ng/mL PMA. Holde blandet kollagen løsning på køl indtil brug.
  3. Tæller 1 – 2 x 106 THP-1 celler og centrifugeres i 4 min ved 190 x g. suspendere celler i 1 mL af opløsningen, blandet kollagen. Holde blandingen på køl indtil det næste skridt.
  4. Tilsæt 10 – 30 µL THP-1-kollagen blandingen ind i såret området af GTE. Erstatte næringssubstrat til 0,7-1 mL KSR medium indeholdende 10 ng/mL PMA.
  5. Inkuber blandingen i en fugtig atmosfære med 5% CO2 ved 37 ° C i 72 timer.
  6. Brug modellen til at undersøge tandkødsbetændelse eller paradentose (f.eks tilføje potentielle anti-inflammatoriske medicin til iGTE at se dens virkninger på cytokin version10). Alternativt, udelader 72 h PMA-behandling, tilsættes 2 µg/mL af LP'ER i kultur, og der inkuberes væv i en fugtig atmosfære med 5% CO2 ved 37 ° C for 48 h11,12.

4. fiksering og hele montere immunfarvning af GTE og iGTE kulturer

  1. Fiksering af kulturer.
    1. Fjerne næringssubstratet fra 24-godt plade. Vask væv 2 gange med fosfatbufferet saltopløsning (PBS).
    2. Der tilsættes 1 mL 10% formalin neutral bufferopløsning at indsætte og 1 mL til kultur godt. Lad den 24-godt plade i køleskab ved 4 ° C natten over.
    3. Fjerne 10% formalin neutral bufferopløsning den følgende dag.
    4. For hele mount immunfarvning, vaske væv 3 - 4 gange med PBS efter fiksering.
    5. Hæmatoxylin og eosin (H & E) farvning og regelmæssig immunfarvning, fortsætte med dehydrering, paraffin indlejring og skæring.
      Bemærk: For hele mount immunfarvning, dette trin kan udelades.
  2. Hele mount immunfarvning
    Bemærk: Denne protokol blev ændret fra ene i reference 13.
    1. Vaske væv 3 x i PBS 0,5-1% Triton, 10-30 min hver gang.
    2. Inkuber væv to gange i 30 min. i blokerende buffer (PBS 1% Triton + 10% BSA), ved stuetemperatur.
    3. Vask væv 2 × i blokerende buffer, 5 – 10 min. hver gang.
    4. Tilføje 50 µL af primære antistof løsning på den krævede fortynding/koncentration til indsætter. Brug en tynd plastik plastfolie til wrap skær for at undgå udtørring af væv.
    5. Inkuber vævet i 1 til 2 dage ved 4 ° C.
    6. Vask væv 3 gange, for 30 min i PBS 1% Triton + 10% BSA. Vask igen 3 gange i 5 min i PBS 1% Triton.
    7. Tilsæt 50 µL af sekundær antistof i blokerende buffer (PBS 1% Triton + 10% BSA) og 5 µL af Hoechst 33342 løsning (NucBlue Live celle pletten) til hver Indsæt. Brug en tynd plastik plastfolie til wrap skær for at undgå udtørring af væv.
    8. Inkuber i 1 til 2 dage ved 4 ° C. Wrap 24-godt plade i en våd køkkenrulle, og derefter sætte det ind i en plastik pack skal anvendes i hele inkubation.
    9. Vask væv 3 gange i 10 min i PBS 1% triton
    10. Brug en skarp nål til at skære membranen af kultur insert for at få vævet. Sted membran på et dias.
      Bemærk: Vævet skal være på membranen.
    11. Tilsæt 2-3 dråber af fluorescens mount medium. Dække væv med et cover glas og opbevares ved 4 ° C i mørke indtil analyse.
    12. Se væv med en Konfokal laser scanning mikroskopi (LSM).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

HaCaT celler vises typisk keratinocytter morfologi under fasekontrast mikroskopiske observation (figur 2A). Scanner elektron mikroskopisk (SEM) billeder viste, at HaCaT celle overflader var dækket af mange microvilli. Intercellulære forbindelser mellem HaCaT celler blev formidlet af membran processer (figur 2B). HaCaT celler udtrykt gingival epitel markør K8/1814, hvilket indikerer at HaCaT celler er egnet til gingiva genopbygning (figur 2 c).

Figur 3A viser et vellykket eksempel på GTE, og figur 3B viser en mislykket eksempel på GTE. Den mislykkede retssag (figur 3B) er forårsaget af kollagen gel blandingen ikke bliver tilføjet i midten af kultur-Indsæt. Figur 3 c viste, at en såret model af GTE kan foretages af stansning et hul i væv med en væv puncher. H & E farvning (figur 3D) og SEM billeder (figur 3E) vist, at på 19 dage af dyrkningen, omkring 10 – 20 lag af HaCaT celler form epitel og kollagen gel-embedded HGF celler form lamina propria. I lamina propria af den rekonstruerede GTE, HGF celler udstillet karakteristiske morfologi af fibroblaster (figur 3F), og var omgivet af veldefinerede arrays af kollagen fibre (figur 3 g). Immunfluorescens farvning viste, vimentin og TE-7 (begge af dem er dermal fibroblast markører15) er udtrykt i lamina propria af GTE (figur 4A og 4B). K19, en specifik markør til junctional og lomme epitel i parodontitis16, er svagt udtrykt i epitel af GTE (figur 4 c), og er stærkt udtrykt i epitel af iGTE (figur 4D). Dataene, der foreslog, at HaCaT celler kan differentiere sig til centrale epitelceller i parodontitis, især efter inflammatoriske stimulation af lamina propria.

Inflammatorisk gingival sygdomme, som tandkødsbetændelse og parodontose, er histologisk karakteriseret ved tilstedeværelsen af lymfocytter og makrofager, og resultere i fibrose og vævet nekrose17,18. I denne protokol, blev THP-1 celler brugt som de inflammatoriske celler for iGTE. Som vist i figur 5, uden PMA-stimulation, præsenteret THP-1 celler en monocytic morfologi og de fleste af dem flød i medium (figur 5A). Derimod efter at være udsat for PMA 10 ng/mL for 72 h, mere end 50% af THP-1 celler opdeles i makrofag-lignende celler og overholdes på kultur overflade (figur 5B). Svarende til HaCaT og HGF celler8, THP-1 celler voksede godt inde i kollagen gel i co næringssubstratet (KSR medium), og differentieret til makrofag-lignende celler efter PMA-behandling (figur 5 c). Immunfarvning viste at de overholdt THP-1 celler udtrykt CD68 (en markør af makrofager19) (fig. 5 d) og CD14 (en anden markør af makrofager) (figur 6). For at danne iGTE, var THP-1 monocytter indlejret i kollagen gele og injiceres i hullet simulerer et sår (figur 5E). På 72 h efter PMA (10 ng/mL)-stimulation, THP-1 celler differentieret til makrofager (figur 5F) inde i hullet simulerer et sår og udtrykt CD68 (figur 5 g), der angiver de er i stand til form inflammatoriske foci i den sårede GTE.

Hele mount Immunhistokemi (figur 6) viste at THP-1 celler i hullet simulerer et sår ikke kun udtrykt CD14 (en anden markør af makrofager), men også udtrykt vimentin samt fibroblaster i kanten af hullet. Vimentin udtrykkes af aktive makrofager20. Dataene bekræftede, at THP-1 makrofager er funktionelle.

Figure 1
Figur 1: eksperimenterende design. Eksperimentel opsætning af 3D menneskelige væv ækvivalenter af gingiva (GTE) (A) og inflammatoriske GTE (iGTE) (B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: karakterisering af HaCaT keratinocytter. (A) fase-kontrast mikroskopisk billede af HaCaT celler i kultur. Skalalinjen = 50 µm. (B) SEM billede af HaCaT celler. (C) immunhistokemisk farvning af HaCaT celler til gingival epitelcelle markør K8/18. Grøn, K8/18. Blå, DAPI. Skalalinjen = 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: karakterisering af 3D menneskelige væv ækvivalenter af gingiva (GTE). (A) eksempel på en vellykket GTE i kultur. Vævet er i midten af kultur-Indsæt. (B) eksempel på en mislykket GTE: en del af GTE er adskilt fra væv og forudindtaget mod væggen (rød pil). (C) sårede GTE: gul pil angiver et hul udstansede af væv puncher. (D) H & E farvning af GTE passes i 19 dage (14 dage luft eksponering). Skalalinjen = 50 µm. (E) SEM billede af en lodret sektion af GTE passes i 19 dage. (F) fasekontrast mikroskopisk billede af HGF celler i kollagen gele, som dannede lamina propria af GTE. Skalalinjen = 25 µm. (G) SEM billede af massive kollagen fibre omkring HGF celler i lamina propria af GTE. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: udtryk for vimentin, TE-7 og K19 i GTE. Immunfluorescens farvning af GTE for lamina propria markører vimentin (A og B) og TE-7 (B) i GTE og epidermis markør K19 i GTE (C) og iGTE (D). Rød, vimentin og K19. Grøn TE-7. Blå, DAPI. E, epidermis; LP, lamina propria. Skalalinjen = 50 µm (A, C og D), 20 µm (B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: karakterisering af THP-1 celler. (A) udifferentierede THP-1 celler i kultur. Skalalinjen = 15 µm. (B) differentierede THP-1 makrofager. Skalalinjen = 15 µm. (C) THP-1 celler blev integreret i kollagen gele i KSR medium og behandlet med PMA for 24 h. skala bar = 50 µm. (D) immunhistokemisk farvning af THP-1 makrofager for makrofag markør CD68. Red, CD68. Blå, DAPI. Skalalinjen = 5 µm. (E) THP-1-kollagen blandingen i den sårede hul i HGE i begyndelsen af PMA behandling. Skalalinjen = 25 µm. (F) THP-1 celler differentieret til makrofager (røde pile) på 72 h efter PMA behandling. Skalalinjen = 25 µm. (G) THP-1 celler udtrykt makrofag markør CD68. Gul stiplede linje angiver området af den sårede hul i H & E. skala bar = 100 µm. rød, CD68. Blå, hoechst 33342. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: karakterisering af iGTE. Hele mount Immunhistokemi CD14 (grøn) og vimentin (rød) blev udført på iGTE. Z-serie billeder (C) fanget gennem iGTE (416 µm i alt. Panel 1 er den første sektion LSM scannet, og panelet 25 er sidst. Intervallet er omkring 16.64 µm mellem sektioner). Repræsentative afsnit (A) (nr. 17 af Z-serie billeder), orthophoto og 3D-billede af Z-stak (B) præsenterede 3D fordelingen af CD14 - og vimentin-positive THP-1 makrofager i hullet simulerer et sår i iGTE. LSM scanning stilling i iGTE er angivet i (D) og den venstre øverste hjørne i (A). Skalalinjen = 50 µm. gul stiplede linjer angiver området af den sårede hul i iGTE. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne protokol er baseret på metoder til at skabe gingival væv ækvivalenter og subkutane fedtvæv ækvivalenter beskrevet af tidligere rapporter8,21,22. Selv om dette er en enkel og nem metode, kræver nogle trin særlig opmærksomhed. For eksempel, bør kollagen blandingen holdes på is indtil brugen for at undgå gel dannelse i løsningen. Når du tilføjer kollagen blandingen ind i kultur-Indsæt, sikre løsningen blev injiceret i midten af Indsæt at undgå danner en forudindtaget gel (som i figur 3B). Stansning et hul i GTE også tager dygtighed. Væv puncher ikke kan undertiden afhente vævet hvis væv er for vådt. En væv biopsi system eller et par pincet ville være nyttigt; dog vil dimensionerne af den sårede placering ændres meget. Det er også muligt at bruge en sprøjte med skarp nål til at injicere THP-1 celler-kollagen blanding uden stansning et hul (Kontroller gelen ikke tilstoppe nålen).

Begrænsning af denne metode er, at det ikke kan perfekt repræsenterer de komplekse biologiske fænomener af gingivitis og parodontitis, fordi iGTE mangler blodkar, neuronale celler og andre immunceller, og betændelse er ikke forårsaget af den Host-biofilm interaktioner. Men det er den eneste in vitro- tandkødsbetændelse væv model lavet af humane celler, dels præsenterer patologi af inflammatoriske gingiva. Modellen kan ændres til at være mere ligner ægte tandkødsbetændelse og paradentose ved 1) Co dyrke GTE med biofilm oprette vært-biofilm interaktioner eller stimulere inflammatoriske respons i iGTE ved hjælp af LP'ER (forbindelser i den ydre membran af Gram-negative bakterier og en stærk inflammatoriske initiativtager som vi foreslog i protokollen), 2) såning kollagen-HGF løsning på udtrukne tænder til form gingiva-tand komplekser og observere, hvordan betændelse i gingiva indflydelse på hårde væv, og 3) ved hjælp af menneskelige gingival epitelceller at danne epidermis af GTE og iGTE.

Med de metoder, der præsenteres her, kan GTE og iGTE kulturer bruges som alsidige værktøjer til at studere sårheling, vævsregeneration, betændelse, celle-celle interaktion, og skærmen potentielle lægemidler for tandkødsbetændelse og paradentose.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer nogen interessekonflikt.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet i del af Japan-samfund til fremme af videnskab (JSP'ER) licensbetaling for videnskabelig forskning (26861689 og 17 K 11813). Forfatterne vil gerne takke Mr. Nathaniel Green for korrekturlæsning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagen type I-A Nitta Gelatin Inc For making dermis of GTE
MEM-alpha Thermo Fisher Scientific 11900073 Cell culture medium
Cell Culture Insert (for 24-well plate), pore size 3.0 μm Corning, Inc. 353096 For tissue culture
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061 Cell culture reagent
DMEM Thermo Fisher Scientific 31600034 Cell culture medium
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828028 Cell culture reagent
Tissue puncher Shibata system service co., LTD SP-703 For punching holes in GTE
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific 31800022 Cell culture medium
BSA Sigma-Aldrich A3294 For immunostaining
Hoechst 33342 (NucBlue Live Cell stain) Thermo Fisher Scientific R37605 For labeling nuclei
Fluorescence mount medium Dako For mounting samples after immunostaining
Anti-Cytokeratin 8+18 antibody [5D3] abcam ab17139 For identifying epithelium
Scaning electron microscope Hitachi, Ltd. HITACHI S-4000 For observing samples' surface topography and composition
Confocal laser scanning microscopy LSM 700; Carl Zeiss Microscopy Co., Ltd. LSM 700 For observing samples' immunofluorescence staining
Anti-Cytokeratin 19 antibody abcam ab52625 For identifying epithelium
Anti-vimentin antibody abcam ab92547 For identifying fibroblasts and activated macrophages
Anti-TE-7 antibody Millipore CBL271 For identifying fibroblasts in the dermis
Anti-CD68 antibody Sigma-Aldrich SAB2700244 For identifying macrophages
Human CD14 Antibody R&D Systems MAB3832-SP For identifying macrophages
Alexa Fluor 594-conjugated secondary goat anti-rabbit antibody Thermo Fisher Scientific A11012 For immunofluorescence staining
Alexa Fluor 488-conjugated secondary goat anti-mouse antibody Thermo Fisher Scientific A11001 For immunofluorescence staining
EVOS FL Cell Imaging System Thermo Fisher Scientific For observing the sample's immunofluorescence staining
THP-1 cells Riken BRC cell bank RCB1189 For making iGTE
PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate) Sigma-Aldrich P8139 For differentiatting THP-1 cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cekici, A., Kantarci, A., Hasturk, H., Van Dyke, T. E. Inflammatory and immune pathways in the pathogenesis of periodontal disease. Periodontology 2000. 64, (1), 57-80 (2014).
  2. Hasturk, H., Kantarci, A., Van Dyke, T. E. Oral Inflammatory Diseases and Systemic Inflammation: Role of the Macrophage. Frontiers in Immunology. 3, 118 (2012).
  3. Koh, T. J., DiPietro, L. A. Inflammation and wound healing: The role of the macrophage. Expert reviews in molecular medicine. 13, e23 (2011).
  4. Mescher, A. L. Macrophages and fibroblasts during inflammation and tissue repair in models of organ regeneration. Regeneration. 4, (2), 39-53 (2017).
  5. Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental Animal Models in Periodontology: A Review. The Open Dentistry Journal. 4, 37-47 (2010).
  6. Han, Y. W., et al. Interactions between Periodontal Bacteria and Human Oral Epithelial Cells: Fusobacterium nucleatum Adheres to and Invades Epithelial Cells. Infection and Immunity. 68, (6), 3140-3146 (2000).
  7. Boukamp, P., Petrussevska, R. T., Breitkreutz, D., Hornung, J., Markham, A., Fusenig, N. E. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J Cell Biol. 106, (3), 761-771 (1988).
  8. Xiao, L., Miwa, N. Hydrogen-rich water achieves cytoprotection from oxidative stress injury in human gingival fibroblasts in culture or 3D-tissue equivalents, and wound-healing promotion, together with ROS-scavenging and relief from glutathione diminishment. Hum Cell. 30, (2), 72-87 (2017).
  9. Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26, (2), 171-176 (1980).
  10. Ara, T., Kurata, K., Hirai, K., Uchihashi, T., Uematsu, T., Imamura, Y., Furusawa, K., Kurihara, S., Wang, P. L. Human gingival fibroblasts are critical in sustaining inflammation in periodontal disease. J Periodontal Res. 44, (1), 21-27 (2009).
  11. Park, E. K., Jung, H. S., Yang, H. I., Yoo, M. C., Kim, C., Kim, K. S. Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli. Inflamm Res. 56, (1), 45-50 (2007).
  12. Sharif, O., Bolshakov, V. N., Raines, S., Newham, P., Perkins, N. D. Transcriptional profiling of the LPS induced NF-kappaB response in macrophages. BMC Immunol. 8, 1 (2007).
  13. Abcam. Whole mount fluorescent immunohistochemistry. Available from: http://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/whole_mount_fluorescent_ihc.pdf (2017).
  14. Shetty, S., Gokul, S. Keratinization and its disorders. Oman Med J. 27, (5), 348-357 (2012).
  15. Klinge, B., Matsson, L., Attström, R. Histopathology of initial gingivitis in humans. A pilot study. J Clin Periodontol. 10, (4), 364-369 (1983).
  16. Nagarakanti, S., Ramya, S., Babu, P., Arun, K. V., Sudarsan, S. Differential expression of E-cadherin and cytokeratin 19 and net proliferative rate of gingival keratinocytes in oral epithelium in periodontal health and disease. J Periodontol. 78, (11), 2197-2202 (2007).
  17. Goodpaster, T., Legesse-Miller, A., Hameed, M. R., Aisner, S. C., Randolph-Habecker, J., Coller, H. A. An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. J Histochem Cytochem. 56, (4), 347-358 (2008).
  18. Langeland, K., Rodrigues, H., Dowden, W. Periodontal disease, bacteria, and pulpal histopathology. Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 37, (2), 257-270 (1974).
  19. Holness, C. L., Simmons, D. L. Molecular cloning of CD68, a human macrophage marker related to lysosomal glycoproteins. Blood. 81, (6), 1607-1613 (1993).
  20. Mor-Vaknin, N., Punturieri, A., Sitwala, K., Markovitz, D. M. Vimentin is secreted by activated macrophages. Nat Cell Biol. 5, (1), 59-63 (2003).
  21. Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. The effect of squalane-dissolved on adipogenesis-accompanied oxidative stress and macrophage in a preadipocyte-monocyte co-culture system. Biomaterials. 31, (23), 5976-5985 (2010).
  22. Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. Highly hydroxylated fullerene localizes at the cytoskeleton and inhibits oxidative stress in adipocytes and a subcutaneous adipose-tissue equivalent. Free Radic Biol Med. 51, (7), 1376-1389 (2011).
Tre-dimensionelle inflammatoriske humant væv ækvivalenter af Gingiva
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xiao, L., Okamura, H., Kumazawa, Y. Three-dimensional Inflammatory Human Tissue Equivalents of Gingiva. J. Vis. Exp. (134), e57157, doi:10.3791/57157 (2018).More

Xiao, L., Okamura, H., Kumazawa, Y. Three-dimensional Inflammatory Human Tissue Equivalents of Gingiva. J. Vis. Exp. (134), e57157, doi:10.3791/57157 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter