Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

תלת מימדי רקמה אנושית דלקתיות במקבילות של חניכיים

Published: April 3, 2018 doi: 10.3791/57157
Automatic Translation
1, 2, 2
1Department of Pharmacology, The Nippon Dental University, 2Department of Oral and Maxillofacial Surgery, The Nippon Dental University Hospital

Summary

המטרה של הפרוטוקול היא לבנות מודל של דלקת חניכיים אנושי בתוך חוץ גופית. מודל זה רקמות מטפחת שיתוף שלושה סוגים של תאים אנושיים, HaCaT keratinocytes, fibroblasts חניכיים ו מקרופאגים THP-1, בתנאים תלת מימדי. מודל זה ניתן להחיל כדי לחקור מחלות חניכיים, כגון דלקת חניכיים, חניכיים.

Abstract

מחלות חניכיים (כגון דלקת חניכיים חניכיים) הם הגורמים המובילים ואובדן שיניים אצל מבוגרים. דלקת חניכיים היא physiopathology היסוד של מחלות חניכיים. הנוכחי ניסיוניות של מחלות חניכיים הוקמו בסוגים שונים של בעלי חיים. עם זאת, physiopathology של מודלים בעלי חיים שונה של בני האדם, ולכן קשה לנתח מנגנונים תאית ומולקולרית ולהעריך תרופות חדשות למחלות חניכיים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לשחזור רקמה דלקתית אנושית במקבילות של חניכיים (iGTE) במבחנה. ראשית, אנו בונים רקמה אנושית במקבילות של חניכיים (GTE) על ידי ניצול שני סוגים של תאים אנושיים, כולל האדם חניכיים fibroblasts (דבורה שחר) העור האנושי keratinocytes עוריות (HaCaT), בתנאים תלת מימדי. אנו יוצרים מודל הפצע באמצעות כבטלן רקמות לחורר ב GTE. ומונוציטים THP-1 הבא, אנושי מעורבב עם ג'ל קולגן מוזרקים לתוך החור GTE. על ידי adimistration של 10 ננוגרם למ"ל phorbol פעילים-12 13-אצטט (PMA) עבור 72 h, הבדיל THP-1 תאים לתוך מקרופאגים אל טופס מוקדים דלקתיים ב GTE (iGTE) (IGTE גם יכול להיות stumilated עם µg/mL 2 של lipopolysaccharides (LPS) במשך 48 שעות ליזום דלקת ). IGTE הוא במבחנה המודל הראשון של דלקת חניכיים באמצעות תאים אנושיים עם ארכיטקטורה תלת מימדי. IGTE משקפת שינויים פתולוגיים משמעותיים (immunocytes activition, תאיים אינטראקציות בין fibryoblasts, תאי אפיתל, ומונוציטים ו מקרופאגים) במחלות חניכיים. GTE GTE פצועים, iGTE יכול לשמש כלי רב-תכליתי ללמוד ריפוי הפצע, התחדשות רקמות, דלקת, תא-תא אינטראקציה, וכן תרופות פוטנציאליות מסך למחלות חניכיים.

Introduction

מחלות חניכיים הן הגורם המוביל לאובדן שיניים בקרב מבוגרים. דלקת חניכיים חניכיים מחלות חניכיים הנפוץ ביותר בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. שניהם מציגים בתיווך biofilm אקוטי או כרוני שינויים דלקתיים חניכיים. דלקת חניכיים מאופיין על ידי דלקת חריפה, ואילו חניכיים בדרך כלל מציג כמו דלקת כרונית. ברובד היסטולוגית, רכיבים חיידקי להפעיל את ההפעלה של תאים חיסוניים, כגון מקרופאגים, לימפוציטים, תאי פלזמה ותאים תורן1,2. אלו תאים חיסוניים, במיוחד מקרופאגים, אינטראקציה עם תאים מקומיים (כולל תאים אפיתל חניכיים, fibroblasts, תאי אנדותל, תאי העצם) וכתוצאה מכך נגעים דלקתיים רקמת חניכיים3,4. גרסאות ניסיוניות של מחלות חניכיים הוקמו בסוגים שונים של בעלי חיים, כגון חולדות, אוגרים, ארנבות, חמוסים, הולכי על ארבע, פרימטים. עם זאת, physiopathology של מודלים בעלי חיים שונה של בני האדם, ולכן קשה לנתח מנגנונים תאית ומולקולרית ולהעריך תרופות חדשות של מחלות חניכיים5. טיפוח ושיתוף של חיידקים חניכיים, תאים אפיתל אוראלי אנוש טפט שימש לחקור את המנגנון של דלקות חניכיים6. ובכל זאת, טפט תרביות של תאים דרך הפה חסר תלת מימדי (3D) הסלולר הארכיטקטורה של רקמות שלם; לכן, הם לא יכול לחקות את המצב במבחנה .

כאן, 3D רקמה אנושית דלקתיות במקבילות של חניכיים (iGTE) הוקם כדי לייצג מחלות חניכיים במבחנה. זה דגם התלת-ממד של מחלות חניכיים נמצא במיקום ביניים בין תרביות תאים חד שכבתי חייתיים. שלושה סוגים של תאים אנושיים, כולל HaCaT keratinocytes, חניכיים fibroblasts THP-1 מקרופאגים, הן מעובדות במשותף על ג'ל קולגן, מגורה על ידי מאתחלי דלקתיות לבנות iGTE. IGTE מקרוב מדמה את התנאים ויוו של תאית התמיינות תאים תאים אינטראקציה, הפעלת מקרופאג בחניכיים. מודל זה יש לא מעט אפליקציות אפשריות סמים הקרנת ובדיקות גישות חדשות תרופתי במחלות חניכיים, כמו גם עבור ניתוח מנגנונים תאית ומולקולרית ריפוי הפצע, דלקת ו התחדשות רקמות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

פרוטוקול זה תוכנן כדי ליצור רקמה אנושית חניכיים מקבילות, הפצע חניכיים דגמים ומודלים דלקת חניכיים. העור האנושי keratinocytes עוריות (HaCaT) נמסרו באדיבותו של פרופסור נורברט אי Fusenig של Deutsches Krebsforschungszentrum (היידלברג, גרמניה)7. האדם חניכיים fibroblasts (HGFs) הם בודדו אותנו מהמתרחש רקמות חניכיים על פי פרוטוקולים שפורסמו בעבר8. הסכמה מדעת הושג מראש, ואת המחקר אושרה בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי ועדת האתיקה, ניפון שיניים אוניברסיטת בית הספר של החיים וברפואת שיניים טוקיו (מספר אישור: NDU-T2012-35). פרוטוקול שלבים 1-3 צריכה להתבצע בשכונה התרבות תאים.

1. הכנת רקמות אנושיות 3D במקבילות של חניכיים (GTE) (איור 1 א')

  1. מיקס קולגן סוג ג'ל-A עם 10% מרוכזים MEM-אלפא ו- 10% שיקום מאגר (2.2 גרם של NaHCO3 ו- g 4.47 HEPES ב 100 מ ל 0.05 N NaOH) בצינור סטרילי 15 מ"ל על-ידי pipetting. לשמור על הפתרון קולגן מעורבים על הקרח, עד נעשה שימוש.
  2. מקום 24-ובכן תרבות מוסיף (נקבוביות בגודל 3.0 מיקרומטר) לתוך צלחת 24-. טוב.
  3. הסר HGFs פני התרבות באמצעות פתרון טריפסין-EDTA 0.25%. להשעות את התאים 10 מ"ל של תרבות בינוני A (MEM-אלפא + 20% FBS + 1% GlutaMAX). לספור את התאים על ידי מונה תא Bürker-טורק.
    1. לחלץ את הכמות הרצויה של תאים (1-5 x105 תאים/mL) ולאחר מכן צנטריפוגה במשך 4 דקות ב 190 x g.
    2. להשעות התאים הפתרון קולגן מעורבת. לשמור את התערובת על הקרח עד השלב הבא.
  4. להוסיף 0.5 מ"ל של תערובת תא-קולגן (0.5-2.5 10x5 תאים/טוב) תותב תרבות מבלי לייצר בועות. דגירה את התערובת למשך 10-30 דקות באווירה humidified עם 5% CO2 -37 ° C עד מצב של קרישת חסר את התערובת לתוך ג'ל.
    הערה: להוסיף את התערובת קולגן לתוך המרכז של התותב תרבות, כדי למנוע היווצרות קולגן ג'ל שוויוני.
  5. להוסיף 1 מ"ל של המדיום תרבות לתוך הבאר ו 0.5 mL לתוך תותב. דגירה לצלחת תרבות עבור 24 שעות או למשך הלילה באווירה humidified עם 5% CO2 ב 37 º C.
  6. להסיר HaCaT תאים מפני השטח תרבות באמצעות פתרון טריפסין-EDTA 0.25%. להשעות את התאים 10 מ"ל של מדיום B (DMEM + 10% FBS + 1% GlutaMAX) ולספור את התאים. תמצית הנידרשת של תאים (1 – 5 x5 10 תאים/מ ל) עם פיפטה, צנטריפוגה במשך 4 דקות ב 190 x g... להשעות את התאים בינוני ב'.
  7. הסר את המדיום הכיסויים תרבות, אשר מכילים את התערובת דבורה שחר-קולגן, על ידי השאיפה. להוסיף 0.5 mL HaCaT תא השעיה (0.5-2.5 10x5 תאים/טוב) על התערובת דבורה שחר-קולגן. דגירה התרבויות עבור 24 שעות או לילה.
    הערה: בנקודת זמן זו, המדיום בתרבות טוב צריך להיות A בינוני, ואילו המדיום בעלון תרבות צריכה להיות בינוני B.
  8. להחליף את המדיום תרבות עם אופנוע בינוני (תרבות משותפת בינוני) (MEM-אלפא + 15% נוקאאוט סרום החלפת + 1% GlutaMAX) + 5% FBS. להוסיף 1 מ"ל של המדיום תרבות לתוך התרבות טוב ו 0.5 mL לתוך תותב תרבות. דגירה התרבויות במשך 24-48 שעות.
  9. להחליף את המדיום תרבות עם אופנוע בינוני + 1% FBS. להוסיף 1 מ"ל לתוך התרבות טוב ו 0.5 mL לתוך תותב תרבות. דגירה התרבויות עבור 24 שעות או לילה.
  10. להחליף את המדיום תרבות בתרבות היטב עם 0.7-1 מ ל אופנוע בינוני. הסר את המדיום לחלוטין תותב תרבות (פני תרבות צריך להיחשף אוויר). תקופת דגירה התרבויות של 1-2 שבועות. לשנות את המדיום בתרבות טוב פעמיים בשבוע.
    הערה: אל תתנו את עליית רמת בינוני מעל פני השטח תרבות (השכבה העליונה מורכבת keratinocytes). תמיד לשמור על פני תרבות יבש.

2. הכנת GTE פצועים (איור 1B)

  1. להכין כבטלן הרקמה 1 – 3 מ מ קוטר. לעקר את זה עם החיטוי ב 121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
  2. לדחוף את ניקוב רקמות בניצב לתוך GTE בקשר עמוק 300 מיקרומטר, חור בתוך הרקמה כדי לדמות פצע.
  3. בשלב זה, השתמש את הפצועים GTE עבור חוקרים התחדשות וריפוי רקמת הפצע. לחלופין, לתקן GTE באמצעות 10% פורמלין נייטרלי בופר לביצוע ניתוח היסטולוגית.

3. הכנת GTE דלקתיים (iGTE) (איור 1B)

  1. לטפח THP-1 תאים על פי הדוח הקודם9.
  2. מיקס קולגן סוג ג'ל-A עם 10% מרוכזים RPMI 1640, 10% שיקום מאגר (2.2 גרם של NaHCO3 ו- g 4.47 HEPES ב 100 מ ל 0.05 N NaOH) ו- 10 ננוגרם למ"ל ובחום. לשמור הפתרון קולגן מעורבים על הקרח עד השימוש.
  3. ספירה 1 – 2 x 10 תאים6 THP-1, צנטריפוגה במשך 4 דקות ב 190 x ג להשעות תאי 1 מ"ל של הפתרון קולגן מעורב. לשמור את התערובת על הקרח עד השלב הבא.
  4. להוסיף 10-30 µL THP-1-קולגן התערובת לתוך האזור הפצוע של GTE. להחליף את המדיום תרבות 0.7-1 מ ל אופנוע בינוני המכיל 10 ננוגרם למ"ל של ובחום.
  5. דגירה התערובת באווירה humidified עם 5% CO2 ב 37 מעלות צלזיוס במשך 72 h.
  6. להשתמש במודל על חקירת דלקת חניכיים או מחלת חניכיים (לדוגמה, להוסיף תרופות אנטי דלקתיות פוטנציאליים iGTE כדי לראות את השפעותיה על שחרור ציטוקינים10). לחלופין, השמט 72 h PMA-טיפול, להוסיף 2 µg/mL של LPS לתוך התרבות, דגירה הרקמה באווירה humidified עם 5% CO2 ב 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות11,12.

4. קיבוע ואת כל Immunostaining הר GTE ו iGTE תרבויות

  1. קיבוע של התרבויות.
    1. הסר את המדיום תרבות הצלחת 24-. טוב. לשטוף את רקמות 2 פעמים עם פוספט buffered סליין (הציבורי).
    2. להוסיף 1 מ"ל של 10% פורמלין נייטרלי בופר את הכנס, 1 מ"ל התרבות היטב. השאירו את הצלחת 24-ובכן מקרר ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    3. הסר את 10% פורמלין נייטרלי בופר ביום המחרת.
    4. עבור כל הר immunostaining, לשטוף את רקמות 3 - 4 פעמים עם PBS לאחר קיבוע.
    5. עבור hematoxylin אאוזין (H & E) צביעת ואת immunostaining רגיל, להמשיך עם התייבשות, פרפין הטבעה ואת חלוקתה.
      הערה: עבור כל הר immunostaining, שלב זה יכול להיות מושמט.
  2. כל הר immunostaining
    הערה: פרוטוקול זה שונה מזו בהפניה 13.
    1. לשטוף את הרקמות 3 x ב- PBS 0.5-1%, טריטון, 10-30 דקות בכל פעם.
    2. דגירה הרקמות פעמיים במשך 30 דקות במאגר חסימה (PBS 1% טריטון + 10% BSA), בטמפרטורת החדר.
    3. לשטוף את רקמות 2 × במאגר חסימה, 5 – 10 דקות בכל פעם.
    4. להוסיף 50 µL של נוגדן ראשוני פתרון-נדרש הדילול/הריכוז התוספות. השתמש סרט דק פלסטיק תיאחז לעטוף את הכיסויים כדי למנוע ייבוש הרקמה.
    5. תקופת דגירה הרקמה של 1-2 ימים ב- 4 מעלות צלזיוס.
    6. לשטוף את הרקמות 3 פעמים, במשך 30 דקות ב- PBS 1% טריטון + 10% BSA. לשטוף שוב שלוש פעמים, במשך 5 דקות ב- PBS 1% טריטון.
    7. להוסיף 50 µL של נוגדנים משניים במאגר חסימה (PBS 1% טריטון + 10% BSA) ו µL 5 בפתרון Hoechst 33342 (הכתם תא חי NucBlue) כל הכנס. השתמש סרט דק פלסטיק תיאחז לעטוף את הכיסויים כדי למנוע ייבוש הרקמה.
    8. תקופת דגירה של 1-2 ימים ב- 4 מעלות צלזיוס. לעטוף את הצלחת 24-ובכן במגבת נייר רטוב, אז את זה לתוך ערכת פלסטיק כדי לשמש במהלך הדגירה.
    9. לשטוף את הרקמות 3 פעמים, במשך 10 דקות ב- PBS 1% טריטון
    10. השימוש מחט חדה לחתוך את הקרום של התותב תרבות, כדי להשיג את הרקמה. מקם את הקרום לשקופית.
      הערה: הרקמה צריך להיות על הקרום.
    11. להוסיף 2-3 טיפות של קרינה פלואורסצנטית הר בינוני. מכסים את הרקמה עם כיסוי זכוכית, חנות ב 4 ° C בחושך עד הניתוח.
    12. הצג את רקמות עם לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ (LSM).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

HaCaT התאים מוצג מורפולוגיה תקין טיפוסי בהסתכלות מיקרוסקופית שלב-ניגודיות (איור 2 א). סורק אלקטרון מיקרוסקופיות (SEM) תמונות הראה כי HaCaT תא משטחים כוסו על ידי רבים microvilli. חיבורי המערכת בין תאים HaCaT היו מתווכת על-ידי תהליכים קרום (איור 2B). תאים HaCaT הביע אפיתל חניכיים סמן K8/1814, המציין כי HaCaT תאים מתאימים עבור שחזור חניכיים (איור 2C).

איור 3A מראה דוגמה מוצלחת של GTE ומראה דמות 3B דוגמה GTE שנכשלו. המשפט לא מוצלח (איור 3B) נגרמת על ידי תערובת ג'ל קולגן מתווספות במרכז תותב תרבות. איור 3C הראה כי מודל הפצע של GTE יכול להתבצע על ידי ניקוב חור ברקמה עם כבטלן רקמות. H & E מכתים (איור 3D) ו- SEM תמונות (איור 3E) הוכיח כי 19 ימים של טיפוח-תרגול, כ 10 – 20 שכבות של HaCaT תאים אפיתל טופס, קולגן ג'ל-מוטבע דבורה שחר תאים טופס פרופריה. מוסקולריס. ב פרופריה. מוסקולריס של GTE המשוחזרת, תאים דבורה שחר הציג מורפולוגיה אופיינית של fibroblasts (איור 3F), ו היו מוקפים מערכים מוגדר היטב של סיבי קולגן (איור 3G). Immunofluorescence מכתים הראה כי vimentin ו- TE-7 (שניהם הם סמנים פיברובלסט עורי15) באים לידי ביטוי פרופריה. מוסקולריס של GTE (איור 4A , 4B). K19, סמן ספציפיים כדי אפיתל מהחיבור ו כיס חניכיים16, הוא חלש לידי ביטוי האפיתל של GTE (איור 4C), מתבטא בחריפות האפיתל של iGTE (איור 4D). הנתונים הראו כי HaCaT תאים יכולים להתמיין לתאי האפיתל מפתח בחניכיים, במיוחד לאחר גירוי דלקתי של פרופריה. מוסקולריס.

מחלות חניכיים דלקתית, כגון דלקת חניכיים, חניכיים, בהיסטולוגיה מאופיינים על ידי הנוכחות של לימפוציטים ו מקרופאגים, וגוררים פיברוזיס ו רקמת נמק17,18. ב פרוטוקול זה, שימשו THP-1 תאים של התאים דלקתיים iGTE. כמוצג באיור 5, ללא PMA-גירוי, תאים THP-1 הציג רובם צף בתוך המדיום (איור 5A) ומורפולוגיה monocytic. לעומת זאת, לאחר נחשפים PMA 10 ng/mL עבור 72 h, יותר מ 50% של תאים THP-1 הבדיל לתוך תאי מקרופאג דמוי, דבקה על גבי המשטח תרבות (איור 5B). בדומה HaCaT ו דבורה שחר תאים8, תאים THP-1 גדל בתוך הג'ל קולגן במדיום תרבות משותפת (אופנוע בינוני), הבדיל לתוך תאי מקרופאג דמוי לאחר PMA-טיפול (איור 5C). Immunostaining הראה כי התאים THP-1 מודבקת מבוטא CD68 (סמן של מקרופאגים19) (איור 5D) ו CD14 (עוד סמן של מקרופאגים) (איור 6). כדי ליצור iGTE, ומונוציטים THP-1 היו בתוך הג'ל קולגן, מוזרק לתוך החור להדמיית פצע (איור 5E). ב- 72 שעות לאחר PMA (10 ng/mL)-גירוי, תאים THP-1 הבדיל לתוך מקרופאגים (איור 5F) בתוך החור להדמיית פצע והביע את CD68 (איור 5G), המציין הם מסוגלים מוקדים דלקתיים טופס ב GTE הפצועים.

הר שלמה אימונוהיסטוכימיה (איור 6) הראה כי THP-1 תאים בתוך החור להדמיית פצע לא רק הביע CD14 (עוד סמן של מקרופאגים), אך באה לידי ביטוי גם vimentin, כמו גם את fibroblasts בקצה של החור. Vimentin מבוטא על ידי מקרופאגים פעילים20. הנתונים אישר כי מקרופאגים THP-1 הם פונקציונליים.

Figure 1
איור 1: עיצובים מוטוריים- הגדרת הניסוי של רקמה אנושית 3D במקבילות של חניכיים (GTE) (A) ו- GTE דלקתיים (iGTE) (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: אפיון HaCaT keratinocytes. (א) שלב חדות התמונה מיקרוסקופי של תאים HaCaT בתרבות. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (B) במיקרוסקופ אלקטרוני של תאים HaCaT. (ג) Immunohistochemical מכתים של תאים HaCaT עבור תאים אפיתל חניכיים סמן K8/18. . ירוק, K8/18. . כחול, דאפי. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: אפיון של רקמה אנושית 3D במקבילות של חניכיים (GTE). (א) דוגמה GTE מוצלחת בתרבות. הרקמה הוא באמצע תותב תרבות. (B) דוגמה GTE שנכשלו: חלק GTE הופרדו הרקמה, העדפה על הקיר (חץ אדום). GTE פצועים (C): חץ צהוב מציין חור מנוקב על-ידי ניקוב רקמות. (ד) H & E כתמים GTE שהונדסו 19 ימים (14 ימים אוויר חשיפה). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר (E) SEM תמונת חתך אנכי של GTE שהונדסו 19 ימים. (F) שלב חדות התמונה המיקרוסקופית של דבורה שחר תאי הקולגן ג'ל שיצרו את פרופריה. מוסקולריס של GTE. סרגל קנה מידה = 25 SEM image מיקרומטר. (G) של סיבי קולגן מסיבית סביב דבורה שחר בתאים פרופריה. מוסקולריס של GTE. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: ביטוי של vimentin, טה-7 ל K19 ב GTE. Immunofluorescence כתמים GTE פרופריה. מוסקולריס סמנים vimentin (A ו- B), טה-7 (B) GTE, סמן האפידרמיס K19 GTE (C) ו iGTE (D). אדום, vimentin, K19. ירוק, טה-7. . כחול, דאפי. E, האפידרמיס; LP, פרופריה. מוסקולריס. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר (A, C ו- D), 20 מיקרומטר (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: אפיון של תאים THP-1- (א) מובחן THP-1 תאים בתרבות. סרגל קנה מידה = 15 מקרופאגים הבדיל THP-1 מיקרומטר. (B). סרגל קנה מידה = 15 THP-1 תאים מיקרומטר. (ג) היו בתוך ג'ל קולגן אופנוע בינוני ו שטופלו PMA עבור 24 ה סולם בר = 50 מיקרומטר. (D) נוגדן של מקרופאגים THP-1 עבור סמן macrophage CD68. . רד, CD68. . כחול, דאפי. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. (E) THP-1-קולגן תערובת בתוך החור הפצועים של HGE בתחילת הטיפול ובחום. סרגל קנה מידה = 25 מיקרומטר. (F) THP-1 תאים הבדיל לתוך מקרופאגים (חצים אדומים)-72 שעות לאחר הטיפול ובחום. סרגל קנה מידה = 25 מיקרומטר. (G) THP-1 תאי מקרופאג ביטוי סמן CD68. קו מקווקו צהוב מציין את האזור של החור הפצועים בבר H & סולם אי = 100 מיקרומטר. אדום, CD68. כחול, hoechst 33342. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: אפיון iGTE. אימונוהיסטוכימיה כל הר CD14 (ירוק), vimentin (אדום) בוצעה ב- iGTE. Z-סדרת תמונות (C) באמצעות iGTE (416 מיקרומטר בסך הכל. לוח 1 הוא החלק הראשון ש-LSM שנסרקו, לוח 25 האחרון. המרווח הוא כ 16.64 מיקרומטר בין מקטעים). נציג סעיף (א) (מס ' 17 של Z-סדרת תמונות), orthophoto, תמונה תלת-ממדית של Z-מחסנית (B) הציג ההתפלגות תלת-ממד של מקרופאגים CD14 - ו vimentin-חיוביות THP-1 בתוך החור להדמיית פצע iGTE. העמדה סריקה של LSM iGTE מסומן ב- (D) ו בפינה העליונה השמאלית (A). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. צהוב קווים מנוקדים מצביעים על האזור של החור הפצועים iGTE. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מבוסס על שיטות ליצירת רקמת חניכיים מקבילות ושווי רקמת שומן תת עורית מתוארת על ידי הקודם דוחות8,21,22. למרות זאת הוא שיטה פשוטה וקלה, כמה צעדים דורשים תשומת לב מיוחדת. לדוגמה, התערובת קולגן יש לשמור בקירור עד השימוש כדי למנוע היווצרות ג'ל בפתרון. בעת הוספת את התערובת קולגן לתוך תותב תרבות, ודא כי הפתרון הוזרק במרכז של התותב, כדי למנוע יצירת ג'ל מוטה (כמו איור 3B). גם לפריצת חור GTE לוקח מיומנות. ניקוב רקמות לפעמים לא יכול לאסוף את הרקמה אם הרקמה רטובים מדי. מערכת ביופסיה רקמות או זוג מלקחיים יהיה מועיל; עם זאת, הממדים של המיקום הפצועים הרבה תשתנה. אפשרי גם להשתמש מזרק עם מחט חדה כדי להזריק את התערובת תא-קולגן THP-1 ללא חורים חור (ודא הג'ל לא לסתום את המחט).

המגבלה של שיטה זו היא שזה לא ניתן לייצג באופן מושלם התופעה ביולוגיות מורכבות של דלקת חניכיים, חניכיים, כי iGTE חסרה כלי הדם, תאים עצביים ותאים חיסוניים אחרים, הדלקת נגרמת לא המארח-biofilm אינטראקציות. עם זאת, זה רק במבחנה דלקת חניכיים רקמות הדגם שנעשו על ידי תאים אנושיים המציג חלקית הפתולוגיה של דלקת חניכיים. המודל יכול להיות שונה כדי להיות דומה יותר אמיתי דלקת חניכיים ומחלות חניכיים על-ידי 1) שותף טיפוח GTE biofilm כדי ליצור אינטראקציות מארח-biofilm או מעורר תגובות דלקתיות של iGTE באמצעות תקליטונים (תרכובות של הממברנה החיצונית של חיידקים גראם שליליים, יוזם דלקתית חזקה כפי שהציע לנו בפרוטוקול), 2) הפתרון קולגן-דבורה שחר על השיניים שחולצו טופס חניכיים-שן מכלולי זריעה והתבוננות כיצד דלקת חניכיים משפיע על רקמות קשה ו- 3) באמצעות תאים אפיתל חניכיים אנושי כדי ליצור של האפידרמיס של GTE ו- iGTE.

עם השיטות המובאות כאן, תרבויות GTE iGTE יכול לשמש כלי רב-תכליתי ללמוד ריפוי הפצע, התחדשות רקמות, דלקת, תא-תא אינטראקציה, וכדי תרופות פוטנציאליות מסך עבור דלקת חניכיים ומחלות חניכיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים ללא ניגוד אינטרסים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמך בחלקה של החברה יפן לקבלת מענק הסיוע קידום המדע (JSPS) למחקר מדעי (26861689 ו- 17 K 11813). המחברים רוצה להודות מר נתנאל גרין לצורך הגהה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagen type I-A Nitta Gelatin Inc For making dermis of GTE
MEM-alpha Thermo Fisher Scientific 11900073 Cell culture medium
Cell Culture Insert (for 24-well plate), pore size 3.0 μm Corning, Inc. 353096 For tissue culture
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061 Cell culture reagent
DMEM Thermo Fisher Scientific 31600034 Cell culture medium
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828028 Cell culture reagent
Tissue puncher Shibata system service co., LTD SP-703 For punching holes in GTE
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific 31800022 Cell culture medium
BSA Sigma-Aldrich A3294 For immunostaining
Hoechst 33342 (NucBlue Live Cell stain) Thermo Fisher Scientific R37605 For labeling nuclei
Fluorescence mount medium Dako For mounting samples after immunostaining
Anti-Cytokeratin 8+18 antibody [5D3] abcam ab17139 For identifying epithelium
Scaning electron microscope Hitachi, Ltd. HITACHI S-4000 For observing samples' surface topography and composition
Confocal laser scanning microscopy LSM 700; Carl Zeiss Microscopy Co., Ltd. LSM 700 For observing samples' immunofluorescence staining
Anti-Cytokeratin 19 antibody abcam ab52625 For identifying epithelium
Anti-vimentin antibody abcam ab92547 For identifying fibroblasts and activated macrophages
Anti-TE-7 antibody Millipore CBL271 For identifying fibroblasts in the dermis
Anti-CD68 antibody Sigma-Aldrich SAB2700244 For identifying macrophages
Human CD14 Antibody R&D Systems MAB3832-SP For identifying macrophages
Alexa Fluor 594-conjugated secondary goat anti-rabbit antibody Thermo Fisher Scientific A11012 For immunofluorescence staining
Alexa Fluor 488-conjugated secondary goat anti-mouse antibody Thermo Fisher Scientific A11001 For immunofluorescence staining
EVOS FL Cell Imaging System Thermo Fisher Scientific For observing the sample's immunofluorescence staining
THP-1 cells Riken BRC cell bank RCB1189 For making iGTE
PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate) Sigma-Aldrich P8139 For differentiatting THP-1 cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cekici, A., Kantarci, A., Hasturk, H., Van Dyke, T. E. Inflammatory and immune pathways in the pathogenesis of periodontal disease. Periodontology 2000. 64 (1), 57-80 (2014).
  2. Hasturk, H., Kantarci, A., Van Dyke, T. E. Oral Inflammatory Diseases and Systemic Inflammation: Role of the Macrophage. Frontiers in Immunology. 3, 118 (2012).
  3. Koh, T. J., DiPietro, L. A. Inflammation and wound healing: The role of the macrophage. Expert reviews in molecular medicine. 13, e23 (2011).
  4. Mescher, A. L. Macrophages and fibroblasts during inflammation and tissue repair in models of organ regeneration. Regeneration. 4 (2), 39-53 (2017).
  5. Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental Animal Models in Periodontology: A Review. The Open Dentistry Journal. 4, 37-47 (2010).
  6. Han, Y. W., et al. Interactions between Periodontal Bacteria and Human Oral Epithelial Cells: Fusobacterium nucleatum Adheres to and Invades Epithelial Cells. Infection and Immunity. 68 (6), 3140-3146 (2000).
  7. Boukamp, P., Petrussevska, R. T., Breitkreutz, D., Hornung, J., Markham, A., Fusenig, N. E. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).
  8. Xiao, L., Miwa, N. Hydrogen-rich water achieves cytoprotection from oxidative stress injury in human gingival fibroblasts in culture or 3D-tissue equivalents, and wound-healing promotion, together with ROS-scavenging and relief from glutathione diminishment. Hum Cell. 30 (2), 72-87 (2017).
  9. Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
  10. Ara, T., Kurata, K., Hirai, K., Uchihashi, T., Uematsu, T., Imamura, Y., Furusawa, K., Kurihara, S., Wang, P. L. Human gingival fibroblasts are critical in sustaining inflammation in periodontal disease. J Periodontal Res. 44 (1), 21-27 (2009).
  11. Park, E. K., Jung, H. S., Yang, H. I., Yoo, M. C., Kim, C., Kim, K. S. Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli. Inflamm Res. 56 (1), 45-50 (2007).
  12. Sharif, O., Bolshakov, V. N., Raines, S., Newham, P., Perkins, N. D. Transcriptional profiling of the LPS induced NF-kappaB response in macrophages. BMC Immunol. 8, 1 (2007).
  13. Abcam. Whole mount fluorescent immunohistochemistry. , Available from: http://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/whole_mount_fluorescent_ihc.pdf (2017).
  14. Shetty, S., Gokul, S. Keratinization and its disorders. Oman Med J. 27 (5), 348-357 (2012).
  15. Klinge, B., Matsson, L., Attström, R. Histopathology of initial gingivitis in humans. A pilot study. J Clin Periodontol. 10 (4), 364-369 (1983).
  16. Nagarakanti, S., Ramya, S., Babu, P., Arun, K. V., Sudarsan, S. Differential expression of E-cadherin and cytokeratin 19 and net proliferative rate of gingival keratinocytes in oral epithelium in periodontal health and disease. J Periodontol. 78 (11), 2197-2202 (2007).
  17. Goodpaster, T., Legesse-Miller, A., Hameed, M. R., Aisner, S. C., Randolph-Habecker, J., Coller, H. A. An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. J Histochem Cytochem. 56 (4), 347-358 (2008).
  18. Langeland, K., Rodrigues, H., Dowden, W. Periodontal disease, bacteria, and pulpal histopathology. Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 37 (2), 257-270 (1974).
  19. Holness, C. L., Simmons, D. L. Molecular cloning of CD68, a human macrophage marker related to lysosomal glycoproteins. Blood. 81 (6), 1607-1613 (1993).
  20. Mor-Vaknin, N., Punturieri, A., Sitwala, K., Markovitz, D. M. Vimentin is secreted by activated macrophages. Nat Cell Biol. 5 (1), 59-63 (2003).
  21. Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. The effect of squalane-dissolved on adipogenesis-accompanied oxidative stress and macrophage in a preadipocyte-monocyte co-culture system. Biomaterials. 31 (23), 5976-5985 (2010).
  22. Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. Highly hydroxylated fullerene localizes at the cytoskeleton and inhibits oxidative stress in adipocytes and a subcutaneous adipose-tissue equivalent. Free Radic Biol Med. 51 (7), 1376-1389 (2011).

Tags

ביולוגיה התפתחותית בעיה 134 תלת מימדי חניכיים מקבילות fibroblasts חניכיים אנושי תאים HaCaT THP-1 תאים מקרופאגים הנדסת רקמות דגם רקמות דלקתיות דלקת חניכיים חניכיים ריפוי הפצע תרבות רקמות התחדשות
תלת מימדי רקמה אנושית דלקתיות במקבילות של חניכיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xiao, L., Okamura, H., Kumazawa, Y.… More

Xiao, L., Okamura, H., Kumazawa, Y. Three-dimensional Inflammatory Human Tissue Equivalents of Gingiva. J. Vis. Exp. (134), e57157, doi:10.3791/57157 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter