Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Tredimensionella inflammatoriska mänsklig vävnad motsvarigheter av Gingiva

doi: 10.3791/57157 Published: April 3, 2018

Summary

Syftet med protokollet är att bygga en inflammatorisk mänskliga gingiva modell in vitro. Denna vävnad modell odlar tillsammans tre typer av mänskliga celler, HaCaT keratinocyter, gingivala fibroblaster och THP-1 makrofager, tredimensionella villkor. Denna modell kan användas till att undersöka parodontala sjukdomar, såsom gingivit och parodontit.

Abstract

Parodontala sjukdomar (såsom gingivit och parodontit) är de främsta orsakerna till tandlossning hos vuxna. Inflammation i tandköttet är den grundläggande Fysiopatologi av parodontala sjukdomar. Aktuella experimentella modeller av parodontala sjukdomar har fastställts i olika typer av djur. Fysiopatologi av djurmodeller är dock olika från människor, vilket gör det svårt att analysera cellulära och molekylära mekanismer och utvärdera nya läkemedel för parodontala sjukdomar. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för att återuppbygga mänsklig inflammatorisk vävnad motsvarigheter av gingiva (iGTE) i vitro. Vi bygger först mänsklig vävnad motsvarigheter av gingiva (GTE) genom att använda två typer av mänskliga celler, inklusive mänskliga gingivala fibroblaster (HGF) och mänsklig hud epidermala keratinocyter (HaCaT), tredimensionell villkor. Vi skapar en såret modell med en vävnad hålslag för att stansa ett hål i GTE. Nästa, mänskliga THP-1 monocyter blandat med kollagen gel injiceras i hålet i GTE. Av adimistration av 10 ng/mL phorbol 12-isopropylmyristat 13-acetat (PMA) för 72 h, THP-1 celler differentieras efter makrofager att bilda inflammatoriska foci i GTE (iGTE) (IGTE kan också stumilated med 2 µg/mL lipopolysackarider (LPS) för 48 h att initiera inflammation ). IGTE är den första i vitro modellen av inflammatoriska gingiva med mänskliga celler med en tredimensionell arkitektur. IGTE speglar stora patologiska förändringar (immunceller activition, intracellulära interaktioner bland fibryoblasts, epitelceller, monocyter och makrofager) i parodontala sjukdomar. GTE, sårade GTE och iGTE kan användas som mångsidiga verktyg att studera sårläkning, vävnadsregenerering, inflammation, cell-cell interaktioner och skärmen potentiella läkemedel för parodontala sjukdomar.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Parodontala sjukdomar är den vanligaste orsaken till tandlossning hos vuxna. Gingivit och parodontit är de vanligaste parodontala sjukdomarna. Båda närvarande biofilm-medierad akuta eller kroniska inflammatoriska förändringar i tandköttet. Gingivit kännetecknas av akut inflammation, medan parodontit presenterar vanligtvis som kronisk inflammation. På histologisk nivå utlösa bakteriella komponenter aktivering av immunceller, såsom makrofager, lymfocyter, plasmaceller och mastceller1,2. Dessa immunceller, särskilt makrofager, interagera med lokala celler (inklusive gingival epitelceller, fibroblaster, endotelceller och osteoblaster) vilket resulterar i inflammatoriska lesioner i parodontal vävnad3,4. Experimentella modeller av parodontala sjukdomar har etablerats i olika typer av djur, som råttor, hamstrar, kaniner, illrar, hörntänder och primater. Fysiopatologi av djurmodeller är dock olika från människor, vilket gör det svårt att analysera cellulära och molekylära mekanismer och utvärdera nya läkemedel av parodontala sjukdomar5. Samtidig odling av parodontala bakterier och enskiktslager mänskliga muntliga epitelceller har använts för att undersöka mekanismen av periodontala infektioner6. Dock saknar enskiktslager kulturer av muntliga celler den tredimensionella (3D) cellulära arkitekturen intakt vävnad; de därför inte kan härma in vitro- situationen.

Här, inrättas 3D inflammatoriska mänsklig vävnad motsvarigheter av gingiva (iGTE) för att representera parodontala sjukdomar i vitro. Denna 3D-modell av parodontala sjukdomar intar ett mellanläge mellan enskiktslager cellodlingar och djurmodeller. Tre typer av mänskliga celler, inklusive HaCaT keratinocyter, gingivala fibroblaster och THP-1 makrofager, är samtidig odlas på kollagen gel, och stimuleras av inflammatoriska initiativtagarna att bygga iGTE. IGTE simulerar noga i vivo villkoren för celldifferentiering, cell-cell interaktioner och makrofag aktivering i tandköttet. Denna modell har många möjliga tillämpningar för drug screening och testa nya farmakologiska metoder i parodontala sjukdomar, samt för att analysera cellulära och molekylära mekanismer i läkning av sår, inflammation och vävnadsregeneration.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Detta protokoll syftar till att skapa mänskliga mjukvävnad medel, gingival såret modeller och gingivit modeller. Mänsklig hud epidermala keratinocyter (HaCaT) var vänligen tillhandahållen från Professor Norbert E. Fusenig av Deutsches Krebsforschungszentrum (Heidelberg, Tyskland)7. Humana gingivala fibroblaster (HGFs) isolerades från gingival vävnader enligt den tidigare publicerade protokoll8. Informerat samtycke erhölls i förväg, och studien var godkänd enligt de riktlinjer som fastställs av kommittén för etik, Nippon Dental University School av liv dentistryen på Tokyo (tillståndsnummer: NDU-T2012-35). Protokoll steg 1 – 3 ska utföras i en cell kultur huva.

1. beredning av 3D mänsklig vävnad motsvarigheter av Gingiva (GTE) (figur 1A)

  1. Blanda kollagen typ I-A gel med 10% koncentrerad MEM-alpha och 10% återuppbyggnad bufferten (2,2 g NaHCO3 och 4,47 g HEPES i 100 mL 0,05 N NaOH) i en 15 mL sterilt rör genom pipettering. Förvara blandad kollagen lösningen på is tills används.
  2. Placera 24-väl kultur skär (por storlek 3,0 µm) i en 24-bra platta.
  3. Ta bort HGFs från kultur ytan med 0,25% trypsin-EDTA lösning. Avbryta cellerna i 10 mL odlingsmedium A (MEM-alfa + 20% FBS + 1% GlutaMAX). Räkna cellerna genom en Bürker-Türk cell räknare.
    1. Extrahera önskad mängd celler (1-5 x105 celler/mL), sedan Centrifugera i 4 min på 190 x g.
    2. Stänga av cellerna i den blanda kollagen lösningen. Hålla blandningen på is tills nästa steg.
  4. Tillsätt 0,5 mL av cell-kollagen blandningen (0,5 – 2,5 x 105 celler per brunn) i kultur insatsen utan att producera några bubblor. Inkubera blandningen i 10 – 30 min i en fuktad atmosfär med 5% CO2 vid 37 ° C koagulerar blandningen till en gel.
    Obs: Lägg till kollagen blandningen in i centrera av kultur skäret att undvika ojämlika bildandet av kollagen gel.
  5. Tillsätt 1 mL odlingssubstrat in i brunnen och 0,5 mL i skäret. Inkubera kultur plattan för 24 h eller över natten i en fuktad atmosfär med 5% CO2 vid 37 ° C.
  6. Ta bort HaCaT celler från kultur ytan med 0,25% trypsin-EDTA lösning. Avbryta cellerna i 10 mL medium B (DMEM + 10% FBS + 1% GlutaMAX) och räkna cellerna. Extrakt behovskvantiteten av celler (1 – 5 x 105 celler/mL) med en pipett, Centrifugera under 4 minuter vid 190 x g. avbryta cellerna i medelstora B.
  7. Ta bort mediet från kultur skären, som innehåller HGF-kollagen blandningen av aspiration. Tillsätt 0,5 mL av HaCaT cellsuspension (0,5 – 2,5 x 105 celler per brunn) på toppen av HGF-kollagen blandningen. Inkubera kulturerna för 24 h eller över natten.
    Obs: Vid denna tidpunkt, medium i kulturen väl ska vara medellång A, medan medium i kultur infoga ska vara medellång B.
  8. Byta ut odlingssubstratet med KSR medium (samtidig odlingsmedium) (MEM-alfa + 15% KnockOut Serum ersätter + 1% GlutaMAX) + 5% FBS. Tillsätt 1 mL odlingssubstrat i kulturen väl och 0,5 mL i kultur skäret. Inkubera kulturerna för 24-48 h.
  9. Ersätta odlingssubstratet med KSR medium + 1% FBS. Tillsätt 1 mL in i kulturen väl och 0,5 mL i kultur skäret. Inkubera kulturerna för 24 h eller över natten.
  10. Ersätta odlingssubstratet i kulturen väl med 0,7 – 1 mL KSR medium. Ta bort mediet helt kultur Infoga (kultur ytan bör utsättas för luft). Inkubera kulturerna i 1 – 2 veckor. Ändra mediet i kulturen väl två gånger per vecka.
    Obs: Låt inte de medelstora stiga ovanför kultur (det översta lagret består av keratinocyter). Alltid hålla kultur ytan torr.

