Konfokalmikroskopi avslöjar Cell Surface Receptor Aggregation genom bilden korrelation spektroskopi

Summary

Konformation och klustring förändringar kan ge antikroppar som binder till rikta receptorer på cellytan. Dessa dynamiska förändringar påverkar för kännetecknar läkemedelsutveckling i målceller. Detta protokoll använder konfokalmikroskopi och bild korrelation spektroskopi genom ImageJ/FIJI att kvantifiera omfattningen av receptorn klustring på cellytan.

Abstract

Konfokalmikroskopi ger en tillgänglig metod för att fånga sub cellulära interaktioner kritiska för karakterisering och vidareutveckling av prekliniska agenter märkta med fluorescerande sonder. Med senaste framstegen i antikropp baserat cytotoxiska läkemedel är leveranssystem, förstå de förändringar som induceras av dessa agenter inom sfären av receptorn aggregering och internalisering av avgörande betydelse. Detta protokoll utnyttjar den väletablerade metodiken av fluorescerande immuncytokemi och öppen källkod FIJI distribution av ImageJ, med dess inbyggda autokorrelation och bild matematiska funktioner, att utföra rumsliga bilden korrelation spektroskopi (ICS). Detta protokoll quantitates fluorescerande intensiteten av märkt receptorer som en funktion av området balk i mikroskopet confocal. Detta ger ett kvantitativt mått av målet molekyl aggregation på cellytan. Denna metod är inriktad på karakterisering av statiska celler med potential att expandera till temporal utredningar av receptorn aggregation. Detta protokoll presenterar en tillgänglig metod för att tillhandahålla kvantifiering av klustring händelser som inträffar på cellytan, använder väl etablerade tekniker och icke specialiserad bildhantering apparater.

Introduction

Utveckling av terapeutiska antikroppar har visat anmärkningsvärd framgång vid behandling av flera tumör typer¹. De senaste framstegen i antikropp-drogen konjugat (ADC) surface som leveransmekanismer för cytotoxiska substanser har utökat kraven för att förstå dynamiken i antikropp: receptor interaktioner på cellen². Efter framgångsrika målinriktning av en antikropp till cell surface receptorn, kan dessa komplex framkalla liknande aggregering mönster som de som observerades i ligand: antikropp interaktioner³. Förändringar i receptorn aggregation kan framkalla förändringar i membran och resultatet i internalisering av receptorn och dess avlägsnande från cellytan. I samband med ett antikropp-läkemedelskonjugat släpper denna process därefter cytotoxiska nyttolasten i internaliserade endosomes och därefter cytoplasman, vilket resulterar i effektiv cell dödande.

Konfokalmikroskopi har lämnat ett effektivt sätt att visualisera dessa viktiga interaktioner av antikroppar och deras mål receptorer⁴. För att utforska förändringarna om sammanläggning av målmolekyl på cellytan detta protokoll använder tredjeparts efterbearbetning av konfokalmikroskopi bilder via en rumslig bild korrelation spektroskopi (ICS) teknik ^5,6,7 .

Grunden för bilden korrelation spektroskopi är observationen att rumsliga fluorescens intensitet fluktuationer delar en relation till tillståndet densitet och aggregering av de märkta strukturerna. Denna relation upprättas efter beräkningen av en spatial autokorrelation funktion av en tagen bild⁵.

Alla varianter av bilden korrelation spektroskopi kräver beräkning av en bild autokorrelation. Detta följs av passande denna funktion till en tvådimensionell Gaussisk kurva för utvinning av kvantitativa aggregation tillstånd parametrar som ingår i bilden. Enkelt uttryckt innebär beräkning av en bild autokorrelation jämföra alla möjliga pixel paren som ingår i en bild och beräkna sannolikheten att båda lika så ljust som varandra. Detta visualiseras som en funktion av avstånd och riktningar av pixel separation⁸.

Det teoretiska ramverket för den bilden korrelation spektroskopin inrättades och definieras av Petersen och Wiseman et al. ^{5 , 6}. i detta protokoll, autokorrelation beräkningarna utförs i Fiji/ImageJ samt ett kalkylbladsprogram, till grund för funktionen intensitet fluktuation spatial autokorrelation kan beskrivas som (Eq 1):

     

där F representerar fouriertransformen; F⁻¹ inversen Fourier transform; F * dess komplexa konjugatet; och rumsliga eftersläpning variabler ε och η. I rumsliga ICS, som beskrivs i detta protokoll, kan autokorrelation funktion beräknas med hjälp av en 2D fast Fourier transform algoritm^7,9. Autokorrelation på noll rumsliga avskiljandet annars känd som noll-lag, g₁₁(0,0), ger omvänd medeltalet för antalet partiklar per balk av mikroskopet. Det kan erhållas genom att montera funktionen spatial autokorrelation till en tvådimensionell Gaussisk funktion (Eq 2):

     

Som pixlar fångas inom en bild ingår i ett set område och dessa mätningar inte utökar till oändlighet, är den termen g∞ används som en offset för långväga rumsliga korrelationer som finns i bilden. För molekylär och medelstora aggregat, ω funktionen point-spread i mikroskopet och beskrivs av den full bredden på halv-maximum av funktionen spatial autokorrelation. Området som ingår i funktionen punkt spridningen av instrumentet kan kalibreras med hjälp av sub resolution fluorescerande pärlor.

För bild korrelation spektroskopi protokollet beskrivs häri, utförs den autokorrelation och matematiska funktioner som krävs för att slutföra ICS med plattformen med öppen källkod i imaging-bearbetning, Fiji¹⁰, en fördelning av ImageJ program^11,12. Fiji/ImageJ använder tredjeparts förinstallerade snabb Fourier omformningen i funktionen FFT Math. Denna funktion minskar tidsåtgången vid denna beräkning beräkning genom att minska dataområdet med en faktor två i varje dimension¹³. Eftersom funktionen 2D autokorrelation är ungefärligt symmetrisk i x, y-axeln, kan en enda rad profil tomt genom autokorrelation bilden användas att mäta den råa autokorrelation som en funktion av den rumsliga eftersläpningen. Noll-lag buller tas bort före ytterligare beräkning, med resulterande autokorrelation amplituden (toppvärdet, g(0)_T) korrigerat för bakgrund med uttrycket (Eq 3):

     

där jag_b är genomsnittliga intensiteten från en bakgrund regionen exklusive cellen. Den kluster densitet eller täthet av fluorescerande objekt, definieras av (Eq 4):

    

I protokollet beskrivs häri, ytterligare vi helt enkelt beräkningen av klustret densitet (CD), med antagandet baserat på observationen att en normaliserad autokorrelation funktion kommer att förfalla till ett värde som närmar sig 1,0 med ökande rumsliga eftersläpning. Med maximal rumsliga eftersläpning, finns det inte längre någon korrelation mellan fluorescens intensitetsvärdena och således utan en korrelation beräkningarna på denna region computing värdet på en intensitet som multipliceras denna intensitet som divideras därefter med den torget som intensitet, som per definition är lika med 1,0. Klustret densitet från en normaliserad autokorrelation funktion kan således beräknas genom att subtrahera 1.0 från normaliserade autokorrelation funktion innan dess ömsesidiga (Eq 5):

     

Ytterligare kalibrering av området balk kan utföras för att kvantifiera antalet kluster som finns inom området med funktionen punkt spridningen av instrumentet. Denna kalibrering måste utföras med samma optiska villkor används under bilden korrelation spektroskopi analysen.

Protocol

1. seedning av vidhäftande cellinjer för Imaging Experiment

1. Utsäde 10.000 A431 epidermoid karcinom celler per väl övernattning (O/N) i 300 µL av Dulbeccos modifierade Eagle Medium/näringsämne blandning F-12 (DMEM/F-12) media som innehåller 10% fetalt bovint Serum, 1% Penicillin-Streptomycin och 1% GlutaMAX i en 8 kamrar imaging bild lämpar sig för hög upplösning olja nedsänkning objektiv (t.ex. NuncTM Lab-TekTM kamrar täckglas).
2. Stimulera receptorn aggregation på A431 celler med tillägg av 100 ng/mL EGF liganden i media under 10 minuter vid rumstemperatur (RT).

2. primär antikropp inkubation

1. Ta bort media och tvätta cellerna med 300 µL av rumstemperatur (RT) fosfatbuffrad saltlösning (1 x PBS) två gånger.
2. Fixa cellerna med 200 µL 4% PARAFORMALDEHYD i PBS för 10 min vid RT.
   Obs: För att utforska de tidsmässiga förändringarna av mål aggregation, denna fixering steg måste utelämnas.
3. Ta bort PFA och tvätta cellerna med 300 µL av rumstemperatur PBS två gånger.
4. Inkubera cellerna med 200 µL PBS med primär antikropp vid en koncentration på 10 µg/mL för minst 2 h vid 4 ° C.
   Obs: För ICS beräkningar ska gälla alla receptorer på cellens yta måste märkas med primär antikropp. Detta kräver preliminära experiment med en utspädning serie varje primär antikropp (1:10, 1:50, 1: 100, 1: 200 eller 1: 500-1:1, 000, etc.) som ska utföras. Optimal primär antikroppskoncentration bestäms genom analys av fluorescensintensiteten kontra kluster densitet. Den valda primära koncentrationen uppstår när klustret tätheten platåer med ökande primär antikropp koncentration före en ytterligare ökning i klustret densitet till följd av icke-specifik antikropp bindande. Den primär antikroppen kan spädas i serum fria medier om utför ett tidsförlopp imaging experiment.
5. Efter slutförandet av önskad inkubationstiden, tvätta cellerna med 300 µL RT PBS två gånger.
6. Blockera provet med 5% bovint serumalbumin (BSA) i PBS för minst 2 h vid 4 ° C.
   Obs: Fasta prover blockeras rutinmässigt övernattning (O/N) vid 4 ° C.

3. sekundära antikroppar inkubation

1. Förbereda ett 10 µg/mL lager av fluorescently märkt sekundär antikropp (t.ex. Alexa Fluor 488 IgG) i PBS. 2 µg/mL Hoechst 33342 kan ingå i denna utspädning för förbättrad prov upptäckt på mikroskopet.
   Obs: För time-lapse experiment, PBS kan bytas mot serum fria medier.
2. Ta bort 5% BSA/PBS från cellerna och inkubera med sekundär antikropp lösningen för 2 h vid 4 ° C, samtidigt skydda proverna från omgivande ljus.
3. Efter avslutad sekundär antikropp inkubationstiden, tvätta cellerna med 300 µL av PBS (två gånger) och förvaras vid 4 ° C, skydda från omgivande ljus.
4. För att förhindra avdunstning, Linda kanterna på avdelningen bilden med parafilm.

4. konfokalmikroskopi av prover

Obs: Inställningarna som används för confocal analys skiljer sig beroende på utrustning och fluorophores används i enskilda experimentet. Moderna confocal instrument tillhandahålla mekanismer för att spara alla tänkbar parametrar som används i experimentet i formatet infödda bild av instrumentet. Det är viktigt att dessa inställningar registreras för att tillhandahålla för lämplig replikering av experimentella förhållanden över olika perioder av datainsamling.

1. Under bildbehandling av fluorescerande signaler och undvika överdriven färgmättnad. Använda en bild titt upp tabell som ger en falsk färgrepresentation av pixel mättnad och minska detektor vinst och laser power med detta. Mest confocal instrument omfattar en ”utbud indikator” inställningen eller motsvarande alternativ i programvaran förvärvet för detta.
2. Minimera exponeringen av fluorophore av intresse för laser power. Användningen av en DNA-märkning fläck såsom Hoechst 33342 ger en enkel mekanism för att upptäcka och placera provet i synfältet innan samlingen.
3. Utföra de inledande skanningar av provet vid låg upplösning och om programvara tillåter en snabb scan hastighet. Detta kommer att begränsa den möjliga fotoblekning av provet.
4. Öka upplösningen capture och långsam scan hastighet när du är redo att samla in bilddata.
5. Om instrumentet confocal tillåter, samla in data med hjälp av en photon counting läge.
   Obs: Om fotonen räkna inte är tillgänglig på instrumentet: säkerställa grå nivåer är linjära under bild förvärv.
6. Ställ in pinhole för varje laserlinjen som brukade 1 luftiga enhet (AU).
7. Använd linje eller ram som genomsnitt under Bild Förvärvandet (x4) att minska detektor associerade buller.
   Obs: I denna variant av ICS som enda tidpunkt fångas förvärv tid är inte experimentella begränsande faktor.
8. För bild samling Välj en hög förstoring, höga numeriska bländaröppningen mål, såsom ett Plan-Apochromat mål, att ge maximal upplösning och korrigering för sfäriska och kromatiska aberrationer (till exempel Plan-Apochromat 100 X eller 63 X /1.40 Olja mål).
9. Oversample storleken på de fångade pixlar i bilden. Det rekommenderas att varje pixel fånga en 50 x 50 nm region. För effektiv ICS, måste pixelstorlek vara mindre än 0,1 x 0,1 µm² per pixel. Detta uppnås genom en kombination av inzoomning för att skanna ett relativt litet område och välja ett relativt stort bildformat (t.ex. 1024 x 1024 eller 2048 x 2048 pixlar).
10. Fokusera på apikala eller basal ytan av cellen i en region som är lika platt som möjligt. Flera celler kan samlas i en bild och regioner av intresse behandlas individuellt under ICS analys.
11. Fånga en cell gratis bakgrund region med samma instrumentinställningar som ska användas för provet normalisering.

5. beräkning av bilden korrelation spektroskopi

Obs: Öppen källkod imaging-bearbetning plattformen, Fiji, en fördelning av programmet ImageJ, krävs för att utföra autokorrelation och matematiska funktioner viktigt att ICS. Denna fördelning av ImageJ rekommenderas eftersom det innehåller många pre-installerat plug-ins och en enklare uppdatering arkitektur som kan utföra operationer över flera imaging experiment.

1. Installera programmet Fiji (http://fiji.sc/Downloads).
2. Ladda de förvärvade datamängderna.
3. Identifiera den apikala eller basalcellscancer ytan membran regionen intresse och duplikat pixelstorlek 2ⁿ (256 x 256, 128 x 128, 64 x 64). ”Meny: bild > Duplicera...”
4. Beräkna den genomsnittliga intensiteten i det beskurna området av intresse ”meny: analysera > mätningar”.
5. Identifiera en bakgrund region och duplicera till samma pixelstorlek fånga cellmembranets yta (2ⁿ: 256 x 256, 128 x 128, 64 x 64). ”Meny: bild > Duplicera...”
6. Beräkna den genomsnittliga intensiteten i bakgrunden beskurna intresseområde. ”Meny: analysera > mätningar”.
7. Subtrahera genomsnittliga intensiteten i bakgrunden från bilden som innehåller regionen av intresse. ”Process > bild miniräknare > subtrahera”.
8. Utföra autokorrelation beräkning. Denna beräkning är innesluten i menystrukturen ”: processen > FTT > FD matte”.
   1. FD matte i dialogrutan rutan Välj: bild 1: beskuren bild namn, drift som korrelation, bild 2: beskuren bild namn, inversen transformation på.
9. Normalisera den resulterande bilden genom att divideras med det totala antalet pixlar. ”Meny: Process > matematik > dela...” (dvs: 64 x 64 pixlar = 4096)
10. Normalisera igen genom att dividera med genomsnittliga intensiteten av den normaliserade beskärningsområdet fyrkant. ”Meny: Process > matematik > dela...”
    Obs: Detta kan uppnås genom att dela bilden med genomsnittliga intensitetsvärdet två gånger.
11. Dra en linje genom den punkt sprida funktionen.
12. Rita profilen för denna linje att beräkna toppvärdet. ”Meny: analysera > Rita profil”.
13. Beräkna kluster per balk område genom att överföra toppvärdet (resultatet av 5.12) till ett kalkylblad och utför du följande beräkning (Eq 6):
    

6. batch-bearbetning av ICS datamängder

Obs: Inrättandet av ett FIJI/ImageJ makro rekommenderas att replikera procedurerna som beskrivs i protokollet ovan. Detta möjliggör en enhetlig och snabb analys av flera bildfiler under bildanalysen korrelation spektroskopi.

1. Skapa ett makro ICS arbetsflöde genom att registrera varje menykommando i protokollet ICS
   ”Meny: Plugins > makron > rekord...”.
2. Välj ”Skapa” för att generera makro.
3. Välj ”språk > IJ1 makro”.
4. Spara makrot.
5. Lägg till dialogrutor i olika steg av makrot, som påminnelser för operatörer av varje funktion. Dialogrutor också fungera som en metod att pausa analysprocessen för lämpligt val som skall göras innan ytterligare behandling (dvs. region att beskära)
   1. Dialogrutan rutan makrokod
      titel = ”dialogrutan rutan Titel”;
      MSG = ”dialogen låda/protokoll steg meddelande”;
      waitForUser (titel, msg);
      Obs: Ytterligare effektivitetsvinster kan fastställas genom att prenumerera till BAR update inom FIJI Updater (instruktioner https://imagej.net/BAR). Detta ger FIJI ”en samling av allmänt tillämpliga rutiner” ¹⁴. En sådan rutin är hitta toppar. Menystruktur ”: BAR > Analys > Hitta toppar”. Skriptet ger ett snabbt sätt att beräkna toppvärdet i profilen för punkten sprida funktion.

7. protokoll filändelser: Beräkning av balk arean av mikroskopet

Obs: Överföringsfunktionen optisk av mikroskopet säkerställer att även molekylär storlek objekt visas som bilder med en radie på cirka 200-300 nm i x-y-planet. ICS-protokollet tillåter bestämning av funktionen point-spread genom att utföra steg 4-5 på sub resolution fluorescerande pärlor. Specifikt:

1. Montera sub upplösning (dvs. < 100 nm diameter) fluorescerande pärlor på en 8 kammare imaging bild.
2. Bild pärlor enligt beskrivs protokoll genom confocal Mikroskop utnyttjas för ICS experiment.
3. Beräkna funktionen Internet-anslutningsdelning från den resulterande bilden enligt protokollstegen 5.1-5.13.
4. Från den plottade profilen, beräkna beam radien (r) som full bredd på halva maximala värdet av funktionen Internet-anslutningsdelning.
5. Beräkna området beam (BA) som (Eq 7):

8. protokoll filändelser: Beräkning av kluster Per ytenhet

1. Compute cluster densiteten (CD) per ytenhet som (Eq 8):
   
   
2. Dela kluster per balk område (resultatet av 5.13) av området i balken (resultatet av 7,5).

Representative Results

En lyckad bild korrelation spektroskopi experiment är beroende av en korrekt tillämpning av behandlingskontroller. Dessa grupper inkluderar undersökning av fluorescensen i ingen primär antikropp och ingen sekundär antikropp behandlingsgrupperna. När de optimala confocal laser inställningarna har gjorts för ett experiment, måste bilder fångas av dessa kontrollgrupper bekräfta avsaknaden av icke-specifika fluorescens i provet. För många vidhäftande cancer cellinjer begränsas identifiering av regioner som är lämplig för ICS av bristen på plana ytor. Detta kompenseras av möjligheten att fånga ett större synfält flera cancer celler i en enda confocal bild. Detta ger förmåga att generera provtagningen som krävs för att utföra statistiska jämförelser mellan behandlingsgrupperna.

I detta representativa experiment stimuleras A431 EGFR positiva epidermoid karcinom celler, med 100ng/mL av EGF-ligand för 10 min i rumstemperatur att inducera EGFR klustring. ICS-analys utfördes på båda EGF stimuleras (figur 1A) och ostimulerade (figur 1 d) celler efter inkubation med den EGFR inriktning humaniserad monoklonal antikropp, cetuximab. Därefter en 64 x 64 pixel gröda i en region (gul ruta) som finns i cellmembranet (figur 1B och 1E) bearbetades utnyttja funktionen autokorrelation ingick i öppen källkod bildbehandling plattformen, FIJI. Detta resulterande autokorrelation bilden var normaliserade genom att subtrahera bakgrunden fluorescensen före divideras med både torget genomsnittliga intensiteten i regionen normaliserade sevärdheter samt kvadraten på antalet pixlar i regionen beskurna ( Figur 1 c och 1F). Verktyget linje funktion användes för att rita profilen av point-spread funktionen av denna bild (figur 1 g och 1 H). Toppvärdet av dessa profiler har införlivats till ett kalkylprogram för ytterligare behandling av personuppgifter. Ett FIJI makro skapades för att replikera dessa FIJI bearbetningssteg för snabb behandling av en rad celler (n = 6) från båda behandlingsgrupperna efter cetuximab immuncytokemi (figur 1I). I detta experiment identifierades EGFR receptorn i 5,84 ± 0,85 kluster per balk område på ytan av den A431 stimuleras cellerna kontra 14.94 ± 1,62 kluster per balk område i ostimulerade celler populationer. Med antagandet att de experimentella förhållanden användas för denna analys gräns snabba receptor omsättning, EGFR kluster tätheten i stimulerad A431 celler minskat 2.56-fold. När villkor jämförs för aggregering tillståndet i samma målmolekylen i villkor när målet molekyl turn-over är begränsad, indikerar ett lägre antal kluster per balk område ökad mål aggregering. Efter EGF ligand stimulering EGFR aggregering ökar 2.56-fold som förväntat i detta system. Generering av en FIJI makrot med stegen som beskrivs i detta protokoll möjliggör statistisk jämförelse av olika behandlingar eller miljömässiga skillnader och deras effekter på receptorn aggregering.

Figur 1: bilden korrelation spektroskopi att upptäcka fluorescently märkt kluster på cellytan av vidhäftande cancerceller. Konfokalmikroskopi bild representant EGF stimuleras (A) eller ostimulerade (D) vidhäftande A431 epidermoid karcinom celler märkta med cetuximab primär antikropp inriktning cell surface EGFR-receptorn med Alex Fluor 488 sekundära antikropp. Stimuleras cellerna behandlades med 100 ng/mL EGF under 10 minuter vid rumstemperatur att inducera EGFR kluster före fixering och immuncytokemi. Cellmembranet innehållande gröda regioner (gul ruta) med pixeldimensioner (64 x 64 [2ⁿ]) användes för att utföra ICS analys ( EochB ). Efter normalisering av autokorrelation funktion i FIJI/ImageJ, linjeverktyget (gul) användes för att mäta funktionen punkt spridning (C och F) profilen för denna linje funktion ritas att upptäcka toppvärdet (G och H ). EGF stimulering observerades att framkalla en 2.56-fold minskning av upptäckt EGFR kluster per balk området 5,84 ±0.85 jämfört med 14,9 5±1.62 till ostimulerade celler (n = 6) (I). Med antagandet av försöksbetingelser som används i denna analys som underhålls ett konstant antal cellens membranreceptorer, är detta en ökning i EGFR aggregering EGF stimulering. Skala barer = 10 µm (A och D); 1 µm (B-C och E-F). Lådagram visas med Tukey stil med polisonger som representerar högsta och minsta observerade värden mer än 1,5 × interkvartilintervall (IQR). Kluster per balk område ± medelfel av menar (SEM). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Tekniken med bild korrelation spektroskopi (ICS) som vi beskriver i detta protokoll använder standard confocal Mikroskop utan behov av specialiserade detektorer. Den ICS-teknik som beskrivs utnyttjar väletablerade immuncytokemi metoder att ge för snabb provtagning av flera behandling villkor för ökad statistisk analys. Denna metod gör det med en liten minskning av absolut precision jämfört med alternativa enda molekyl tekniker som bygger på sambandet mellan fluorescens fluktuationer av mobila molekyler sprida genom en confocal volym, såsom fluorescens korrelation spektroskopi (FCS)¹⁵. De mer specialiserade FCS tillvägagångssättet kräver också hög känslighet photon counting detektorer såsom lavin fotodiod (APD) eller GaAsP detektorer tillsammans med dedikerad specialiserad programvara som inte rutinmässigt finns på standard confocal instrument. En omfattande analys av precisionen i ICS bestäms denna teknik kan mäta antalet kluster där > 1 partikel är närvarande inom beam fokal plats av laser scanning Mikroskop⁷.

Insamling av lämpliga fluorescerande bilder är av avgörande betydelse för en framgångsrik ICS-analys. Regionen av intresse måste innehålla en hög signal-bakgrund fluorescerande förhållande med laser och få stödnivåer justeras för att ta bort någon signal mättnad. Cellulära regionen fångas måste vara oversampled med en pixelstorlek på cirka 50 nm. Denna region skall vara homogen, med noggrann uppmärksamhet betalas till undvika cellulära kanter eller korsningar som kan öka artefakter i beräkningen autokorrelation. En av de stora fallgroparna med ICS tillvägagångssätt är känsligheten för heterogena cellulära ytor. Således kommer att att begränsa regionen fångas den maximala plan yta, oavsett cell form förbättra noggrannheten i någon ICS-analys.

Flera avbildningsmetoder har utforskats för att studera sammanläggning av receptor komplex. Elektronmikroskopi (EM) ger högupplösta spatial bedömning av protein kluster men verkar under extremt högt vakuum och gäller inte för studier som kräver temporal upplösning. EM är ytterligare begränsat eftersom dess hårda provberedning är oöverkomliga för levande vävnad utredningar⁵. För att övervinna de inneboende resolution begränsningarna av standard konfokalmikroskopi, Förster resonans energiöverföringen kan (bandet) användas för att beräkna den rumsliga organisationen av strukturer märkt med överlappande givare och acceptor fluorophores par¹⁶ . Trots dess känslighet ger bandet men inte information om storleken av aggregaten enligt undersökningen⁶. Utvecklingen av olika super upplösning fluorescence mikroskopi metoder ger spännande möjligheter att lösa cellulära objekt inte möjligt med standardupplösning confocal metoder^17,18. De kostnader och den kompetens som krävs av sådan teknik och sådana instrument, begränsar deras nuvarande vardagsmat tillgänglighet.

Med ökad känslighet och låg foto-toxicitet i confocal instrumentation utökas bild korrelation spektroskopi för att utforska tidsmässiga förändringar av receptorn aggregation i levande celler i time-lapse experiment. Detta kan vara kontrasteras med ökande laser kraften används för att medvetet framkalla foto blekning av enskilda prover med efterföljande ICS bedömning (pbICS) att retas isär den högre ordningens aggregationen i vissa receptor komplex⁹. En ytterligare anpassning, bild cross-korrelation spektroskopi (ICCS) ger en analys av samtidig localizationen av två baserat membranproteiner genom analys av bild par för varje fluorescently märkt protein¹⁹. Styrkan i denna bild korrelation spektroskopi metod är att det utnyttjar tekniker väl etablerade i området och ger en fritt tillgänglig analys pipeline till kvantitativa de mycket dynamiska händelser på cellmembranet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass - 8 well	ThermoFisher Scientific	155409
DPBS, no calcium, no magnesium	ThermoFisher Scientific	14190144
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher Scientific	10099141
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red	ThermoFisher Scientific	12604021
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15140122
GlutaMAX Supplement	ThermoFisher Scientific	35050061
Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A11013
TetraSpeck Fluorescent Microsphere Standards 0.1µm	ThermoFisher Scientific	T7279
Cetuximab	Merck Serono	3023715501
Parafilm M 38mx100mm	Merck Millipore	BRND701605
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution	ProSciTech	C004
Recombinant Human EGF	R&D System	236-EG