Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

عزل الخلايا الجذعية الوسيطة من السمحاق السنخية البشرية وآثار فيتامين د على نشاط الخلايا المستمدة من السمحاق أوستيوجينيك

Published: May 4, 2018 doi: 10.3791/57166
Automatic Translation
1,2, 3, 1,4,5,6, 1,7,8
1Chang Gung University, 2Department of Periodontics, Chang Gung Memorial Hospital, 3California Northstate University College of Medicine, 4Department of Nephrology, Clinical Poison Center, Chang Gung Memorial Hospital, 5Kidney Research Center, Chang Gung Memorial Hospital, 6Center for Tissue Engineering, Chang Gung Memorial Hospital, 7Department of Periodontics, Chang Gung Memorial Hospital, 8College of Oral Medicine, Taipei Medical University

Summary

نقدم بروتوكولا للتحقيق في المؤشرات الحيوية التعبير مرناً للخلايا المستمدة من السمحاق (PDCs) الناجم عن فيتامين ج (فيتامين ج) و 1, 25-ديهيدروكسي فيتامين د [1,25-(OH)2د3]. وبالإضافة إلى ذلك، نقوم بتقييم قدرة PDCs تفرق في أوستيوسيتيس وتشوندروسيتيس و adipocytes.

Abstract

الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) الموجودة في مجموعة متنوعة من الأنسجة، ويمكن أن تكون متباينة في العديد من أنواع الخلايا، بما في ذلك خلايا الاوستيوبلاستس. بين مصادر MSCs الأسنان، هو السمحاق أنسجة يسهل الوصول إليها، والتي تم تحديدها لاحتواء MSCs في طبقة كامبيوم. إلا أن هذا المصدر لم حتى الآن على نطاق واسع تدرس.

فيتامين د3 و 1,25-(OH)2د3 ثبت لتحفيز في المختبر التمايز من MSCs إلى خلايا الاوستيوبلاستس. وبالإضافة إلى ذلك، يسهل فيتامين ج الكولاجين تشكيل والعظام نمو الخلايا. ومع ذلك، حقق أي دراسة بعد آثار فيتامين (د)3 وفيتامين ج على MSCs.

نقدم هنا، وسيلة لعزل MSCs من السمحاق السنخية البشرية، والنظر في الفرضية القائلة بأن 1,25-(OH)2د3 قد بذل تأثير أوستيويندوكتيفي على هذه الخلايا. ونحن أيضا التحقيق في وجود MSCs في السمحاق السنخية البشرية وتقييم التصاق الخلايا الجذعية وانتشار. لتقييم قدرة فيتامين ج (كعنصر تحكم) وتركيزات مختلفة من 1,25-(OH)2د3 (10−10و 10−9، 10−8و 10−7 م) لتغيير مفتاح المؤشرات الحيوية مرناً في العظام التعبير مرناً MSCs معزولة عن الفوسفاتيز القلوية (حزب العمال الأسترالي)، سيالوبروتين (BSP) وعامل الربط الأساسية ألفا-1 (CBFA1)، الكولاجين-1 osteocalcin (OCN) يتم قياس استخدام الوقت الحقيقي البلمرة المتسلسل (RT-PCR).

Introduction

على الرغم من أن العديد من التقنيات ذات الصلة قد وضعت في السنوات الأخيرة، العظام التعمير تظل محدودة بقيود متعددة، وتقدير مدى إعادة البناء الضرورية وكثيراً ما يستحيل. تكبير الأنسجة الثابت مطلوب لتحقيق الأهداف الجمالية والفنية على حد سواء بالإضافة إلى نسبة نجاح الطويل الأجل مواتية. وتشمل الأساليب المستخدمة عادة لمثل هذه الإجراءات تطعيم العظم الغازي و allogenic، إكسينوجرافتينج، وتطعيم العظم اللوبلاستيك. بين مختلف أنواع الفساد العظام، وترقيع العظام الغازي تعتبر الأكثر فعالية. ومع ذلك، كانت المانحة الموقع الاعتلال والشبهة الأوعية الدموية والأنسجة محدودية توافر1 العوائق الرئيسية لتطعيم العظم الغازي. وباﻹضافة إلى ذلك، ارتبطت ترقيع العظام allogenic وتكثيفها بانتقال المرض. وحاليا، ترقيع العظام الاصطناعية تستخدم على نطاق واسع لحل هذه المشاكل. ومع ذلك، مع افتقارها إلى الإمكانات أوستيوجينيك، النتائج السريرية قد تفاوتت تفاوتاً كبيرا. المواد، مثل السليلوز المرتبطة بتقلب حجم، والعدوى، والافتقار إلى القوة.

تكبير العظام باستخدام هندسة الأنسجة قد ولدت قدرا كبيرا من الاهتمام. في هذا الأسلوب، الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) في البداية تستخدم لتعزيز التمايز osteoblast، التي يتم زرعها ثم إلى موقع فقدان العظام لتحقيق إصلاح العظام. ويطبق هذا الإجراء حاليا في العلاج بالخلايا. تحقيق إعادة إعمار العظام باستخراج كمية محدودة من الأنسجة أبسط وأقل الغازية مقارنة بالأساليب الأخرى.

الدور المحتمل ل MSCs كأداة للعلاج يستند إلى الخلية التي تهدف إلى تجديد الأسنان مصلحة ناشئة بين مختلف المجموعات البحثية. وقد أكدت الدراسات أن MSCs يمكن أن تكون متباينة من الأنواع التالية من الأنسجة: نخاع العظام والأغشية الدهنية، الزليلي، بيريسيتي، العظم ترابيكولار، الحبل السري البشري وأنسجة الأسنان2،3. وتشمل المصادر الشائعة ل MSCs نخاع العظام والأنسجة الدهنية وأنسجة الأسنان. بالمقارنة مع MSCs المستمدة من نخاع العظام والأنسجة الدهنية، مزايا الخلايا الجذعية طب الأسنان هي سهولة الحصول عليها وأقل معدلات الاعتلال بعد الحصاد. بالمقارنة مع الخلايا الجذعية الجنينية، MSCs المستمدة من أنسجة الأسنان تظهر نونيمونوجينيك ولا ترتبط بالشواغل الأخلاقية المعقدة3.

وفي عام 2006، أوصت "الجمعية الدولية" للعلاج باستخدام المعايير التالية لتحديد MSCs: أولاً، MSCs يجب أن تكون قادرة على ربط للبلاستيك. ثانيا، يجب أن تكون MSCs الإيجابية المستضدات السطحية CD105 و CD73 و CD90 والسلبية للعلامات وحيدات، الضامة، والخلايا ب الإضافة إلى مولدات المكونة للدم CD45 و CD344. MSCs كمعيار نهائي، يجب أن يكون قادراً على التفريق في الأنواع الثلاثة التالية من الخلايا تحت الظروف القياسية من التمايز في المختبر : خلايا الاوستيوبلاستس و adipocytes chondrocytes4. وحتى الآن، تم عزل ستة أنواع من الخلايا الجذعية البشرية الأسنان وتتميز. النوع الأول كان معزولاً من الأنسجة البشرية اللب وتسمى الخلايا الجذعية لب الأسنان بعد الولادة5. في وقت لاحق، تم عزل ثلاثة أنواع إضافية من MSCs الأسنان وتتميز: الخلايا الجذعية من سينظف الأسنان المتساقطة6و أربطة اللثة7الحليمة قمي8. في الآونة الأخيرة، المستمدة من جريب الأسنان9و المستمدة من أنسجة اللثة10براعم الأسنان الجذعية cells(DBSCs)11ذروية كيسه MSCs (هبسي-MSCs)12 حددت أيضا.

وكان فريدينستين أول تعريف MSCs13. MSCs يحمل إمكانية انتشار عالية ويمكن التلاعب بها للتفريق بين قبل يجري زرعها، مما يوحي بأن هم المرشحين المثالي لإجراءات التجدد10.

على الرغم من أن معظم الدراسات قد استخدمت النخاع العظمى كمصدر للخلايا الجذعية، الخلايا المستمدة من السمحاق (PDCs) كما تم استخدامه مؤخرا14. السمحاق أكثر سهولة مما نخاع العظام. ولذلك، هذا الأسلوب، نستخدم سمحاق السنخية للقضاء على الحاجة إلى شقوق إضافية أثناء الجراحة وتقليل الاعتلال بوستسورجيكال في المرضى. السمحاق هو النسيج الضام التي تشكل بطانة الخارجي للعظام الطويلة، وتضم اثنين من طبقات مختلفة: الطبقة الليفية الخارجية تتألف من الخلايا الليفية، والكولاجين والألياف المرنة15، وطبقه كامبيوم الغنية بالخلايا الداخلية في الاتصال المباشر مع سطح العظم. طبقة كامبيوم يحتوي على محتوى خلية مختلطة، أساسا الليفية16وخلايا الاوستيوبلاستس17بيريسيتيس18يتدنى حرجة المحددة ك MSCs19،،من2021. وقد أفادت معظم الدراسات أن PDCs قابلة للمقارنة، أن لم يكن متفوقة، على الخلايا الجذعية المشتقة من نخاع العظم (بمسكس) في العظام شفاء وتجديد22،،من2324. يمكن الوصول إليها بسهولة السمحاق والمعارض فعالية التجدد ممتازة. ومع ذلك، ركزت دراسات القليلة على ال26،25،سمحاق27.

وفيما يتعلق بإصلاح العظام، ينطوي الممارسة السريرية الحالية زرع الخلايا السلف periosteal تضخيم داخل السقالات الداعمة. ركزت الدراسات التي أجريت مؤخرا على الحصول على الخلايا الجذعية في المناطق المعيبة وتستخدم الخلايا السلف ل تجديد الأنسجة20. كما توقع أطباء الأسنان التطبيق المستقبلي للتجدد العظام اللثة في علاجات اللثة وزراعة الأسنان. فيما يتعلق بالموقع، والجهات المانحة يمكن حصادها في السمحاق بسهولة بجراحي طب الأسنان العام. يقارن هذا مشجعا للغاية ضد الخلايا اللحمية في النخاع، كما يمكن الوصول إليها في السمحاق أثناء الجراحة الفموية الروتينية. وهكذا، والهدف من هذه الدراسة هو لوضع بروتوكول لحصاد PDCs ولتقييم مورفولوجيا والمرفقات، والبقاء، وتكاثر الخلايا الجذعية البشرية السمحاق.

والايضات فيتامين (د) يؤثر في فيفو العظام المعدنية ديناميكية التوازن. وأفادت إحدى الدراسات أن2د 24R,25-(OH)3 النموذج النشط من فيتامين (د) أمر ضروري للتفريق بين أوستيوبلاستيك البشرية MSCs (همسكس)28. ينظم التوازن العظام وإصلاح شبكة من فيتامين (د)3 نواتج الأيض، من الذي 1,25-(OH)2د3 (الكالسيتريول) هو الأكثر بيولوجيا نشطة وذات الصلة في التنظيم لصحة العظام. فيتامين د3 ضروري تكلس29. وأوضحت الهيئات امبريويد في الفئران في دراسة واحدة باستخدام الفئران كونمينغ بيضاء عمرها 2 د، أن مكملات فيتامين (ج) وفيتامين (د) عززت فعالية التفريق بين خلايا الاوستيوبلاستس المستمدة من ESC30. ضمن أنشطته البيولوجية الأخرى، 1,25-(OH)2د3 يحفز التمايز في المختبر من همسكس إلى خلايا الاوستيوبلاستس، التي يمكن رصدها استناداً إلى الزيادة في نشاط إنزيم الفوسفاتيز القلوية (حزب العمال الأسترالي) أو الجينات OCN التعبير.

وقد كشف دراسات قليلة علاقة جرعة واستجابة للعلاجات مجتمعة مع 1,25-(OH) وفيتامين ج2د3 في PDCs البشرية مع تركيز بوجه خاص على هندسة الأنسجة العظام. ولذلك، في هذه الدراسة، ندرس التركيزات المثلى لمعاملة مفردة أو مجتمعة من 1,25-(OH)2د3 وفيتامين (ج) لحفز التفريق بين osteogenic PDCs البشرية. والهدف من هذا البروتوكول لتحديد ما إذا كان عدد سكان خلية المعزولة من السمحاق السنخية الأسنان يحتوي على الخلايا التي تحتوي النمط الظاهري ماجستير وما إذا كان يمكن التوسع في الثقافة (في المختبر) هذه الخلايا ومتباينة لتشكيل النسيج المطلوب . وبالإضافة إلى ذلك، نقوم بتقييم قدرة PDCs تفرق في أوستيوسيتيس وتشوندروسيتيس و adipocytes. الجزء الثاني من هذه الدراسة تقييم آثار فيتامين ج و 10−1010−9، 10−8و 10−7 ، 1,25-(OH) م2د3 على نشاط osteogenic PDCs. الهدف الرئيسي من هذه الدراسة تقييم وظائف فيتامين ج و 1,25-(OH)2د3 خلال التفريق بين PDCs أوستيوبلاستيك بنشاط حزب العمال الأسترالي، والجينات برو أوستيوجينيك، مثل حزب العمال الأسترالي، الكولاجين-1، OCN، BSP، و CBFA1. وبالإضافة إلى ذلك، تحدد هذه الدراسة الشروط أوستيويندوكتيفي الأمثل للبشرية PDCs استناداً إلى هذه النتائج.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وأقر بروتوكول الدراسة "المؤسسية استعراض المجلس تشانغ الأمنيون التذكارية المستشفى". وقدمت جميع المشاركين الموافقة الخطية.

1-إعداد الأنسجة

  1. حصاد الأنسجة بيريوستيل من المرضى أثناء جراحة الأسنان (الشكل 1). بعد تفكير رفرف تحت التخدير الموضعي، يأخذ قطعة من نسيج سمحاق العظام السنخية باستخدام فاصل periosteal31.
  2. بعد الحصاد، تخزين شرائح الأنسجة periosteal حوالي 5 مم × 2 مم في الفوسفات مخزنة المالحة دولبيكو (دببس) مع يو/مليلتر 300 البنسلين و 300 ملغ/مل من ستربتوميسين. نقل الأنسجة إلى المختبر خلال 24 ساعة.
  3. فرم الشظايا الأنسجة periosteal السنخية مع المشارط حتى مفروم جيدا والمحافظة على العينات في المرور 0 المتوسطة (التي تتألف من 300 يو/مليلتر من البنسلين و 300 ملغ/مل ستربتوميسين، α-الفنزويلية، ونسبة 5% مصل بقرى الجنين [FBS]) المزروع في حاضنة في 37 درجة مئوية مع هوميديفيد الهواء (ثاني أكسيد الكربون 5%). في الحاضنة، إعداد حوض الماء للحفاظ على رطوبة.
  4. تغيير المتوسطة بعد 3 أيام ومرتين في الأسبوع بعد ذلك.
  5. عندما وصلت الخلايا سوبكونفلوينسي (80%)، الإفراج عن الخلايا ملتصقة مع 200 ميليلتر من التربسين 0.25% في الحاضنة (37 درجة مئوية) لمدة 3 دقائق ومن ثم استخدام 4.5 مل متوسطة إلى إنهاء رد فعل.
  6. لوحة الخلايا مرة أخرى في المتوسط مرور جديدة 1 (α-الفنزويلية، 10% FBS، 100 وحدة/مل من البنسلين، و 100 ميكروغرام/مل من ستربتوميسين). لوحة هو 5 × 103 الخلايا (كما عد من هيموسيتوميتير).
  7. أداء كل مرور اللاحقة بعد تحقيق التقاء 80%31من الخلايا.
    ملاحظة: في البداية، سوف تكون المتوسطة البرتقالي الأحمر. وبعد ثلاثة أيام تقريبا، يجب تغيير اللون المتوسط إلى ظل مصفر. الوقت مضاعفة الخلايا تقريبا ح 30-40، التي تحتاج إلى 7 أيام للأجيال 3-5.
  8. وتستكمل الثقافة PDCs معزولة في α-الفنزويلية مع 10% FBS، يو مليلتر 100 من البنسلين، و 100 مغ/مل من ستربتوميسين في حاضنة (37 درجة مئوية، 5% CO2).
  9. مراقبة نمو الخلايا يوميا واستبدال المتوسطة النمو مرتين في الأسبوع. استخدام خلايا الجيل الثالث إلى الخامس لتجارب إضافية.

2-التدفق الخلوي

  1. الحصاد 1 × 106 الخلايا عن طريق الهضم التربسين:
    1. إضافة 200 ميليلتر من 0.25% التربسين. بعد 3 دقائق، استخدام 4.5 مل من الثقافة المتوسطة التي تحتوي على FBS لإنهاء رد فعل التربسين وجمعها عن طريق الطرد المركزي (1500 لفة في الدقيقة، 5 دقائق، 22 درجة مئوية).
    2. تغسل الكريات الخلية باستخدام ثلاث مرات 1 x DPBS. ريسوسبيند الخلايا في 200 1 x ميليلتر permeabilization المخزن المؤقت. عد الخلايا مع هيموسيتوميتير.
  2. فحص العلامات السطحية أعرب أعرب من PDCs من خلال التدفق الخلوي (الأسفار تنشيط الخلية الفرز)32. استخدام الأجسام المضادة (ماب) ضد CD19 (fluorescein isothiocyanate (فيتك))، CD34 (فيتك)، CD44 (Phycoerythrin [بي])، CD45 (فيتك)، CD73 (PE)، CD90 (اللوفيكوسيانين [APC])، CD146 (PE) وقامت-1 (أليكس)، والدكتور هلا (فيتك)32.
    1. إضافة الأجسام المضادة للعينات والثقافة في الظلام عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    2. تغسل الخلايا مع 1 x DPBS ثلاث مرات.
    3. إصلاح الخلايا باستخدام 2% فورمالدهايد والمضي قدما في التدفق الخلوي التحليل32.

3-خلية المرفقات والبقاء مع أوستيوجينيك، أديبوجينيك، والتمايز تشوندروجينيك

الحث على التمايز في الخلايا في أوستيوجينيك، أديبوجينيك، وتشوندروجينيك الأنساب باستزراع الخلايا periosteal في كل المعابر الثلاثة على ألواح ستة-جيدا مع وسائل الإعلام التمايز محددة.

