Summary
바인딩할 대상 수용 체 세포 표면에 항 체 구조와 클러스터링 변경 부여 수 있습니다. 이러한 동적 변경 내용이 대상 셀에 약물 개발 특성화에 대 한 영향을 미칠. 이 프로토콜 confocal 현미경 검사 법 및 이미지 상호 관계 분광학 ImageJ/피지 수용 체 세포 표면에 클러스터링의 척도를 통해 활용 합니다.
Abstract
Confocal 현미경 검사 법 특성화 및 형광 프로브로 분류 하는 전 임상 에이전트의 추가 개발에 대 한 중요 한 하위 세포 상호 작용을 캡처를 액세스할 수 있는 방법론을 제공 합니다. 기반으로 하는 항 체 세포 독성 약물에 최근 전진으로 전달 시스템, 수용 체 집계 및 국제화의 영역 내에서 이러한 에이전트에 의해 유도 된 변경 이해 중요 한 중요성 이다. 이 프로토콜 활용 하 여 형광 immunocytochemistry의 잘 설립 방법론 및 오픈 소스 피지 분포 ImageJ, inbuilt 상관와 이미지 수학 함수, 공간 이미지 상관 관계를 수행 하 분광학 (IC)입니다. 이 프로토콜은 공초점 현미경의 광선 영역의 기능으로 레이블이 지정 된 수용 체의 형광 강도 quantitates. 이 세포 표면에 대상 분자 집단의 국가의 양적 측정을 제공합니다. 이 방법론은 수용 체 집합의 일시적인 수사로 확장 하는 잠재력을 가진 정적 셀의 특성에 초점. 이 프로토콜은 클러스터링 기술 및 비 전문 이미징 장치 설립 잘 활용 하 여 세포 표면에서 발생 하는 이벤트의 정량화를 제공 하는 접근 방법론을 선물 한다.
Introduction
치료 항 체의 개발에는 여러 종양 종류1의 치료에서 놀라운 성공을 보이고 있다. 마약 항 체 어원이 같은 말 (ADC)의 최근 발전으로 세포 독성 화합물에 대 한 전달 메커니즘 셀에 항 체: 수용 체 상호 작용의 역동성을 이해 하기 위한 요구 사항을 확대 하고있다2표면. 성공적인 타겟팅 세포 표면 수용 체에 항 체의, 다음이 단지 리간드: 항 체 상호 작용3에서 관찰 된 그 유사 집계 패턴을 유도할 수 있다. 수용 체 집계에서 변경 셀 표면에서 막 하는 수용 체와 그것의 제거의 결과 국제화에 변화를 유도할 수 있다. 항 체 약물 켤레의 맥락에서이 프로세스 이후에 내 면된 endosomes와 이후 효과적인 셀 죽이 결과 세포질 세포 독성 페이로드를 해제 합니다.
Confocal 현미경 검사 법은 항 체와 그들의 대상 수용 체4의 이러한 중요 한 상호 작용을 시각화 하는 효과적인 수단을 제공 했다. 집계 대상 분자 세포 표면에서의 변화를 탐험이 프로토콜 활용 공간 이미지 상호 관계 분광학 (IC) 기술 5,6,7 통해 confocal 현미경 이미지의 후 처리 .
이미지 상관 분광학의 기초 공간 형광 강도 변동 관계 레이블이 구조체의 밀도 및 집계 상태를 공유 하는 관찰 이다. 이 관계는 캡처된 이미지5의 공간 자기 상관 함수의 계산에 따라 설정 됩니다.
이미지 상관 분광학의 모든 이체는 이미지 상관의 계산이 필요합니다. 이것은이 기능을 양적 집계 상태 매개 변수는 이미지 내에 포함 된의 추출에 대 한 2 차원 가우스 곡선 피팅 옵니다. 간단히에서 이미지 상관의 계산 포함 됩니다 모두 이미지에 포함 된 및 가능성을 계산 가능한 픽셀 쌍을 비교 하는 둘 다 동등 하 게 서로 밝은. 이 거리의 기능과 픽셀 분리8방향으로 시각 이다.
이미지 상호 관계 분광학에 대 한 이론적 프레임 워크 그리고 피터슨과 Wiseman 외정의 설립 되었다. 5 , 6.이 프로토콜 상관 계산 피지/ImageJ 스프레드시트 응용 프로그램에서 수행 됩니다, 강도 변동 공간 자기 상관 함수에 대 한 기준 (Eq 1)로 기술 될 수 있다:
여기서 F 나타냅니다 푸리에 변환을; F− 1 역 푸리에 변환; F * 복소수; 공간 지연 변수 ε 그리고 η. 공간 IC에서이 프로토콜에서 설명 된 대로 자기 상관 함수 계산할 수는 2D 빠른 푸리에 변환 알고리즘7,9를 사용 하 여. 0-지연, g11(0, 0)로 그렇지 않으면 알려진 제로 공간 별거에 상관 입자 빔 현미경의 영역 당 현재 역 평균 수를 제공 합니다. 그것은 2 차원 가우스 함수 (Eq 2)공간 자기 상관 함수를 피팅 하 여 얻을 수 있습니다.
와 픽셀 이미지 내에서 캡처 영역 설정된에 포함 된 이러한 측정 무한대로 확장 되지 않습니다, 용어 g∞ 이미지 내에 포함 된 장거리 공간적 상관을 오프셋으로 사용 됩니다. 분자 크기의 집계, ω 현미경의 포인트 확산 함수 이며 반-최대 공간 자기 상관 함수에의 전체 폭에 의해 설명. 악기의 확산 기능에 포함 된 지역 하위 해상도 형광 구슬을 사용 하 여 측정 될 수 있다.
여기에 설명 된 이미지 상호 관계 분광학 프로토콜, 상관 및 ICS를 완료 하는 데 필요한 수학 함수는 사용 하 여 수행 오픈 소스 영상 처리 플랫폼, 피지10는 ImageJ의 분포 프로그램11,12. 피지/ImageJ FFT 수학 함수에 사전 설치 된 빠른 푸리에 변환을 사용합니다. 이 기능은 각 차원13에서 2의 요인에 의해 데이터의 범위를 줄임으로써이 계산의 계산 시간을 줄일 수 있습니다. 2D 자기 상관 함수는 x, y 축에서에서 대략 대칭 상관 이미지를 통해 한 줄 프로필 플롯 원시 자기 상관 공간 지연의 기능으로 측정을 사용할 수 있습니다. 모든 0 지연 잡음 추가 계산을 하기 전에, 결과 상관 진폭 (피크 값, g(0)T)와 식 (Eq 3)와 함께 배경에 대 한 수정 제거 됩니다.
어디 내가b 셀을 제외 하는 배경 영역에서 평균 강도 이다. 클러스터 밀도, 또는 형광 개체의 밀도 (Eq 4)에 의해 정의 됩니다.
여기에 설명 된 프로토콜 우리 가정 접근 공간 지연 증가 함께 1.0 값을 정규화 된 자기 상관 함수 것입니다 붕괴는 관찰을 바탕으로 단순히 클러스터 밀도 (CD)의 계산을 더. 최대 공간 피로 더 이상 어떤 상관 관계가 형광의 강도 값 하 고 따라서 상관 없이이 지역에서 계산 컴퓨팅 나눈 이후에이 강도 곱한 강도 값은 그 강도, 정의 1.0의 광장. 따라서, 클러스터 정규화 된 자기 상관 함수에서 밀도 상호 (Eq 5)을복용 하기 전에 정규화 된 자기 상관 함수에서 1.0을 빼서 계산 될 수 있다:
악기의 포인트 확산 함수의 영역 내에 포함 된 클러스터 수를 quantitate 하 빔 영역의 추가 보정을 수행할 수 있습니다. 이 교정은 이미지 상호 관계 분광학 분석 중에 사용 하는 동일한 광학 조건을 사용 하 여 수행 되어야 합니다.
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Protocol
1. 부착 셀 라인의 이미징 실험에 대 한 시드
- 10%를 포함 하는 Dulbecco의 수정이 글 매체/영양소 혼합 F-12 (DMEM/F-12) 미디어의 300 µ L에서 잘 하룻밤 (O/N) 당 10000 A431 해 암 세포를 씨앗 소 태아 혈 청, 1% 페니실린-스와 1%는 8에서 GlutaMAX 이미징 연 발 슬라이드 고해상도 기름 침수 렌즈에 적합 (예를 들어, NuncTM 실험실-TekTM coverglass 연 발).
- 미디어 실 온 (RT)에서 10 분에 100 ng/mL EGF ligand의 추가 A431 세포에 수용 체 집계를 자극.
2. 1 차적인 항 체 외피
- 미디어를 제거 하 고 실내 온도 (RT) 버퍼링 하는 인산 염 (1 x PBS)의 300 µ L 셀을 두 번 씻어.
- 실시간에서 10 분에 대 한 PBS에 4 %paraformaldehyde 200 µ L로 셀 수정
참고: 대상 집단의 시간적 변화를 탐험,이 고정 단계 생략 해야 합니다. - PFA를 제거 하 고 실내 온도 PBS의 300 µ L에 포함 된 셀을 두 번 씻어.
- 셀 4 ° c.에 적어도 2 시간에 10 µ g/mL의 농도에서 1 차적인 항 체를 포함 하는 PBS의 200 µ L 품 어
참고: ICS 계산 유효에 대 한 모든 수용 체 세포 표면에 존재 1 차 항 체로 표시 되어야 합니다. 각 기본 항 체의 희석 시리즈와 예비 실험 필요 (1:10, 1시 50분, 1: 100, 1: 200, 1: 1:1, 500, 000 등) 수행. 최적의 기본 항 체 농도의 형광 강도 클러스터 밀도 비교 분석을 통해 결정 됩니다. 선택한 기본 농도 클러스터 밀도 일반적인 항 체 바인딩 결과로 클러스터 밀도 증가 이전 1 차 항 체 농도 증가 함께 정점 때 발생 합니다. 1 차적인 항 체 시간 코스 이미징 실험을 수행 하는 경우 혈 청 자유로운 미디어에 희석 수 있습니다. - 원하는 보육 시간 완료, 다음 RT PBS의 300 µ L에 포함 된 셀을 두 번 씻어.
- 와 5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) PBS에 4 ° c.에 적어도 2 시간에 대 한 샘플을 차단
참고: 고정된 샘플 차단 정기적으로 4 ° c.에 하룻밤 (O/N)
3. 이차 항 체 외피
- 이차 항 체 (예: 알 렉 사 Fluor 488 IgG) PBS에 놓여있는지 표시의 10 µ g/mL 재고를 준비 합니다. 2 µ g/mL Hoechst 33342의 현미경에 향상 된 샘플 검색에 대 한 허용이 희석에 포함 될 수 있습니다.
참고: 시간 경과 실험, PBS는 혈 청 자유로운 미디어에 대 한 교환할 수 있습니다. - 제거 5 %BSA / 셀에서 PBS 및 주변광에서 샘플을 보호 하면서 4 ° C에서 2 시간에 대 한 2 차 항 체 솔루션으로 품 어.
- 완료 되 면 이차 항 체 외피 시간, PBS (2 회)의 300 µ L로 세포 세척 하 고 주위 빛에서 보호 4 ° C에서 저장 합니다.
- 증발을 방지 하기 위해, parafilm으로 챔버 슬라이드의 가장자리를 래핑하십시오.
4. 샘플의 confocal 현미경 검사 법
참고: confocal 분석에 사용 된 설정 장비 및 fluorophores 개별 실험에 사용 된 따라 달라 집니다. 현대 confocal 악기 악기의 기본 이미지 파일 형식에서 실험에 사용 된 모든 이미지 매개 변수를 저장 하기 위한 메커니즘을 제공 합니다. 그것은 중요 이러한 설정은 데이터 수집의 다른 기간에 걸쳐 실험 조건의 적절 한 복제에 대 한 제공에 기록 됩니다.
- 형광 신호의 이미징, 동안-채도를 하지 마십시오. 픽셀 채도의 거짓 색상 표현을 제공 하는 테이블을 이미지 보기를 사용 하 고 검출기 이득 감소 따라 레이저 출력. 가장 confocal 악기가 수집 소프트웨어에 "범위 표시기" 설정 또는 유사한 옵션을 포함합니다.
- 레이저 출력에 대 한 관심의 fluorophore의 노출을 최소화 합니다. Hoechst 33342 같은 DNA 라벨 얼룩의 사용 감지 하 고 수집 하기 전에 시야에서 샘플 위치는 쉬운 메커니즘을 제공 합니다.
- 낮은 해상도에서 샘플의 초기 검사를 수행 하 고 경우 소프트웨어 빠른 스캔 속도. 이 샘플의 가능한 photobleaching를 제한 합니다.
- 캡처 해상도 증가 하 고 느린 검색 속도 때 이미지 데이터를 수집할 준비가.
- 경우 허용 하는 confocal 악기, 광자 계산 모드를 사용 하 여 데이터를 수집 합니다.
참고: 광자 계산 사용할 수 없는 경우는 악기에: 회색은 선형 이미지 수집 동안 보장. - 1 공기 단위 (AU)를 사용 하는 각 레이저 라인에 대 한 작은 구멍을 설정 합니다.
- 사용 선 또는 프레임을 검출기를 줄이기 위해 이미지 수집 (x4) 동안 평균 소음 관련.
참고: ICS의이 변종에만 한 시간-포인트 캡처한 획득 시간 아니다 실험적인 요소를 제한. - 이미지 컬렉션 선택 높은 배율, 최대 해상도 (예로 계획-Apochromat 100 X 63 X /1.40 구형과 반음계 aberrations에 대 한 보정을 제공 하기 위해 계획 Apochromat 목표 등 높은 수 가늠 구멍 목표에 대 한 오일 목표).
- 이미지 내에 포함 된 캡처된 픽셀의 크기 oversample 각 픽셀 50 x 50 nm 영역을 포착 하는 것이 좋습니다. 효과적인 ICS에 대 한 픽셀 크기 픽셀 당 0.1 µ m2 x 0.1 미만 이어야 합니다. 이 스캔 비교적 작은 영역을 확대 하 고 상대적으로 큰 이미지 형식 (예: 1024 x 1024 또는 2048 x 2048 픽셀)을 선택의 조합에 의해 이루어집니다.
- 지역 수 평면에 셀의 꼭대기 또는 기저 표면에 초점. 하나의 이미지와 IC 분석 하는 동안 개별적으로 처리 하는 관심 영역에 여러 개의 셀을 수집할 수 있습니다.
- 샘플 정규화에 사용할 동일한 계측기 설정을 사용 하 여 셀 무료 배경 영역을 캡처하십시오.
5입니다. 이미지 상관 분광학의 계산
참고: 오픈 소스 영상 처리 플랫폼, 피지, ImageJ 프로그램의 배포 상관 및 IC에 필수적인 수학 함수를 수행 해야 합니다. ImageJ의이 배급으로 수많은 사전 설치 된 플러그 인 및 여러 이미징 실험에 걸쳐 작업을 수행할 수 있는 쉽게 업데이트 아키텍처를 포함 것이 좋습니다.
- 피지 프로그램 (http://fiji.sc/Downloads)를 설치 합니다.
- 인수 데이터 집합을 로드 합니다.
- 관심과 복제 2n (256 x 256, 128 × 128, 64 × 64)의 픽셀 크기를의 꼭대기 또는 기저 세포 표면 막 영역을 식별 합니다. "메뉴: 이미지 > 중복..."
- 관심의 자른 영역의 평균 강도 계산 "메뉴: 분석 > 측정."
- 배경 영역을 식별 하 고 캡처 세포 표면 막의 같은 픽셀 크기를 중복 (2n: 256 x 256, 128 × 128, 64 × 64). "메뉴: 이미지 > 중복..."
- 관심의 영역을 자른 배경의 평균 농도 계산 합니다. "메뉴: 분석 > 측정."
- 관심 영역을 포함 하는 이미지에서 백그라운드의 평균 강도를 뺍니다. "과정 > 계산기 이미지 > 빼기."
-
상관 계산을 수행 합니다. 이 계산 메뉴 구조 내에 포함 된: "과정 > FTT > FD 수학."
- FD 수학 대화 상자 선택: 이미지 1: 자른 이미지 이름, 상관 관계, 이미지 2 작업: 자른 이미지 이름, 역 변환에.
- 픽셀의 총 수로 나누어 결과 이미지를 정상화. "메뉴: 프로세스 > 수학 > 분할..." (예: 64 x 64 픽셀 = 4096)
- 정상화 다시는 정규화의 평균 휘도로 나누어 자른 영역 제곱. "메뉴: 프로세스 > 수학 > 분할..."
참고:이 두 번 평균 강도 값으로 이미지를 분할 하 여 얻을 수 있습니다. - 포인트 확산 기능을 통해 선을 그립니다.
- 피크 값을 계산 하려면이 줄의 프로필을 플롯 합니다. "메뉴: 분석 > 프로필 그림."
- 스프레드시트에 피크 값 (5.12의 결과)를 전송 하 여 빔 지역 당 클러스터를 계산 하 고 다음 계산 (Eq 6)를 수행:
6. 일괄 처리 IC 데이터 집합의
참고: 피지/ImageJ 매크로의 설립 위의 프로토콜에 설명 하는 절차를 복제 하는 것이 좋습니다. 여러 이미지 파일의 일관 되 고 신속한 분석을 위한 이미지 상호 관계 분광학 분석 하는 동안 수 있습니다.
- ICS 프로토콜에서 각 메뉴 명령을 기록 하 여 매크로 IC 워크플로 설정
"메뉴: 플러그인 > 매크로 > 기록...". - "만들기" 매크로 생성을 선택 합니다.
- 선택 "언어 > IJ1 매크로."
- 매크로 저장 합니다.
-
각 함수의 운영자에 게 알림을 제공 하는 매크로의 다양 한 단계를 대화 상자를 추가 합니다. 대화 상자는 또한 적절 한 선택 이전에 추가 처리 (즉, 영역 자르기) 만들 수 있도록 분석 프로세스를 일시 중지 하는 방법으로 봉사
- 대화 상자에 매크로 코드
제목 = "대화 상자 제목";
msg = "대화 상자/프로토콜 단계 메시지";
waitForUser (제목, msg);
참고: 추가 효율성 피지 업데이트 (지침 https://imagej.net/BAR) 내에서 바 업데이트 사이트에 가입 하 여 설정할 수 있습니다. 이 "광범위 하 게 적용 가능한 루틴의 컬렉션" 14피지를 제공 한다. 이러한 루틴을 하나 찾기 봉우리 이다. 메뉴 구조: "바 > 데이터 분석 > 찾기 봉우리." 이 스크립트는 빠른 포인트의 프로필에 피크 값 확산 함수 계산의 의미를 제공 합니다.
- 대화 상자에 매크로 코드
7. 현미경의 광선 영역 프로토콜 확장: 계산
참고: 현미경의 광학 전달 함수 개체도 분자 크기의 약의 반경 가진 이미지로 나타납니다 보장 x y 평면에서 200-300 nm. ICS 프로토콜 하위 해상도 형광 구슬에 4-5 단계를 수행 하 여 포인트 확산 함수의 결정을 수 있습니다. 특히:
- 하위 해상도 탑재 (예: < 100 nm 직경) 8에 형광 구슬 챔버 이미징 슬라이드.
- ICS 실험에 대 한 활용 하는 confocal 현미경을 사용 하 여 설명된 프로토콜에 따라 이미지 구슬.
- 프로토콜 단계 5.1-5.13에 따라 결과 이미지에서 ICS 함수를 계산 합니다.
- 그려진된 프로필에서 ICS 기능의 절반 최대 값에서 전체 폭으로 빔 반지름 (r)을 계산 합니다.
- 계산 하는 빔 영역 (BA) (Eq 7):
8. 프로토콜 확장: 단위 면적 당 클러스터의 계산
- (Eq 8)로 지역의 단위 당 클러스터 밀도 (CD)를 계산:
- 빔 (7.5의 결과)의 영역으로 빔 지역 (5.13의 결과) 당 클러스터를 나눕니다.
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Representative Results
성공적인 이미지 상호 관계 분광학 실험 치료 컨트롤의 적절 한 응용 프로그램에 따라 달라 집니다. 이러한 치료 그룹 없이 1 차적인 항 체 및 이차 항 체 치료 그룹이 없는 형광의 검사를 포함합니다. 실험에 대 한 최적의 confocal 레이저 설정 설정 되 면 이미지 샘플 내에서 일반적인 형광의 부족을 확인 하이 컨트롤 그룹의 캡처할 수 해야 합니다. 많은 부착 암 세포 라인에 대 한 ICS에 대 한 적합 한 영역의 식별 평면의 부족에 의해 제한 됩니다. 이 단일 confocal 이미지에 여러 개의 암 세포의 큰 시야를 잡으려고 기능에 의해 보상 된다. 이 치료 그룹 간의 통계적 비교를 수행 하기 위해 필요한 샘플링을 생성 하는 기능을 제공 합니다.
이 대표적인 실험 A431 EGFR 긍정적인 해 암 세포, EGFR 클러스터링을 유도 하기 위해 실 온에서 10 분 동안 EGF ligand의 100ng/mL로 자극 했다. IC 분석 두 EGF에 수행한 자극된 (그림 1A)와 unstimulated (그림 1D) 셀 humanized 단일 클론 항 체, cetuximab을 대상으로 하는 EGFR와 인큐베이션을 다음. 세포 막에 포함 된 지역 (노란색 상자)의 그 후, 64 x 64 픽셀 자르기 (그림 1B 및 1E) 처리 된 오픈 소스 이미지 처리 플랫폼, 피지에에서 포함 된 자기 상관 함수를 활용 하 여. 이 결과 상관 이미지 모두 정규화 된 관심 영역으로 자른된 영역 ( 픽셀의 수의 제곱의 평균 농도의 제곱으로 나누어 이전 배경 형광을 빼서 정규화 되었는지 그림 1 c 및 1 층). 선 기능 도구가이 이미지의 포인트 확산 함수의 프로 파일을 그리는 데 사용 되었다 (그림 1G 및 1 시간). 이러한 프로 파일의 피크 값은 추가 데이터 처리를 위해 스프레드시트 응용 프로그램에 조 변경 됩니다. 피지 매크로 셀의 일련의 신속한 처리를 위해 이러한 피지 처리 단계를 복제 생성 (n = 6) cetuximab immunocytochemistry (그림 1I) 다음 두 치료 그룹에서. 이 실험에서 EGFR 수용 체 A431 14.94 ± 1.62 대 자극된을 세포 unstimulated 세포 인구에서 빔 지역 당 클러스터의 표면에 빔 지역 당 5.84 ± 0.85 클러스터에서 확인 되었다. 실험 조건에서이 분석 제한 빠른 수용 체 회전율에 사용 하는 가정으로 자극된 A431 세포에서 EGFR 클러스터 밀도 감소 2.56-fold. 때 대상 분자 턴 오버는 제한 된 조건에서 동일한 대상 분자의 집계 상태 조건 비교, 빔 지역 당 클러스터의 낮은 수 증가 대상 집계를 나타냅니다. EGF ligand 자극 EGFR 집계에 따라 2.56-fold이 시스템에 예상 대로 증가 합니다. 이 프로토콜에서 설명 하는 단계를 사용 하 여 피지 매크로의 생성 통계의 비교 다양 한 치료 또는 환경 차이 수용 체 집계에 미치는 영향에 대 한 수 있습니다.
그림 1: 이미지 상호 관계 분광학 붙일 감지 표시 부착 암 세포의 세포 표면에 클러스터. Confocal 현미경 이미지 대표 EGF 자극된의 (A) 또는 unstimulated (D) 부착 A431 해 암 세포 cetuximab 1 차적인 항 체 수용 체 EGFR을 알렉스 Fluor 488 보조와 표면 셀을 대상으로 표시 항 체입니다. 자극된을 세포 100 ng/mL EGF EGFR 고정 및 immunocytochemistry 이전 클러스터링을 유도 하기 위해 실 온에서 10 분으로 치료 했다. 픽셀 크기 (64 x 64 [2n])와 세포 막 포함 자르기 영역 (노란색 상자) IC 분석 (B 와 E)을 수행 하기 위해 사용 되었다. 피지/ImageJ의 자기 상관 함수의 정상화, 다음 선 도구 (노랑) (C 및 F) 포인트 확산 기능을 측정 하 사용 되었다 (G 와 H 피크 값을 감지 하이 라인 함수 프로 파일 플롯 ). EGF 자극 감지 빔 지역 5.84 ±0.85 unstimulated 셀 14.9 5±1.62에 비해 당 EGFR 클러스터 2.56-fold 감소를 유도 하는 것을 관찰 되었다 (n = 6) (I). 가정, 세포 막 수용 체의 일정 수를 유지 하는이 분석에 사용 하는 실험 조건이 EGFR 집계 EGF 자극 다음에 증가 나타냅니다. 스케일 바 = 10 µ m (A와 D); 1 μ (B-C와 E-F) 상자 그림 수염 대표 하는 최대와 Tukey 스타일을 사용 하 여 표시 하 고 최소 관찰 값 더 이상 1.5 × interquartile 범위 (IQR). 클러스터 빔 지역 ± 표준 오차의 의미 (SEM) 당. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
우리가이 프로토콜에서 설명 하는 이미지 상호 관계 분광학 (IC)의 기술 특수 감지기에 대 한 필요 없이 표준 confocal 현미경을 사용 합니다. ICS 기술 설명 잘 설립 immunocytochemistry 메서드 증가 통계 분석에 대 한 여러 치료 조건의 빠른 샘플링을 사용 합니다. 이 방법론 confocal 볼륨, 형광 등을 통해 확산 모바일 분자의 형광 동요의 상관 관계에 따라 대체 단일 분자 기법에 비해 절대 정밀도에 약간의 감소와 함께 저러 상호 관계 분광학 (FCS)15. 보다 전문적인된 FCS 접근에는 눈사태 포토 다이오드 (APD) 같은 감지기 또는 표준 confocal 악기에 일상적으로 사용할 수 있는 전용된 전문된 소프트웨어와 함께 GaAsP 경보기를 계산 하는 높은 감도 광자를 필요 합니다. IC의 정밀도 대 한 포괄적인 분석 결정이 기술을 정확 하 게 클러스터의 수를 측정할 수 있는 > 1 입자 빔 초점 레이저 스캔 현미경7의 내 존재 하는.
성공적인 IC 분석에 대 한 중요 적절 한 형광 이미지의 컬렉션이입니다. 관심 영역 레이저 배경 형광 비율 높은 신호를 포함 하 고 제거 어떤 신호 채도를 조정 하는 농도 얻을 해야 합니다. 캡처한 세포 지역 약 50의 픽셀 크기와 oversampled 해야 합니다 nm. 이 지역 균질, 세포 가장자리 또는 상관 계산에서 아티팩트를 증가 시킬 수 있는 접합을 피하기 위해도 주의 해야 합니다. ICS의 주요 함정 중 하나는 다른 유형의 세포 표면에 감도입니다. 따라서, 최대 평평한 표면에 캡처 지역 제한, 셀 모양에 향상 됩니다 모든 IC 분석의 정확도.
여러 이미지 형식 수용 체 복합물의 집계 연구 탐험 되었습니다 있다. 전자 현미경 (EM) 단백질 클러스터링의 고해상도 공간 평가 하지만 매우 높은 진공에서 운영 하며 시간적 해상도 필요로 하는 연구에 적용 되지 않습니다. 그들은 더 가혹한 샘플 준비는 생활에 대 한 금지 제한 조직 조사5. 표준 confocal 현미경 검사 법, 포스터 공명 에너지 전달의 고유의 해상도 한계를 극복 하기 위해 (무서 워)를 사용할 수 있는 계산 구조 기증자 및 수락자 fluorophores 쌍16 중첩으로 표시의 공간 조직 . 그러나 그것의 감도도 불구 하 고 무서 워 제공 하지 않습니다 조사6아래 집계의 크기에 관한 정보. 다양 한 슈퍼 해상도 형광 현미경 검사 법 방법의 개발 세포 개체 표준 해상도 confocal 방법17,18불가능을 해결 하기 위해 흥미로운 기회를 제공 합니다. 경비와 같은 기술 및 장비, 필요한 전문 지식을 그들의 현재 평범한 가용성을 제한 합니다.
감도 증가와 낮은 사진-독성 confocal 계측에 이미지 상호 관계 분광학 탐구 시간 경과 실험에서 살아있는 세포에 수용 체 집단의 시간적 변화를 확장할 수 있습니다. 이 떨어져 일부 수용 체 단지9에 있는 더 높은 순서 집계 애타게 레이저 전원 사진 후속 IC 평가 (pbICS)와 개별 샘플의 표백 의도적으로 유도 하는 데 사용 증가 함께 juxtaposed 될 수 있습니다. 더 적응 이미지 교차 상관 분광학 (ICC) 각 붙일 레이블된 단백질19에 대 한 이미지의 분석을 통해 두 개의 기반 막 단백질의 공동 지역화의 분석을 제공합니다. 이 이미지 상호 관계 분광학 방법론의 강도 그것 기술 분야에서 설립을 활용 하 고 세포 막에 발생 하는 매우 역동적인 이벤트 양적을 자유롭게 사용할 수 있는 분석 파이프라인을 제공 합니다.
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Disclosures
앤드류 M 스콧 자금 지원을 AbbVie 조제 학, EMD 세로 노와 다이 이치 산 쿄 공동 연구와 컨설팅 및 생명 공학 의약품의 주식 소유권을 하고있다. 저자는 다른 관련 제휴 또는 어떤 조직으로 금융 참여 또는 법인 금융 관심이 나 주제 또는 공개 그 외 원고에서 설명 하는 자료와 함께 금융 충돌 있다.
Acknowledgments
저자 인정 자금 지원을 NHMRC (교제 1084178와 보조금 1087850, 1030469, 1075898 (AMS))에서 암 호주, 루드비히 암 연구, 존 T 리드 신뢰, 치료 뇌 암 재단, 라 Trobe 대학교와 빅토리아 암 기관. Victorian 정부에 의해 제공 운영 인프라 지원 프로그램에서 자금, 호주는 또한 인정 했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass - 8 well | ThermoFisher Scientific | 155409 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 10099141 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red | ThermoFisher Scientific | 12604021 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
| Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A11013 | |
| TetraSpeck Fluorescent Microsphere Standards 0.1µm | ThermoFisher Scientific | T7279 | |
| Cetuximab | Merck Serono | 3023715501 | |
| Parafilm M 38mx100mm | Merck Millipore | BRND701605 | |
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | ProSciTech | C004 | |
| Recombinant Human EGF | R&D System | 236-EG |
References
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