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Bioengineering

Isolamento de células-tronco mesenquimais do periósteo Alveolar humano e efeitos da vitamina D na atividade osteogênica do periósteo-derivado de células

Published: May 4, 2018 doi: 10.3791/57166
Automatic Translation
1,2, 3, 1,4,5,6, 1,7,8
1Chang Gung University, 2Department of Periodontics, Chang Gung Memorial Hospital, 3California Northstate University College of Medicine, 4Department of Nephrology, Clinical Poison Center, Chang Gung Memorial Hospital, 5Kidney Research Center, Chang Gung Memorial Hospital, 6Center for Tissue Engineering, Chang Gung Memorial Hospital, 7Department of Periodontics, Chang Gung Memorial Hospital, 8College of Oral Medicine, Taipei Medical University

Summary

Apresentamos um protocolo para investigar os biomarcadores de expressão do mRNA de células periósteo-derivado (PDCs) induzidas pela vitamina C (vitamina C) e 1,25-dihidroxi vitamina D [1,25-(OH)2D3]. Além disso, avaliamos a capacidade dos PDCs para diferenciar em adipócitos, condrócitos e osteócitos.

Abstract

Células-tronco mesenquimais (MSCs) estão presentes em uma variedade de tecidos e pode ser diferenciadas em vários tipos de células, incluindo os osteoblastos. Entre as fontes dentais de MSCs, o periósteo é um tecido facilmente acessível, que foi identificado para conter MSCs na camada do cambium. No entanto, esta fonte ainda não foi amplamente estudada.

Vitamina D3 e 1,25-(OH)2D3 foram demonstradas para estimular a diferenciação em vitro de MSCs em osteoblastos. Além disso, vitamina C facilita o crescimento de células de formação e osso de colágeno. No entanto, nenhum estudo ainda investigou os efeitos da vitamina D3 e vitamina C no MSCs.

Aqui, apresentamos um método de isolar o MSCs do periósteo alveolar humano e examinar a hipótese de que 1,25-(OH)2D3 podem exercer um efeito osteoindutivo nessas células. Podemos também investigar a presença de MSCs no periósteo alveolar humano e avaliar a proliferação e a adesão de células-tronco. Para avaliar a capacidade da vitamina C (como um controle) e as diferentes concentrações de 1,25-(OH)2D3 (10−10, 10−9, 10−8e 10−7 M) para alterar a chave biomarcadores de mRNA em expressão de RNAm de MSCs isoladas de fosfatase alcalina (FAL ou ALP), osso sialoprotein (BSP), ligação núcleo fator alfa-1 (CBFA1), 1-colágeno e osteocalcina (OCN) são medidos usando a reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR).

Introduction

Apesar de inúmeras técnicas relevantes têm sido desenvolvidas nos últimos anos, osso restos de reconstrução limitado por várias restrições e estimar que a extensão da reconstrução necessária muitas vezes é impossível. Aumento do tecido duro é necessário para alcançar objetivos estéticos e funcionais, além de uma taxa de sucesso a longo prazo favoráveis. Métodos comumente utilizados para tais procedimentos incluem enxerto ósseo autólogo e alogênico, Xeno e aloplásticos transplante de osso. Entre os vários tipos de enxerto ósseo, enxertos ósseos autógenos são considerados os mais eficazes. Entretanto, a morbidez do local doador, vascularização comprometida e tecido limitada disponibilidade1 foram grandes inconvenientes para enxerto ósseo autógeno. Além disso, enxertos ósseos alogênico e xenografts têm sido associados com a transmissão da doença. Atualmente, enxertos sintéticos são amplamente utilizados para resolver estes problemas. No entanto, com sua falta de potencial osteogênico, desfechos clínicos têm variado amplamente. Materiais, tais como celulose estão associados com a flutuação do volume, infecção e falta de força.

Aumento do osso, usando a engenharia de tecidos tem gerado um interesse considerável. Nesta técnica, as células-tronco mesenquimais (MSCs) inicialmente são utilizadas para promover a diferenciação de osteoblastos, que em seguida são transplantadas para o local da perda óssea para alcançar a reparação óssea. Este procedimento é aplicado atualmente em terapia celular. Alcançar a reconstrução óssea extraindo uma quantidade limitada de tecido é mais simples e menos invasivo em comparação com outros métodos.

O papel potencial do MSCs como uma ferramenta para terapias baseadas em células destinadas a regeneração dentária é um interesse emergente entre vários grupos de investigação. Estudos têm confirmado que MSCs podem ser diferenciados entre os seguintes tipos de tecido: medula óssea, membrana sinovial, tecido adiposa, Pericito, osso trabecular, humano de cordão umbilical e tecidos dentais2,3. Fontes comuns de MSCs incluem a medula óssea, tecido adiposo e tecidos dentais. Comparado com MSCs derivadas de tecido adiposo e da medula óssea, as vantagens das células-tronco dentárias são de fácil acessibilidade e menor morbidade após a colheita. Em comparação com células-tronco embrionárias, MSCs derivados de tecidos dentários aparecem nonimmunogenic e não estão associados com preocupações éticas complexas3.

Em 2006, a sociedade internacional de terapia celular recomendado usando as seguintes normas para identificar MSCs: primeiro, MSCs devem ser capazes de anexar ao plástico. Em segundo lugar, MSCs devem ser positivo para os antígenos de superfície CD105, CD73 e CD90 e negativo para os marcadores de monócitos, macrófagos e células B, além dos antígenos hematopoiéticos CD45 e CD344. Como um critério final, MSCs devem ser capazes de se diferenciar em três tipos de células sob condições padrão de diferenciação em vitro : osteoblastos, condrócitos e adipócitos4. Até à data, seis tipos de células-tronco dentais humanas foram isolados e caracterizados. O primeiro tipo foi isolado do tecido pulpar humano e denominadas de células-tronco de polpa dentária pós-natal5. Posteriormente, três tipos adicionais do MSCs dentais foram isolados e caracterizados: células-tronco de dentes decíduos esfoliada6, o ligamento periodontal7e a papila apical8. Mais recentemente, derivado de folículo dental9, derivado de tecido gengival10, broto dental haste cells(DBSCs)11e cisto periapical MSCs (hPCy-MSCs)12 também foram identificados.

Friedenstein foi o primeiro a definir MSCs13. MSCs apresentam uma elevado potencial de proliferação e podem ser manipulados para diferenciar-se antes de ser transplantado, o que sugere que eles são candidatos ideais para procedimentos regenerativos10.

Embora a maioria dos estudos usou como fonte de células-tronco da medula óssea, células derivadas de periósteo (PDCs) também têm sido usados recentemente14. O periósteo é mais facilmente acessível, que é a medula óssea. Portanto, nesta técnica, vamos usar o periósteo alveolar para eliminar a necessidade de incisões adicionais durante a cirurgia e reduzir a morbidade pós-cirúrgicas em pacientes. O periósteo é o tecido conjuntivo que forma o revestimento exterior de ossos longos e é composto por duas camadas distintas: a camada exterior fibrosa é composto por fibroblastos, colágeno e fibras elásticas15e a camada interna do cambium célula rica em contato direto com a superfície óssea. A camada do cambium contém uma população de mistura de células, principalmente fibroblastos16, osteoblastos17, pericitos18e uma subpopulação crítica identificado como MSCs19,20,21. A maioria dos estudos têm relatado que PDCs são comparáveis, se não superior, a medula óssea-derivado células-tronco (bMSCs) em osso cura e regeneração22,23,24. O periósteo é facilmente acessível e apresenta excelente eficácia regenerativa. No entanto, poucos estudos têm incidido sobre o periósteo25,26,27.

Em matéria de reparação óssea, a prática clínica atual envolve o transplante de células progenitoras periosteal amplificado dentro apoio andaimes. Estudos recentes têm-se centrado na aquisição de células-tronco em regiões com defeito e empregando células progenitoras para regeneração de tecido20. Dentistas também antecipam a aplicação futura de regeneração óssea periodontal em implantes dentários e tratamentos periodontais. Sobre o site do doador, o periósteo pode ser facilmente colhido por cirurgiões-dentistas gerais. Isto compara-se favoravelmente contra células do estroma da medula, como o periósteo pode ser acessado durante cirurgia oral de rotina. Assim, o objetivo deste estudo é estabelecer um protocolo para a colheita PDCs e para avaliar a morfologia, apego, viabilidade e proliferação de células-tronco humanas periósteo.

Metabólitos de vitamina D afetam na vivo mineral óssea equilíbrio dinâmico. Um estudo relatou que o 24R,25-(OH) o2D3 a forma ativa da vitamina D é essencial para a diferenciação osteoblástica de humano MSCs (hMSCs)28. Homeostase óssea e reparação são regulados por uma rede de vitamina D3 metabólitos, dos quais 1,25-(OH)2D3 (calcitriol) é o mais biologicamente ativo e relevante na regulação da saúde óssea. Vitamina D3 é essencial para a calcificação29. Em um estudo utilizando ratos de Kunming branco 2-d-old, os corpos do embryoid nos ratos indicaram que suplementos de vitamina C e vitamina D efetivamente promovido a diferenciação de osteoblastos ESC-derivado de30. Entre suas outras atividades biológicas, 1,25-(OH)2, D3 estimula a diferenciação em vitro de hMSCs de osteoblastos, que podem ser monitorados com base no aumento na atividade da enzima fosfatase alcalina (FAL ou ALP) ou gene OCN expressão.

Alguns estudos detectaram uma relação dose-resposta de tratamentos combinados com vitamina C e 1,25-(OH)2D3 em PDCs humanos com um foco particular na engenharia de tecido ósseo. Portanto, neste estudo, examinamos as concentrações ideais para tratamento simples ou combinado de 1,25-(OH)2D3 e vitamina C para induzir a diferenciação osteogênica de PDCs humanas. O objetivo do presente protocolo é determinar se uma população de células isolada do periósteo alveolar dental contém células com um fenótipo MSC e se essas células podem ser expandidas em cultura (em vitro) e diferenciadas para formar o tecido desejado . Além disso, avaliamos a capacidade dos PDCs para diferenciar em adipócitos, condrócitos e osteócitos. A segunda parte do estudo avalia os efeitos da vitamina C e 10−10, 10−9, 10−8e 10−7 M 1,25-(OH)2D3 sobre a atividade osteogênica do PDC. O principal objetivo deste estudo é avaliar as funções da vitamina C e 1,25-(OH)2D3 durante a diferenciação osteoblástica de PDCs por atividade ALP e genes pro-osteogênica, tais como ALP, CBFA1, OCN, BSP e colágeno-1. Além disso, este estudo determina as condições de osteoindutora ideal para PDCs humanas com base nesses resultados.

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Protocol

O protocolo de estudo foi aprovado pelo institucional Review Board de Chang Gung Memorial Hospital. Todos os participantes fornecido o consentimento informado por escrito.

1. tecido preparação

  1. Colha os tecidos periosteal de pacientes durante a cirurgia dental (Figura 1). Após reflexão flap sob anestesia local, pegue um pedaço de tecido do periósteo do osso alveolar usando um separador periosteal31.
  2. Após a colheita, armazene as fatias periosteal tecidos de aproximadamente 5 × 2 mm na salina de tampão fosfato de Dulbecco (DPBS) com 300 U/mL de penicilina e 300 mg/mL de estreptomicina. Transferi os tecidos para o laboratório no prazo de 24 h.
  3. Picar os fragmentos de tecido periosteal alveolar com bisturis até bem picada e manter as amostras em meio de passagem 0 (composto de 300 U/mL de penicilina e 300 mg/mL de estreptomicina, α-MEM e 5% de soro fetal bovino [FBS]) cultivadas em uma incubadora a 37 ° C, com ar umidificado (5% de dióxido de carbono). Na incubadora, prepare uma bacia de água para manter a umidade.
  4. Mude o meio, depois de 3 dias e duas vezes por semana depois disso.
  5. Quando as células têm alcançado subconfluence (80%), liberar as células aderentes com 200 µ l de tripsina 0,25% na incubadora (37 ° C) por 3 min e então use 4,5 mL de meio para encerrar a reação.
  6. As células novamente no meio de passagem fresco 1 da placa (α-MEM, 10% FBS, 100 unidades/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina). Placa é 5 × 103 células (como contados por um hemocytometer).
  7. Execute cada passagem subsequente após as células alcançar 80% de confluência31.
    Nota: No início, o meio será vermelho alaranjado. Após cerca de três dias, a cor média deve mudar para um tom amarelado. O tempo de duplicação das células é aproximadamente 30 – 40 h, precisando de 7 dias para 3 – 5 gerações.
  8. Cultura os PDCs isolados em α-MEM suplementado com 10% FBS, 100 U/mL de penicilina e 100 mg/mL de estreptomicina em uma incubadora (37 ° C, 5% CO2).
  9. Observar o crescimento celular diariamente e substituir o meio de crescimento duas vezes por semana. Use células de terceiro a quinto-geração para tudo mais experiências.

2. fluxo Cytometry

  1. Colheita de 1 × 106 células através da digestão do trypsin:
    1. Adicione 200 µ l de tripsina 0,25%. Depois de 3 min, use 4,5 mL de meio de cultura contendo FBS para finalizar a reação de tripsina e recolher através de centrifugação (1500 rpm, 5 min, 22 ° C).
    2. Lave as pelotas de célula três vezes usando 1 x DPBS. Ressuspender as células em 200 µ l 1 x buffer de permeabilização. Conte as células com um hemocytometer.
  2. Examine os marcadores de superfície expressados expressados dos PDCs através de fluxo cytometry (classificação de fluorescência-ativado da pilha)32. Uso de anticorpos monoclonais (MAb) contra CD19 (isotiocianato de fluoresceína (FITC)), CD34 (FITC), CD44 (ficoeritrina [PE]), CD45 (FITC), CD73 (PE), CD90 (allophycocyanin [APC]), CD146 (PE), STRO-1 (Alex) e HLA-DR (FITC)32.
    1. Adicione os anticorpos para as amostras e a cultura no escuro a 4 ° C por 30 min.
    2. Lave as células com 1 x DPBS três vezes.
    3. Consertar as células usando 2% de formaldeído e proceder com fluxo cytometry análise32.

3. penhora e viabilidade com osteogênica, Adipogenic e Chondrogenic de diferenciação de células

Induzir a diferenciação nas células em osteogênica, adipogenic e linhagens de chondrogenic pelo cultivo as células do periósteo em todas as três passagens em seis poços placas com meios de diferenciação específica.

  1. Para diferenciação osteogênica, cultura de células em α-MEM em uma densidade de 5000 células por poço em placas de cultura de seis poços.
    1. Em alcançar 80% de confluência, cultura de células em meios contendo α-MEM, 5% FBS, β-glicerofosfato (10 mM), 10−7 M. dexametasona (0,1 mM) e 5 mL de ácido ascórbico (100...). Cultura do controlo negativo na mídia consistindo de α-MEM e 5% FBS.
    2. Mude a mídia duas vezes por semana.
    3. Após 4 semanas, avalie o potencial das células de se diferenciar em uma linhagem osteogênica manchando as células usando um ensaio de von Kossa, que distingue a presença de depósitos calcificados em uma cultura de33.
      1. Adicione formol a 10% para fixação. Dentro de 30 min, adicionar 5% de nitrato de prata e tratar sob raios ultravioleta (UV) por 1h à temperatura ambiente.
      2. Adicionar 5% Na24 quatro vezes, permitindo que 3 min para cada reação. Finalmente, lave as células duas vezes com água destilada.
        Nota: Von Kossa coloração é uma reação de precipitação onde os íons de prata e fosfato reagem na presença de materiais ácidos; Esta técnica de coloração não é específica para o cálcio. Neste estudo, quando as células investigadas foram tratadas com solução de nitrato de prata, cálcio — que é reduzido pela forte luz UV — foi substituído por prata, que se tornou visível como prata metálica.
  2. Para diferenciação de adipogenic, cultura de células em uma densidade de 5000 células por poço em placas de cultura de seis poços contendo α-MEM.
    1. Em alcançar 80% de confluência, cultura das células em meios contendo α-MEM 5% FBS, 0.5 mM 3-isobutil-1-methylxanthine (100 mg/mL), 1% penicilina, 10− 6 M dexametasona (1 mM), insulina (5 mg/mL) e indometacina (60 mM).
    2. Cultura do controlo negativo na mídia consistindo de α-MEM e 5% FBS.
    3. Depois de 6 a 9 semanas, use O vermelho para manchar as células e destacar gotas de lipídios, determinando, assim, a presença de adipogenic diferenciação33de óleo:
      1. Adicione formol a 10% para fixação. Dentro de 30 min, a manchar as células com 0,5% óleo vermelho O em temperatura ambiente por 10 min e depois lavar as células três vezes com isopropanol 60% por 3 min cada tempo; Finalmente, lave as células com água destilada.
        Nota: Óleo vermelho oé um lisocromo (lipossolúvel) corante usado para a coloração de lipídios neutros, principalmente Ésteres de colesterol, lipoproteína e triacilglicerol. O corante se dissolve nas gotículas lipídicas na célula, transformando as gotículas lipídicas vermelho.
  3. Para diferenciação de condrócitos, células de cultura em placas de cultura de seis-bem com cada um contendo bem 5000 células.
    1. Adicione uma diferenciação médio contendo α-MEM, 5% FBS, 10−7 M. dexametasona (0,1 mM), piruvato de sódio (100 µ g/mL), insulin-transferrina-selênio-A (1 × ITS), fator de crescimento transformador-β (10 ng/mL) e 5 mL de ácido ascórbico (100 µM).
    2. Cultura do controlo negativo na mídia consistindo de α-MEM e 5% FBS.
    3. Depois de 4-5 semanas, use Alcian azul de coloração para realçar os polissacarídeos ácidos, tais como glicosaminoglicanos ou alguns tipos de mucopolissacarídeos, na cartilagem das células para determinar a presença de condrócitos diferenciação33.
      1. Adicione formol a 10% para fixação. Dentro de 30 min, adicione ácido acético a 3% e permitir que 2 min para a reação. Posteriormente, lave com água destilada três vezes, adicionar 1% azul de Alcian 8GX incubado por 30 min e depois lave com água destilada. Finalmente, adicione ácido acético a 3% e lavar por 3 min e em seguida lavar com água destilada para terminar.
        Nota: As partes da célula que mancham especificamente por este corante tornar-se azul a azul esverdeado após coloração e são chamadas de "alcianophilic".

4. efeitos da 25-dihidroxivitamina D3 (1,25-(OH),2D3) na osteogênese

  1. Dividi o P3 para P5 PDCs em seis grupos e cultura em placas de 6-poços com vários meios de cultura:
  2. grupo negativo (α-MEM e 5% FBS);
  3. Grupo de vitamina C (α-MEM, 5% FBS, β-glicerofosfato de 10 mM e dexametasona 10−7 M + 100 hum vitamina C);
  4. e 10−7 M 1,25-(OH)2D3 grupo (α-MEM, 5% FBS, β-glicerofosfato de 10 mM e 10−7 M dexametasona + 10−7 1,25-(OH) M2D3).
  5. Adicione 2 mL do meio de uma incubadora (37 ° C) em cada poço e mudar o médio duas vezes por semana.

5. inverter a reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa/transcrição

  1. Depois d 7 da diferenciação osteoblástica, isolar o RNA total no gelo usando um reagente comercial (ver Tabela de materiais):
    1. Adicione 1 mL do reagente de isolamento para cada poço. Adicionar 200 µ l de bromochloropropane e deixar por 10 min gerar RNA em camadas e em seguida centrifugar a 10.000 rpm por 15 min a 4 ° C.
    2. Após a centrifugação, adicione 500 µ l de 2-propanol a 500 µ l do sobrenadante contendo RNA. Precipitar o RNA no gelo e deixe 15 min para a reação.
    3. Após o procedimento, centrifugar a 12.000 rpm por 15 min a 4 ° C, após o qual o RNA está localizado na parte inferior do tubo. Posteriormente, remover o sobrenadante usando 1 mL de álcool de 75% para lavar e centrifugar a 7.500 rpm por 8 min em 4 ° C.
    4. Remover o sobrenadante e usar um concentrador a vácuo para produzir RNA do fundo do líquido. Recupere-se com água.
  2. Reverso transcrever o RNA (1 μg) usando o transcriptase reverso vírus myeloblastosis aviária. Definir a reação em cadeia do polymerase (PCR) para executar a 25 ° C por 10 min, seguido de 50 ° C por 60 min e, em seguida, 85 ° C por 5 min, antes de finalmente manter a 4 ° C.
  3. Sintetiza primeiro-strand DNA complementar (cDNA). Realizar o PCR quantitativo (qPCR) usando 5 μL de 01:10 diluído do cDNA. Conduta de RT-PCR quantitativo (qRT-PCR) utilizando primers para ALP, BSP, OCN, CBFA1 e colágeno-1.
    Nota: Para evitar a contaminação de DNA pelos sinais, as sequências de frente e verso de cada primer foram projetadas em distintas exões.
  4. Executar qPCR usando um comercial do PCR Master Mix (ver Tabela de materiais), em conformidade com as instruções do fabricante. Definir o termociclador a 50 ° C por 2 min, seguido de 95 ° C por 10 minutos e então 40 ciclos cada um a 95 ° C por 15 s seguido de 60 ° C por 60 s.
    Nota: O protocolo SYBR também requer uma fase de curva de derreter, que é executada a 95 ° C por 15 s, 60 ° C por 60 s e em seguida a 95 ° C por 15 s.
  5. Normalizar os valores de limiar de ciclo para ALP, BSP, CBFA1, colágeno-1 e OCN do gene das tarefas domésticas GAPDH. 34
  6. Pares da primeira demão são listados na Tabela de materiais.

6. alcalina fosfatase atividade

  1. Avaliar a atividade de enzima ALP das células usando a técnica descrita anteriormente,35, que converte p- nitrofenil fosfato de p- nitrofenol; p- nitrofenil fosfato é um substrato de fosfatase que fica amarelo quando dephosphorylated por ALP, conforme determinado no comprimento de onda de 405 nm. Normalizar o total de p- nitrofenol formado com base na proteína total conforme determinado pelo ensaio de Bradford.
  2. Comparar as atividades ALP do controle (α-MEM, 5% FBS), vitamina C (α-MEM, 5% FBS, β-glicerofosfato de 10 mM, 10−7 M dexametasona + 100 hum vitamina C), 1,25-(OH)2D3 (α-MEM, 5% FBS, β-glicerofosfato de 10 mM e 10−7 M dexametasona + 108 M 1,25-(OH)2D3) e vitamina C + 1,25-(OH)2D3 (α-MEM, 5% FBS, β-glicerofosfato de 10 mM, 10−7 M dexametasona + 100 hum +1,25-(OH) de vitamina C2D3) grupos após 1, 2, 3 e 4 semana de cultura.
  3. Execute um procedimento de extração de proteínas no gelo:
    1. Raspar as células das placas 6-poços e adicionar 50 µ l de tampão de Lise. Posteriormente, coloque as pilhas no gelo por 30 min destruir as células e liberar a proteína.
    2. Depois de 30 min, centrifugar a 13000 rpm a 4 ° C por 15 min. Após a centrifugação, extrair o sobrenadante para armazenamento e uso.

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Representative Results

Para todos os ensaios quantitativos, os dados são apresentados como média ± desvio-padrão (SD). Todas as análises estatísticas foram realizadas usando o Student t-teste. No total, 34 amostras foram obtidas com uma idade média de participantes de 48,1 ± 12,3 y. onze destas amostras foram obtidas de pacientes do sexo masculino e 23 do sexo feminino. Vinte e oito amostras foram obtidas a partir das regiões molares e seis das regiões anteriores; 26 foram obtidos de maxila e 8 da mandíbula. A duração média entre a cultura e o procedimento odontológico foi 0,5 ± 0,1 h. Das 34 amostras investigadas, 20 com sucesso rendeu colônias MSC, com uma taxa de sucesso de isolamento de 58,8%. Não há diferenças significativas foram observadas em qualquer um dos parâmetros entre o com êxito e os PDCs sem sucesso isolados (idade média: 48.8 ± 13,0 vs 47.1 y ± 11,5, sexo: 7 homens [35%] vs 4 homens [28,6%], local: 15 de regiões molares [75%] vs 13 [92,9%] e 15 de a maxila [75%] vs 11 [78,6%], respectivamente).

Isolamento e morfologia celular: osteogênica, chondrogenic e diferenciação de adipogenic

Dos dias 1 a 9, PDCs formaram colônias e aglomerados esféricos. A maioria das células exibiu uma aparência de eixo e foram homogêneos sob um microscópio de contraste de fase (Figura 2). Após 14 d da cultura, a morfologia celular apareceu fusiformes como observado ao microscópio de contraste de fase. Após as células da primeira geração, as células já não cresceram em clusters, mas exibiram a proliferação generalizada e uniforme.

Os MSCs foram fusiformes com processos irregulares e firmemente presa ao prato de cultura após 1-3 d de cultura primária (Figura 2a). A cultura inicial exibiu pequeno, redondo células e células fusiformes sob um microscópio óptico. As células cultivadas exibiram uma forma homogênea, fibroblasto, como eixo de primeira passagem (Figura 2a). O estudo de diferenciação revelou que os PDCs poderiam ser subpassaged e diferenciadas em vitro em adipócitos (Figura 2d), condrócitos (Figura 2C) e osteoblastos (Figura 2b).

No final da diferenciação osteogênica, von Kossa coloração indicaram a presença de depósitos de cálcio e diferenciação osteogênica (Figura 2b). Estes resultados fortemente indicam que entre populações de células do periósteo, células progenitoras possuem o potencial de se diferenciar em células osteogênicas.

Para avaliar a produção de proteoglicanos, Alcian mancha azul foi usada como um indicador para determinar a presença de diferenciação de condrócitos (Figura 2C). As células diferenciadas com êxito em condrócitos. Estes resultados sugeriram que, entre as populações de células do periósteo, células progenitoras possuem o potencial de se diferenciar em células chondrogenic.

As células foram cultivadas nos meios de comunicação específicos mencionados anteriormente para acionar adipogenic diferenciação. Depois de 8 semanas, óleo vermelho que s foi usado para detectar a existência de lipídios intracelulares. Seguir a coloração, intracelular gordura microscópica gotas foram observadas em cinco amostras diferenciadas (Figura 2d).

Análise de expressão de marcador de superfície do fluxo cytometric para PDCs

Um ensaio de cytometric do fluxo foi realizado para confirmar a expressão do marcador de superfície mesenquimal na superfície das células. Marcadores MSC CD73, CD90, STRO-1 e CD44 foram fortemente positivas nos PDCs, Considerando que marcadores de linhagem hematopoiética CD19, CD34, CD45 e HLA-DR foram negativos.

Efeitos de diferentes vitamina D 3 concentrações na osteogênese

Embora os resultados confirmaram os efeitos positivos da 1,25-(OH)2D3 (calcitriol) na atividade osteogênica, diferenças estatisticamente significativas foram observadas somente entre algumas das mudanças nas expressões de mRNA do osteogênica dobra enzimas. Esta análise pode ter sido influenciada pelos altos valores de SD, que podem ser atribuídos para os desvios individuais entre os hosts.

Expressão do RNA mensageiro da fosfatase alcalina

As alterações de dobra na expressão do mRNA de ALP após 1 semana de cultura foi 7.43 (SD = 3,96) no grupo de vitamina C e 7.15 (SD = 4.88), 9,30 (SD = 5,63), 12.92 (SD = 7,95) e 6,60 (SD = 6.33) na 10−10, 10−9, 10−8 e 10−7 M 1,25-(OH)2D3 grupos, respectivamente (figura 4a). Os níveis de expressão de RNAm de ALP em 10−9 M 1,25-(OH)2D3 grupos, 10−8 1,25-(OH) M2D3e a vitamina C foram significativamente maior (p < 0,05) do que aqueles dos outros grupos, indicando aumento da expressão do mRNA ALP nestes grupos. O controle foi definido para o valor 1. Neste estudo, observaram-se os seguintes aumentos de dobra nas expressões de mRNA ALP: 7.43-fold no grupo de vitamina C; 9.30-fold no grupo 1,25-(OH)2D3 de 10−9 M; e 12.92-fold no grupo de 10−8 M 1,25-(OH)2D3 .

Apesar de uma mudança maior de dobra nas expressões de ALP mRNA foi observada no grupo de 10−8 M 1,25-(OH)2D3 , não há diferenças estatisticamente significativas foram observadas em relação estes níveis de expressão entre este grupo e o grupos de vitamina C e negativos (p = 0.20 e p = 0,52, respectivamente).

ALP é um forte indicador para determinar a diferenciação osteogênica precoce das células. ALP também serve como um ectoenzyme para a degradação do pirofosfato inorgânico e libera fosfato durante a mineralização36. Os PDCs tratadocom com vitamina C e 10−8 e 10−9 M 1,25-(OH)2D3 exibiram diferenças significativas quando comparados com os dos outros grupos (figura 4a).

Expressão do RNA mensageiro de osso sialoprotein

As alterações de dobra nas expressões de mRNA de BSP após 1 semana de cultura foram 3.21 (SD = 1,20) e 4,18 (SD = 2.55), 10.34 (SD = 10,31), 24.91 (SD = 23.44) e 5,24 (SD = 3,54) a vitamina C e a 10−10, 10−9, 10−8 e 10−7 M 1,25-(OH)2D3 grupos, respectivamente (figura 4b). As expressões de BSP mRNA foram maiores no grupo de 10−8 M 1,25-(OH)2D3 , mas não estatisticamente significante em comparação com as expressões correspondentes dos outros grupos.

As expressões de BSP mRNA na vitamina C e 10−10 M 1,25-(OH)2D3 grupos foram significativamente maior (p < 0,05) do que as dos outros grupos, indicando que a vitamina C e 10−10 M 1,25-(OH) 2 D3 promovido expressão BSP. O controle foi definido para um valor de 1. A vitamina C e os 10−10 M 1,25-(OH)2D3 grupos exibiram um aumento de 3,21 - e 4.18 vezes nas expressões de mRNA BSP, respectivamente. A 10−9 M e 10−8 M 1,25-(OH)2D3 grupos exibiram expressões de mRNA BSP mais elevados do que os outros grupos. A 10−9 e 10−8 M 1,25-(OH)2D3 grupos apresentaram um aumento de 10,34 - e 24.91 vezes nas expressões de mRNA BSP, respectivamente, mas este aumento não foi estatisticamente significativa (p > 0,05). Uma possível explicação é que as células-tronco não foram todas obtidas com o mesmo participante. Assim, as diferenças de potenciais podem ter aumentado o SD e, consequentemente, afetou os resultados estatísticos.

Expressão do RNA mensageiro da CBFA1

As alterações de dobra nas expressões CBFA1 mRNA após 1 semana de cultura foram 0,96 (SD = 0,10) e 0,90 (SD = 0,26), 1.01 (SD = 0,25), 1,31 (SD = 0.32) e 1.12 (SD = 0,35) na vitamina C e a 10−10, 10−9, 10−8 e 10−7 M 1,25-(OH)2D3 grupos, respectivamente (Figura 4C). 10−8 1,25-(OH) M2D3 grupo exibiu maiores expressões CBFA1 mRNA. Nenhuma alteração marcada foram observadas as expressões do gene CBFA1 mRNA nos grupos de tratamento ou no grupo controle. Além disso, não observou-se nenhum aumento significativo na expressão de marcadores de mRNA, após a adição de vitamina C ou 1,25-(OH)2D3. Além disso, não há diferenças significativas intergrupos foram observadas.

Expressão do RNA mensageiro de colágeno-1

As alterações de dobra na expressão do mRNA de colágeno-1 após 1 semana de cultura foram 0,98 (SD = 0.17) e 0,85 (SD = 0,16), 1.05 (SD = 0,16), 1.52 (SD = 0,36) e 1,01 (SD = 0,33) a vitamina C e a 10−10, 10−9, 10−8 e 10−7 M 1,25-(OH)2D3 grupos, respectivamente (Figura 4D). As expressões de mRNA de colágeno-1 foram maiores no grupo de 10−8 M 1,25-(OH)2D3 , mas sem diferenças estatisticamente significativas em comparação com as expressões correspondentes dos outros grupos.

10−8 M 1,25-(OH)2D3 e controle grupos exibiram diferenças estatisticamente significativas em seus resultados (p < 0,05). O controle foi definido para um valor de 1. Observou-se um 1.52-fold aumento nas expressões de mRNA de colágeno-1. A 10−10 M 1,25-(OH)2D3 e 10−8 1,25-(OH) M2D3 grupos exibiram diferenças significativas em seus resultados (p < 0,05).

Expressão do RNA mensageiro da osteocalcina

As alterações de dobra nas expressões OCN mRNA após 1 semana de cultura foram 0,60 (SD = 0,1) e 0,78 (SD = 0.18), 1.13 (SD = 0,55), 2,59 (SD = 1,59) e 1.61 (SD = 0,73) na vitamina C e a 10−10, 10−9, 10−8 e 10−7 M 1,25-(OH)2D3 grupos, respectivamente (Figura 4e). As expressões de mRNA OCN foram maiores no grupo de 10−8 M 1,25-(OH)2D3 , mas sem diferenças estatisticamente significativas em comparação com as expressões correspondentes dos outros grupos.

Nenhum aumento significativo foi observado nas expressões dos marcadores OCN mRNA após a adição de vitamina C ou 1,25-(OH)2D3. No entanto, as expressões de mRNA OCN diminuíram após tratamento com vitamina C. O controle foi definido para o valor 1. As expressões de OCN basais exibiram um decréscimo significativo de 0.6-fold (p < 0,05) durante a diferenciação osteoblástica. O mRNA OCN expressões foram significativamente maior (p < 0,001) nas células cultivadas em 10−8 M 1,25-(OH)2D3 do que nas expressões correspondentes dos outros grupos, que exibiram uma dobra média aumentar de 2.59. no entanto, estes resultados não foram estatisticamente significativos (p > 0,05). Uma possível explicação é que as células-tronco não foram todas obtidas a partir do mesmo participante; assim, as diferenças de potenciais podem ter aumentado o SD e, consequentemente, afetou os resultados estatísticos.

Ensaio da atividade ALP

Um estudo anterior demonstrou que 1,25-(OH)2D3 é mais eficaz em uma concentração de 10−8 M; Portanto, 10−8 M foi usado no grupo de teste para comparar a capacidade osteogênica do 1,25-(OH)2D3 com isso do negativo, vitamina C e vitamina C + 1,25-(OH)2D3 grupos. A capacidade osteogênica foi expressa pela atividade ALP. Após 1 semana da cultura (Figura 5a), as mudanças de dobra em atividade ALP eram 1.00 (SD = 0,00), 1,92 (SD = 0,89), 3.77 (SD = 1,66) e 1,46 (SD = 0,49) em negativo, C, D e C + D, respectivamente. Entre todos os grupos, apenas foram observadas diferenças estatisticamente significativas entre os grupos D e negativo (p = 0,03; Figura 5a). Depois de 2 semanas de cultura, as mudanças de dobra em atividade ALP (Figura 5b) eram 1.00 (SD = 0,00), 2,32 (SD = 1,68), 4.98 (SD = 3,02) e 4,86 (SD = 2,73) em negativo, C, D e C + D, respectivamente. Não há diferenças estatisticamente significativas foram observadas em nenhum dos grupos. Após 3 semanas de cultura, as mudanças de dobra em atividade ALP (Figura 5C) eram 1.00 (SD = 0,00), 2,93 (SD = 2.15), 5,76 (SD = 3,60) e 5,61 (SD = 3,88) em negativo, C, D e C + D, respectivamente. Novamente, não há diferenças estatisticamente significativas foram observadas em nenhum dos grupos (Figura 5C). Após 4 semanas de cultura, as mudanças de dobra em atividade ALP (Figura 5D) eram 1.00 (SD = 0,00), 2.83 (SD = 1,97), 3.79 (SD = 0,77) e 4,24 (SD = 2,87) em negativo, C, D e C + D, respectivamente. Aqui, os grupos D e negativo exibiram diferenças estatisticamente significativas (p = 0,00; Figura 5D).

Em 1 semana, apenas o 10−8 M 1,25-(OH)2D3 grupo exibiu diferenças significativas em comparação com o grupo controle (p = 0,03). Na semana 2, os 10−8 M 1,25-(OH)2D3 e vitamina C grupos exibiram diferenças significativas em comparação com o grupo controle (p = 0.0498). Na semana 3, nenhum dos grupos exibiram diferenças significativas em comparação com o grupo de controle. Na semana 4, a 10−8 1,25-(OH) M2D3 grupo exibiu diferenças significativas em comparação com o grupo de controle. Isto indicou que 10−8 M 1,25-(OH)2D3 promoveu atividade ALP.

Em breve, a 10−8 1,25-(OH) M2D3 grupo exibiu aumentou ALP e a expressão de RNAm de colágeno-1; o vitamina C grupo exibiu ALP significativamente melhorada e a expressão de RNAm BSP; e o 10−9 M 1,25-(OH)2D3 grupo exibiu expressão de RNAm ALP significativamente melhorada. Em 1 semana, observou-se maior atividade da ALP em vitamina C e 1,25-(OH)2D3 grupos, mas sem diferenças estatisticamente significativas em comparação com os níveis correspondentes de expressão dos outros grupos. De semanas 2 a 4, vitamina C e 1,25-(OH)2D3 grupos exibiram resultados semelhantes. Portanto, estes resultados não poderiam elucidar claramente os efeitos sinérgicos de vitamina C e 1,25-(OH)2D3 sobre a diferenciação osteogênica das células (atividade ALP).

Figure 1
Figura 1: periósteo alveolar humano. Periosteal tecidos foram colhidos durante cirurgia dentária. O asterisco indica a localização do periósteo alveolar.

Figure 2
Figura 2: estudo da diferenciação. Os MSCs foram fusiformes com processos irregulares e firmemente presa ao prato de cultura após 1-3 d da cultura principal (A; o asterisco indica a localização da célula tronco mesenquimal). Em vitro condições de cultura, os MSCs foram subpassaged e diferenciadas em osteoblastos (B, o asterisco preto indica a área manchada por von Kossa), condrócitos (C, o asterisco azul indica a área manchada por Azul de Alcian) e adipócitos (D, o asterisco rosa indica a área manchada com óleo O vermelho). Figura 2 é reutilizado de Biomedical Research International, Volume 2016, artigo ID 352956125. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: citometria de fluxo. Marcadores de superfície expressados pelo MSCs foram CD73 (65.2%), CD90 (75,6%), STRO-1 (65.2%) e CD44 (88,1%) mas não CD45 (1,34%), CD34 (1,61%), CD19 (2,18%), ou HLA-DR (2,20%). "%" na figura denota uma relação positiva. O grupo de controle (α-MEM e 5% FBS) é representado pela linha vermelha. O grupo experimental é representado pela linha azul. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: expressões mRNA. expressões de mRNA de diferenciação osteoblástica por 1 semana. BSP de ALP (B) (), (C) CBFA1, (D) COL-I e (E) OCN. é p < 0,05 *, p < 0,01 é * *, p < 0,001 é * * *. A mudança de dobra do mRNA é contra controle (α-MEM e 5% FBS). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: a atividade da fosfatase alcalina. Atividade da fosfatase alcalina do ensaio de diferenciação osteoblástica para (A) semana 1, semana (B) 2, (C) semana 3 e (D) semana 4. p < 0,05 é *, p < 0,01 é * *, p < 0,001 é * * *. A mudança de dobra é contra controle (α-MEM, 5% FBS). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Uma modalidade terapêutica recentemente desenvolvida, ou seja tecido de engenharia que impliquem MSCs, tem inúmeras vantagens. MSCs, que estão presentes em diversos tipos de tecido, são células multipotentes que podem se diferenciar em uma variedade de células de tecidos mesodérmicos funcional37 e outras células, como os osteoblastos.

O periósteo serve como um nicho de células progenitoras, e como uma fonte de rica vascularização para o osso envolve-38. Em nosso estudo, das 34 amostras investigadas, 20 com sucesso rendeu colônias MSC, com uma taxa de sucesso de isolamento de 58,8%. MSCs derivados do periósteo foram selecionados neste estudo baseada sua proliferação e diferenciação osteogênica habilidades. A taxa de proliferação das células do periósteo foi muito maior do que a de células do estroma da medula22. Em relação a capacidade osteogênica do periósteo, Ousual24 sustentou que a capacidade osteogênica de células-tronco derivadas de periósteo (EMP) foi inferior do BMSCs. No entanto, Yoshimura atestou que a capacidade osteogênica das EMP/ESP superou o de BMSCs39. Hayashi et al. demonstrado periosteal MSCs adultos como candidatos ideais para o de regeneração de tecido ósseo24. Além disso, periosteal MSCs adultos são considerados úteis para encurtar o período de cultura celular, reduzindo, assim, tanto o custo e o risco de contaminação de22. Declaradamente, o envelhecimento também afeta a atividade mitogênico do células osteoprogenitoras40. Um estudo relatou 1,25-(OH)2D3 induzido a um maior grau de estimulação de em vitro diferenciação osteoblástica em hMSCs de jovens participantes (envelhecido < 65 y)41. O presente estudo envolveu o uso de células do periósteo obtidos de jovens adultos (idade < 65 y). Mais estudos são necessários para comparar a capacidade de regeneração óssea de células do periósteo entre velhos e jovens doadores.

Neste estudo, uma população de células foi isolada com base na sua propriedade de plástico aderente, como descrito por Friedenstein et al. 13. the PDCs colhidas aqui aderiu ao plástico de cultura de células. Os marcadores de esenchymal (73 de CD, CD-90, STRO-1 e CD 44) dos antígenos de superfície dessas células de culturas primárias exibiram expressões significativas. Além disso, marcadores hematopoiéticas (CD 45, 34 CD, CD 19 e HLA-DR) estavam ausentes, indicando que as células cultivadas eram de origem mesenquimal. A diferenciação osteogênica, chondrogenic e adipogenic dos PDCs poderia ser induzida usando a mídia de diferenciação específica, conforme descrito em outros estudos avaliando amostras obtidas a partir de tecidos e medula óssea gengival42. Os resultados do presente estudo cumprem com os padrões mínimos para a definição fenotípica e funcional de MSCs humanos aceitado pela sociedade internacional de terapia celular4. No presente estudo, os MSCs do periósteo humano foram isolados e ampliados, que revelou características similares àquelas descritas tipicamente de BMSCs.

Estudos têm sugerido que a dexametasona, ascorbato e β-glicerofosfato causam BMSCs submeter-se a diferenciação osteogênica43. Outro estudo demonstrou que 1 α, 25-dihidroxivitamina D3 (1,25-(OH),2D3) em combinação com ácido ascórbico promovido de diferenciação de células-tronco44. Portanto, dexametasona, ascorbato e β-glicerofosfato foram adicionados neste estudo para promover a diferenciação de células-tronco. Os padrões observados foram semelhantes em todos os três amostras de células doentes. Neste estudo, MSCs foram identificados com êxito desde o periósteo alveolar com uma taxa de isolamento de 58,8%. Não há diferenças estatisticamente significativas foram observadas na taxa de sucesso em relação ao sexo, idade e localização.

O presente estudo experimental investigou duas substâncias, ou seja, 1,25-(OH)2D3 e vitamina C, ambos os quais podem estimular a diferenciação osteogênica de células-tronco. Um estudo de 200845 indicou que 1,25-(OH)2D3 é crucial para o metabolismo do osso e homeostase do cálcio e afeta o sistema cardiovascular através de mecanismos ainda para ser completamente compreendido. Em estudo outra anterior46, 1,25-(OH)2, D3 estimulado em vitro diferenciação do MSCs humanas em osteoblastos. A capacidade de 1,25-(OH)2D3 para induzir BMSCs indiferenciados de se diferenciar em células osteoblast em vitro tem sido demonstrada em vários estudos, explorando vários sistemas46. Alguns estudos também têm demonstrado que, quando adicionado a culturas de células osteoblast-like, 1,25-(OH)2, D3 inibe a proliferação celular mas aumenta a expressão de marcadores osteoblásticas como ALP, osteopontin, OCN e matriz Gla proteína47,,48. Um estudo anterior relatou que 1,25-(OH)2D3 normalmente inibe a proliferação celular e induz a diferenciação de osteoblastos49. Um estudo em vitro realizado em células de murino indicou que 1,25-(OH)2D3 pode promover os estágios iniciais de osteoblastogenesis9. Além disso, outro em vitro estudo sugeriu que, para MSCs,1,25-(OH) cedo e tarde2D3 pode estimular marcadores de diferenciação osteogênica, incluindo ALP, osteopontin, BSP e OCN43.

Ambos os OCN — considera-se responsável pelo controle da síntese de matriz — e colágeno 1A1 — a mais abundante proteína matriz — é osso ácido crucial proteínas da matriz que desempenham um papel vital na síntese de matriz. Além disso, eles são característicos osteoblastos maduros formadoras de matriz. 50 um estudo anterior relatou que 1,25-(OH)2D3 tratamento estimulada aumento do colágeno 1A1 expressão mas não CBFA1 ou ALP gene expressão34. Avaliações de genes envolvidos na diferenciação osteoblástica revelaram que 1,25-(OH)2D3 tratamento aumentou a expressão da OCN51,52,53. Em nosso estudo, os resultados mostraram que 1,25-(OH)2D3 exerce efeitos positivos sobre a atividade osteogênica. Em comparação com os outros grupos, 108 M 1,25-(OH)2D3 demonstrou aumento da expressão do mRNA de ALP, BSP, CBFA1, OCN e Col1. Entre estes, os resultados de ALP e Col1 atingiu significância estatística. Portanto, condições ideais foram obtidas ao usar 108 M 1,25-(OH)2D3. expressão de RNAm de BSP em 10− 10 M 1,25-(OH)2D3 grupo aumentado significativamente (p < 0,05). No entanto, não há diferenças estatisticamente significativas foram observadas nas mudanças nas expressões de mRNA de CBFA1 e OCN dobra. Ao analisar a expressão de RNAm do gene, os resultados do experimento indicaram em vitro diferenciação osteogênica. Com base nesses resultados, a osteogênese observada no negativo, vitamina C e 10− 10, 10,−9, 10−7 1,25-(OH) M2D3 grupos foi mais fraca do que no 1,25-(OH) 108 M2D3 grupo. Estes resultados levaram à especulação que 1,25-(OH)2D3 primos PDCs por estrogenos as proteínas da matriz necessárias para mineralização (colágeno 1A1).

Um estudo anterior relatou OCN como alvo principal de 1,25-(OH)2D3, que aumentou acentuadamente OCN expressão52. Deposição de OCN pode ser vista como um marcador para a diferenciação osteogênica do PDC. Além disso, a expressão OCN foi avaliado como uma tarde de marcador osteogênica54. OCN é um marcador confiável para osso formação e osteogênese55. Portanto, a expressão OCN está geralmente relacionada à capacidade de mineralização de células. OCN é um biomarcador sensível dos osteoblastos maduros. Para uma comparação osteogênica em vitro , observou-se marcadamente elevada expressão de RNAm OCN no 108 1,25-(OH) M2D3 grupo.

Um estudo indicou que a atividade da ALP foi inibida por transformar o fator de crescimento beta (0,1-10 ng/mL) e promovida com 1,25-(OH)2D3 (50 nM)46. Estes resultados implicam que 108 M 1,25-(OH)2D3 promove o desenvolvimento de maturação e osso de células-tronco. Atividade ALP nas concentrações observadas ideais de 108 1,25-(OH) M2D3 foi comparada com o que em concentrações correspondentes de vitamina c. Os PDCs expressaram a atividade da ALP. Além disso, a adição de 1,25-(OH)2D3 aumentou a atividade da ALP e promovido a diferenciação osteoblástica os PDCs. Em todas as três configurações, vitamina C, 108 M 1,25-(OH)2D3e vitamina C + 108 M 1,25-(OH)2D3 aumento da atividade da ALP em semanas 1 (figura 4a), 2 (figura 4b), 3 ( Figura 4 c) e 4 (Figura 4D) por diversas vezes comparado com o do grupo controle negativo. Nas semanas 1 e 4, atividade da ALP aumentou significativamente no grupo de3 108 1,25-(OH) M2D. Na semana 2, atividade da ALP aumentou significativamente a vitamina C e 108 1,25-(OH) M2D3 grupos.

Através de um estudo comparativo de várias MSCs humanas na passagem 3, Sakaguchi et al. 56 encontrado que BMSCs e EMP possuem habilidades osteogênicas semelhantes. Portanto, o período de cultura celular provavelmente pode ser encurtado usando células do periósteo, que por sua vez reduziria o risco de contaminação e custo. O uso de hMSCs de início-passagem evita os efeitos senescentes da expansão da cultura. Ousual e Yoshimura usado MSCs no passage 3 e repicagem por 2 semanas sob condições de diferenciação osteogênica35. Portanto, o tempo de passagem deve ser considerado quando se comparam as atividades celulares de várias fontes de célula. Neste estudo, PDCs de terceira geração foram usados porque o potencial osteogênico das células-tronco das gerações posteriores de PDCs é menor do que as células-tronco de PDCs de terceira geração.

Quando cultivadas em um meio de soro humano, células-tronco periósteo pode não apenas manter sua forma, mas pode também anexar, manter atividade e alcançar crescimento celular. Em resumo, com base nestes resultados, PDCs humanas possuam a habilidade de sobreviver, proliferar e diferenciar-se na linhagem osteogênica em vitro, que é crucial na avaliação de eficácia na vivo. O periósteo é rico em MSCs e, portanto, é apropriado para a engenharia de tecidos. O periósteo obtido a gengiva apresenta menos complicações. Portanto, o osso alveolar é considerado um local doador ideal. Os resultados demonstraram claramente a possibilidade da mesma forma, isolando o MSCs do periósteo e alcançar sua diferenciação em adipócitos, condrócitos e osteoblastos. Neste estudo, os efeitos da vitamina C sobre o potencial osteogênico de PDCs foram comparados com os de 1,25-(OH)2D3 em diferentes concentrações. A concentração mais eficaz foi 108 M 1,25-(OH)2D3. O 108 M 1,25-(OH)2D3 tratamento durante todo o período de cultura foi um método eficaz e econômico de induzir a diferenciação osteogênica no PDC. Em conclusão, vitamina C e 1,25-(OH)2D3 promovem a diferenciação osteogênica do PDC. No entanto, estas exibiram sem efeitos sinérgicos significativos nos resultados da atividade ALP. Considerando o pequeno tamanho da amostra, amostras adicionais são necessárias para futura avaliação. Assim, PDCs cultivadas sob condições osteogênicas podem ser útil para a engenharia de tecidos ósseo e oferecem a vantagem de maior proliferação celular.

Passos críticos do presente protocolo incluem etapas 1.2 e 1.3 (início do processo de cultivo dentro de 24 horas de colheita e manutenção adequada posteriormente). Deve-se evitar a contaminação do tecido e uso de técnica asséptica é obrigatório. Uma limitação do presente protocolo é que, comparado com a fonte de células-tronco da medula óssea ou tecido adiposo, fonte de células-tronco do tecido dental é limitada em termos de baixo número de células que podem ser obtidos por intermédio da técnica.

A identificação e caracterização de células-tronco periosteal podem fornecer informações valiosas sobre as funções e o potencial regenerativo deste tecido, bem como sua aplicabilidade em terapia regenerativa. Obteve-se uma condição ideal usando 108 M 1,25-(OH)2D3. Portanto, o tratamento de PDCs com 108 1,25-(OH) M2D3 promove diferenciação osteogênica. Estudos futuros devem examinar o requerimento na vivo de 108 M 1,25-(OH)2D3 para engenharia de tecidos ósseos eficaz e econômica.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

O protocolo de estudo foi aprovado pelo Conselho de revisão institucional para clínicas pesquisa de Chang Gung Memorial Hospital (IRB99-1828B, 100-3019C, 99-3814B, 102-1619C, 4728B-101 e 103-4223C). Este estudo foi suportado por Chang Gung Memorial Hospital (CMRPG392071, CMRPG3A1141, CMRPG3A1142 e NMRPG3C0151). Este manuscrito foi editado por Wallace edição académica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA Gibco 25200-056
2-phospho-L-ascorbic acidtrisodium salt Sigma 49752
35-mm culture dishes Corning 430165
3-isobutyl-1-methylxanthine Sigma I5879
6  well plate Corning 3516
Alkaline phosphatase ABI Hs01029144_m1
Alkaline Phosphatase Activity Colorimetric Assay Kit BioVision K412-500
avian myeloblastosis virus reverse transcriptase Roche 10109118001
CD146 BD 561013
CD19 BD 560994
CD34 BD 560942
CD44 BD 561858
CD45 BD 561088
CD73 BD 561014
CD90 BD 561974
Cell banker1 ZEAOAQ 11888
core binding factor alpha-1 ABI Hs00231692_m1
dexamethasone Sigma D4902
DPBS Gibco 14190250
FBS Gibco 26140-079
GAPDH ABI Hs99999905_m1
HLA-DR BD 562008
indomethacin Sigma I7378
insulin sigma 91077C
insulin–transferrin–selenium-A Sigma I1884
MicroAmp Fast 96 well reaction plate(0.1ml) Life 4346907
MicroAmp optical adhesive film Life 4311971
Minimum Essential Medium 1X Alpha Modification HyClone SH30265.02
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122
Permeabilization buffer eBioscience 00-8333-56
Sodium pyruvate Gibco 11360070
STRO-1 BioLegend 340103
SYBER Green PCR Master Mix AppliedBiosystems 4309155
TaqMan Master Mix Life 4304437
transforming growth factor-β Sigma T7039 
Trizol reagent (for RNA isolation) Life 15596018
β-glycerophosphate Sigma G9422
collagen-1 Invitrogen forward primer 5' CCTCAAGGGCTCCAACGAG-3
reverse primer 5'-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3'
OCN Invitrogen forward primer 5'-GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG-3'
reverse primer 5'-GTCAGCCAACTCGTCACAGT-3'
BSP Invitrogen forward primer 5' AAAGTGAGAACGGGGAACCT-3'
reverse primer 5'-GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3'
Commercial ALP primers
Commercial CBFA1 primers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Wang, Y. L., Hong, A., Yen, T. H., Hong, H. H. Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells. J. Vis. Exp. (135), e57166, doi:10.3791/57166 (2018).

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