2. beredning av sårade GTE (figur 1B)

  1. Förbereda en 1 – 3 mm diameter vävnad hålslag. Sterilisera det med en autoklav vid 121 ° C i 20 min.
  2. Skjut den vävnad hålslag vinkelrätt i GTE om 300 µm djupa och slå ett hål i vävnaden att simulera ett sår.
  3. I detta steg, Använd den sårade GTE för att undersöka såret läka och vävnad förnyelse. Alternativt, fixa GTE använder 10% formalin neutrala buffertlösning för att utföra histologisk analys.

3. beredning av inflammatoriska GTE (iGTE) (figur 1B)

  1. Odla THP-1 celler enligt den tidigare rapport9.
  2. Blanda kollagen typ I-A gel med 10% koncentrerad RPMI 1640, 10% återuppbyggnad bufferten (2,2 g NaHCO3 och 4,47 g HEPES i 100 mL 0,05 N NaOH) och 10 ng/mL PMA. Förvara blandad kollagen lösningen på is fram till användning.
  3. Räkna 1 – 2 x 106 THP-1 celler och Centrifugera under 4 minuter vid 190 x g. upphäva cellerna i 1 mL av den blanda kollagen lösningen. Hålla blandningen på is tills nästa steg.
  4. Tillsätt 10 – 30 µL THP-1-kollagen blandning i området sårade i GTE. Byta ut odlingssubstratet till 0,7 – 1 mL KSR medium innehållande 10 ng/mL PMA.
  5. Inkubera blandningen i en fuktad atmosfär med 5% CO2 vid 37 ° C i 72 h.
  6. Använda modellen för att utreda tandköttsinflammation eller tandlossning (till exempel lägga till potentiella antiinflammatoriskt läkemedel till iGTE att se dess effekter på cytokin release10). Alternativt kan utelämna 72 h PMA-behandling, tillsätt 2 µg/mL av LPS in i kulturen och inkubera vävnaden i en fuktad atmosfär med 5% CO2 vid 37 ° C för 48 h11,12.

4. fixering och hela montera immunfärgning av GTE och iGTE kulturer

  1. Fixering av kulturer.
    1. Ta bort odlingssubstratet från 24-väl plattan. Tvätta vävnader 2 gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
    2. Tillsätt 1 mL 10% formalin neutrala buffertlösning till Infoga och 1 mL till kulturen väl. Lämna 24-väl plattan i kylskåp vid 4 ° C över natten.
    3. Ta bort 10% formalin neutrala buffertlösningen följande dag.
    4. För hela berget immunfärgning, tvätta vävnader 3 - 4 gånger med PBS efter fixering.
    5. Hematoxylin och eosin (H & E) färgning och regelbundna immunfärgning, Fortsätt med uttorkning, paraffin inbäddning och snittning.
      Obs: För hela berget immunfärgning, detta steg kan utelämnas.
  2. Hela berget immunfärgning
    Obs: Detta protokoll ändrades från den i referens 13.
    1. Tvätta vävnader 3 x i PBS 0,5 – 1% Triton, 10 – 30 min varje gång.
    2. Inkubera i vävnaderna två gånger i 30 min i blockerande buffert (PBS 1% Triton + 10% BSA), vid rumstemperatur.
    3. Tvätta den vävnader 2 × i blockerande buffert, 5 – 10 min varje gång.
    4. Tillsätt 50 µL primär antikropp lösning på önskad spädning/koncentration i skären. Använd en tunn plast plastfilm för att Linda skären för att undvika uttorkning vävnaden.
    5. Inkubera vävnaden i 1 till 2 dagar vid 4 ° C.
    6. Tvätta vävnader 3 gånger, för 30 min i PBS 1% Triton + 10% BSA. Tvätta igen 3 gånger, för 5 min i PBS 1% Triton.
    7. Tillsätt 50 µL av sekundär antikropp i blockerande buffert (PBS 1% Triton + 10% BSA) och 5 µL av Hoechst 33342 lösning (NucBlue Live Cell fläcken) till varje insats. Använd en tunn plast plastfilm för att Linda skären för att undvika uttorkning vävnaden.
    8. Inkubera i 1 till 2 dagar vid 4 ° C. Linda 24-väl plattan i en våt pappershandduk, och sedan sätta det i en plast förpackning för att användas i hela ruvningen.
    9. Tvätta vävnader 3 gånger, i 10 min i PBS 1% triton
    10. Använd en vass nål för att skära membranet i kultur skäret att erhålla vävnad. Placera membranet på ett objektglas.
      Obs: Vävnaden ska vara på membranet.
    11. Tillsätt 2-3 droppar av fluorescens mount medium. Täcka vävnaden med täckglaset och förvaras vid 4 ° C i mörker tills analys.
    12. Visa vävnader med en confocal microscopy (LSM) för laserscanning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

HaCaT celler visas typiska keratinocyter morfologi under faskontrast mikroskopisk observation (figur 2A). Skanner elektron mikroskopisk (SEM) bilder visade att HaCaT cellytan omfattades av många Mikrovilli. Intercellulära anslutningar mellan HaCaT celler var medieras av membran processer (figur 2B). HaCaT celler uttrycks gingival epitel markör K8/1814, vilket indikerar att HaCaT celler är lämplig för gingiva återuppbyggnad (figur 2 c).

Figur 3A visar ett framgångsrikt exempel på GTE och figur 3B visar ett misslyckade exempel på GTE. Misslyckade rättegången (figur 3B) orsakas av kollagen gel blandningen inte läggs i mitten av kultur skäret. Figur 3 c visade att en såret modell av GTE kan göras genom stansning hål i vävnaden med en vävnad hålslag. H & E-färgning (figur 3D) och SEM-bilder (figur 3E) visade att på 19 dagar för odling, ca 10 – 20 lager av HaCaT celler bildar epitel och kollagen gel-embedded HGF celler bildar lamina propria. HGF celler i lamina propria av den rekonstruerade GTE, uppvisade karakteristisk morfologi av fibroblaster (figur 3F) och var omgivna av väldefinierade matriser av kollagenfibrer (figur 3 g). Immunofluorescens färgning visade att vimentin och TE-7 (båda av dem är dermal fibroblast markörer15) uttrycks i lamina propria av GTE (figur 4A och 4B). K19, en specifik markör till Junktional och ficka epitel i parodontit16, är svagt uttryckt i epitelet i GTE (figur 4 c), och är starkt uttryckt i epitelet i iGTE (figur 4 d). Data föreslog att HaCaT celler kan differentieras till viktiga epitelceller i parodontit, särskilt efter inflammatorisk stimulering av lamina propria.

Gingival inflammationssjukdomar, såsom gingivit och parodontit, är histologiskt kännetecknas av förekomsten av lymfocyter och makrofager, och leda till fibros och vävnad nekros17,18. I detta protokoll användes THP-1 celler som de inflammatoriska cellerna för iGTE. Som visas i figur 5, utan PMA-stimulering, presenterade THP-1 celler en monocytic morfologi och de flesta av dem flöt på medellång (figur 5A). Däremot efter att utsättas för PMA 10 ng/mL för 72 h, mer än 50% av THP-1 celler differentieras efter makrofag-liknande celler och följs på kultur ytan (figur 5B). Liknar HaCaT och HGF celler8, THP-1 celler växte väl släpper kollagen gelen i samtidig odlingssubstratet (KSR medium), och differentieras efter makrofag-liknande celler efter PMA-behandling (figur 5 c). Immunfärgning visade att vidhäftat THP-1 cellerna uttryckt CD68 (en markör för makrofager19) (figur 5 d) och CD14 (en annan markör av makrofager) (figur 6). Bilda iGTE, var THP-1 monocyter inbäddade i kollagen gel och injiceras in i hålet som simulerar ett sår (bild 5E). På 72 h efter PMA (10 ng/mL)-stimulering, THP-1 celler differentieras efter makrofager (figur 5F) inuti hålet simulera ett sår och uttryckt CD68 (figur 5 g), som visar de kunna bilda inflammatoriska foci i den sårade GTE.

Hela berget immunohistokemi (figur 6) visade att THP-1 celler i hålet simulera ett sår inte bara uttryckte CD14 (en annan markör av makrofager), men också uttryckt vimentin samt fibroblaster i kanten av hålet. Vimentin uttrycks av aktiva makrofager20. Uppgifterna bekräftade att THP-1 makrofager är funktionella.