  1. للتفريق بين أوستيوجينيك، ثقافة الخلايا في α-الفنزويلية في كثافة الخلايا 5000 كل بئر على ألواح الثقافة ستة آبار.
    1. على تحقيق التقاء 80%، ثقافة الخلايا الموجودة في الوسائط التي تحتوي على α-الفنزويلية، 5% FBS، β-جليسيروفوسفاتي (10 ملم)، 10−7 م الديكساميتازون (0.1 مم)، و 5 مل حمض الأسكوربيك (100 أم). الثقافة مراقبة سلبية في وسائل الإعلام التي تتألف من α-MEM و 5% FBS.
    2. تغيير الوسائط مرتين في الأسبوع.
    3. بعد 4 أسابيع، تقييم إمكانات الخلايا تفرق في نسب أوستيوجينيك واسطة تلطيخ الخلايا باستخدام مقايسة فون كوسي، الذي يميز بين وجود رواسب متكلسة في ثقافة33.
      1. إضافة الفورمالين 10% لتحديد. خلال 30 دقيقة، إضافة نترات الفضة 5% وعلاج تحت الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) الضوء على ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
      2. إضافة 5% Na2حتى4 أربع مرات، مما يسمح 3 دقائق لكل رد فعل. وأخيراً، غسل الخلايا مرتين بماء مقطر.
        ملاحظة: فون كوسي تلطيخ رد فعل هطول الأمطار حيث تتفاعل أيونات الفضة والفوسفات حضور المواد الحمضية؛ هذا الأسلوب المصبوغة ليست محددة للكالسيوم. في هذه الدراسة، عندما كانت تعامل الخلايا يتم التحقيق مع محلول نترات الفضة، الكالسيوم – الذي يخفض بقوة الأشعة فوق البنفسجية – محله الفضة، التي أصبحت تظهر الفضي المعدني.
  2. أديبوجينيك التفريق، ثقافة الخلايا في كثافة الخلايا 5000 كل بئر على ستة آبار الثقافة لوحات تتضمن α-الفنزويلية.
    1. على تحقيق التقاء 80%، ثقافة الخلايا الموجودة في الوسائط التي تحتوي على α-الفنزويلية، 5% FBS، 0.5 مم 3-إيسوبوتيل-1-زانتين (100 مغ/مل)، البنسلين 1%، 10−6 م الديكساميتازون (1 مم) والإنسولين (5 ملغ/مل) الاندوميتاسين (60 ملم).
    2. الثقافة مراقبة سلبية في وسائل الإعلام التي تتألف من α-MEM و 5% FBS.
    3. بعد 6 – 9 أسابيع، استخدام النفط س الأحمر وصمة عار الخلايا وإبراز قطرات الدهن، وبالتالي تحديد وجود التمايز أديبوجينيك33:
      1. إضافة الفورمالين 10% لتحديد. خلال 30 دقيقة، وصمة عار الخلايا التي تحتوي على 0.5% النفط يا أحمر في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق، ويغسل الخلايا ثلاث مرات مع الايزوبروبانول 60% لمدة 3 دقائق في كل مرة؛ وأخيراً، غسل الخلايا بالماء المقطر.
        ملاحظة: الزيت الأحمر س ليسوتشرومي صبغة ديازو (تذوب) تستخدم لتلطيخ الدهون محايدة، أساسا استرات triacylglycerol والبروتين الدهني، ونسبة الكولسترول في الدم. الصبغ يذوب في قطرات الدهون في الخلية، تحول قطرات الدهن الأحمر.
  3. تشوندروسيتي التفريق، خلايا الثقافة على ألواح الثقافة ستة-جيدا مع بعضها التي تحتوي على الخلايا 5000.
    1. إضافة تمايز متوسطة المحتوية على α-MEM 5% FBS، 10−7 م الديكساميتازون (0.1 مم)، بيروفات صوديوم (100 ميكروغرام/مل)، الأنسولين-ترانسفيرين-السيلينيوم-أ (1 × لها)، وتحويل عامل النمو-بيتا (10 نانوغرام/مل) و 5 مل من حمض الأسكوربيك (100 ميكرومتر).
    2. الثقافة مراقبة سلبية في وسائل الإعلام التي تتألف من α-MEM و 5% FBS.
    3. بعد 4 – 5 أسابيع، استخدم السيان الأزرق تلطيخ لتسليط الضوء على السكريات الحمضية، مثل الجليكوزامينوجليكان أو بعض أنواع mucopolysaccharides في غضروف الخلايا لتحديد وجود التمايز تشوندروسيتي33.
      1. إضافة الفورمالين 10% لتحديد. خلال 30 دقيقة، إضافة 3% حمض الخليك وتسمح 2 دقيقة لرد الفعل. وفي وقت لاحق، تغسل بالماء المقطر ثلاث مرات وإضافة 1% السيان الأزرق 8GX المحتضنة لمدة 30 دقيقة وثم يغسل بالماء المقطر. أخيرا، إضافة حمض الخليك 3% والمياه والصرف الصحي لمدة 3 دقائق ومن ثم يغسل بالماء المقطر لإنهاء.
        ملاحظة: بعد تلطيخ أجزاء الخلية التي وصمة عار على وجه التحديد بهذه الصبغة يصبح الأزرق إلى الأخضر والأزرق وتسمى "السيانوفيليك".

4-آثار 25-ديهيدروكسيفيتامين د3 (1,25-(OH)2د3) في تكون العظم

  1. تقسيم P3 إلى P5 PDCs إلى ست مجموعات والثقافة على ألواح 6-جيدا مع وسائل الإعلام المختلفة في الثقافة:
  2. مجموعة السلبية (α-MEM و 5% FBS)؛
  3. مجموعة فيتامين C (α-الفنزويلية، 5% FBS، 10 مم β-جليسيروفوسفاتي، ودكساميثازون 10−7 م + 100 أم فيتامين (ج))؛
  4. و 10−7 م 1,25-(OH)2د3 المجموعة (α-الفنزويلية، 5% FBS، 10 مم β-جليسيروفوسفاتي، والديكساميتازون م−7 10 + 10−7 1,25-(OH) م2د3).
  5. إضافة 2 مل الوسط إلى حاضنة (37 درجة مئوية) في كل بئر وتغيير في المتوسط مرتين كل أسبوع.

5-عكس النسخ/الكمية في الوقت الحقيقي البلمرة المتسلسل

  1. بعد 7 د التمايز osteoblast، عزل الجيش الملكي النيبالي إجمالي على الجليد باستخدام كاشف تجاري (انظر الجدول للمواد):
    1. أضف 1 مل كاشف العزل لكل بئر. إضافة 200 ميليلتر من بروموتشلوروبروباني وتترك لمدة 10 دقيقة لتوليد الطبقات الجيش الملكي النيبالي، وثم الطرد المركزي في 10000 لفة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
    2. بعد الطرد المركزي، إضافة 500 ميليلتر من 2-بروبانول إلى 500 ميليلتر من الجيش الملكي النيبالي الذي يتضمن طافية. يعجل بالجيش الملكي النيبالي على الجليد، والسماح لمدة 15 دقيقة لرد الفعل.
    3. بعد الإجراء الطرد المركزي 12,000 لفة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة على 4 درجة مئوية، وبعدها الجيش الملكي النيبالي يقع في الجزء السفلي من الأنبوب. وفي وقت لاحق، إزالة المادة طافية باستخدام 1 مل كحول 75% للغسيل والطرد المركزي 7,500 لفة في الدقيقة لمدة 8 دقائق في 4 درجات مئوية.
    4. إزالة المادة طافية واستخدام مركز فراغ لإنتاج الحمض النووي الريبي من الجزء السفلي من السائل. استرداد مع الماء.
  2. عكس نقل الجيش الملكي النيبالي (1 ميكروغرام) استخدام المنتسخة العكسية فيروس إنفلونزا الطيور ميلوبلاستوسيس. تعيين البلمرة المتسلسل (PCR) لتشغيل عند 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق تليها 50 درجة مئوية عن 60 دقيقة ومن ثم 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، قبل أخيرا الحفاظ على 4 درجة مئوية.
  3. توليف الحمض النووي التكميلية الأولى-ستراند (كدنا). إجراء PCR الكمي (قبكر) باستخدام 5 ميكروليتر من 01:10 إضعاف كدنا. إجراء كمي RT-PCR (قرة-PCR) باستخدام كبسولة تفجير لحزب العمال الأسترالي، باهوجان ساماج، OCN، CBFA1، والكولاجين-1.
    ملاحظة: لتجنب تلويث الحمض النووي بالإشارات، صممت تسلسل إلى الأمام وعكس كل التمهيدي على exons متميزة.
  4. أداء قبكر باستخدام سيد بكر تجارية مزيج (انظر الجدول للمواد) وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. تعيين cycler الحرارية عند 50 درجة مئوية 2 دقيقة تليها 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق وثم 40 دورات كل منها عند 95 درجة مئوية لمدة 15 s يليه 60 درجة مئوية ل 60 ثانية.
    ملاحظة: يتطلب البروتوكول سيبر أيضا مرحلة منحنى تذوب، الذي يتم تشغيله عند 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 60 درجة مئوية مقابل 60 s، ومن ثم 95 درجة مئوية لمدة 15 ق.
  5. تطبيع قيم العتبة دورة لحزب العمال الأسترالي، باهوجان ساماج، CBFA1، الكولاجين-1، و OCN لأن الجينات التدبير المنزلي جابده. 34
  6. وترد في الجدول للموادأزواج التمهيدي.

6. النشاط الفوسفاتيز القلوية

  1. تقييم نشاط إنزيم الب الخلايا باستخدام الأسلوب هو موضح سابقا35، الذي يحول الفوسفات-نيتروفينيل ف لف-نيتروفينول؛ فنيتروفينيل الفوسفات هو ركيزة الفوسفاتيز الذي يتحول إلى اللون الأصفر عند ديفوسفوريلاتيد من حزب العمال الأسترالي، كما هو محدد في طول موجي 405 نانومتر. تطبيع المجموع فنيتروفينول شكلت استناداً إلى مجموع البروتين يحددها المقايسة برادفورد.
  2. مقارنة أنشطة حزب العمال الأسترالي لعنصر التحكم (α-الفنزويلية، 5% FBS)، فيتامين ج (α-الفنزويلية، 5% FBS، 10 مم β-جليسيروفوسفاتي، الديكساميتازون 10−7 م + 100 أم فيتامين ج)، 1,25-(OH)2د3 (α-الفنزويلية، 5% FBS، 10 مم β-جليسيروفوسفاتي، 10−7 م الديكساميتازون + 10−8 م 1,25-(OH)2د3)، وفيتامين ج + 1,25-(OH)2د3 (α-الفنزويلية، 5% FBS، 10 مم β-جليسيروفوسفاتي، الديكساميتازون 10−7 م + 100 أم فيتامين ج +1,25-(OH)2د3) المجموعات بعد أسبوع 1، 2، 3، و 4 من الثقافة.
  3. تنفيذ إجراء استخراج بروتين على الجليد:
    1. تتخلص الخلايا من لوحات 6-جيدا وإضافة 50 ميليلتر من تحلل المخزن المؤقت. وفي وقت لاحق، مكان الخلايا على الجليد مدة 30 دقيقة لتدمير الخلايا وخالية من البروتين.
    2. وبعد 30 دقيقة، الطرد المركزي في 13000 دورة في الدقيقة عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد الطرد المركزي، واستخراج المادة طافية لتخزين واستخدام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ترد البيانات لجميع الاختبارات الكمية، كما يعني ± الانحراف المعياري (SD). أجريت جميع التحليلات الإحصائية باستخدام الطالب t-اختبار. وفي المجموع، تم الحصول على العينات 34 مع متوسط عمر المشاركين من 48.1 ± 12.3 يوسف أحد عشر من هذه العينات التي تم الحصول عليها من المرضى الذكور و 23 من المرضى الإناث. وتم الحصول على عينات ثمانية وعشرون من المناطق المولى وستة من المناطق الأمامية؛ وتم الحصول على 26 من الفك الأعلى و 8 من الفك السفلي. وكانت مدة يعني بين إجراءات طب الأسنان والثقافة ± 0.5 0.1 ح. عينات التحقيق 34، أثمر 20 بنجاح المستعمرات MSC، مع معدل نجاح عزل 58.8 في المائة. لوحظ وجود لا اختلافات كبيرة في أي من المعلمات بين بنجاح و PDCs معزولة دون جدوى (متوسط عمر: ± 48.8 13.0 مقابل 47.1 ± 11.5 y، الجنس: الرجال 7 (35 في المائة) مقابل الرجال 4 [28.6 في المائة]، الموقع: 15 من مناطق المولى [75%] مقابل 13 [92.9%]، و 15 من الفك الأعلى [75%] مقابل 11 [78.6%]، على التوالي).

الخلية والعزلة ومورفولوجيا: أوستيوجينيك، تشوندروجينيك، والتمايز أديبوجينيك

من الأيام 1-9، شكلت PDCs المستعمرات وتجمعات كروية. معظم الخلايا أظهرت مظهراً مغزل ومتجانسة تحت مجهر تباين مرحلة (الشكل 2). بعد 14 د الثقافة، ظهرت مورفولوجية الخلية على شكل المغزل كما لاحظ تحت المجهر المرحلة عالي التباين. بعد الجيل الأول من الخلايا، الخلايا لم تعد نما في مجموعات لكن أظهرت الانتشار على نطاق واسع وموحدة.

MSCs كانت على شكل عمود الدوران مع العمليات غير النظامية وإيمانا راسخا تعلق على الطبق الثقافة بعد د 1-3 من الثقافة الأولية (الشكل 2a). الثقافة الأولية أظهرت الصغيرة، جولة الخلايا والخلايا على شكل عمود الدوران تحت مجهر ضوئي. تعرض الخلايا المستزرعة شكل مغزل متجانسة، مثل تنتجها الخلايا الليفية من المقطع الأول (الشكل 2a). وكشفت الدراسة التمايز أن PDCs يمكن أن يكون سوبباساجيد ومتباينة في المختبر إلى خلايا الاوستيوبلاستس (الشكل 2)، تشوندروسيتيس (الشكل 2 (ج)) و adipocytes (الشكل 2d).

في نهاية للتفريق بين أوستيوجينيك، فون كوسي تلطيخ أشارت إلى وجود رواسب الكالسيوم والتمايز osteogenic (الشكل 2). وأشارت هذه النتائج بقوة إلى أن الخلايا السلف بين السكان خلية periosteal، تمتلك القدرة على التفريق بين داخل الخلايا أوستيوجينيك.

لتقييم إنتاج بروتيوجليكانس، السيان وصمة عار الأزرق كان يستخدم كمؤشر لتحديد وجود التمايز تشوندروسيتي (الشكل 2 (ج)). الخلايا المتمايزة بنجاح في تشوندروسيتيس. واقترحت هذه النتائج، خلايا السلف بين السكان خلية بيريوستيل، تمتلك القدرة على التفريق بين داخل الخلايا تشوندروجينيك.

كانت الخلايا المستزرعة في وسائط الإعلام المحددة المذكورة سابقا لتحريك التمايز أديبوجينيك. بعد 8 أسابيع، النفط الأحمر س كان يستخدم للكشف عن وجود الدهون داخل الخلايا. التالي تلطيخ، الدهون مجهرية داخل الخلايا وقد لوحظت قطرات في خمس عينات مختلفة (الشكل 2d).

تحليل تدفق سيتوميتريك ماركر سطح التعبير عن PDCs

وأجرى مقايسة سيتوميتريك تدفق لتأكيد التعبير عن علامة السطحية الوسيطة على سطح الخلايا. علامات ماجستير CD73 "و" CD90 "،" بهونغ-1 "و" CD44 بقوة إيجابية في PDCs، في حين كانت علامات النسب المكونة للدم CD19، CD34، CD45، والدكتور هلا السلبية.

آثار مختلف فيتامين د 3 التركيزات في تكون العظم

رغم تأكيد النتائج الآثار الإيجابية 1,25-(OH)2د3 (الكالسيتريول) في النشاط أوستيوجينيك، لوحظت فروق معتد بها إحصائيا فقط بين بعض التغييرات حظيرة في عبارات مرناً أوستيوجينيك الإنزيمات. قد تم متحيزة هذا التحليل بالقيم SD عالية، التي يمكن أن تعزى إلى الانحرافات الفردية بين المضيفين.

الحمض النووي الريبي رسول التعبير عن الفوسفاتيز القلوية

التغييرات حظيرة في التعبير مرناً من الب بعد أسبوع واحد من الثقافة كان 7.43 (SD = 3.96) في مجموعة فيتامين C و 7.15 (SD = 4.88)، 9.30 (SD = 5.63)، 12.92 (SD = 7.95)، و 6.60 (SD = 6.33) في 10−10، 10−9، 10−8 ، و 10−7 م 1,25-(OH)2د3 مجموعات، على التوالي (الشكل 4 أ). وكانت مستويات التعبير مرناً الب في فيتامين ج و 10−8 ، 1,25-(OH) م2د310−9 1,25-(OH) م2د3 مجموعات أعلى بكثير (p < 0.05) مما الفئات الأخرى، مما يشير إلى زيادة التعبير مرناً الب في هذه المجموعات. تم تعيين عنصر التحكم إلى القيمة 1. ولوحظت زيادات حظيرة التالية في التعبيرات مرناً الب في هذه الدراسة: 7.43-fold في مجموعة فيتامين (ج)؛ 9.30-fold في 10−9 م 1,25-(OH)2د3 المجموعة؛ و 12.92-fold في المجموعة3 2د 1,25-(OH) 10−8 م.

على الرغم من أن تغيير إضعاف أكبر في التعبير مرناً الب لوحظ في المجموعة3 2د 1,25-(OH) 10−8 م، لم توجد فروق معتد بها إحصائيا لم يلاحظ فيما يتعلق بهذه المستويات التعبير بين هذه المجموعة مجموعات فيتامين (ج) وسلبية (p = 0.20 و p = 0.52، على التوالي).

حزب العمال الأسترالي مؤشر قوي لتحديد التمايز أوستيوجينيك المبكر للخلايا. الب أيضا بمثابة اكتونزيمي لتدهور بيروفوسفات غير العضوية والنشرات الفوسفات خلال التمعدن36. PDCs تعامل مع فيتامين ج و 10−8 و 10−9 م 1,25-(OH)2د3 أظهرت اختلافات كبيرة بالمقارنة مع الفئات الأخرى (الشكل 4 أ).

الحمض النووي الريبي رسول التعبير عن سيالوبروتين العظام

كانت التغييرات حظيرة في عبارات مرناً باهوجان ساماج بعد أسبوع واحد من الثقافة 3.21 (SD = 1.20) و 4.18 (SD = 2.55)، 10.34 (SD = 10.31)، 24.91 (SD = 23.44)، و 5.24 (SD = 3.54) في فيتامين ج وال 10−10، 10−9، 10−8 ، و 10−7 م 1,25-(OH)2د3 مجموعات، على التوالي (الشكل 4 باء). التعبير مرناً باهوجان ساماج كانت أعلى في المجموعة3 2د 10−8 م 1,25-(OH)، ولكن مع لا دلالة إحصائية مقارنة مع التعبيرات المقابلة في المجموعات الأخرى.

التعبيرات مرناً باهوجان ساماج في فيتامين ج و 10−10 م 1,25-(OH)2د3 مجموعات كانت أعلى بكثير (p < 0.05) من تلك التي في الفئات الأخرى، والتي تشير إلى أن فيتامين ج و 10−10 م 1,25-(OH) 2 دال-3 تشجيع التعبير باهوجان ساماج. تم تعيين عنصر التحكم إلى قيمة 1. فيتامين ج و 10−10 م 1,25-(OH)2د مجموعات3 أظهرت زيادة 3.21 و 4.18 أمثال في التعبيرات مرناً باهوجان ساماج، على التوالي. −109 م و 10−8 م 1,25-(OH)2د3 مجموعات أظهرت تعبيرات مرناً باهوجان ساماج أعلى مما عليه المجموعات الأخرى. −109 و 10−8 م 1,25-(OH)2د3 مجموعات أظهرت زيادة 10.34 و 24.91 أمثال في التعبيرات مرناً باهوجان ساماج، على التوالي، ولكن هذه الزيادة لم يكن معتدا به إحصائيا (p > 0.05). التفسيرات المحتملة أن الخلايا الجذعية لم تكن جميعها التي تم الحصول عليها من المشارك نفسه. وهكذا، الاختلافات المحتملة قد زادت SD ونتيجة لذلك تتأثر النتائج الإحصائية.

الحمض النووي الريبي رسول التعبير عن CBFA1

كانت التغييرات حظيرة في التعبيرات مرناً CBFA1 بعد أسبوع واحد من الثقافة 0.96 (SD = 0.10) و 0.90 (SD = 0.26)، 1.01 (SD = 0.25)، 1.31 (SD = 0.32)، و 1.12 (SD = 0.35) في فيتامين ج وال 10−10، 10−9، 10−8 ، و 10−7 م 1,25-(OH)2د3 مجموعات، على التوالي (الشكل 4 ج). −108 1,25-(OH) م2د3 المجموعة أظهرت أعلى مرناً CBFA1 التعبيرات. لم تلاحظ أي تغييرات ملحوظة في تعبيرات الجين CBFA1 مرناً في مجموعات العلاج أو في السيطرة على المجموعة. وبالإضافة إلى ذلك، لم يلاحظ أي زيادة كبيرة في التعبير عن علامات مرناً بعد إضافة فيتامين ج أو 1,25-(OH)2د3. وعلاوة على ذلك، لوحظ وجود لا اختلافات انترجروب.

تعبير الرنا رسول الكولاجين-1

كانت التغييرات حظيرة في التعبير مرناً من الكولاجين-1 بعد أسبوع واحد من الثقافة 0.98 (SD = 0.17) و 0.85 (SD = 0.16)، 1.05 (SD = 0.16)، 1.52 (SD = 0.36)، و 1.01 (SD = 0.33) في فيتامين ج وال 10−10، 10−9، 10−8 ، و 10−7 م 1,25-(OH)2د3 مجموعات، على التوالي (الشكل 4 د). التعبير مرناً الكولاجين-1 كانت أعلى في المجموعة3 2د 10−8 م 1,25-(OH) ولكن مع لا فروق معتد بها إحصائيا بالمقارنة مع التعبيرات المقابلة في المجموعات الأخرى.

10−8 م 1,25-(OH)2د3 ومراقبة المجموعات أظهرت فروق معتد بها إحصائيا في نتائجها (ف < 0.05). تم تعيين عنصر التحكم إلى قيمة 1. ولوحظ زيادة بنسبة 1.52-fold في التعبير مرناً الكولاجين-1. 10−10 م 1,25-(OH)2د3 و 10−8 1,25-(OH) م2د3 المجموعات أظهرت وجود اختلافات كبيرة في نتائجها (ف < 0.05).

الحمض النووي الريبي رسول التعبير عن أوستيوكالسين

كانت التغييرات حظيرة في التعبيرات مرناً OCN بعد أسبوع واحد من الثقافة 0.60 (SD = 0.1) و 0.78 (SD = 0.18)، 1.13 (SD = 0.55)، 2.59 (SD = 1.59)، و 1.61 (SD = 0.73) في فيتامين ج وال 10−10، 10−9، 10−8 ، و 10−7 م 1,25-(OH)2د3 مجموعات، على التوالي (4e الشكل). التعبير مرناً OCN كانت أعلى في المجموعة3 2د 10−8 م 1,25-(OH) ولكن مع لا فروق معتد بها إحصائيا بالمقارنة مع التعبيرات المقابلة في المجموعات الأخرى.

لوحظ لا زيادة كبيرة في التعبير عن علامات مرناً OCN بعد إضافة فيتامين ج أو 1,25-(OH)2د3. ومع ذلك، انخفض التعبيرات مرناً OCN بعد العلاج فيتامين (ج). تم تعيين عنصر التحكم إلى القيمة 1. عبارات OCN القاعدية أظهرت انخفاضا كبيرا في 0.6-fold (ف < 0.05) خلال التمايز أوستيوبلاستيك. مرناً OCN تعبيرات كانت أعلى بكثير (p < 0.001) في الخلايا المستزرعة في 10−8 م 1,25-(OH)2د3 من التعبيرات المقابلة من الجماعات الأخرى، التي عرضت إضعاف متوسط زيادة 2.59. غير أن هذه النتائج لا يعتد به إحصائيا (p > 0.05). التفسيرات المحتملة أن الخلايا الجذعية لم تكن جميعها التي تم الحصول عليها من المشارك نفسه؛ وهكذا، الاختلافات المحتملة قد زادت SD ونتيجة لذلك تتأثر النتائج الإحصائية.

حزب العمال الأسترالي بنشاط الإنزيم

أظهرت دراسة سابقة أن 1,25-(OH)2د3 الأكثر فعالية بتركيز 10−8 م؛ ولذلك، استخدمت 10−8 م في مجموعة الاختبار لمقارنة القدرة أوستيوجينيك 1,25-(OH)2د3 مع أن السلبية وفيتامين ج، وفيتامين ج + 1,25-(OH)2د3 مجموعات. وأعرب القدرة أوستيوجينيك بنشاط حزب العمال الأسترالي. بعد أسبوع الثقافة (الشكل 5a)، كانت التغييرات حظيرة في نشاط حزب العمال الأسترالي 1.00 (SD = 0.00)، 1.92 (SD = 0.89)، 3.77 (SD = 1.66)، و 1.46 (SD = 0.49) في السلبية، ج، د، وج + د، على التوالي. بين جميع الفئات، لوحظت فروق معتد بها إحصائيا فقط بين المجموعات د والسلبية (p = 0.03؛ الشكل 5a). بعد أسبوعين ثقافة، كانت التغييرات حظيرة في نشاط حزب العمال الأسترالي (الشكل 5b) 1.00 (SD = 0.00)، 2.32 (SD = 1.68)، 4.98 (SD = 3.02)، و 4.86 (SD = 2.73) في السلبية، ج، د، وج + د، على التوالي. لم توجد فروق معتد بها إحصائيا لوحظت في أي من المجموعات. بعد 3 أسابيع ثقافة، كانت التغييرات حظيرة في نشاط حزب العمال الأسترالي (الشكل 5 ج) 1.00 (SD = 0.00)، 2.93 (SD = 2.15)، 5.76 (SD = 3.60)، و 5.61 (SD = 3.88) في السلبية، ج، د، وج + د، على التوالي. مرة أخرى، ولم توجد فروق معتد بها إحصائيا لوحظت في أي من المجموعات (الشكل 5 ج). بعد 4 أسابيع ثقافة، كانت التغييرات حظيرة في نشاط حزب العمال الأسترالي (الشكل 5 د) 1.00 (SD = 0.00)، 2.83 (SD = 1.97)، 3.79 (SD = 0.77)، و 4.24 (SD = 2.87) في السلبية، ج، د، وج + د، على التوالي. هنا، إلى الفئات دال وسلبية أظهرت فروق معتد بها إحصائيا (p = 0.00; د الشكل 5).

في الأسبوع 1، 10−8 م 1,25-(OH)2د3 المجموعة فقط عرضت اختلافات كبيرة مقارنة مع مجموعة التحكم (p = 0.03). في الأسبوع 2، 10−8 م 1,25-(OH)2د3 وفيتامين (ج) المجموعات أظهرت اختلافات كبيرة مقارنة مع مجموعة التحكم (p = 0.0498). في الأسبوع 3، أيا من الجماعات التي أظهرت اختلافات كبيرة مقارنة مع مجموعة التحكم. في الأسبوع 4، عرضت 10−8 1,25-(OH) م2د المجموعة3 اختلافات كبيرة مقارنة مع مجموعة التحكم. هذا وأوضحت أن 10−8 م 1,25-(OH)2د3 عززت نشاط حزب العمال الأسترالي.

وباختصار، زادت 10−8 1,25-(OH) م2د3 مجموعة معارضها الب والتعبير مرناً الكولاجين-1؛ عرضت مجموعة فيتامين ج الب معززا إلى حد كبير والتعبير مرناً باهوجان ساماج؛ وعرضت المجموعة3 2د 1,25-(OH) 10−9 م التعبير مرناً الب معززا إلى حد كبير. 1 أسبوع، لوحظ تزايد نشاط حزب العمال الأسترالي في 1,25-(OH) وفيتامين ج2د3 المجموعات ولكن مع لا فروق معتد بها إحصائيا بالمقارنة مع مستويات التعبير المطابق في المجموعات الأخرى. من 2 أسابيع إلى 4، عرضت كل من فيتامين (ج) و 1,25-(OH)2د3 مجموعات نتائج مماثلة. لذلك، هذه النتائج يمكن أن عدم وضوح توضيح آثار التآزر من فيتامين ج و 1,25-(OH)2د3 في التفريق بين الخلايا (نشاط حزب العمال الأسترالي) أوستيوجينيك.

Figure 1
رقم 1: السمحاق السنخية البشرية. كانت تحصد الأنسجة periosteal أثناء جراحة الأسنان. تدل العلامة النجمية موقع سمحاق السنخية.

Figure 2
رقم 2: دراسة التمايز. MSCs كانت على شكل عمود الدوران مع العمليات غير النظامية وإيمانا راسخا تعلق على الطبق الثقافة بعد د 1-3 من الثقافة الأولية (A؛ تشير العلامة النجمية إلى موقع الخلية الجذعية الوسيطة). ظروف في المختبر الثقافة، سوبباساجيد MSCs ومتمايزة إلى خلايا الاوستيوبلاستس (ب، العلامة النجمية الأسود يشير إلى منطقة الملون كوسي فون)، تشوندروسيتيس (ج، العلامة النجمية الأزرق يشير إلى منطقة الملون ب السيان الأزرق)، و adipocytes (د، العلامة النجمية الوردي يشير إلى منطقة ملطخة بالزيت يا أحمر). يتم إعادة استخدام الرقم 2 من الدولية البحوث الطبية الحيوية، 2016 التخزين، 3529561 معرف في المادة25. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: التدفق الخلوي- علامات السطحية التي أعرب عنها MSCs كانت CD73 (65.2%)، CD90 (75.6%)، قامت-1 (65.2%)، و CD44 (88.1%) لكن لا CD45 (1.34%)، CD34 (1.61%)، CD19 (2.18%)، أو هلا-الدكتور (2.20%). "%" في الشكل يشير إلى نسبة إيجابية. السيطرة على المجموعة (α-MEM و 5% FBS) ويمثل الخط الأحمر. ويمثل المجموعة التجريبية بالخط الأزرق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: تعبيرات مرناً. مرناً التعبير عن التمايز osteoblast ل 1 الأسبوع. باهوجان ساماج الب (ب) (أ)، CBFA1 (ج)، (د) العقيد-الأول، و OCN (E). ف < 0.05 *، ف < 0.01 * *، ف < 0.001 * * *. التغيير إضعاف مرناً مقابل عنصر تحكم (α-MEM و 5% FBS). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: النشاط الفوسفاتيز القلوية. النشاط الفوسفاتيز القلوية الاعتداء التمايز osteoblast (A) الأسبوع 1، 2 في الأسبوع (ب)، (ج) الأسبوع 3، و 4 في الأسبوع (د). ف < 0.05 *، ف < 0.01 * *، 0.001 < p * * *. التغيير إضعاف مقابل عنصر تحكم (α-الفنزويلية، 5% FBS). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

طريقة علاجية المتقدمة مؤخرا، إلا وهي الأنسجة الهندسة التي تستتبع MSCs، له فوائد عديدة. MSCs، التي موجودة في العديد من أنواع الأنسجة، هي multipotent الخلايا التي يمكن أن تفرق في مجموعة متنوعة من خلايا الأنسجة ميسوديرمال الوظيفية37 وغيرها من الخلايا مثل خلايا الاوستيوبلاستس.

السمحاق بمثابة محراب للخلايا السلف وإمدادات المفرج غنية للعظام من مظاريف38. في دراستنا، عينات التحقيق 34، أثمر 20 بنجاح المستعمرات MSC، مع معدل نجاح عزل 58.8 في المائة. MSCs المستمدة من السمحاق اختير في هذه الدراسة استناداً إلى الانتشار وقدراتهم التمايز osteogenic. وكان معدل انتشار الخلايا periosteal أعلى بكثير من أن الخلايا اللحمية نخاع22. وادعت أووسوال24 فيما يتعلق بقدرة أوستيوجينيك السمحاق، أن قدرة الخلايا الجذعية المشتقة من السمحاق (الشركات) أوستيوجينيك كان أدنى من بمسكس. ومع ذلك، تشهد يوشيمورا أن قدرة تلك الشركات osteogenic تفوقت من بمسكس39. هاياشي وآخرون. أظهر periosteal MSCs الكبار كالمرشحين المثالي ل تجديد أنسجة العظام24. وباﻹضافة إلى ذلك، MSCs الكبار periosteal تعتبر مفيدة في تقصير فترة ثقافة الخلية، مما يقلل من تكاليف ومخاطر التلوث22. وأفيد أن الشيخوخة يؤثر أيضا على نشاط الخلايا أوستيوبروجينيتور40ميتوجينيك. وأفادت دراسة 1,25-(OH)2د3 الناجمين عن درجة أعلى من التحفيز في المختبر التمايز أوستيوبلاست في همسكس من الشباب المشاركين (65 عاماً < y)41. وشملت هذه الدراسة استخدام periosteal الخلايا التي تم الحصول عليها من الشباب (الذين تتراوح أعمارهم بين 65 < y). يلزم إجراء مزيد من الدراسات مقارنة قدرة التجدد العظام الخلايا periosteal بين المانحين كبارا وصغارا.

في هذه الدراسة، عدد سكان خلية تم عزل استناداً إلى الخاصية البلاستيكية-تمسكا به، كما وصفها فريدينستين وآخرون. 13-PDCs تحصد هنا الالتزام بالبلاستيك ثقافة الخلية. علامات اسينتشيمال (CD 73، CD 90، بهونغ-1، ومؤتمر نزع السلاح 44) المستضدات السطحية لهذه الخلايا الثقافات الأولية أظهرت تعبيرات هامة. وعلاوة على ذلك، علامات المكونة للدم (45 مؤتمر نزع السلاح، 34 مؤتمر نزع السلاح ومؤتمر نزع السلاح 19 والدكتور هلا) كانوا غائبين، تشير إلى أن الخلايا المزروعة من أصل الوسيطة. التفريق بين أوستيوجينيك وتشوندروجينيك وأديبوجينيك PDCs يمكن أن يتسبب استخدام وسائط محددة التمايز، كما هو موضح في دراسات أخرى تقييم العينات التي تم الحصول عليها من نخاع العظام والأنسجة اللثة42. نتائج هذه الدراسة الامتثال للحد الأدنى من المعايير لتحديد MSCs البشرية قبولا لدى "المجتمع الدولي" "العلاج الخلوي"4المظهرية والوظيفية. في هذه الدراسة، MSCs من السمحاق البشرية كانت معزولة والموسع، الذي كشف عن خصائص مشابهة لتلك الموصوفة عادة من بمسكس.

وقد اقترحت الدراسات أن الديكساميتازون، اسكوربات، وبيتا-جليسيروفوسفاتي تسبب بمسكس للخضوع للتمايز osteogenic43. أظهرت دراسة أخرى أن 1α، 25-ديهيدروكسيفيتامين د3 (1,25-(OH)2د3) في تركيبة مع حمض الأسكوربيك عززت الخلايا الجذعية التمايز44. ولذلك، أضيفت الديكساميتازون، اسكوربات، وبيتا-جليسيروفوسفاتي في هذه الدراسة تعزيز تمايز الخلايا الجذعية. أنماط لاحظ متشابهة في جميع العينات خلية المرضى الثلاثة. في هذه الدراسة، حددت MSCs من السمحاق السنخية بنجاح بمعدل عزل 58.8 في المائة. ولوحظت لم توجد فروق معتد بها إحصائيا في معدل النجاح فيما يتعلق بالعمر، والجنس، والموقع.

هذه الدراسة التجريبية التحقيق المواد اثنين، هما 1,25-(OH)2د3 وفيتامين (ج)، التي يمكن أن تحفز التفريق بين أوستيوجينيك من الخلايا الجذعية. دراسة 200845 أشارت إلى أن 1,25-(OH)2د3 هو حاسم بالنسبة استقلاب العظام والكالسيوم التوازن ويؤثر على نظام القلب والأوعية الدموية من خلال آليات بعد أن تكون مفهومة تماما. في آخر دراسة السابق46، حفزت 1,25-(OH)2د3 التمايز في المختبر من MSCs البشرية إلى خلايا الاوستيوبلاستس. قدرة 1,25-(OH)2د3 للحث على بمسكس غير متمايزة تفرق في أوستيوبلاست--مثل الخلايا في المختبر قد ثبت في العديد من الدراسات استكشاف مختلف نظم46. بعض الدراسات أظهرت أيضا أنه عند إضافة إلى ثقافات خلايا مثل أوستيوبلاست، 1,25-(OH)2د3 يحول دون انتشار الهاتف الخلوي لكنه يزيد التعبير عن علامات أوستيوبلاستيك مثل الب، osteopontin، OCN، ومصفوفة Gla بروتين،من4748. وأفادت دراسة سابقة أن 1,25-(OH)2د3 عادة ما يحول دون انتشار الهاتف الخلوي، ويستحث osteoblast التمايز49. واحد في المختبر دراسة أجريت على خلايا مورين أشارت إلى أن 1,25-(OH)2د3 يمكن أن تعزز في المراحل المبكرة من أوستيوبلاستوجينيسيس9. بالإضافة إلى ذلك، اقترحت دراسة أخرى في المختبر ،2د3 إلى MSCs,1,25-(OH) المبكرة والمتأخرة على حد سواء يمكن أن تحفز علامات التمايز أوستيوجينيك، بما في ذلك حزب العمال الأسترالي، osteopontin، باهوجان ساماج و OCN43.

كلا OCN – تعتبر مسؤولة عن مراقبة تجميع مصفوفة — و 1A1 الكولاجين – مصفوفة البروتين الأكثر وفرة – هي الحاسمة العظام الحمضية مصفوفة البروتينات التي تلعب دوراً حيويا في توليف مصفوفة. وباﻹضافة إلى ذلك، فهي خلايا الاوستيوبلاستس تشكيل مصفوفة ناضجة مميزة. 50 دراسة سابقة أفادت أن 1,25-(OH)2د3 العلاج وحفز زيادة الكولاجين 1A1 التعبير ولكن لا CBFA1 أو الب الجينات التعبير34. كشفت التقييمات للجينات المعنية في تمايز أوستيوبلاستيك أن 1,25-(OH)2د3 العلاج زيادة التعبير عن OCN51،،من5253. وفي دراستنا، أظهرت النتائج أن 1,25-(OH)2د3 تمارس تأثيرات إيجابية على النشاط أوستيوجينيك. بالمقارنة مع المجموعات الأخرى، أظهرت 10−8 م 1,25-(OH)2د3 زيادة التعبير مرناً من الب، باهوجان ساماج، CBFA1، OCN، والعمود 1. ومن بين هذه النتائج لحزب العمال الأسترالي و Col1 التوصل إلى دلالة إحصائية. ولذلك، تم الحصول على الظروف المثلى عند استخدام 10−8 م 1,25-(OH)2د3. التعبير مرناً من باهوجان ساماج في 10−10 م 1,25-(OH)2د3 المجموعة زيادة كبيرة (ف < 0.05). ومع ذلك، لوحظت لم توجد فروق معتد بها إحصائيا في حظيرة التغييرات في تعابير مرناً CBFA1 و OCN. عند استعراض التعبير مرناً الجينات، أشارت نتائج التجربة إلى التمايز أوستيوجينيك في المختبر . استناداً إلى هذه النتائج، تكون العظم ولاحظ سلبية، فيتامين ج، و 10−10،9، 10 10−7 1,25-(OH) م2د3 مجموعات كانت أضعف من أن في ال 10−8 م 1,25-(OH)2د3 المجموعة. هذه النتائج أدت إلى تكهنات أن 1,25-(OH)2د3 يعبي PDCs ب upregulating مصفوفة البروتينات اللازمة التمعدن (1A1 الكولاجين).

وأفادت دراسة سابقة OCN كهدف رئيسي 1,25-(OH)2د3، زيادة ملحوظة OCN التعبير52. يمكن اعتبار ترسب OCN علامة للتفريق بين osteogenic PDCs. وبالإضافة إلى ذلك، تم تقييم التعبير OCN كعلامة osteogenic أواخر54. OCN علامة موثوقة للعظام تشكيل وتكون العظم55. ولذلك، التعبير OCN عموما تتصل بقدرات التمعدن من الخلايا. OCN هو العلامات البيولوجية حساسة من خلايا الاوستيوبلاستس ناضجة. في المختبر مقارنة أوستيوجينيك، لوحظ ارتفاع ملحوظ OCN مرناً التعبير في 10−8 1,25-(OH) م2د3 المجموعة.

أشارت دراسة واحدة إلى أن نشاط حزب العمال الأسترالي بتحويل عامل النمو بيتا (0.1-10 نانوغرام/مل) وعزز مع 1,25-(OH)2د3 (50 نانومتر)46. هذه النتائج تعني أن 1,25-(OH) 10−8 م2د3 يعزز التنمية النضج والعظام الخلايا الجذعية. كان نشاط حزب العمال الأسترالي في التركيزات المرصودة الأمثل من 10−8 1,25-(OH) م2د3 مقارنة بتركيزات المقابلة من فيتامين (ج) وأعرب PDCs نشاط حزب العمال الأسترالي. وعلاوة على ذلك، إضافة 1,25-(OH)2د3 زيادة النشاط الب وتعزز التفرقة أوستيوبلاستيك في PDCs. في جميع الإعدادات الثلاثة، فيتامين ج، 10−8 م 1,25-(OH)2د3، وفيتامين ج + 10−8 م 1,25-(OH)2د3 زيادة نشاط حزب العمال الأسترالي في الأسابيع 1 (الشكل 4 أ)، 2 (الشكل 4)، 3 ( الشكل 4 ج)، و 4 (د الرقم 4) قبل عدة إضعاف بالمقارنة مع مجموعة المراقبة السلبية. في الأسابيع 1 و 4، النشاط الب زيادة كبيرة في المجموعة3 2د م 1,25-(OH) 10−8 . في الأسبوع 2، الب النشاط زيادة كبيرة في فيتامين ج و 10−8 1,25-(OH) م2د3 مجموعات.

من خلال دراسة مقارنة لمختلف MSCs البشرية في مرور 3، ساكاجوتشى et al. 56 العثور على امتلاك قدرات مماثلة أوستيوجينيك بمسكس وتلك الشركات. ولذلك، يمكن المحتمل أن تقصير فترة ثقافة الخلية باستخدام خلايا بيريوستيل، الذي بدوره سيقلل من مخاطر التلوث والتكلفة. ويتجنب استخدام همسكس المبكر مرور مسن آثار التوسع في الثقافة. استخدام أووسوال ويوشيمورا MSCs في مرور 3 وسوبكولتوريد لمدة أسبوعين تحت ظروف تمايز osteogenic35. ولذلك، ينبغي النظر مرور الوقت عند مقارنة الأنشطة الخلوية من مصادر مختلفة في الخلية. واستخدمت PDCs الجيل الثالث في هذه الدراسة، نظراً لأن احتمال أوستيوجينيك للخلايا الجذعية للأجيال اللاحقة من PDCs أقل من الخلايا الجذعية من الجيل الثالث PDCs.

عند مثقف في متوسط مصل الدم البشري، الخلايا الجذعية سمحاق يمكن ليس فقط الحفاظ على شكلها، ولكن يمكن أيضا إرفاق والمحافظة على النشاط وتحقيق نمو الخلايا. وخلاصة القول، بناء على هذه النتائج، PDCs البشرية تمتلك القدرة على البقاء على قيد الحياة وتتكاثر، وتفرق في النسب أوستيوجينيك في المختبر، هو أمر حاسم في تقييم مدى نجاعة في فيفو. غنية ب MSCs السمحاق وهو بالتالي مناسبة لهندسة الأنسجة. السمحاق التي تم الحصول عليها من الحامل يشكل مضاعفات أقل. ولذلك، يعتبر العظام السنخية موقعا مثاليا من الجهات مانحة. النتائج بوضوح إمكانية عزل MSCs من السمحاق المثل وتحقيق على التمايز إلى خلايا الاوستيوبلاستس وتشوندروسيتيس و adipocytes. في هذه الدراسة، تم مقارنة آثار فيتامين ج على إمكانات osteogenic PDCs ب 1,25-(OH)2د3 بتركيزات مختلفة. وكان تركيز الأكثر فعالية 10−8 م 1,25-(OH)2د3. وكان 10−8 1,25-(OH) م2د3 العلاج طوال فترة الثقافة وسيلة فعالة واقتصادية ليحفز التمايز osteogenic في PDCs. وفي الختام، فيتامين ج و 1,25-(OH)2د3 تعزيز التفريق بين osteogenic PDCs. ومع ذلك، هذه أظهرت لا آثار التآزر هامة في نتائج نشاط حزب العمال الأسترالي. ونظرا لصغر حجم العينة، عينات إضافية مطلوبة لمزيد من التقييم. وهكذا، قد تكون مفيدة لهندسة الأنسجة العظام PDCs مثقف تحت ظروف أوستيوجينيك وتوفر ميزة أعلى انتشار الهاتف الخلوي.

الخطوات الأساسية لهذا البروتوكول وتشمل الخطوات 1.2 و 1.3 (بدء الإجراء تثقيف خلال 24 ساعة من الحصاد والصيانة المناسبة بعد ذلك). ويجب تجنب تلوث الأنسجة واستخدام تقنية العقيم إلزامي. واحد الحد من هذا البروتوكول أنه، بالمقارنة مع مصادر الخلايا الجذعية من نخاع العظم أو الأنسجة الدهنية، مصادر الخلايا الجذعية البالغة من أنسجة الأسنان محدودة من حيث انخفاض عدد الخلايا التي يمكن الحصول عليها من خلال هذا الأسلوب.

تحديد وتوصيف الخلايا الجذعية periosteal يمكن أن توفر معلومات قيمة فيما يتعلق بوظائف وإمكانات التجدد هذا النسيج، فضلا عن تطبيقها في العلاج بالتجدد. وحصل شرط أمثل باستخدام 10−8 م 1,25-(OH)2د3. لذلك، معاملة PDCs مع 10−8 1,25-(OH) م2د3 يعزز التمايز أوستيوجينيك. وينبغي دراسة الدراسات المستقبلية التطبيق في فيفو 10−8 م 1,25-(OH)2د3 لهندسة الأنسجة العظام فعالة واقتصادية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

وأقر "مجلس المراجعة المؤسسية" "البحوث من تشانغ الأمنيون التذكارية المستشفى اﻻكلينيكي" (IRB99-1828B و C 100-3019، 99-3814B، ج 102-1619، 101-4728B وج 103-4223) بروتوكول الدراسة. وأيد هذه الدراسة تشانغ الأمنيون التذكاري مستشفى (CMRPG392071، CMRPG3A1141، CMRPG3A1142، و NMRPG3C0151). تم تحرير هذه المخطوطة عن طريق "تحرير والاس الأكاديمية".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA Gibco 25200-056
2-phospho-L-ascorbic acidtrisodium salt Sigma 49752
35-mm culture dishes Corning 430165
3-isobutyl-1-methylxanthine Sigma I5879
6  well plate Corning 3516
Alkaline phosphatase ABI Hs01029144_m1
Alkaline Phosphatase Activity Colorimetric Assay Kit BioVision K412-500
avian myeloblastosis virus reverse transcriptase Roche 10109118001
CD146 BD 561013
CD19 BD 560994
CD34 BD 560942
CD44 BD 561858
CD45 BD 561088
CD73 BD 561014
CD90 BD 561974
Cell banker1 ZEAOAQ 11888
core binding factor alpha-1 ABI Hs00231692_m1
dexamethasone Sigma D4902
DPBS Gibco 14190250
FBS Gibco 26140-079
GAPDH ABI Hs99999905_m1
HLA-DR BD 562008
indomethacin Sigma I7378
insulin sigma 91077C
insulin–transferrin–selenium-A Sigma I1884
MicroAmp Fast 96 well reaction plate(0.1ml) Life 4346907
MicroAmp optical adhesive film Life 4311971
Minimum Essential Medium 1X Alpha Modification HyClone SH30265.02
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122
Permeabilization buffer eBioscience 00-8333-56
Sodium pyruvate Gibco 11360070
STRO-1 BioLegend 340103
SYBER Green PCR Master Mix AppliedBiosystems 4309155
TaqMan Master Mix Life 4304437
transforming growth factor-β Sigma T7039 
Trizol reagent (for RNA isolation) Life 15596018
β-glycerophosphate Sigma G9422
collagen-1 Invitrogen forward primer 5' CCTCAAGGGCTCCAACGAG-3
reverse primer 5'-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3'
OCN Invitrogen forward primer 5'-GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG-3'
reverse primer 5'-GTCAGCCAACTCGTCACAGT-3'
BSP Invitrogen forward primer 5' AAAGTGAGAACGGGGAACCT-3'
reverse primer 5'-GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3'
Commercial ALP primers
Commercial CBFA1 primers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kao, R. T., Murakami, S., Beirne, O. R. The Use of Biologic Mediators and Tissue Engineering in Dentistry. Periodontol. 50, 127-153 (2000).
  2. Rosenbaum, A. J., Grande, D. A., Dines, J. S. The Use of Mesenchymal Stem Cells in Tissue Engineering: A Global Assessment. Organogenesis. 4, 23-27 (2008).
  3. Yen, T. H., Wright, N. A., Poulsom, R. Bone Marrow Stem Cells: From Development to Therapy. Horizons in Medicine. Franklyn, J. 16, Royal College of Physicians of London. London, UK. 249-257 (2004).
  4. Dominici, M., et al. Minimal Criteria for Defining Multipotent Mesenchymal Stromal Cells. The International Society for Cellular Therapy Position Statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
  5. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal Human Dental Pulp Stem Cells (DPSCs). In Vitro and In Vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 13625-13630 (2000).
  6. Miura, M., et al. Stem Cells from Human Exfoliated Deciduous Teeth. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 5807-5812 (2003).
  7. Seo, B. M., et al. Investigation of Multipotent Postnatal Stem Cells from Human Periodontal Ligament. Lancet. 364, 149-155 (2004).
  8. Sonoyama, W., et al. Mesenchymal Stem Cell-Mediated Functional Tooth Regeneration in Swine. PLOS ONE. 1, e79 (2006).
  9. Morsczeck, C., et al. Isolation of Precursor Cells (PCs) from Human Dental Follicle of Wisdom Teeth. Matrix Biol. 24, 155-165 (2005).
  10. Mitrano, T. I., et al. Culture and Characterization of Mesenchymal Stem Cells from Human Gingival Tissue. J Periodontol. 81, 917-925 (2010).
  11. Di Benedetto, A., Brunetti, G., Posa, F., Ballini, A., et al. Osteogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from Dental Bud: Role of Integrins and Cadherins. Stem Cell Res. 15, 618-628 (2015).
  12. Marrelli, M., Paduano, F., Tatullo, M. Cells Isolated from Human Periapical Cysts Express Mesenchymal Stem Cell-like Properties. Int J Biol Sci. 9 (10), Published online Nov 16 1070-1078 (2013).
  13. Friedenstein, A. J., Piatetzky-Shapiro, I. I., Petrakova, K. V. Osteogenesis in Transplants of Bone Marrow Cells. J Embryol Exp Morphol. 16, 381-390 (1966).
  14. Perka, C., Schultz, O., Spitzer, R. S., Lindenhayn, K., Burmester, G. R., Sittinger, M. Segmental Bone Repair by Tissue-Engineered Periosteal Cell Transplants with Bioresorbable Fleece and Fabrin Scaffolds in Rabbits. Biomaterials. 21, 1145-1153 (2000).
  15. Taylor, J. F. The Periosteum and Bone Growth. Hall, B. K. , CRC Press. Boca Raton. Bone Growth VI (1992).
  16. Squier, C., Ghoneim, S., Kremenak, C. Ultrastructure of the Periosteum from Membrane Bone. J Anat. 171, 233-239 (1990).
  17. Aubin, J., Triffitt, J. Mesenchymal Stem Cells and Osteoblast Differentiation. Principles of Bone Biology. Bilezikian, J., Raisz, L. G., Rodan, G. A. , Academic Press. San Diego. 59-81 (2002).
  18. Diaz-Flores, L., Gutierrez, R., Lopez-Alonso, A., Gonzalez, R., Varela, H. Pericytes as a Supplementary Source of Osteoblasts in Periosteal Osteogenesis. Clin Orthop Relat Res. 275, 280-286 (1992).
  19. Lim, S. M., Choi, Y. S., Shin, H. C., Lee, C. W., Kim, S. L., Kim, D. I. Isolation of Human Periosteum-Derived Progenitor Cells Using Immunophenotypes for Chondrogenesis. Biotechnol Lett. 27, 607-611 (2005).
  20. Stich, S., et al. Human Periosteum-Derived Progenitor Cells Express Distinct Chemokine Receptors and Migrate Upon Stimulation with CCL2, CCL25, CXCL8, CXCL12, and CXCL13. Eur J Cell Biol. 87, 365-376 (2008).
  21. Choi, Y. S., et al. Multipotency and Growth Characteristic of Periosteum-Derived Progenitor Cells for Chondrogenic, Osteogenic, And Adipogenic Differentiation. Biotechnol Lett. 30, 593-601 (2008).
  22. Agata, H., et al. Effective Bone Engineering with Periosteum-Derived Cells. J Dent Res. 86, 79-83 (2007).
  23. Ribeiro, F. V., et al. Periosteum-Derived Cells as an Alternative to Bone Marrow Cells for Bone Tissue Engineering Around Dental Implants. A Histomorphometric Study in Beagle Dogs. J Periodontol. 81, 907-916 (2010).
  24. Hayashi, O., et al. Comparison of Osteogenic Ability of Rat Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow, Periosteum and Adipose Tissue. Calcif Tissue Int. 82, 238-247 (2008).
  25. Hong, H. H., Hong, A., Yen, T. H., Wang, Y. L. Potential Osteoinductive Effects of Calcitriol onthe m-RNA of Mesenchymal Stem Cells Derived from Human Alveolar Periosteum. BioMed Res Int. , Article ID 3529561 (2016).
  26. Knothe, U. R., Dolejs, S., Miller, R. M., Knothe Tate, M. L. Effects of Mechanical Loading Patterns, Bone Graft, and Proximity to Periosteum on Bone Defect Healing. J Biomech. 43, 2728-2737 (2010).
  27. McBride, S. H., Dolejs, S., Brianza, S., Knothe, U. R., Knothe Tate, M. L. Net Change in Periosteal Strain During Stance Shift Loading After Surgery Correlates to Rapid de novo Bone Generation in Critically Sized Defects. Ann Biomed Eng. 39, 1570-1581 (2011).
  28. Curtis, K. M., Aenlle, K. K., Roos, B. A., Howard, G. A. 24R,25-Dihydroxyvitamin D3 Promotes the Osteoblastic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. Mol Endocrinol. 28 (5), 644-658 (2014).
  29. Mostafa, N. Z., et al. Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells Cultured with Dexamethasone, Vitamin D3, Basic Fibroblast Growth Factor, and Bone Morphogenetic Protein-2. Connect Tissue Res. 53 (2), 117-131 (2012).
  30. Sun, Y., Yang, X., Li, F., Dou, Z. Study on Differentiation of Embryonic Stem Cells into Osteoblast in vitro Inducing by 1,25(OH)2VD3. Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi. 22 (9), 1117-1120 (2008).
  31. Ishii, M., Koike, C., Igarashi, A., et al. Molecular Markers Distinguish Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells from Fibroblasts. Biochem Biophys Res Commun. 332, 297-303 (2005).
  32. Maund, S. L., Barclay, W. W., Hover, L. D., et al. Interleukin-1α Mediates the Antiproliferative Effects of 1,25-Dihydroxyvitamin D3 in Prostate Progenitor/Stem Cells. Cancer Res. 71, 5276-5286 (2011).
  33. Mitrano, T. I., Grob, M. S., Carrión, F., Nova-Lamperti, E., Luz, P. A., Fierro, F. S., Quintero, A., Chaparro, A., Sanz, A. Culture and Characterization of Mesenchymal Stem Cells From Human Gingival Tissue. J Periodontol. 81 (6), 917-925 (2010).
  34. Curtis, K. M., Aenlle, K. K., Roos, B. A., Howard, G. A. 24R,25-Dihydroxyvitamin D3 Promotes the Osteoblastic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. Mol Endocrinol. 28, 644-658 (2014).
  35. Ippolito, G., Schiller, P. C., Ricordi, C., Roos, B. A., Howard, G. A. Age Related Osteogenic Potential of Mesenchymal Stromal Stem Cells from Human Vertebral Bone Marrow. J Bone Miner Res. 14, 1115-1122 (1999).
  36. D'Stucki, U., et al. Temporal and Local Appearance of Alkaline Phosphatase Activity in Early Stages of Guided Bone Regeneration. A Descriptive Histochemical Study in Humans. Clin Oral Implants Res. 12, 121-127 (2001).
  37. Caplan, A. I., Bruder, S. P. Mesenchymal stem cells: building blocks for molecular medicine in the 21st century. Trends Mol Med. 7, 259-264 (2001).
  38. Knothe Tate, M. L., Falls, T., McBride, S. H., Atit, R., Knothe, U. R. Mechanical Modulation of Osteochondroprogenitor Cell Fate. Int J Biochem Cell Biol. 40, 2720-2738 (2008).
  39. Yoshimura, H., Muneta, T., Nimura, A., Yokoyama, A., Koga, H., Sekiya, I. Comparison of Rat Mesenchymal Stem Cells Derived from Bone Marrow, Synovium, Periosteum, Adipose Tissue, and Muscle. Cell Tissue Res. 327, 449-462 (2007).
  40. Tanaka, H., Ogasa, H., Barnes, J., Liang, C. T. Actions of bFGF on Mitogenic Activity and Lineage Expression in Rat Osteoprogenitor Cells: Effect of Age. Mol Cell Endocrinol. 150, 1-10 (1999).
  41. Zhou, S., et al. Clinical characteristics influence in vitro action of 1,25-dihydroxyvitamin D(3) in human marrow stromal cells. J Bone Miner Res. 27 (9), 1992-2000 (1992).
  42. Pittenger, M. F., et al. Multilineage Potential of Adult Human Mesenchymal Stem Cells. Science. 284, 143-147 (1999).
  43. Jørgensen, N. R., Henriksen, Z., Sorensen, O. H., Civitelli, R. Dexamethasone, BMP-2, and 1,25-dihydroxyvitamin D enhance a more differentiated osteoblast phenotype: validation of an in vitro model for human bone marrow-derived primary osteoblasts. Steroids. 69, 219-226 (2004).
  44. Khanna-Jain, R., et al. Vitamin D(3) Metabolites Induce Osteogenic Differentiation in Human Dental Pulp and Human Dental Follicle Cells. J Steroid BiochemMol Biol. 122 (3), 133-141 (2010).
  45. Lee, J. H., O'Keefe, J. H., Bell, D., Hensrud, D. D., Holick, M. F. Vitamin D Deficiency an Important, Common, and Easily Treatable Cardiovascular Risk Factor? J Am Coll Cardiol. 52, 1949-1956 (2008).
  46. Liu, P., Oyajobi, B. O., Russell, R. G., Scutt, A. Regulation of osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells: interaction between transforming growth factor-beta and 1,25(OH)(2) vitamin D(3) In vitro. Calcif Tissue Int. 65 (2), 173-180 (1999).
  47. Beresford, J. N., Gallagher, J. A., Russell, R. G. G. 1,25-Dihydroxyvitamin D3 and Human Bone-Derived Cells In Vitro: Effects on Alkaline Phosphatase, Type I Collagen and Proliferation. Endocrinology. 119, 1776-1785 (1986).
  48. Price, P. A., Baukol, S. A. 1,25-Dihydroxyvitamin D3 Increases Synthesis of the Vitamin K-Dependent Bone Protein by Osteosarcoma Cells. J Biol Chem. 255, 11660-11663 (1986).
  49. Kawase, T., Oguro, A. Granulocyte Colony-Stimulating Factor Synergistically Augments 1, 25-Dihydroxyvitamin D3-Induced Monocytic Differentiation in Murine Bone Marrow Cell Cultures. Horm Metab Res. 36, 445-452 (2004).
  50. Fujisawa, R., Tamura, M. Acidic Bone Matrix Proteins and Their Roles in Calcification. Front Biosci. (Landmark Ed). 17, 1891-1903 (2012).
  51. van Driel, M., et al. Evidence that Both 1α,25 Dihydroxyvitamin D3 and 24-Hydroxylated D3 Enhance HuMan Osteoblast Differentiation and Mineralization. J Cell Biochem. 99, 922-935 (2006).
  52. Atkins, G. J., et al. Metabolism of Vitamin D3 in Human Osteoblasts: Evidence for Autocrine and Paracrine Activities of 1 α ,25-Dihydroxyvitamin D3. Bone. 40, 1517-1528 (2007).
  53. Kerner, S. A., Scott, R. A., Pike, J. W. Sequence Elements in the Human Osteocalcin Gene Confer Basal Activation and Inducible Response to Hormonal Vitamin D3. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4455-4459 (1989).
  54. Viereck, V., et al. Differential Regulation of Cbfa1/Runx2 and Osteocalcin Gene Expression by Vitamin-D3, Dexamethasone, and Local Growth Factors in Primary Human Osteoblasts. J Cell Biochem. 86, 348-356 (2002).
  55. Shi, X., et al. In-vitro osteogenesis of synovium stem cells induced by controlled release of bisphosphate additives from microspherical mesoporous silica composite. Biomaterials. 30, 3996-4005 (2009).
  56. Sakaguchi, Y., Sekiya, I., Yagishita, K., Muneta, T. Comparison of Human Stem Cells Derived from Various Mesenchymal Tissues: Superiority of Synovium as a Cell Source. Arthritis Rheum. 52, 2521-2529 (2005).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 135، السمحاق السنخية، والخلايا الجذعية الوسيطة، 1,25-(OH)2د3، وفيتامين (د)3 الكالسيتريول سمحاق
عزل الخلايا الجذعية الوسيطة من السمحاق السنخية البشرية وآثار فيتامين د على نشاط الخلايا المستمدة من السمحاق أوستيوجينيك
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, Y. L., Hong, A., Yen, T. H.,… More

Wang, Y. L., Hong, A., Yen, T. H., Hong, H. H. Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells. J. Vis. Exp. (135), e57166, doi:10.3791/57166 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter