Summary
Het doel van het protocol is het bouwen van een inflammatoire menselijke tandvlees model in vitro. Dit weefsel model cultiveert samen drie soorten menselijke cellen, HaCaT keratinocyten, gingival fibroblasten en THP-1 macrofagen, driedimensionale omstandigheden. Dit model kan worden toegepast op het onderzoek naar parodontale ziekten, zoals gingivitis en Parodontitis.
Abstract
Parodontale ziekten (zoals gingivitis en parodontitis) zijn de belangrijkste oorzaken van tandverlies bij volwassenen. Ontsteking in tandvlees is de fundamentele fysiopathologie van parodontale ziekten. Huidige experimentele modellen van parodontale ziekten zijn vastgesteld in verschillende soorten dieren. Echter verschilt de fysiopathologie van diermodellen van die van de mens, waardoor het moeilijk is om te analyseren van cellulaire en moleculaire mechanismen en evalueren van nieuwe geneesmiddelen voor parodontale ziekten. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de wederopbouw van menselijk weefsel van de inflammatoire equivalenten van tandvlees (iGTE) in vitro. Wij bouwen eerst menselijk weefsel equivalenten van tandvlees (GTE) door gebruik te maken van twee soorten menselijke cellen, met inbegrip van menselijke gingival fibroblasten (HGF) en menselijke huid epidermale keratinocyten (HaCaT), drie-dimensionale omstandigheden. We maken een wond-model met behulp van een weefsel perforatie om punch een gat in de GTE. Volgende, menselijke THP-1 monocyten gemengd met collageen gel worden ingespoten in het gat in de GTE. Door adimistration van 10 ng/mL phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) voor 72 uur, THP-1 cellen onderscheiden in macrofagen naar formulier inflammatoire foci in GTE (iGTE) (IGTE kunnen ook stumilated met 2 µg/mL lipopolysacchariden (LPS) voor 48 h tot ontsteking ). IGTE is de eerste in vitro model van inflammatoire tandvlees met behulp van menselijke cellen met een driedimensionale architectuur. IGTE weerspiegelt belangrijke pathologische veranderingen (immunocytes werkzaamheden, intracellulaire interacties tussen fibryoblasts, epitheliaale cellen, monocyten en macrofagen) in parodontale ziekten. GTE, gewonde GTE en iGTE kunnen worden gebruikt als veelzijdige tools om te studeren wondgenezing, weefselregeneratie, ontsteking, cel-cel interactie en scherm potentiële geneesmiddelen voor parodontale ziekten.
Introduction
Parodontale ziekten zijn de belangrijkste oorzaak van tandverlies bij volwassenen. Gingivitis en Parodontitis zijn de meest voorkomende parodontale ziekten. Beide aanwezig biofilm-gemedieerde acute of chronische ontstekingsreactie in het tandvlees. Gingivitis wordt gekenmerkt door een acute ontsteking, overwegende dat parodontitis meestal als chronische ontsteking presenteert. Op het niveau van de histologische activeren bacteriële onderdelen de activering van immune cellen, zoals macrofagen, lymfocyten en plasmacellen mestcellen1,2. Deze immune cellen, met name in macrofagen, interactie met lokale cellen (inclusief gingival epitheliale cellen, fibroblasten, endotheliale cellen en botcellen) wat resulteert in de inflammatoire letsels in parodontale weefsel3,4. Experimentele modellen van parodontale ziekten zijn vastgesteld in verschillende soorten dieren, zoals ratten, hamsters, konijnen, fretten, hoektanden en primaten. Echter verschilt de fysiopathologie van diermodellen van die van de mens, waardoor het moeilijk is om te analyseren van cellulaire en moleculaire mechanismen en evalueren van nieuwe geneesmiddelen voor parodontale ziekten5. Co teelt van Parodontale bacteriën en enkelgelaagde menselijke mondelinge epitheliale cellen is gebruikt om het mechanisme van parodontale infecties6onderzoeken. Niettemin ontbreken enkelgelaagde culturen van mondelinge cellen de driedimensionale (3D) cellulaire architectuur van intact weefsel; Daarom, zij kunnen niet na te bootsen de situatie in vitro .
3D inflammatoire menselijk weefsel equivalenten van tandvlees (iGTE) zijn hier gevestigd parodontale ziekten in vitrote vertegenwoordigen. Deze 3D-model van parodontale ziekten is gevestigd in een tussenpositie tussen enkelgelaagde cel-culturen en dierlijke modellen. Drie soorten menselijke cellen, met inbegrip van HaCaT keratinocyten, gingival fibroblasten en THP-1 macrofagen, zijn samen op collageen gel worden gekweekt, en gestimuleerd door inflammatoire initiatiefnemers te bouwen iGTE. IGTE simuleert nauw de in vivo voorwaarden van celdifferentiatie, interactie van cel-cel en macrofaag activering in het tandvlees. Dit model heeft vele mogelijke toepassingen voor drug screening en testen van nieuwe farmacologische benaderingen in parodontale ziekten, alsmede voor het analyseren van cellulaire en moleculaire mechanismen in de wondgenezing, ontsteking en weefselregeneratie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol is ontworpen om menselijke gingival weefsel equivalenten, modellen gingival wond en gingivitis modellen maken. Menselijke huid epidermale keratinocyten (HaCaT) werden vriendelijk geleverd door Professor Norbert E. Fusenig van Deutsches Krebsforschungszentrum (Heidelberg, Duitsland)7. Menselijke gingival fibroblasten (HGFs) werden geïsoleerd uit gingival weefsels volgens de eerder gepubliceerde protocollen8. Geïnformeerde toestemming vooraf was verkregen, en de studie goedgekeurd volgens de richtsnoeren van de Commissie voor ethiek, de Nippon tandheelkundige University School leven tandheelkunde in Tokyo (Authorization Number: NDU-T2012-35). Protocol stappen 1-3 moeten worden uitgevoerd in een cel cultuur kap.
1. bereiding van 3D menselijk weefsel equivalenten van tandvlees (GTE) (figuur 1A)
- Mix collageen type-A gel met 10% geconcentreerde MEM-alpha en 10% wederopbouw buffer (2.2 g van NaHCO3 en 4,47 g HEPES in 100 mL 0,05 N NaOH) in een buis 15 mL steriele door pipetteren. Bewaar deze oplossing gemengde collageen op ijs totdat gebruikt.
- 24-well cultuur inserts (porie grootte 3.0 µm) in een 24-well plaat plaatsen.
-
Verwijder HGFs uit het oppervlak van de cultuur met behulp van 0,25% trypsine-EDTA-oplossing. Opschorten van de cellen in 10 mL gestolde voedingsbodem A (MEM-alpha + 20% FBS + 1% GlutaMAX). Cellen tellen door een Bürker-Türk cel teller.
- Uitpakken van de gewenste hoeveelheid cellen (1-5 x105 cellen/mL), en vervolgens gedurende 4 min op 190 x g centrifugeren.
- Opschorten van de cellen in de gemengde collageen-oplossing. Houd het mengsel op het ijs tot de volgende stap.
- 0,5 mL van het mengsel van de cel-collageen (0.5-2.5 x 105 cellen/well) in de cultuur invoegen toevoegen zonder produceren bubbels. Incubeer het mengsel gedurende 10-30 min. in een bevochtigde sfeer met 5% CO2 bij 37 ° C te coaguleren van het mengsel in een gel.
Opmerking: Voeg het collageen-mengsel in het midden van de cultuur invoegen om ongelijke vorming van collageen gel. - Voeg 1 mL gestolde voedingsbodem in de put en in de insert 0,5 mL. Incubeer de cultuur plaat voor 24u of overnachting in een bevochtigde sfeer met 5% CO2 bij 37 ° C.
- HaCaT cellen verwijderen uit het oppervlak van de cultuur met behulp van 0,25% trypsine-EDTA-oplossing. Opschorten van de cellen in 10 mL van medium B (DMEM + 10% FBS + 1% GlutaMAX) en de cellen tellen. Extract het benodigde aantal cellen (1-5 x 105 cellen/mL) met een precisiepipet centrifuge voor 4 min op 190 x g. schorten de cellen in middelgrote B.
- Verwijder het medium van de cultuur inserts, waarin het mengsel HGF-collageen door aspiratie. Voeg 0,5 mL celsuspensie HaCaT (0.5-2.5 x 105 cellen/well) op de bovenkant van het mengsel HGF-collageen. Incubeer de culturen voor 24 h of 's nachts.
Opmerking: Op dit punt van tijd, het medium in de cultuur Nou moet middellange A, terwijl het medium in de cultuur invoegen middellange B. moet - Vervang het kweekmedium met KSR medium (co kweekmedium) (MEM-alpha + 15% KnockOut Serum vervanging + 1% GlutaMAX) + 5% FBS. Voeg 1 mL gestolde voedingsbodem in de cultuur goed en in de cultuur-insert 0,5 mL. Incubeer de culturen voor 24-48 h.
- Het kweekmedium vervangen door KSR medium + 1% FBS. Voeg 1 mL in de cultuur goed en 0,5 mL in de cultuur invoegen. Incubeer de culturen voor 24 h of 's nachts.
- Vervang het kweekmedium in de cultuur goed met 0,7-1 mL KSR medium. Verwijder het medium volledig uit het invoegen van de cultuur (het oppervlak cultuur mag worden blootgesteld aan lucht). Incubeer de culturen voor 1-2 weken. Het wijzigen van het medium in de cultuur goed twee keer per week.
Opmerking: Laat niet de middellange niveau boven het oppervlak van de cultuur (de bovenste laag opgebouwd van keratinocyten). Altijd de cultuur oppervlak droog te houden.
2. voorbereiding van de gewonde GTE (figuur 1B)
- Een 1-3 mm diameter weefsel perforatie voor te bereiden. Steriliseren het met een autoclaaf bij 121 ° C gedurende 20 minuten.
- Duw de weefsel perforatie loodrecht in GTE over 300 µm diepe en punch een gat in het weefsel te simuleren van een wond.
- Bij deze stap gebruikt u de gewonde GTE voor het onderzoeken van de wond genezing en weefsels regeneratie. U kunt ook vast GTE 10% formaline neutrale Bufferoplossing met histologische analyses uit te voeren.
3. voorbereiding van de inflammatoire GTE (iGTE) (figuur 1B)
- Cultiveren THP-1 cellen volgens de vorige verslag-9.
- Mix collageen type-A gel met 10% geconcentreerd RPMI 1640, 10% wederopbouw buffer (2.2 g van NaHCO3 en 4,47 g HEPES in 100 mL 0,05 N NaOH) en 10 ng/mL PMA. Bewaar deze gemengde collageen oplossing op ijs tot gebruik.
- Tellen 1-2 x 106 THP-1 cellen en centrifuge voor 4 min op 190 x g. schorten de cellen in 1 mL van de oplossing van de gemengde collageen. Houd het mengsel op het ijs tot de volgende stap.
- Voeg 10-30 µL THP-1-collageen mengsel in de gewonde gebied van GTE. Vervang het kweekmedium aan 0.7-1 mL KSR opslagmedium met 10 ng/mL PMA.
- Incubeer het mengsel in een bevochtigde sfeer met 5% CO2 bij 37 ° C gedurende 72 uur.
- Gebruik van het model voor het onderzoeken van tandvleesontsteking of parodontitis (bijvoorbeeld het toevoegen van potentiële anti-inflammatoire geneeskunde aan iGTE om te zien de gevolgen ervan voor de cytokine versie10). U kunt ook weglaten 72 h PMA-behandeling, voeg 2 µg/mL LPS in de cultuur, en Incubeer het weefsel in een bevochtigde sfeer met 5% CO2 bij 37 ° C gedurende 48 h11,12.
4. fixatie en hele Mount immunokleuring van GTE en iGTE culturen
-
Fixatie van de culturen.
- Verwijder het kweekmedium uit de plaat 24-well. Wassen van de weefsels 2 keer met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Voeg 1 mL van de neutrale bufferoplossing 10% formaline de invoegen en 1 mL ook aan de cultuur. Laat de plaat 24-well in een koelkast bij 4 ° C's nachts.
- De volgende dag 10% formaline neutrale bufferoplossing te verwijderen.
- Voor hele mount immunokleuring, de weefsels 3 - 4 keer met PBS na fixatie te wassen.
- Voor de haematoxyline en eosine (H & E) kleuring en regelmatige immunokleuring, gaat u verder met uitdroging, paraffine insluiten en segmenteren.
Opmerking: Voor de hele berg immunokleuring, deze stap kan worden weggelaten.
-
Hele mount immunokleuring
Opmerking: Dit protocol werd gewijzigd van in verwijzing 13.- Wassen van de weefsels 3 x in PBS 0,5 – 1% Triton, 10-30 min. telkens.
- Incubeer de weefsels tweemaal voor 30 min in de blokkeerbuffer (PBS 1% Triton + 10% BSA), bij kamertemperatuur.
- Wassen van de weefsels 2 × in de blokkeerbuffer, 5 – 10 min telkens.
- 50 µL van primair antilichaam oplossing op de vereiste verdunning/concentratie aan de inserts toevoegen. Gebruik een dun plastic cling-film wilt laten teruglopen van de inserts Voorkom uitdrogen van het weefsel.
- Het weefsel Incubeer gedurende 1 tot 2 dagen bij 4 ° C.
- Wassen de weefsels 3 keer, 1% gedurende 30 min. in PBS Triton + 10% BSA. Wassen weer 3 keer, gedurende 5 min. in PBS 1% Triton.
- Voeg 50 µL van secundair antilichaam in blokkeerbuffer (PBS 1% Triton + 10% BSA) en 5 µL van Hoechst 33342 oplossing (NucBlue Live cel vlek) voor elke toevoeging. Gebruik een dun plastic cling-film wilt laten teruglopen van de inserts Voorkom uitdrogen van het weefsel.
- Incubeer gedurende 1 tot 2 dagen bij 4 ° C. Wikkel de 24-well-plaat in een natte papieren handdoek, en zet het dan in een plastic verpakking moet worden gebruikt tijdens de incubatie.
- Wassen van de weefsels 3 keer, voor 10 min in PBS 1% triton
- Gebruik een scherpe naald te snijden het membraan van het donormateriaal cultuur te verkrijgen van het weefsel. Plaats het membraan in een dia verschijnt.
Opmerking: Het weefsel moet worden op het membraan. - Voeg 2-3 druppels van fluorescentie mount medium. Betrekking hebben op het weefsel met een cover glas en bewaren bij 4 ° C in het donker tot analyse.
- Weefsels met een confocale laser scanning microscopie (LSM) bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HaCaT cellen weergegeven typische Keratinocyt morfologie onder fase contrast microscopische observatie (figuur 2A). Scanner elektronen microscopische (SEM) beelden bleek dat de HaCaT cel oppervlakken werden gedekt door veel microvilli. Intercellulaire verbindingen tussen HaCaT cellen werden bemiddeld door membraanscheidingsprocessen (figuur 2B). HaCaT cellen uitgedrukt gingival epitheel marker K8/18/EG14, die aangeeft dat de HaCaT cellen geschikt voor tandvlees wederopbouw (figuur 2C zijn).
Figuur 3A geeft een geslaagd voorbeeld van GTE en figuur 3B ziet u een mislukte voorbeeld van GTE. De mislukte proef (figuur 3B) wordt veroorzaakt door het collageen gel mengsel niet worden toegevoegd in het midden van de cultuur invoegen. Figuur 3 c toonde aan dat een wond model van GTE door ponsen van een gat in het weefsel met een perforatie weefsel kan worden gemaakt. H & E kleuring (figuur 3D) en SEM beelden (figuur 3E) aangetoond dat op 19 dagen van teelt, ongeveer 10-20 lagen van HaCaT cellen formulier epitheel en collageen gel-embedded HGF cellen formulier lamina propria. In de lamina propria van de gereconstrueerde GTE, HGF cellen kenmerkende morfologie van fibroblasten (figuur 3F) tentoongesteld en werden omringd door goed gedefinieerde matrices van collageenvezels (Figuur 3 g). Immunofluorescentie kleuring toonde dat vimentin en TE-7 (beiden zijn dermale fibroblast markeringen15) worden uitgedrukt in de lamina propria van GTE (figuur 4A en 4B). K19, een specifieke marker aan regulates en zak epitheel in parodontitis16, zwak uitgedrukt in het epitheel van de GTE (figuur 4C), en wordt sterk uitgedrukt in het epitheel van het iGTE (Figuur 4 d). De gegevens gesuggereerd dat HaCaT cellen in belangrijke epitheliale cellen in parodontitis, vooral na inflammatoire stimulatie van de lamina propria onderscheiden kunnen.
Inflammatoire gingival ziekten, zoals gingivitis en parodontitis, histologisch worden gekenmerkt door de aanwezigheid van lymfocyten en macrofagen, en leiden tot fibrose en weefsel necrose17,18. In dit protocol werden THP-1 cellen gebruikt als de OntstekingsCellen voor iGTE. Zoals afgebeeld in Figuur 5, zonder PMA-stimulatie, THP-1 cellen gepresenteerd een monocytic morfologie en de meeste van hen dreef in het medium (figuur 5A). In tegenstelling, na wordt blootgesteld aan PMA 10 ng/mL voor 72 uur, meer dan 50% van de THP-1 cellen onderscheiden in macrofaag-achtige cellen en nageleefd op het oppervlak van de cultuur (figuur 5B). Gelijkaardig aan HaCaT en HGF cellen8, THP-1 cellen groeide goed binnen de collageen-gel in het co kweekmedium (KSR medium), en gedifferentieerde in macrofaag-achtige cellen na de PMA-behandeling (figuur 5C). Immunokleuring bleek dat de zelfklevend THP-1 cellen CD68 uitgedrukt (een marker van macrofagen19) (figuur 5D) en CD14 (een marker van de macrofagen) (Figuur 6). IGTE werden, THP-1 monocyten ingesloten in de gel collageen en om geïnjecteerd in het gat simuleren een wond (figuur 5E). 72 uur na de PMA (10 ng/mL)-stimulatie, THP-1 cellen onderscheiden in macrofagen (figuur 5F) binnen het gat simuleren van een wond en uitgedrukt CD68 (Figuur 5 g), die aangeeft dat ze zijn in staat om de inflammatoire foci vorm in de gewonde GTE.
Hele mount immunohistochemistry (Figuur 6) bleek dat THP-1 cellen in het gat simuleren een wond niet alleen CD14 uitgedrukt (een marker van de macrofagen), maar ook uitgedrukt vimentin evenals de fibroblasten in de rand van het gat. Vimentin wordt uitgedrukt door actieve macrofagen20. De gegevens bevestigd dat THP-1 macrofagen functioneel zijn.
Figuur 1: experimentele designs. Experimentele opstelling van 3D menselijk weefsel equivalenten van tandvlees (GTE) (A) en inflammatoire GTE (iGTE) (B). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: karakterisering van HaCaT keratinocyten. (A) fase contrast microscopische opname van HaCaT cellen in cultuur. Schaal bar = 50 µm. (B) SEM-beeld van HaCaT cellen. (C) immunohistochemische kleuring van HaCaT cellen voor gingival epitheliale cel marker K8/18/EG. Green, K8/18/EG. Blauw, DAPI. Schaal bar = 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: karakterisering van 3D menselijk weefsel equivalenten van tandvlees (GTE). (A) voorbeeld van een succesvolle GTE in cultuur. Het weefsel is in het midden van de cultuur invoegen. (B) voorbeeld van een mislukte GTE: deel van de GTE is gescheiden van het weefsel en bevooroordeeld richting de muur (rode pijl). (C) gewonde GTE: gele pijl geeft aan een geperforeerd door het weefsel perforatie. (D) H & E kleuring van GTE gekweekt voor 19 dagen (14 dagen lucht blootstelling). Schaal bar = 50 µm. (E) SEM-beeld van een verticale sectie van de GTE gekweekt voor 19 dagen. (F) fase contrast microscopische opname van HGF cellen in collageen gel die gevormd de lamina propria van GTE. Schaal bar = 25 µm. (G) SEM-beeld van massale collageenvezels rond HGF cellen in de lamina propria van GTE. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: uitdrukking van vimentin, TE-7 en K19 in GTE. Immunofluorescentie verkleuring van de GTE voor lamina propria markeringen vimentin (A en B) en TE-7 (B) in GTE en opperhuid marker K19 in GTE (C) en iGTE (D). Rood, vimentin en K19. Green, TE-7. Blauw, DAPI. E, opperhuid; LP, lamina propria. Schaal bar = 50 µm (A, C en D), 20 µm (B). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: karakterisering van THP-1 cellen. (A) niet-gedifferentieerdeproductie THP-1 cellen in cultuur. Schaal bar = 15 µm. (B) gedifferentieerd THP-1 macrofagen. Schaal bar = 15 µm. (C) THP-1 cellen waren ingesloten in collageen gel in KSR medium en gedurende 24 h. schaal behandeld met PMA bar = 50 µm. (D) immunohistochemische kleuring van de THP-1 macrofagen voor macrophage marker CD68. Rood, CD68. Blauw, DAPI. Schaal bar = 5 µm. (E) THP-1-collageen mengsel in het gewonde gat van HGE aan het begin van de PMA behandeling. Schaal bar = 25 µm. (F) THP-1 cellen onderscheiden in macrofagen (rode pijlen) 72 uur na de behandeling van de PMA. Schaal bar = 25 µm. (G) THP-1 cellen uitgesproken macrofaag marker CD68. Gele stippellijn geeft het gebied van de gewonde gat in H & E. schaal bar = 100 µm. rood, CD68. Blauw, hoechst 33342. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: karakterisering van iGTE. Hele mount immunohistochemistry voor CD14 (groen) en vimentin (rood) werd uitgevoerd op iGTE. Z-serie opnamen (C) die zijn gemaakt via iGTE (416 µm in totaal. Panel 1 is de eerste sectie die LSM gescand en paneel 25 is de laatste. Het interval is ongeveer 16.64 µm tussen secties). Vertegenwoordiger deel (A) (nr. 17 van de Z-serie beelden) en orthofoto 3D-afbeelding van Z-stack (B) presenteerde de 3D verdeling van CD14 - en vimentin-positieve THP-1 macrofagen in het gat simuleren een wond in de iGTE. Scannen betreffendedepositie van LSM in iGTE wordt aangegeven in (D) en de linker boven hoek in (A). Schaal bar = 50 µm. gele stippellijnen duiden het gebied van de gewonde gat in iGTE. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol is gebaseerd op de methoden van het creëren van gingival weefsel equivalenten en onderhuids vetweefsel equivalenten beschreven door vorige verslagen8,-21,22. Hoewel dit een eenvoudige en gemakkelijke methode is, vereist enkele stappen speciale aandacht. Het mengsel van collageen moet bijvoorbeeld op ijs worden bewaard tot gebruik om te voorkomen dat de formatie van de gel in de oplossing. Bij het toevoegen van het mengsel van collageen in de cultuur invoegen, zorg ervoor dat de oplossing werd geïnjecteerd in het midden van de insert om te voorkomen dat de vorming van een vooringenomen gel (zoals in figuur 3B). Ponsen van een gat in de GTE ook duurt vaardigheid. Het weefsel perforatie niet kan soms halen het weefsel als het weefsel te nat is. Een weefsel biopsie systeem of een paar pincet zou nuttig zijn; de afmetingen van de gewonde locatie zal echter veel worden gewijzigd. Het is ook mogelijk met een injectiespuit met scherpe naald te injecteren de THP-1 cel-collageen mengsel zonder het ponsen van een gat (zorg ervoor dat de gel doet niet verstoppen de naald).
De beperking van deze methode is dat het niet perfect vertegenwoordigen de complexe biologische fenomenen van gingivitis en parodontitis, omdat iGTE bloedvaten, neuronale cellen en andere immune cellen ontbreekt, en de ontsteking wordt niet veroorzaakt door de host-biofilm interacties. Het is echter de enige in vitro gingivitis weefsel model gemaakt door menselijke cellen die deels de pathologie van inflammatoire tandvlees presenteert. Het model kan worden aangepast om meer lijken op de echte gingivitis en Parodontitis door 1) mede het cultiveren van GTE met biofilm waarmee host-biofilm interacties of stimuleren van inflammatoire reacties in iGTE met behulp van LPS (de verbindingen in de buitenmembraan van Gram-negatieve bacteriën en een sterke inflammatoire initiator zoals we in het protocol), 2) zaaien de collageen-HGF oplossing op uitgepakte tanden te formulier tandvlees-tooth complexen en observeren hoe de ontsteking in tandvlees beïnvloedt harde weefsel, en 3) met behulp van menselijke gingival epitheliale cellen vormen de epidermis van GTE en iGTE.
Met de methoden die hier gepresenteerd, kunnen GTE en iGTE culturen worden gebruikt als veelzijdige tools om te studeren wondgenezing weefselregeneratie, ontsteking, cel-cel interactie en scherm potentiële geneesmiddelen voor gingivitis en Parodontitis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflict.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Japan Society voor de promotie van wetenschap (JSPS) Grant-in-Aid voor wetenschappelijkonderzoek (26861689 en 17 K 11813). De auteurs bedank Mr. Nathaniel Green voor proeflezen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagen type I-A | Nitta Gelatin Inc | For making dermis of GTE | |
| MEM-alpha | Thermo Fisher Scientific | 11900073 | Cell culture medium |
| Cell Culture Insert (for 24-well plate), pore size 3.0 μm | Corning, Inc. | 353096 | For tissue culture |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Cell culture reagent |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 31600034 | Cell culture medium |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Cell culture reagent |
| Tissue puncher | Shibata system service co., LTD | SP-703 | For punching holes in GTE |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 31800022 | Cell culture medium |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3294 | For immunostaining |
| Hoechst 33342 (NucBlue Live Cell stain) | Thermo Fisher Scientific | R37605 | For labeling nuclei |
| Fluorescence mount medium | Dako | For mounting samples after immunostaining | |
| Anti-Cytokeratin 8+18 antibody [5D3] | abcam | ab17139 | For identifying epithelium |
| Scaning electron microscope | Hitachi, Ltd. | HITACHI S-4000 | For observing samples' surface topography and composition |
| Confocal laser scanning microscopy | LSM 700; Carl Zeiss Microscopy Co., Ltd. | LSM 700 | For observing samples' immunofluorescence staining |
| Anti-Cytokeratin 19 antibody | abcam | ab52625 | For identifying epithelium |
| Anti-vimentin antibody | abcam | ab92547 | For identifying fibroblasts and activated macrophages |
| Anti-TE-7 antibody | Millipore | CBL271 | For identifying fibroblasts in the dermis |
| Anti-CD68 antibody | Sigma-Aldrich | SAB2700244 | For identifying macrophages |
| Human CD14 Antibody | R&D Systems | MAB3832-SP | For identifying macrophages |
| Alexa Fluor 594-conjugated secondary goat anti-rabbit antibody | Thermo Fisher Scientific | A11012 | For immunofluorescence staining |
| Alexa Fluor 488-conjugated secondary goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A11001 | For immunofluorescence staining |
| EVOS FL Cell Imaging System | Thermo Fisher Scientific | For observing the sample's immunofluorescence staining | |
| THP-1 cells | Riken BRC cell bank | RCB1189 | For making iGTE |
| PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate) | Sigma-Aldrich | P8139 | For differentiatting THP-1 cells |
References
- Cekici, A., Kantarci, A., Hasturk, H., Van Dyke, T. E. Inflammatory and immune pathways in the pathogenesis of periodontal disease. Periodontology 2000. 64 (1), 57-80 (2014).
- Hasturk, H., Kantarci, A., Van Dyke, T. E. Oral Inflammatory Diseases and Systemic Inflammation: Role of the Macrophage. Frontiers in Immunology. 3, 118 (2012).
- Koh, T. J., DiPietro, L. A. Inflammation and wound healing: The role of the macrophage. Expert reviews in molecular medicine. 13, e23 (2011).
- Mescher, A. L. Macrophages and fibroblasts during inflammation and tissue repair in models of organ regeneration. Regeneration. 4 (2), 39-53 (2017).
- Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental Animal Models in Periodontology: A Review. The Open Dentistry Journal. 4, 37-47 (2010).
- Han, Y. W., et al. Interactions between Periodontal Bacteria and Human Oral Epithelial Cells: Fusobacterium nucleatum Adheres to and Invades Epithelial Cells. Infection and Immunity. 68 (6), 3140-3146 (2000).
- Boukamp, P., Petrussevska, R. T., Breitkreutz, D., Hornung, J., Markham, A., Fusenig, N. E. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).
- Xiao, L., Miwa, N. Hydrogen-rich water achieves cytoprotection from oxidative stress injury in human gingival fibroblasts in culture or 3D-tissue equivalents, and wound-healing promotion, together with ROS-scavenging and relief from glutathione diminishment. Hum Cell. 30 (2), 72-87 (2017).
- Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- Ara, T., Kurata, K., Hirai, K., Uchihashi, T., Uematsu, T., Imamura, Y., Furusawa, K., Kurihara, S., Wang, P. L. Human gingival fibroblasts are critical in sustaining inflammation in periodontal disease. J Periodontal Res. 44 (1), 21-27 (2009).
- Park, E. K., Jung, H. S., Yang, H. I., Yoo, M. C., Kim, C., Kim, K. S. Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli. Inflamm Res. 56 (1), 45-50 (2007).
- Sharif, O., Bolshakov, V. N., Raines, S., Newham, P., Perkins, N. D. Transcriptional profiling of the LPS induced NF-kappaB response in macrophages. BMC Immunol. 8, 1 (2007).
- Abcam. Whole mount fluorescent immunohistochemistry. , Available from: http://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/whole_mount_fluorescent_ihc.pdf (2017).
- Shetty, S., Gokul, S. Keratinization and its disorders. Oman Med J. 27 (5), 348-357 (2012).
- Klinge, B., Matsson, L., Attström, R. Histopathology of initial gingivitis in humans. A pilot study. J Clin Periodontol. 10 (4), 364-369 (1983).
- Nagarakanti, S., Ramya, S., Babu, P., Arun, K. V., Sudarsan, S. Differential expression of E-cadherin and cytokeratin 19 and net proliferative rate of gingival keratinocytes in oral epithelium in periodontal health and disease. J Periodontol. 78 (11), 2197-2202 (2007).
- Goodpaster, T., Legesse-Miller, A., Hameed, M. R., Aisner, S. C., Randolph-Habecker, J., Coller, H. A. An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. J Histochem Cytochem. 56 (4), 347-358 (2008).
- Langeland, K., Rodrigues, H., Dowden, W. Periodontal disease, bacteria, and pulpal histopathology. Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 37 (2), 257-270 (1974).
- Holness, C. L., Simmons, D. L. Molecular cloning of CD68, a human macrophage marker related to lysosomal glycoproteins. Blood. 81 (6), 1607-1613 (1993).
- Mor-Vaknin, N., Punturieri, A., Sitwala, K., Markovitz, D. M. Vimentin is secreted by activated macrophages. Nat Cell Biol. 5 (1), 59-63 (2003).
- Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. The effect of squalane-dissolved on adipogenesis-accompanied oxidative stress and macrophage in a preadipocyte-monocyte co-culture system. Biomaterials. 31 (23), 5976-5985 (2010).
- Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. Highly hydroxylated fullerene localizes at the cytoskeleton and inhibits oxidative stress in adipocytes and a subcutaneous adipose-tissue equivalent. Free Radic Biol Med. 51 (7), 1376-1389 (2011).
