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Developmental Biology

Dimensions des tissus inflammatoires humaines équivalents de la gencive

doi: 10.3791/57157 Published: April 3, 2018

Summary

L’objectif du protocole est de construire un modèle d’inflammatoire gencive humaine in vitro. Ce modèle de tissu co cultive trois types de cellules humaines, HaCaT kératinocytes, fibroblastes gingivaux et macrophages THP-1, dans des conditions en trois dimensions. Ce modèle peut être appliqué à une enquête sur les maladies parodontales, telles que la gingivite et la parodontite.

Abstract

Les maladies parodontales (telles que la gingivite et la parodontite) sont les principales causes de la perte des dents chez les adultes. Inflammation de la gencive est la fondamentale physiopathologie des maladies parodontales. Les modèles expérimentaux actuels des maladies parodontales ont été créés dans différents types d’animaux. Toutefois, la physiopathologie des modèles animaux est différente de celle des humains, il est difficile d’analyser les mécanismes cellulaires et moléculaires et d’évaluer les nouveaux médicaments pour les maladies parodontales. Nous présentons ici un protocole détaillé pour reconstruire les équivalents humains inflammatoires des tissus de la gencive (iGTE) in vitro. Nous avons tout d’abord créer des équivalents de tissus humains de la gencive (GTE) en utilisant deux types de cellules humaines, y compris les fibroblastes gingivaux humains (HGF) et les kératinocytes épidermiques de la peau humaine (HaCaT), dans des conditions en trois dimensions. Nous créons un modèle de la plaie à l’aide d’un perforateur de tissu pour percer un trou dans le GTE. Ensuite, humaines monocytes THP-1 mélangés avec du gel de collagène sont injectées dans le trou dans le GTE. Par adimistration de 10 ng/mL phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) pendant 72 h, THP-1 cellules se différencient en macrophages aux foyers inflammatoires de la forme en GTE (iGTE) (IGTE peut également être stumilated avec 2 µg/mL de lipopolysaccharides (LPS) pendant 48 h initier l’inflammation ). IGTE est le premier modèle in vitro de la gencive inflammatoire utilisant des cellules humaines avec une architecture en trois dimensions. IGTE reflète des changements pathologiques principaux (immunocytes activition, interactions intracellulaires chez les fibryoblasts, les cellules épithéliales, les monocytes et les macrophages) dans les maladies parodontales. GTE, GTE blessé et iGTE utilisable comme outils polyvalents pour étudier la cicatrisation, régénération des tissus, l’inflammation, interaction cellule-cellule et médicaments potentiels écran des maladies parodontales.

Introduction

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Les maladies parodontales sont la principale cause de la perte des dents chez les adultes. La gingivite et la parodontite est des maladies parodontales les plus courantes. Les deux induite par le biofilm aiguës ou chroniques inflammatoires changements actuels dans la gencive. La gingivite est caractérisée par une inflammation aiguë, tandis que la parodontite se présente généralement comme une inflammation chronique. Sur le plan histologique, les composantes bactériennes déclenchent l’activation des cellules immunitaires, tels que les macrophages, lymphocytes, plasmocytes et mastocytes1,2. Ces cellules immunitaires, en particulier les macrophages, interagissent avec les cellules locales (y compris les cellules épithéliales gingivales, fibroblastes, cellules endothéliales et les ostéoblastes) entraînant des lésions inflammatoires dans les tissus parodontaux3,4. Modèles expérimentaux de maladies parodontales ont été créés dans différents types d’animaux, comme les rats, hamsters, lapins, furets, chiens et des primates. Toutefois, la physiopathologie des modèles animaux est différente de celle des humains, il est difficile d’analyser les mécanismes cellulaires et moléculaires et d’évaluer les nouveaux médicaments des maladies parodontales5. Co-culture de bactéries parodontales et cellules épithéliales humaines orale de monocouche a été utilisé pour étudier le mécanisme de l’infection parodontale6. Néanmoins, des cultures monocouches de cellules par voie orale n’ont pas l’architecture cellulaire d’en trois dimensions (3D) de tissus intacts ; par conséquent, ils ne peuvent pas imiter la situation in vitro .

Ici, équivalents 3D inflammatoires des tissus humains de la gencive (iGTE) sont mis en place pour représenter les maladies parodontales in vitro. Ce modèle 3D des maladies parodontales occupe une position intermédiaire entre des cultures monocouches de cellules et des modèles animaux. Trois types de cellules humaines, y compris HaCaT kératinocytes, fibroblastes gingivaux et macrophages THP-1, sont conjointement cultivés sur gel de collagène et stimulées par les initiateurs inflammatoires de construire iGTE. IGTE simule étroitement les conditions in vivo de la différenciation cellulaire, interaction cellule-cellule et activation des macrophages dans la gencive. Ce modèle a de nombreuses applications possibles pour drogue préliminaire et d’essai de nouvelles approches pharmacologiques dans les maladies parodontales, ainsi que pour analyser les mécanismes cellulaires et moléculaires dans la guérison des blessures, l’inflammation et la régénération des tissus.

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Protocol

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Ce protocole est conçu pour créer des tissus gingivaux humains équivalents, blessure gingivale modèles et modèles de gingivite. Kératinocytes épidermiques de la peau humaine (HaCaT) ont été gracieusement fournis du professeur Norbert E. Fusenig de Deutsches Krebsforschungszentrum (Heidelberg, Allemagne)7. Les fibroblastes gingivaux humains (HGFs) ont été isolés des tissus gingivaux selon les protocoles publiés précédemment8. Le consentement éclairé a été obtenu au préalable et l’étude a été approuvée selon les lignes directrices établies par le Comité d’éthique, l’Université dentaire Nippon School of Life Dentistry à Tokyo (numéro d’autorisation : NDU-T2012-35). Protocole, étapes 1-3 devraient être effectuées sous une hotte de culture cellulaire.

1. préparation du tissu humain 3D équivalents de la gencive (GTE) (Figure 1 a)

  1. Mélange collagène type I-A gel 10 % concentré MEM-alpha et tampon de reconstruction de 10 % (2,2 g de NaHCO3 et 4,47 g HEPES dans 100 mL 0,05 N NaOH) dans un tube stérile de 15 mL de pipetage. Conserver la solution mixte de collagène sur la glace jusqu'à utilisation.
  2. Placer les inserts de culture 24 puits (pore taille 3,0 µm) dans une plaque de 24 puits.
  3. Enlever HGFs de la surface de la culture à l’aide de la solution de trypsine-EDTA de 0,25 %. Suspendre les cellules dans 10 mL de milieu de culture A (MEM-alpha + 20 % BF + 1 % GlutaMAX). Compter les cellules par un compteur de cellules Bürker-Türk.
    1. Extraire la quantité désirée de cellules (1-5 x105 cellules/mL), puis centrifuger pendant 4 min à 190 x g.
    2. Suspendre les cellules dans la solution mixte de collagène. Garder le mélange sur la glace jusqu’au niveau suivant.
  4. Ajouter 0,5 mL du mélange cellulaire-collagène (0,5 à 2,5 x 105 cellules/puits) dans l’insert de culture sans produire toutes les bulles. Incuber le mélange pendant 10 à 30 min en atmosphère humidifiée avec 5 % de CO2 à 37 ° C, pour coaguler le mélange dans un gel.
    NOTE : Ajouter le mélange de collagène dans le centre de l’insert de culture afin d’éviter la formation inégale de gel de collagène.
  5. Ajouter 1 mL de milieu de culture dans le puits et 0,5 mL dans l’insert. Incuber la plaque de culture pendant 24 h ou toute la nuit dans une atmosphère humidifiée avec 5 % de CO2 à 37 ° C.
  6. Éliminer les cellules HaCaT de la surface de la culture à l’aide de la solution de trypsine-EDTA de 0,25 %. Suspendre les cellules dans 10 mL de milieu B (DMEM + 10 % BF + 1 % GlutaMAX) et compter les cellules non vides. Extrait la quantité nécessaire de cellules (1 – 5 x 105 cellules/mL) avec une pipette, centrifuger pendant 4 min à 190 x g. suspendre les cellules de B. moyen
  7. Retirez le support les inserts de culture, contenant le mélange de HGF-collagène, par aspiration. Ajouter 0,5 mL de suspension de cellules HaCaT (0,5 à 2,5 x 105 cellules/puits) sur le dessus le mélange de HGF-collagène. Incuber les cultures pour 24 h ou toute une nuit.
    Remarque : À ce moment, le milieu de la culture bien devrait être A moyen, tandis que le milieu dans le foyer de la culture devrait être moyen B.
  8. Remplacer le milieu de culture avec support KSR (milieu de culture Co) (MEM-alpha + 15 % KnockOut remplacement de sérum + 1 % GlutaMAX) + 5 % FBS. Ajouter 1 mL de milieu de culture dans la culture bien et 0,5 mL dans le foyer de la culture. Incuber les cultures pendant 24 à 48 h.
  9. Remplacer le milieu de culture avec moyen KSR + 1 % FBS. Ajouter 1 mL dans la culture bien et 0,5 mL dans l’insert de la culture. Incuber les cultures pour 24 h ou toute une nuit.
  10. Remplacer le milieu de culture dans la culture bien avec 0,7 – 1 mL de milieu KSR. Retirez complètement le milieu de l’insert de culture (la surface de culture doit être exposée à l’air). Incuber les cultures pendant 1 à 2 semaines. Modifier le milieu dans la culture bien deux fois par semaine.
    Remarque : Ne laissez pas la montée de niveau moyenne au-dessus de la surface de culture (la couche supérieure composée de kératinocytes). Gardez toujours la surface de culture sèche.

2. préparation du GTE blessé (Figure 1 b)

  1. Préparer un perforateur de tissus 1 à 3 mm de diamètre. Stériliser à l’autoclave à 121 ° C pendant 20 min.
  2. Poussez le perforateur de tissu perpendiculairement dans GTE environ 300 µm de profondeur et percer un trou dans le tissu pour simuler une blessure.
  3. À cette étape, utilisez le GTE blessé pour enquêter sur la régénération de tissus et la cicatrisation plaie. Vous pouvez également fixer GTE en utilisant la solution tampon neutre de 10 % de formol pour effectuer une analyse histologique.

3. préparation du GTE inflammatoires (iGTE) (Figure 1 b)

  1. Cultiver des cellules THP-1 selon le précédent rapport9.
  2. Mélange collagène type I-A gel 10 % concentré RPMI 1640, tampon de reconstruction de 10 % (2,2 g de NaHCO3 et 4,47 g HEPES dans 100 mL 0,05 N NaOH) et 10 ng/mL PMA. Conserver la solution mixte de collagène sur la glace jusqu'à l’utilisation.
  3. Nombre 1-2 x 106 THP-1 cellules et centrifuger pendant 4 min à 190 x g. suspendre les cellules dans 1 mL de la solution mixte de collagène. Garder le mélange sur la glace jusqu’au niveau suivant.
  4. Ajouter 10 – 30 µL THP-1-collagène mélange dans la zone blessé de GTE. Remplacer le milieu de culture à 0,7 – 1 mL de milieu KSR contenant 10 ng/mL de PMA.
  5. Incuber le mélange dans une atmosphère humidifiée avec 5 % de CO2 à 37 ° C pendant 72 h.
  6. Utiliser le modèle pour l’étude de gingivite ou parodontopathie (par exemple, ajouter potentiel anti-inflammatoire à iGTE pour voir ses effets sur la libération de cytokines10). Vous pouvez également omettre 72 h PMA-traitement, ajouter 2 µg/mL de LPS dans la culture et incuber le tissu dans une atmosphère humidifiée avec 5 % de CO2 à 37 ° C pendant 48 h11,12.

4. fixation et immunomarquage de monter ensemble de GTE et iGTE Cultures

  1. Fixation des cultures.
    1. Retirer le milieu de culture de la plaque 24 puits. Laver les tissus 2 fois avec du sérum physiologique tamponné au phosphate (PBS).
    2. Ajouter 1 mL de solution tampon neutre de 10 % de formol à l’insert et 1 mL de la culture. Laisser la plaque 24 puits dans un réfrigérateur à 4 ° C durant la nuit.
    3. Enlever la solution de tampon neutre de formol 10 % le lendemain.
    4. Pour toute monture immunostaining, laver les tissus 3 - 4 fois avec du PBS après fixation.
    5. Pour l’hématoxyline et éosine (H & E) souillant et immunostaining régulière, procéder avec déshydratation, enrobage de paraffine et de sectionnement.
      Remarque : Pour toute monture immunostaining, cette étape peut être omise.
  2. Toute monture immunostaining
    Remarque : Ce protocole a été modifié de celle de référence 13.
    1. Laver les tissus 3 x dans du PBS 0,5 – 1 % Triton, 10 – 30 min chaque fois.
    2. Incuber les tissus deux fois pendant 30 min dans un tampon bloquant (PBS 1 % Triton + 10 % de BSA), à la température ambiante.
    3. Laver les tissus 2 × dans un tampon bloquant, 5 – 10 minutes chaque fois.
    4. Ajouter 50 µL de solution d’anticorps primaire à la dilution/concentration requise pour les inserts. Utiliser un film mince en plastique autocollant pour envelopper les inserts pour éviter le dessèchement des tissus.
    5. Incuber le tissu pendant 1 à 2 jours à 4 ° C.
    6. Laver les tissus 3 fois, pendant 30 min dans du PBS 1 % Triton + 10 % de BSA. Lavez à nouveau 3 fois, pendant 5 min dans du PBS 1 % Triton.
    7. Ajouter 50 µL d’anticorps secondaire dans un tampon bloquant (PBS 1 % Triton + 10 % de BSA) et 5 µL de solution de Hoechst 33342 (tache NucBlue vivre cellule) à chaque insertion. Utiliser un film mince en plastique autocollant pour envelopper les inserts pour éviter le dessèchement des tissus.
    8. Incuber pendant 1 à 2 jours à 4 ° C. Enrouler la plaque 24 puits dans une serviette de papier humide et puis le mettre dans un paquet en plastique à utiliser tout au long de l’incubation.
    9. Laver les tissus 3 fois, pendant 10 min dans triton de PBS 1 %
    10. Utilisez une aiguille fine pour couper la membrane de l’insert de culture pour obtenir le tissu. Placer la membrane sur une lame.
      Remarque : Le tissu doit être sur la membrane.
    11. Ajouter 2 à 3 gouttes de milieu de montage de fluorescence. Couvrir le tissu avec une lamelle couvre-objet et conserver à 4 ° C dans l’obscurité jusqu'à l’analyse.
    12. Découvre les tissus avec un laser confocal, microscopie (LSM).

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Representative Results

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Cellules HaCaT affichent la morphologie typique de kératinocytes sous observation au microscope à contraste de phase (Figure 2 a). Images de scanner électronique microscopiques (SEM) ont montré que les surfaces de cellules HaCaT étaient couverts de nombreuses microvillosités. Liens intercellulaires entre les cellules HaCaT ont été véhiculées par des procédés à membranes (Figure 2 b). HaCaT cellules expriment l’épithélium gingival marqueur K8/1814, indiquant que les cellules HaCaT sont adaptés pour la reconstruction de gencive (Figure 2).

Figure 3 montre un exemple réussi de GTE et Figure 3 b montre un exemple d’échec de GTE. L’essai infructueux (Figure 3 b) est provoquée par le mélange de gel de collagène ne pas ajouté dans le centre de l’insert de la culture. Figure 3 a montré qu’un modèle de la plaie du GTE peut être fait en perçant un trou dans le tissu avec un perforateur de tissu. H & E coloration (Figure 3D) et images de SEM (Figure 3E) ont démontré que, à 19 jours de culture, environ 10 à 20 couches de l’épithélium HaCaT forme des cellules et collagène gel incorporé HGF cellules forme lamina propria. Dans la lamina propria de la GTE reconstituée, HGF cellules présentaient une morphologie caractéristique des fibroblastes (Figure 3F) et ont été encerclés par des baies bien définis des fibres de collagène (Figure 3). Immunofluorescence souillant a montré que la vimentine et TE-7 (deux d'entre eux sont des fibroblastes dermiques marqueurs15) sont exprimés dans la lamina propria du GTE (Figure 4 a et 4 b). K19, un marqueur spécifique à l’épithélium jonctionnel et poche en parodontite16, est faiblement exprimée dans l’épithélium du GTE (Figure 4) et est fortement exprimée dans l’épithélium des iGTE (Figure 4). Ces données suggèrent que les cellules HaCaT peuvent différencier dans les cellules épithéliales clés en parodontite, surtout après stimulation inflammatoire de la lamina propria.

Les maladies gingivales inflammatoires, comme la gingivite et la parodontite, se caractérisent histologiquement par la présence de lymphocytes et de macrophages et entraînent la fibrose et le tissu nécrose17,18. Dans ce protocole, cellules THP-1 ont été utilisés comme les cellules inflammatoires pour iGTE. Comme illustré à la Figure 5, sans stimulation-PMA, cellules THP-1 présente une morphologie monocytaire et la plupart d'entre eux flottait dans le milieu (Figure 5 a). En revanche, après avoir été exposés à PMA 10 ng/mL pendant 72 h, plus de 50 % des cellules THP-1 se différencient en cellules macrophages et adhère sur la surface de culture (Figure 5 b). Semblable à HaCaT et HGF cellules8, cellules THP-1 a augmenté nettement à l’intérieur le gel de collagène dans le milieu de culture mixte (KSR milieu) et se différencient en cellules macrophages après traitement de PMA (Figure 5). Immunomarquage a montré que les cellules adhérentes de THP-1 expriment CD68 (un marqueur de macrophages19) (Figure 5) et CD14 (un autre marqueur des macrophages) (Figure 6). Pour former iGTE, monocytes THP-1 ont été incorporés dans le gel de collagène et injectés dans le trou en simulant une blessure (Figure 5E). 72 h après PMA (10 ng/mL)-stimulation, THP-1 cellules se différenciés en macrophages (Figure 5F) dans le trou en simulant une blessure et exprimé CD68 (Figure 5), ce qui indique qu’ils sont capables de foyers inflammatoires de forme dans le GTE blessé.

Toute monture immunohistochimie (Figure 6) ont montré que les cellules THP-1 dans le trou en simulant une blessure non seulement expriment CD14 (autre marqueur de macrophages), mais aussi exprimé vimentine ainsi que les fibroblastes dans le bord du trou. Vimentine est exprimée par des macrophages actif20. Les données ont confirmé que les macrophages THP-1 sont fonctionnels.

Figure 1
Figure 1 : schémas expérimentaux. Montage expérimental d’équivalents de tissus humains 3D de la gencive (GTE) (A) et inflammatoire GTE (iGTE) (B). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : caractérisation des kératinocytes HaCaT. (A) image microscopique de contraste de Phase de HaCaT des cellules en culture. Echelle = 50 µm. (B) SEM image de cellules HaCaT. (C) Immunohistochemical souillant des cellules HaCaT pour marqueur de cellules épithéliales gingivales K8/18. Vert, K8/18. Bleu, DAPI. Echelle = 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : caractérisation des équivalents de tissus humains 3D de la gencive (GTE). (A) exemple d’un GTE avec succès dans la culture. Le tissu est au milieu de l’insert de culture. (B) exemple d’un GTE a échoué : partie de la GTE est séparée du tissu et biaisée vers le mur (flèche rouge). (C) GTE blessés : flèche jaune indique un trou perforé par le perforateur de tissu. (D) H & E coloration de GTE cultivé pendant 19 jours (14 jours exposition d'air). Echelle = 50 SEM image de µm. (E) d’une section verticale de GTE cultivé pendant 19 jours. (F) image microscopique de HGF cellules en gel de collagène qui forment la lamina propria de GTE en contraste de Phase. Echelle = 25 µm. (G) SEM image massive de fibres de collagène autour des cellules HGF dans la lamina propria de GTE. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Expression de vimentine, TE-7 et K19 en GTE. Immunofluorescence souillant de GTE pour lamina propria marqueurs vimentine (A et B) et TE-7 (B) en GTE et marqueur d’épiderme K19 GTE (C) et iGTE (D). Rouge, vimentine et K19. Vert, TE-7. Bleu, DAPI. E, épiderme ; LP, lamina propria. Echelle = 50 µm (A, C et D), 20 µm (B). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : caractérisation des cellules THP-1. (A) indifférencié THP-1 des cellules en culture. Echelle = 15 µm. (B) les macrophages différenciés THP-1. Echelle = 15 µm. (C) cellules THP-1 ont été incorporés dans le gel de collagène dans un milieu KSR et traités avec de la PMA pour 24 h. échelle bar = 50 µm. (D) coloration immunohistochimique des macrophages THP-1 pour le marqueur de macrophage CD68. Rouge, CD68. Bleu, DAPI. Echelle = 5 mélange de THP-1-collagène µm. (E) dans le trou blessé du HGE au début du traitement de PMA. Echelle = 25 µm. (F) THP-1 les cellules se différenciés en macrophages (flèches rouges) à 72 h après traitement de PMA. Echelle = 25 µm. (G) THP-1 cellules macrophages expresse marqueur CD68. Pointillé jaune indique la zone du trou blessé en H & E. échelle bar = 100 µm. rouge, CD68. Bleu, hoechst 33342. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : caractérisation des iGTE. Toute monture immunohistochemistry pour CD14 (vert) et la vimentine (rouge) a été réalisée sur iGTE. Images de la série Z (C) capturés par iGTE (416 µm au total. Panneau 1 est la première section que LSM scanné et panneau 25 est le dernier. L’intervalle est µm environ 16.64 entre les sections). Section représentative (A) (no 17 sur les images de la série Z), orthophoto et image 3D de Z-pile (B) a présenté la distribution 3D des macrophages CD14 séropositifs et vimentine THP-1 dans le trou en simulant une blessure dans l’iGTE. La position de balayage de LSM dans iGTE est indiquée en (D) et le coin supérieur gauche à (A). Echelle = 50 µm. jaune pointillés indiquent la zone du trou iGTE blessé. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

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Ce protocole est basé sur les méthodes de création d’équivalents de tissu gingival et les équivalents de-le tissu adipeux sous-cutané décrits par les précédents rapports8,21,22. Bien qu’il s’agit d’une méthode simple et facile, certaines étapes nécessitent une attention particulière. Par exemple, le mélange collagène doit être maintenu sur la glace jusqu'à l’utilisation afin d’éviter la formation de gel dans la solution. Lorsque vous ajoutez le mélange de collagène dans l’insert de la culture, s’assurer que la solution est injectée dans le centre de l’insert pour éviter la formation d’un gel partial (comme dans la Figure 3 b). Perforer un trou en GTE prend également des compétences. Le perforateur de tissus parfois ne peut pas aspirer le tissu si le tissu est trop humide. Un système de biopsie de tissu ou une paire de pinces serait utile ; Toutefois, les dimensions de l’emplacement blessé beaucoup changera. Il est également possible d’utiliser une seringue avec aiguille fine pour injecter le mélange de THP-1 cell-collagène sans perforer un trou (Assurez-vous que le gel n’obstrue pas l’aiguille).

La limitation de cette méthode est qu’il est incapable de représenter parfaitement les phénomènes biologiques complexes de la gingivite et la parodontite, parce qu’iGTE manque de vaisseaux sanguins, des cellules neuronales et autres cellules immunitaires, et l’inflammation n’est pas causée par la interactions hôte-biofilm. Cependant, c’est le seul en vitro gingivite tissu modèle produite par les cellules humaines qui en partie présente la pathologie de la gencive inflammatoire. Le modèle peut être modifié pour être plus proche de la véritable gingivite et maladies parodontales par 1) co cultiver GTE avec biofilm pour créer des interactions hôte-biofilm ou stimuler les réactions inflammatoires en iGTE à l’aide de LPS (les composés dans la membrane externe de Bactéries Gram-négatives et un initiateur inflammatoire fort que nous avons suggéré dans le protocole), 2) ensemencement de la solution de collagène-HGF sur des dents extraites pour former des complexes gencive-dent et en observant comment l’inflammation de la gencive influence tissu dur et 3) à l’aide cellules épithéliales gingivales humaines pour former l’épiderme de GTE et iGTE.

Avec les méthodes présentées ici, GTE et iGTE cultures peuvent être utilisés comme outils polyvalents pour étudier la cicatrisation, régénération des tissus, l’inflammation, interaction cellule-cellule et aux médicaments potentiels d’écran pour la gingivite et des maladies parodontales.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu en partie par la société japonaise pour la subvention Promotion of Science (JSPS) pour la recherche scientifique (26861689 et 17 K 11813). Les auteurs tiennent à remercier M. Nathaniel Green pour la relecture.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagen type I-A Nitta Gelatin Inc For making dermis of GTE
MEM-alpha Thermo Fisher Scientific 11900073 Cell culture medium
Cell Culture Insert (for 24-well plate), pore size 3.0 μm Corning, Inc. 353096 For tissue culture
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061 Cell culture reagent
DMEM Thermo Fisher Scientific 31600034 Cell culture medium
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828028 Cell culture reagent
Tissue puncher Shibata system service co., LTD SP-703 For punching holes in GTE
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific 31800022 Cell culture medium
BSA Sigma-Aldrich A3294 For immunostaining
Hoechst 33342 (NucBlue Live Cell stain) Thermo Fisher Scientific R37605 For labeling nuclei
Fluorescence mount medium Dako For mounting samples after immunostaining
Anti-Cytokeratin 8+18 antibody [5D3] abcam ab17139 For identifying epithelium
Scaning electron microscope Hitachi, Ltd. HITACHI S-4000 For observing samples' surface topography and composition
Confocal laser scanning microscopy LSM 700; Carl Zeiss Microscopy Co., Ltd. LSM 700 For observing samples' immunofluorescence staining
Anti-Cytokeratin 19 antibody abcam ab52625 For identifying epithelium
Anti-vimentin antibody abcam ab92547 For identifying fibroblasts and activated macrophages
Anti-TE-7 antibody Millipore CBL271 For identifying fibroblasts in the dermis
Anti-CD68 antibody Sigma-Aldrich SAB2700244 For identifying macrophages
Human CD14 Antibody R&D Systems MAB3832-SP For identifying macrophages
Alexa Fluor 594-conjugated secondary goat anti-rabbit antibody Thermo Fisher Scientific A11012 For immunofluorescence staining
Alexa Fluor 488-conjugated secondary goat anti-mouse antibody Thermo Fisher Scientific A11001 For immunofluorescence staining
EVOS FL Cell Imaging System Thermo Fisher Scientific For observing the sample's immunofluorescence staining
THP-1 cells Riken BRC cell bank RCB1189 For making iGTE
PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate) Sigma-Aldrich P8139 For differentiatting THP-1 cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Dimensions des tissus inflammatoires humaines équivalents de la gencive
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Xiao, L., Okamura, H., Kumazawa, Y. Three-dimensional Inflammatory Human Tissue Equivalents of Gingiva. J. Vis. Exp. (134), e57157, doi:10.3791/57157 (2018).More

Xiao, L., Okamura, H., Kumazawa, Y. Three-dimensional Inflammatory Human Tissue Equivalents of Gingiva. J. Vis. Exp. (134), e57157, doi:10.3791/57157 (2018).

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