Figure 1
Figur 1: experimentell mönster. Experiment av 3D mänsklig vävnad motsvarigheter av gingiva (GTE) (A) och inflammatorisk GTE (iGTE) (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: karakterisering av HaCaT keratinocyter. (A) faskontrast mikroskopisk bild av HaCaT celler i kultur. Skalstapeln = 50 µm. (B) SEM-bild av HaCaT celler. (C) immunhistokemisk färgning av HaCaT celler för gingival epitelial cell markör K8/18. Green, K8/18. Blå, DAPI. Skalstapeln = 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: karakterisering av 3D mänsklig vävnad motsvarigheter av gingiva (GTE). (A) exempel på en framgångsrik GTE i kultur. Vävnaden är i mitten av kultur skäret. (B) exempel på en misslyckad GTE: delen av GTE är separerade från vävnaden och partisk mot väggen (röd pil). (C) sårade GTE: gul pil visar ett hål stansade av den vävnad hålslag. (D) H & E färgning av GTE odlas för 19 dagar (14 dagar flyg exponering). Skalstapeln = 50 µm. (E) SEM-bild av en vertikala sektionen av GTE odlas för 19 dagar. (F) fas-kontrast mikroskopiska bilden av HGF celler i kollagen gel som bildade lamina propria av GTE. Skalstapeln = 25 µm. (G) SEM-bild av massiva kollagenfibrer runt HGF celler i lamina propria av GTE. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: uttryck för vimentin, TE-7 och K19 i GTE. Immunofluorescens färgning av GTE för lamina propria markörer vimentin (A och B) och TE-7 (B) i GTE och epidermis markör K19 i GTE (C) och iGTE (D). Röd, vimentin och K19. Green, TE-7. Blå, DAPI. E, epidermis; LP, lamina propria. Skalstapeln = 50 µm (A, C och D), 20 µm (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: karakterisering av THP-1 celler. (A) odifferentierade THP-1 celler i kultur. Skalstapeln = 15 µm. (B) differentierade THP-1 makrofager. Skalstapeln = 15 µm (C) THP-1 celler var inbäddade i kollagen gel i KSR medium och behandlade med PMA för 24 h. skala bar = 50 µm. (D) immunhistokemisk färgning av THP-1 makrofager för makrofag markör CD68. Röd, CD68. Blå, DAPI. Skalstapeln = 5 µm. (E) THP-1-kollagen blandning i sårade hålet i HGE början av PMA behandling. Skalstapeln = 25 µm (F) THP-1 celler differentieras efter makrofager (röda pilar) på 72 h efter PMA behandling. Skalstapeln = 25 µm. (G) THP-1 celler uttryckt makrofag markör CD68. Gul streckad linje visar området av sårade hålet i H & E. skala bar = 100 µm. röd, CD68. Blå, hoechst 33342. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: karakterisering av iGTE. Hela berget immunhistokemi för CD14 (grön) och vimentin (röd) utfördes på iGTE. Z-serie bilder (C) fångas genom iGTE (416 µm totalt. Panel 1 är det första avsnittet LSM skannas och panelen 25 är sist. Intervallet är ca 16.64 µm mellan sektioner). Representativa avsnitt (A), (nr. 17 av Z-serie bilder), ortofoto och 3D-bilden av Z-stack (B) presenteras 3D fördelningen av CD14 - och vimentin-positiva THP-1 makrofager i hålet simulera ett sår i iGTE. LSM skanning position i iGTE indikeras i (D) och det vänstra övre hörnet i (A). Skalstapeln = 50 µm. gula streckade linjer visar området av sårade hålet i iGTE. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Detta protokoll baseras på metoder för att skapa mjukvävnad medel och subkutan fettvävnad medel beskrivs av tidigare rapporter8,21,22. Men detta är en enkel och lätt metod, kräver vissa steg särskild uppmärksamhet. Till exempel ska kollagen blandningen förvaras på is fram till användning för att undvika gel bildas i lösningen. När du lägger till kollagen blandningen in kultur skäret, kontrollera lösningen injicerades i mitten av insatsen att undvika bildar en partisk gel (som i figur 3B). Stansning hål i GTE tar också skicklighet. Den vävnad hålslag inte kan ibland plocka upp vävnaden om vävnaden är för blöt. En vävnad biopsi system eller ett par pincett skulle vara till hjälp; måtten på den skadade platsen kommer dock ändras mycket. Det är också möjligt att använda en spruta med vass nål för att injicera THP-1 cell-kollagen blandningen utan att stansa ett hål (kontrollera att gelen inte täpper nålen).

Begränsning av denna metod är att det inte går att representera komplexa biologiska fenomenen gingivit och parodontit, perfekt eftersom iGTE saknar blodkärl, neuronala celler och andra immunceller, och inflammationen orsakas inte av den värd-biofilm interaktioner. Det är dock endast in vitro- gingivit vävnad modellen av mänskliga celler som delvis presenterar inflammatoriska gingiva patologi. Modellen kan modifieras för att vara mer likt de riktiga gingivit och parodontit genom 1) Co odla GTE med biofilm att skapa värd-biofilm interaktioner eller stimulerande inflammatoriskt svar i iGTE med hjälp av LPS (föreningarna i yttermembranet hos Gramnegativa bakterier och en stark inflammatorisk initiativtagare som vi föreslog i protokollet), 2) sådd kollagen-HGF lösningen på extraherade tänder till formuläret gingiva-tand komplex och observera hur inflammation i tandköttet påverkar hårdvävnad och 3) med humana gingivala epitelceller att bilda epidermisen av GTE och iGTE.

Med de metoder som presenteras här, kan GTE och iGTE kulturer användas som mångsidiga verktyg att studera sårläkning, vävnadsregenerering, inflammation, cell-cell interaktioner, och skärmen potentiella läkemedel för gingivit och parodontit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar någon intressekonflikt.

Acknowledgments

Detta arbete stöds delvis av Japan Society för den befordran av vetenskap (JSPS) bidrag för vetenskaplig forskning (26861689-17 K 11813). Författarna vill tacka Mr Nathaniel Green för korrekturläsning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagen type I-A Nitta Gelatin Inc For making dermis of GTE
MEM-alpha Thermo Fisher Scientific 11900073 Cell culture medium
Cell Culture Insert (for 24-well plate), pore size 3.0 μm Corning, Inc. 353096 For tissue culture
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061 Cell culture reagent
DMEM Thermo Fisher Scientific 31600034 Cell culture medium
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828028 Cell culture reagent
Tissue puncher Shibata system service co., LTD SP-703 For punching holes in GTE
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific 31800022 Cell culture medium
BSA Sigma-Aldrich A3294 For immunostaining
Hoechst 33342 (NucBlue Live Cell stain) Thermo Fisher Scientific R37605 For labeling nuclei
Fluorescence mount medium Dako For mounting samples after immunostaining
Anti-Cytokeratin 8+18 antibody [5D3] abcam ab17139 For identifying epithelium
Scaning electron microscope Hitachi, Ltd. HITACHI S-4000 For observing samples' surface topography and composition
Confocal laser scanning microscopy LSM 700; Carl Zeiss Microscopy Co., Ltd. LSM 700 For observing samples' immunofluorescence staining
Anti-Cytokeratin 19 antibody abcam ab52625 For identifying epithelium
Anti-vimentin antibody abcam ab92547 For identifying fibroblasts and activated macrophages
Anti-TE-7 antibody Millipore CBL271 For identifying fibroblasts in the dermis
Anti-CD68 antibody Sigma-Aldrich SAB2700244 For identifying macrophages
Human CD14 Antibody R&D Systems MAB3832-SP For identifying macrophages
Alexa Fluor 594-conjugated secondary goat anti-rabbit antibody Thermo Fisher Scientific A11012 For immunofluorescence staining
Alexa Fluor 488-conjugated secondary goat anti-mouse antibody Thermo Fisher Scientific A11001 For immunofluorescence staining
EVOS FL Cell Imaging System Thermo Fisher Scientific For observing the sample's immunofluorescence staining
THP-1 cells Riken BRC cell bank RCB1189 For making iGTE
PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate) Sigma-Aldrich P8139 For differentiatting THP-1 cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cekici, A., Kantarci, A., Hasturk, H., Van Dyke, T. E. Inflammatory and immune pathways in the pathogenesis of periodontal disease. Periodontology 2000. 64, (1), 57-80 (2014).
  2. Hasturk, H., Kantarci, A., Van Dyke, T. E. Oral Inflammatory Diseases and Systemic Inflammation: Role of the Macrophage. Frontiers in Immunology. 3, 118 (2012).
  3. Koh, T. J., DiPietro, L. A. Inflammation and wound healing: The role of the macrophage. Expert reviews in molecular medicine. 13, e23 (2011).
  4. Mescher, A. L. Macrophages and fibroblasts during inflammation and tissue repair in models of organ regeneration. Regeneration. 4, (2), 39-53 (2017).
  5. Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental Animal Models in Periodontology: A Review. The Open Dentistry Journal. 4, 37-47 (2010).
  6. Han, Y. W., et al. Interactions between Periodontal Bacteria and Human Oral Epithelial Cells: Fusobacterium nucleatum Adheres to and Invades Epithelial Cells. Infection and Immunity. 68, (6), 3140-3146 (2000).
  7. Boukamp, P., Petrussevska, R. T., Breitkreutz, D., Hornung, J., Markham, A., Fusenig, N. E. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J Cell Biol. 106, (3), 761-771 (1988).
  8. Xiao, L., Miwa, N. Hydrogen-rich water achieves cytoprotection from oxidative stress injury in human gingival fibroblasts in culture or 3D-tissue equivalents, and wound-healing promotion, together with ROS-scavenging and relief from glutathione diminishment. Hum Cell. 30, (2), 72-87 (2017).
  9. Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26, (2), 171-176 (1980).
  10. Ara, T., Kurata, K., Hirai, K., Uchihashi, T., Uematsu, T., Imamura, Y., Furusawa, K., Kurihara, S., Wang, P. L. Human gingival fibroblasts are critical in sustaining inflammation in periodontal disease. J Periodontal Res. 44, (1), 21-27 (2009).
  11. Park, E. K., Jung, H. S., Yang, H. I., Yoo, M. C., Kim, C., Kim, K. S. Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli. Inflamm Res. 56, (1), 45-50 (2007).
  12. Sharif, O., Bolshakov, V. N., Raines, S., Newham, P., Perkins, N. D. Transcriptional profiling of the LPS induced NF-kappaB response in macrophages. BMC Immunol. 8, 1 (2007).
  13. Abcam. Whole mount fluorescent immunohistochemistry. Available from: http://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/whole_mount_fluorescent_ihc.pdf (2017).
  14. Shetty, S., Gokul, S. Keratinization and its disorders. Oman Med J. 27, (5), 348-357 (2012).
  15. Klinge, B., Matsson, L., Attström, R. Histopathology of initial gingivitis in humans. A pilot study. J Clin Periodontol. 10, (4), 364-369 (1983).
  16. Nagarakanti, S., Ramya, S., Babu, P., Arun, K. V., Sudarsan, S. Differential expression of E-cadherin and cytokeratin 19 and net proliferative rate of gingival keratinocytes in oral epithelium in periodontal health and disease. J Periodontol. 78, (11), 2197-2202 (2007).
  17. Goodpaster, T., Legesse-Miller, A., Hameed, M. R., Aisner, S. C., Randolph-Habecker, J., Coller, H. A. An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. J Histochem Cytochem. 56, (4), 347-358 (2008).
  18. Langeland, K., Rodrigues, H., Dowden, W. Periodontal disease, bacteria, and pulpal histopathology. Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 37, (2), 257-270 (1974).
  19. Holness, C. L., Simmons, D. L. Molecular cloning of CD68, a human macrophage marker related to lysosomal glycoproteins. Blood. 81, (6), 1607-1613 (1993).
  20. Mor-Vaknin, N., Punturieri, A., Sitwala, K., Markovitz, D. M. Vimentin is secreted by activated macrophages. Nat Cell Biol. 5, (1), 59-63 (2003).
  21. Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. The effect of squalane-dissolved on adipogenesis-accompanied oxidative stress and macrophage in a preadipocyte-monocyte co-culture system. Biomaterials. 31, (23), 5976-5985 (2010).
  22. Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. Highly hydroxylated fullerene localizes at the cytoskeleton and inhibits oxidative stress in adipocytes and a subcutaneous adipose-tissue equivalent. Free Radic Biol Med. 51, (7), 1376-1389 (2011).
Tredimensionella inflammatoriska mänsklig vävnad motsvarigheter av Gingiva
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xiao, L., Okamura, H., Kumazawa, Y. Three-dimensional Inflammatory Human Tissue Equivalents of Gingiva. J. Vis. Exp. (134), e57157, doi:10.3791/57157 (2018).More

Xiao, L., Okamura, H., Kumazawa, Y. Three-dimensional Inflammatory Human Tissue Equivalents of Gingiva. J. Vis. Exp. (134), e57157, doi:10.3791/57157 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter