Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

[كنفوكل] مجهرية يكشف خلية مستقبلات سطح التجميع عن طريق التحليل الطيفي ارتباط الصورة

Published: August 2, 2018 doi: 10.3791/57164
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 1,2,5,6,7
1Tumour Targeting Laboratory, Olivia Newton-John Cancer Research Institute, 2School of Cancer Medicine, La Trobe University, 3Centre for Micro-Photonics, Faculty of Science, Engineering and Technology, Swinburne University of Technology, 4LIMS Bioimaging Facility, La Trobe Institute for Molecular Science, La Trobe University, 5Department of Medical Oncology, Olivia Newton-John Cancer and Wellnes Centre, Austin Health, 6Department of Medicine, University of Melbourne, 7Department of Molecular Imaging and Therapy, Austin Health

Summary

يمكن أن تضفي الأجسام المضادة التي تربط لمستقبلات المستهدفة على سطح الخلية المطابقة والتجميع التعديلات. آثار هذه التغيرات الدينامية لوصف وضع المخدرات في الخلايا الهدف. يستخدم هذا البروتوكول [كنفوكل] مجهرية والتحليل الطيفي ارتباط الصورة عن طريق إيماجيج/فيجي تقدير مدى مستقبلات التكتل على سطح الخلية.

Abstract

[كنفوكل] الفحص المجهري يوفر بمنهجية موجوداً لالتقاط التفاعلات الخلوية دون الحرجة لتوصيف ومواصلة تطوير عوامل ما قبل السريرية المسمى مع تحقيقات الفلورسنت. مع التطورات الأخيرة في جسم القائمة على المخدرات السامة للخلايا يتم إيصالها، فهم التعديلات الناجمة عن هذه العوامل ضمن نطاق التجميع مستقبلات واستيعاب أهمية حاسمة. هذا البروتوكول روافع منهجية راسخة immunocytochemistry الفلورسنت وتوزيع فيجي مفتوحة المصدر إيماجيج، يحمل في ثناياه عوامل ترابط تلقائي والدوال الرياضية الصورة، لإجراء ارتباط الصورة المكانية التحليل الطيفي (ICS). هذا البروتوكول كوانتيتاتيس شدة الفلورسنت مستقبلات مسماة كدالة لمنطقة شعاع من المجهر [كنفوكل]. وهذا يوفر مقياس كمي للدولة المستهدفة جزيء التراكم على سطح الخلية. وتركز هذه المنهجية على توصيف الخلايا ثابتة مع إمكانات للتوسع في التحقيقات الزمانية لتجميع مستقبلات. ويقدم هذا البروتوكول بمنهجية موجوداً لتقديم التقدير الكمي لتجميع الأحداث التي تحدث على سطح الخلية، تستخدم أيضا إنشاء تقنيات وأجهزة التصوير غير المتخصصة.

Introduction

تطوير الأجسام المضادة العلاجية أظهرت نجاحا ملحوظا في علاج أنواع الأورام متعددة1. التطورات الأخيرة للمخدرات جسم يصرف (ADC) كما توسعت آليات التسليم للمركبات السامة للخلايا الاحتياجات اللازمة لفهم القوى المحركة للتفاعلات بين الأضداد: مستقبلات في الخلية السطحية2. في أعقاب نجاح استهداف جسم مضاد لمستقبلات سطح الخلية، يمكن حمل هذه المجمعات أنماط التجميع مشابهة لتلك التي لوحظت في التفاعلات يجند: جسم3. يمكن للتعديلات في تجميع مستقبلات حمل تغييرات في الغشاء والنتيجة في الاستيعاب المستقبلات وإزالتها من على سطح الخلية. في سياق المتقارن الأجسام المضادة-المخدرات، تطلق هذه العملية لاحقاً الحمولة السامة للخلايا في اندوسوميس المدخلة والسيتوبلازم، أسفر عن قتل الخلية فعالة في وقت لاحق.

[كنفوكل] مجهرية وفرت وسيلة فعالة لتصور هذه التفاعلات الهامة للأجسام المضادة و مستقبلات المستهدفة على4. لاستكشاف تغيرات التجميع للجزيء المستهدف في سطح الخلية يستخدم هذا البروتوكول بعد تجهيز الصور مجهرية [كنفوكل] عن طريق صورة مكانية ارتباط مطيافية (ICS) تقنية 5،6،7 .

أسس التحليل الطيفي ارتباط الصورة هو ملاحظة أن حصة fluorescence المكانية كثافة تقلبات علاقة للدولة وكثافة وتجميع هياكل المسمى. يتم تأسيس هذه العلاقة بعد حساب دالة ترابط تلقائي المكانية ل الصورة التي تم التقاطها5.

تتطلب كافة المتغيرات من صورة ارتباط مطيافية حساب ترابط تلقائي الصورة. ويعقب هذا تركيب هذه الدالة لمنحنى غاوسي ثنائي الأبعاد لاستخراج معلمات الدولة تجميع الكمية الموجودة داخل الصورة. بعبارات بسيطة تتضمن حساب ترابط تلقائي الصورة مقارنة جميع أزواج بكسل المحتملة الواردة داخل صورة وحساب احتمال أن كليهما نفس القدر مشرقة مثل بعضها البعض. وهذا هو تصور كدالة للمسافة والاتجاهات بكسل الفصل8.

أنشئ الإطار النظري للتحليل الطيفي ارتباط الصورة ويحددها بيترسن ووايزمان وآخرون. 5 , 6-في هذا البروتوكول، يتم تنفيذ العمليات الحسابية ترابط تلقائي في فيجي/إيماجيج، فضلا عن تطبيق جدول بيانات، وأساساً لشدة تقلب ترابط تلقائي المكانية الدالة يمكن وصفها بأنها (مكافئ 1):

Equation 1     

حيث يمثل و تحويل فورييه؛ تحويل فورييه العكسي و1 ؛ واو * بالمرافق المركب؛ والفارق المكاني متغيرات اليورو و η. في ICS المكانية، كما هو موضح في هذا البروتوكول، الدالة ترابط تلقائي يمكن حسابها باستخدام 2D سريعة فورييه تحويل خوارزمية7،9. ترابط تلقائي في صفر الفصل المكاني المعروف بصفر-متخلفة، ز11(0, 0)، يوفر معكوس يعني عدد الجسيمات الحالي كل منطقة شعاع من المجهر. ويمكن الحصول من تركيب دالة ترابط تلقائي المكانية لوظيفة غاوسي ثنائي الأبعاد (مكافئ 2):

Equation 3     

كما ترد بكسل القبض داخل صورة داخل منطقة محددة، وهذه القياسات لا تمتد إلى اللانهاية، g∞ مصطلح يستخدم كتعويض لمراعاة الارتباطات المكانية بعيدة المدى الواردة ضمن الصورة. للمجاميع الحجم الجزيئي، ω الدالة نقطة انتشار المجهر ووصف العرض الكامل في النصف-الحد الأقصى لوظيفة ترابط تلقائي المكانية. يمكن معايرة منطقة الواردة ضمن الدالة نقطة انتشار الصك عن طريق استخدام الخرز الفلورسنت القرار الفرعي.

بروتوكول التحليل الطيفي ارتباط الصورة الموضحة هنا، ترابط تلقائي والدوال الرياضية المطلوبة لإكمال ICS يتم تنفيذها باستخدام المصدر المفتوح منصة تجهيز التصوير، فيجي10، توزيع ImageJ البرنامج11،12. فيجي/إيماجيج يستخدم تحويل فورييه السريع المثبتة مسبقاً في وظيفة "الرياضيات الاتحاد الفرنسي للتنس". يقلل هذه الدالة لحساب الوقت المطلوب لهذا الحساب بتقليل نطاق البيانات بمعدل اثنين في كل البعد13. كما وظيفة ترابط تلقائي في 2D متماثلة تقريبا في x, y المحور، مؤامرة الشخصية سطر مفرد من خلال الصورة ترابط تلقائي يمكن استخدامها لقياس ترابط تلقائي الخام كدالة للتأخر المكاني. تتم إزالة أي ضوضاء متخلفة صفر قبل مواصلة الحساب، مع السعة الناتجة عن ترابط تلقائي (قيمة الذروة، ز(0)T) تصحيح للخلفية باستخدام التعبير (مكافئ 3):

Equation 4     

حيث أناب هو كثافة يعني من منطقة خلفية الخلية باستثناء. كثافة الكتلة، أو كثافة الأجسام الفلورسنت، ويحددها (مكافئ 4):

Equation 5    

في البروتوكول الموضحة هنا، نحن كذلك ببساطة حساب كثافة الكتلة (CD)، مع افتراض استناداً إلى الملاحظة التي سوف تسوس دالة ترابط تلقائي تم تسويتها بقيمة تقترب من 1.0 مع زيادة الفارق المكاني. مع الفارق المكاني كحد أقصى، يوجد ارتباط لم يعد أي من الأسفار قيم الكثافة وهكذا دون وجود ترابط العمليات الحسابية في هذه المنطقة هي الحوسبة قيمة كثافة مضروبة في هذه الكثافة التي تنقسم في وقت لاحق ساحة هذه الكثافة، التي تساوي 1.0 بالتعريف. وهكذا، يمكن حسابها كثافة الكتلة من دالة ترابط تلقائي تم تسويتها عن طريق طرح 1.0 من الدالة ترابط تلقائي تم تسويتها قبل أن تتخذ المعاملة بالمثل (مكافئ 5):

Equation 6     

يمكن إجراء المعايرة المزيد من منطقة شعاع كوانتيتاتي عدد المجموعات الواردة ضمن مجال الدالة نقطة توزيع للصك. هذه المعايرة يجب أن يتم استخدام نفس الشروط الضوئية المستخدمة أثناء التحليل الطيفي ارتباط الصورة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-بذر من خطوط الخلايا ملتصقة لتصوير التجربة

  1. البذور 10,000 خلايا سرطان شرانيه A431 الواحدة وكذلك بين عشية وضحاها (O/N) في 300 ميليلتر دولبيكو لتعديل النسر المتوسطة/المغذيات "خليط" F-12 (دميم/و-12) الوسائط التي تحتوي على 10% "مصل بقرى الجنين"، 1% البنسلين والستربتوميسين و 1% جلوتاماكس في 8 غرف التصوير الشريحة مناسبة للعدسات الهدف الغمر النفط عالية الدقة (في غرفمثل مختبر نونكتم-تيكتم كوفيرجلاس).
  2. تحفيز مستقبلات التجميع على خلايا A431 مع إضافة 100 نانوغرام/مليلتر لو يجند في وسائل الإعلام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).

2. جسم مضاد الابتدائي الحضانة

  1. قم بإزالة الوسائط وغسل الخلايا مع 300 ميليلتر من درجة حرارة الغرفة (RT) الفوسفات مخزنة المالحة (1 x PBS) مرتين.
  2. إصلاح الخلايا مع 200 ميليلتر من بارافورمالدهيد 4% في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق في الرايت
    ملاحظة: لاستكشاف التغيرات الزمنية لتجميع الهدف، يجب حذف هذه الخطوة التثبيت.
  3. إزالة منهاج عمل بيجين وغسل الخلايا مع 300 ميليلتر من درجة حرارة الغرفة برنامج تلفزيوني مرتين.
  4. احتضان الخلايا مع 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على جسم الأولية بتركيز 10 ميكروغرام/مل على الأقل 2 ح في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: لحسابات المركز لتكون صالحة، يجب تمييز جميع المستقبلات حاضرا في سطح الخلية بجسم الأولية. وهذا يتطلب تجارب أولية مع سلسلة تمييع لكل جسم الأولية (01:10، 01:50, 1: 100, 1: 200, 1: 500 1:1، 000، إلخ) التي يتعين القيام بها. يتم تحديد تركيز الأجسام المضادة الأساسي الأمثل من خلال تحليل كثافة fluorescence مقابل كثافة الكتلة. التركيز الأساسي المحدد عند هضاب كثافة الكتلة مع زيادة تركيزات جسم الأساسي قبل زيادة في كثافة الكتلة نتيجة لربط جسم غير محدد. يمكن أن تضعف جسم الأولية في وسائل الإعلام الحرة المصل إذا كان أداء تجربة تصوير الوقت بالطبع.
  5. بعد انتهاء الوقت المطلوب من الحضانة، غسل الخلايا مع 300 ميليلتر من برنامج تلفزيوني RT مرتين.
  6. كتلة العينة مع 5% البقري ألبومين المصل (BSA) في برنامج تلفزيوني على الأقل 2 ح في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يتم حظر عينات ثابتة بشكل روتيني بين عشية وضحاها (O/N) في 4 درجات مئوية.

3-الثانوية جسم الحضانة

  1. إعداد مخزون ميكروغرام/مل 10 المسمى فلوريسسينتلي جسم الثانوية (مثل أليكسا فلور مفتش 488) في برنامج تلفزيوني. قد يتم تضمين 2 ميكروغرام/مل من هويشت 33342 في تمييع هذا للسماح لاكتشاف نماذج محسنة في المجهر.
    ملاحظة: لإجراء التجارب على مرور الزمن، يمكن تبادل برنامج تلفزيوني للإعلام الحر في المصل.
  2. إزالة 5% جيش صرب البوسنة/برنامج تلفزيوني من الخلايا واحتضان مع الحل جسم الثانوية ح 2 في 4 درجات مئوية، مع حماية العينات من الإضاءة المحيطة.
  3. عند انتهاء الوقت حضانة جسم الثانوية، تغسل الخلايا مع 300 ميليلتر من برنامج تلفزيوني (مرتين) وتخزينها في 4 درجات مئوية، حماية من الضوء المحيط.
  4. لمنع التبخر، التفاف حواف الشريحة الدائرة مع بارافيلم.

4-[كنفوكل] الفحص المجهري لعينات

ملاحظة: سوف تختلف الإعدادات المستخدمة لتحليل [كنفوكل] بالمعدات وفلوروفوريس التي استخدمت في التجربة الفردية. وتوفر الصكوك الحديثة [كنفوكل] آليات لحفظ كافة المعلمات التصوير التي استخدمت في التجربة في تنسيق ملف الصورة الأصلية للصك. من المهم أن تسجل هذه الإعدادات لتوفير النسخ المتماثل المناسبة للظروف التجريبية عبر فترات مختلفة للحصول على البيانات.

  1. أثناء تصوير إشارات مضيئة، تجنب التشبع المفرط. استخدام نظرة صورة أعلى الجدول الذي يوفر تمثيل ألوان زائفة للتشبع بكسل والحد من مكاسب كاشف والليزر السلطة تبعاً لذلك. تشمل معظم الصكوك [كنفوكل] إعداد "نطاق مؤشر" أو خيار مشابه في اقتناء البرمجيات لهذا.
  2. التقليل من تعرض فلوروفوري ذات الصلة بالطاقة بالليزر. ويوفر استخدام وصمة عار وسم الحمض النووي مثل هويشت 33342 إليه سهلة لكشف وموقف العينة في مجال الرؤية أمام جمع.
  3. القيام بمسح أولى للعينة بدقة منخفضة، وإذا كان برنامج يسمح بسرعة سرعة المسح الضوئي. وسيحد هذا فوتوبليتشينج الممكنة للعينة.
  4. زيادة دقة الالتقاط وبطء سرعة المسح الضوئي عندما تكون جاهزاً لجمع بيانات الصورة.
  5. إذا كان يسمح بأن الصك [كنفوكل]، جمع البيانات باستخدام فوتون عد الوضع.
    ملاحظة: إذا كان العد فوتون غير متوفر في الصك: ضمان مستويات الرمادي خطية أثناء الحصول على الصور.
  6. تعيين الثقب لكل خط الليزر المستخدمة في وحدة مهواة 1 (الاتحاد الأفريقي).
  7. استخدام خط أو الإطار المتوسط أثناء الحصول على الصور (x4) لتقليل كاشف المرتبطة الضوضاء.
    ملاحظة: في هذا الخيار للمركز كما يتم التقاطها نقطة مرة واحدة فقط شراء الوقت ليس التجريبية الحد من العوامل.
  8. صورة جمع حدد تكبير عالية، الهدف الفتحة العددية عالية، مثل هدف خطة أبوتشرومات، لتوفير الحد الأقصى من القرار وتصحيح الانحرافات الكروية ولوني (أمثلة تتضمن الخطة--أبوتشرومات 100 X أو 63 X/1.40 أهداف النفط).
  9. أوفيرسامبلي حجم بكسل القبض الواردة ضمن الصورة. ويوصي كل بكسل التقاط منطقة شمال البحر الأبيض المتوسط 50 × 50. ل ICS فعالة، يجب أن يكون حجم بكسل أقل من 0.1 × 0.1 ميكرومتر2 لكل بكسل. ويتحقق ذلك بالجمع بين التكبير لمسح منطقة صغيرة نسبيا وتحديد تنسيق صورة كبيرة نسبيا (مثل 1024 × 1024 أو 2048 × 2048 بكسل).
  10. وتركز على السطح قمي أو القاعدية للخلية في منطقة مسطحة قدر الإمكان. ويمكن جمع خلايا متعددة في صورة واحدة والمناطق ذات الاهتمام التي تتم معالجتها على حدة أثناء تحليل ICS.
  11. التقاط منطقة مجاناً خلفية خلية استخدام نفس إعدادات الأداة التي ستستخدم لتطبيع عينة.

5-حساب صورة ارتباط مطيافية

ملاحظة: المصدر المفتوح منصة تجهيز التصوير، فيجي، توزيع البرنامج إيماجيج، مطلوب لتنفيذ ترابط تلقائي والدوال الرياضية الأساسية للمركز. ويوصي هذا التوزيع من إيماجيج كما أنها تتضمن المكونات المثبتة مسبقاً العديدة وبنية تحديث أسهل التي يمكن تنفيذ عمليات عبر عدة تجارب التصوير.

  1. قم بتثبيت البرنامج فيجي (http://fiji.sc/Downloads).
  2. تحميل مجموعات البيانات المكتسبة.
  3. تحديد المنطقة السطحية غشاء قمي أو الخلايا القاعدية للفائدة ومكررة إلى حجم بكسل من 2ن (64 × 64، 128 × 128 أو 256 × 256). "القائمة: الصورة > المكررة..."
  4. حساب متوسط كثافة المساحة المحصودة من الفائدة "القائمة: تحليل > القياسات."
  5. تحديد منطقة خلفية وتكرار لنفس حجم بكسل للقبض على خلية الغشاء السطحي (2ن: 256 × 256، 128 × 128، 64 × 64). "القائمة: الصورة > المكررة..."
  6. حساب متوسط كثافة الخلفية اقتصاص مجال الاهتمام. "القائمة: تحليل > القياسات."
  7. قم بطرح متوسط كثافة الخلفية من الصورة التي تحتوي على المنطقة للفائدة. "عملية > صورة آلة حاسبة > استقطاع."
  8. تنفيذ حساب ترابط تلقائي. ويرد هذا الحساب داخل "بنية القائمة": "عملية > فت > فد الرياضيات."
    1. في الرياضيات فد حدد مربع الحوار: 1 صورة: اسم "الصورة اقتصاص"، العملية كارتباط، 2 صورة: اسم "اقتصاص الصورة"، والتحويل العكسي على.
  9. تطبيع الصورة الناتجة بقسمة مجموع عدد البكسل. "القائمة: عملية > الرياضيات > تقسيم..." (أي: 64 × 64 بكسل = 4096)
  10. تطبيع مرة أخرى بقسمة متوسط كثافة تطبيع اقتصاص منطقة المربعة. "القائمة: عملية > الرياضيات > تقسيم..."
    ملاحظة: يمكن أن يتحقق هذا بتقسيم الصورة بقيمة متوسط كثافة مرتين.
  11. رسم خط من خلال دالة نقطة نشر.
  12. ارسم ملامح هذا الخط لحساب قيمة الذروة. "القائمة: تحليل > ارسم الشخصية."
  13. حساب المجموعات كل منطقة شعاع بنقل قيمة الذروة (نتيجة 5.12) إلى جدول بيانات وإجراء العملية الحسابية التالية (6 مكافئ):
    Equation 7

6-معالجة مجموعات البيانات ICS الدفعية

ملاحظة: من المستحسن إنشاء ماكرو فيجي/إيماجيج للنسخ المتماثل الإجراءات المبينة في هذا البروتوكول. وهذا يسمح لتحليل ملفات صور متعددة تتفق والسريع أثناء التحليل الطيفي ارتباط الصورة.

  1. إنشاء سير عمل ICS ماكرو بتسجيل كل أمر القائمة في بروتوكول ICS
    "القائمة: الإضافات > وحدات الماكرو > سجل...".
  2. حدد "إنشاء" لإنشاء ماكرو.
  3. حدد "اللغة > ماكرو IJ1."
  4. حفظ الماكرو.
  5. إضافة مربعات الحوار لمختلف الخطوات الماكرو، توفير التذكيرات للمشغلين لكل وظيفة. مربعات الحوار أيضا بمثابة وسيلة لإيقاف عملية تحليل للسماح للتحديدات الملائمة تتم قبل مواصلة تجهيزها (أي منطقة المحاصيل)
    1. تعليمات برمجية لماكرو مربع الحوار
      عنوان = "عنوان مربع الحوار"؛
      msg = "الحوار مربع/البروتوكول خطوة رسالة"؛
      ويتفوروسير (العنوان، msg)؛
      ملاحظة: يمكن إنشاء كفاءات إضافية عن طريق الاشتراك في موقع تحديث شريط داخل "فيجي المحدث" (تعليمات https://imagej.net/BAR). وهذا يوفر فيجي مع 14من "مجموعة من الإجراءات المطبقة على نطاق واسع". واحد مثل هذا الروتين هو البحث عن قمم. بنية القائمة: "بار > تحليل البيانات > البحث عن قمم." هذا البرنامج النصي يوفر وسيلة سريعة لحساب قيمة الذروة في التشكيل الجانبي للنقطة نشر الدالة.

7-بروتوكول ملحقات: حساب منطقة شعاع من المجهر

ملاحظة: وظيفة نقل البصرية المجهر يضمن أن تظهر الكائنات حتى الحجم الجزيئي كصور مع دائرة نصف قطرها حوالي 200-300 نانومتر في طائرة س-ص. يسمح بروتوكول ICS تحديد وظيفة نقطة الانتشار قبل تنفيذ الخطوات 4-5 في القرار الفرعي الخرز الفلورسنت. على وجه التحديد:

  1. جبل القرار الفرعي (أي < 100 نانومتر القطر) الخرز الفلورسنت على 8 غرفة التصوير الشريحة.
  2. صورة الخرز وفقا لبروتوكول وصف استخدام مجهر [كنفوكل] تستخدم في تجارب ICS.
  3. حساب الدالة ICS من الصورة الناتجة وفقا للبروتوكول خطوات 5.1 5.13.
  4. من الشخصية المرسومة، حساب شعاع دائرة نصف قطرها (r) كعرض كامل في نصف الحد الأقصى لقيمة الدالة ICS.
  5. حساب مساحة شعاع (BA) (مكافئ 7):Equation 8

8-بروتوكول ملحقات: حساب المجموعات لكل وحدة منطقة

  1. حساب كثافة الكتلة (CD) لكل وحدة منطقة ك (مكافئ 8):
    Equation 9
    Equation 10
  2. تقسيم المجموعات كل منطقة شعاع (نتيجة 5.13) بمنطقة الشعاع (نتيجة 7.5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تجربة التحليل الطيفي ارتباط صورة ناجحة فيعتمد على التطبيق السليم لعناصر العلاج. تتضمن هذه المجموعات المعاملة دراسة الأسفار في لا جسم الأولية وأية مجموعات علاج جسم الثانوية. حالما يتم إنشاء الإعدادات المثلى الليزر [كنفوكل] لتجربة، يجب التقاط الصور هذه المجموعات المراقبة للتأكد من عدم وجود الأسفار غير محددة ضمن العينة. للعديد من خطوط الخلايا السرطان ملتصقة، يحد الافتقار إلى الأسطح المسطحة تحديد مناطق مناسبة ل ICS. وهذا يعوض بالقدرة على التقاط مجال رؤية كبير لخلايا السرطان متعددة في صورة واحدة [كنفوكل]. وهذا يوفر القدرة على توليد العينات المطلوبة لإجراء مقارنات إحصائية بين مجموعات العلاج.

في هذه التجربة التمثيلية، حفز خلايا سرطان شرانيه الإيجابية A431 EGFR، مع 100ng/mL ليجند مماثلة لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لحمل EGFR التكتل. وأجرى التحليل ICS على كلا لو unstimulated الخلايا (الشكل 1) بعد الحضانة مع EGFR استهداف أنسنة [مونوكلونل] جسم, سيتوكسيماب وحفز (الشكل 1A). في وقت لاحق، محصول 64 × 64 بكسل من منطقة (المربع الأصفر) الواردة ضمن غشاء الخلية (الشكل 1B و 1E) تمت معالجة استخدام الدالة ترابط تلقائي يرد في منصة مفتوحة المصدر تجهيز الصور، وفيجي. وكان تطبيع هذه الصورة الناتجة عن ترابط تلقائي عن طريق طرح fluorescence الخلفية قبل قسمة كل مربع متوسط كثافة منطقة طبيعية للفائدة، فضلا عن ساحة عدد وحدات البكسل في المنطقة المزروعة ( الشكل 1 و 1F). واستخدمت أداة الدالة خط الرسم في ملف التعريف للدالة نقطة انتشار هذه الصورة (الشكل 1 وح 1). كانت تنقل قيمة الذروة من ملفات التعريف هذه إلى تطبيق جدول بيانات لمواصلة تجهيز البيانات. تم إنشاء ماكرو فيجي تكرار هذه الخطوات تجهيز فيجي للتجهيز السريع لمجموعة من الخلايا (n = 6) من كلا الفريقين العلاج عقب سيتوكسيماب immunocytochemistry (1I الشكل). في هذه التجربة، تم تحديد مستقبلات EGFR في مجموعات ± 0.85 5.84 كل منطقة شعاع على سطح A431 مجموعات خلايا حفز مقابل 14.94 ± 1.62 كل منطقة شعاع في السكان الخلايا أونستيمولاتيد. مع افتراض أن الظروف التجريبية المستخدمة في هذا التحليل حد مستقبلات سرعة دوران، انخفضت كثافة الكتلة EGFR في حفز A431 الخلايا 2.56-fold. عند مقارنة الظروف للدولة تجميع جزيء الهدف نفسه في ظروف عندما يكون الهدف جزيء بدوره على مدى محدود، يشير إلى عدد أقل من المجموعات كل منطقة شعاع الهدف زيادة التراكم. بعد تجميع EGFR التحفيز يجند لو يزيد 2.56-fold كما هو متوقع في هذا النظام. إنشاء ماكرو فيجي باستخدام الخطوات المذكورة في هذا البروتوكول يسمح للمقارنة الإحصائية من العلاجات المتنوعة أو الاختلافات البيئية وآثارها على تجميع مستقبلات.

Figure 1
رقم 1: صورة ارتباط التحليل الطيفي للكشف عن فلوريسسينتلي المسمى مجموعات على سطح الخلية من الخلايا السرطانية ملتصقة. صورة مجهرية [كنفوكل] للممثل لو حفز (أ) أو (د) A431 ملتصقة unstimulated شرانيه سرطان الخلايا المسماة بجسم الابتدائي سيتوكسيماب استهداف مستقبلات EGFR سطح الخلية مع أليكس فلور 488 الثانوية الأجسام المضادة. حفز الخلايا تعامل مع 100 نانوغرام/مليلتر مماثلة لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لحمل EGFR التكتل قبل التثبيت وإيمونوسيتوتشيميستري. واستخدمت غشاء الخلية التي تحتوي على مناطق المحاصيل (المربع الأصفر) مع أبعاد البيكسل (64 × 64 [2ن]) لإجراء تحليل ICS (باء و هاء). في أعقاب تطبيع وظيفة ترابط تلقائي في فيجي/إيماجيج، استخدمت أداة سطر (أصفر) لقياس دالة انتشار النقطة (C و F) التشكيل الجانبي لهذه الدالة خط يتم رسمه للكشف عن قيمة الذروة (ز و ح ). ولوحظ تحفيز مماثلة للحث على انخفاض 2.56-fold في الكشف عن مجموعات EGFR كل شعاع منطقة 5.84 ±0.85 5±1.62 14.9 للخلايا أونستيمولاتيد بالمقارنة مع (n = 6) (ط). مع الافتراض، الظروف التجريبية المستخدمة في هذا التحليل الإبقاء على عدد ثابت من مستقبلات غشاء الخلية، وهذا يمثل زيادة في تجميع EGFR بعد التحفيز لو. أشرطة مقياس = 10 ميكرون (ألف ودال)؛ 1 ميكرومتر (ب-ج وه-و). ارسم مربع عرض باستخدام نمط توكي مع شعيرات تمثل الحد الأقصى والحد الأدنى ولاحظ نطاق المجال لا تزيد عن 1.5 × القيم (IQR). مجموعات كل شعاع منطقة ± الخطأ القياسي لتعنى (SEM). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يستخدم الأسلوب المتمثل في صورة ارتباط مطيافية (ICS) الذي يصف لنا في هذا البروتوكول القياسي مجاهر [كنفوكل] دون الحاجة إلى أجهزة متخصصة لكشف. تستخدم تقنية ICS وصف أساليب immunocytochemistry الراسخة لتوفير لأخذ العينات السريع لشروط المعاملة متعددة لزيادة التحليل الإحصائي. هذه المنهجية لا ذلك مع انخفاض طفيف في الدقة المطلقة مقارنة بتقنيات بديلة جزيء واحد استناداً إلى العلاقة بين تقلبات الأسفار من الجزيئات المحمولة نشرها من خلال وحدة تخزين [كنفوكل]، مثل الأسفار علاقة التحليل الطيفي (FCS)15. كما يتطلب نهج FCS أكثر تخصصا فوتون حساسية عالية عد كشف مثل انهيار جليدي الضوئي (APD) أو كشف جاسب جنبا إلى جنب مع البرمجيات المتخصصة مخصصة غير متوفرة بشكل روتيني على الصكوك [كنفوكل] القياسية. إجراء تحليل شامل لدقة ICS تحديد هذا الأسلوب يمكن قياس دقة عدد الكتل حيث > الجسيمات 1 موجود ضمن بقعة تركيز شعاع الليزر مسح المجهر7.

المجموعة من الصور الفلورسنت المناسب ذا أهمية حاسمة لإجراء تحليل ICS ناجحة. يجب أن تحتوي على إشارة عالية لنسبة الفلورسنت الخلفية مع الليزر منطقة الاهتمام واكتساب كثافة تعديلها لإزالة أي إشارة التشبع. يجب أن يكون ثقيلاً المنطقة الخلوية القبض على مع حجم بكسل لما يقرب من 50 نانومتر. يجب أن تكون هذه المنطقة متجانسة، مع الحرص على الاهتمام سيولي لتجنب الحواف الخلوية أو الوصلات التي يمكن أن تزيد من التحف في حساب ترابط تلقائي. من المزالق الرئيسية للنهج ICS، الحساسية للسطوح الخلوية غير متجانسة. وبالتالي، تحد منطقة استولت على سطح مسطح كحد أقصى، بغض النظر عن شكل خلية سيتم تحسين دقة أي تحليل ICS.

وقد تم استكشاف طرائق التصوير متعددة لدراسة تجميع مجمعات مستقبلات. المجهر الإلكتروني (م) يوفر التقييم المكاني عالية الاستبانة لتجميع البروتين ولكن تعمل في ظل فراغ عالية للغاية ولا ينطبق على الدراسات التي تتطلب الأزمنة. م زيادة محدودة كما إعداد نموذج قاسية باهظة بالنسبة للمعيشة الأنسجة التحقيقات5. للتغلب على القيود الملازمة للقرار مجهرية [كنفوكل] القياسية، نقل الطاقة الرنين فورستر (الحنق) يمكن استخدامها لحساب المنظمة المكانية هياكل المسمى مع تداخل الجهات المانحة ويقبلون أزواج فلوروفوريس16 . على الرغم من حساسيتها، لا توفر الحنق إلا المعلومات المتعلقة بالحجم المجاميع تحت التحقيق6. تطوير أساليب الفحص المجهري fluorescence سوبر القرار المختلفة فرصاً مثيرة لحل الكائنات الخلوية غير ممكن مع الدقة القياسية أساليب [كنفوكل]17،18. المصروفات والخبرة اللازمة لمثل هذه التكنولوجيات والأدوات، يحد من توافرها الحالية أمرا شائعا.

مع زيادات في حساسية وصور-سمية منخفضة في الأجهزة [كنفوكل]، يمكن توسيع صورة ارتباط التحليل الطيفي لاستكشاف التغيرات الزمنية لتجميع المستقبلات في الخلايا الحية في الوقت الفاصل بين التجارب. وهذا يمكن أن تكون جنبا إلى جنب مع زيادة الطاقة الليزر المستخدمة لحمل عمدا تبييض الصورة العينات الفردية مع ICS التقييم اللاحق (ببيكس) ندف أربا بتجميع أعلى ترتيب هذا في بعض المجمعات مستقبلات9. تكييف مزيد، الصورة عبر ارتباط مطيافية (التنسيق) يقدم تحليلاً للتعريب المشارك من البروتينات الغشاء على أساس اثنين من خلال تحليل أزواج الصورة لكل البروتين المسمى فلوريسسينتلي19. قوام هذه المنهجية التحليل الطيفي ارتباط الصورة هو أنها روافع راسخة في المجال التقنيات ويوفر خط أنابيب تحليل متاحة بحرية لكمية أحداث ديناميكية للغاية التي تحدث في غشاء الخلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

أندرو سكوت م بدعم تمويلي من المستحضرات الصيدلانية أبفيي، EMD Serono وشركة دايتشي سانكيو للبحث، والاستشارات وملكية الأسهم "المستحضرات الصيدلانية في علوم الحياة". الكتاب لا تحتوي الأخرى الانتماءات ذات الصلة أو مشاركة مالية مع أي منظمة أو كيان بمصلحة مالية في أو الصراع المالي مع الموضوع أو المواد التي نوقشت في هذه المخطوطة وبصرف النظر عن تلك التي كشفت عن.

Acknowledgments

الكتاب الاعتراف بدعم تمويلي من NHMRC (1084178 الزمالات والمنح 1087850، 1030469، 1075898 (هيئة علماء المسلمين))، أستراليا السرطان، لودفيج لأبحاث السرطان، تي جون ريد تثق، مؤسسة سرطان الدماغ علاج، جامعة لوس أنجليس تروب ووكالة السرطان في فيكتوريا. تمويل من "برنامج دعم البنية التحتية التشغيلية" المقدمة من "حكومة ولاية فيكتوريا"، أستراليا من المعترف به أيضا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass - 8 well ThermoFisher Scientific 155409
DPBS, no calcium, no magnesium ThermoFisher Scientific 14190144
Fetal Bovine Serum ThermoFisher Scientific 10099141
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red ThermoFisher Scientific 12604021
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15140122
GlutaMAX Supplement ThermoFisher Scientific 35050061
Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A11013
TetraSpeck Fluorescent Microsphere Standards 0.1µm ThermoFisher Scientific T7279
Cetuximab Merck Serono 3023715501
Parafilm M 38mx100mm Merck Millipore BRND701605
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution ProSciTech C004
Recombinant Human EGF R&D System 236-EG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scott, A. M., Wolchok, J. D., Old, L. J. Antibody therapy of cancer. Nature reviews. Cancer. 12 (4), 278-287 (2012).
  2. Parslow, A. C., Parakh, S., Lee, F. -T., Gan, H., Scott, A. Antibody-Drug Conjugates for Cancer Therapy. Biomedicines. 4 (3), 14 (2016).
  3. Sorkin, A., Waters, C. M. Endocytosis of growth factor receptors. BioEssays. 15 (6), 375-382 (1993).
  4. Pawley, J. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , Springer Science & Business Media. (2006).
  5. Petersen, N. O., Höddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application. Biophysical Journal. 65 (3), 1135-1146 (1993).
  6. Wiseman, P. W., Petersen, N. O. Image Correlation Spectroscopy. II. Optimization for Ultrasensitive Detection of Preexisting Platelet-Derived Growth Factor-β Receptor Oligomers on Intact Cells. Biophysical Journal. 76 (2), 963-977 (1999).
  7. Costantino, S., Comeau, J. W. D., Kolin, D. L., Wiseman, P. W. Accuracy and Dynamic Range of Spatial Image Correlation and Cross-Correlation Spectroscopy. Biophysical Journal. 89 (2), 1251-1260 (2005).
  8. Claire Robertson, S. C. G. Theory and practical recommendations for autocorrelation-based image correlation spectroscopy. Journal of Biomedical Optics. 17 (8), 080801 (2012).
  9. Ciccotosto, G. D., Kozer, N., Chow, T. T. Y., Chon, J. W. M., Clayton, A. H. A. Aggregation Distributions on Cells Determined by Photobleaching Image Correlation Spectroscopy. Biophysical Journal. 104 (5), 1056-1064 (2013).
  10. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  11. Abràmoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
  12. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43 (1 Suppl), 25-30 (2007).
  13. Rappaz, B., Wiseman, P. W. Image correlation spectroscopy for measurements of particle densities and colocalization. Current protocols in cell biology. , Chapter 4, Unit 4.27.1-15 (2013).
  14. Ferreira, T., Hiner, M., Rueden, C., Miura, K., Eglinger, J., Chef, B. tferrS. criptsB. A. R. tferr/Scripts: BAR 1.5.1. Zenodo. , Available from: https://zenodo.org/record/495245 (2017).
  15. Elson, E. L. Fluorescence Correlation Spectroscopy: Past, Present, Future. Biophysical Journal. 101 (12), 2855-2870 (2011).
  16. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. Imaging molecular interactions in living cells by FRET microscopy. Current opinion in chemical biology. 10 (5), 409-416 (2006).
  17. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-Resolution Fluorescence Microscopy. dx.doi.org.ez.library.latrobe.edu.au. 78 (1), 993-1016 (2009).
  18. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
  19. Nohe, A., Petersen, N. O. Image Correlation Spectroscopy. Sci. Signal. (417), pl7 (2007).

Tags

علم الأحياء، 138 قضية، مجهرية [كنفوكل]، صورة ارتباط مطيافية (ICS)، التفاعلات بين الأضداد: مستقبلات، جسم-المخدرات-المتقارن (ADC)، إيماجيج، فيجي، صورة معالجة تجميع التجميع
[كنفوكل] مجهرية يكشف خلية مستقبلات سطح التجميع عن طريق التحليل الطيفي ارتباط الصورة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Parslow, A. C., Clayton, A. H. A.,… More

Parslow, A. C., Clayton, A. H. A., Lock, P., Scott, A. M. Confocal Microscopy Reveals Cell Surface Receptor Aggregation Through Image Correlation Spectroscopy. J. Vis. Exp. (138), e57164, doi:10.3791/57164 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter