Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Isolering af mesenkymale stamceller fra menneskelige alveolær Periosteum og effekter af D-Vitamin på Osteogenic aktivitet af Periosteum-afledte celler

Published: May 4, 2018 doi: 10.3791/57166
Automatic Translation
1,2, 3, 1,4,5,6, 1,7,8
1Chang Gung University, 2Department of Periodontics, Chang Gung Memorial Hospital, 3California Northstate University College of Medicine, 4Department of Nephrology, Clinical Poison Center, Chang Gung Memorial Hospital, 5Kidney Research Center, Chang Gung Memorial Hospital, 6Center for Tissue Engineering, Chang Gung Memorial Hospital, 7Department of Periodontics, Chang Gung Memorial Hospital, 8College of Oral Medicine, Taipei Medical University

Summary

Vi præsenterer en protokol for at undersøge mRNA udtryk biomarkører periosteum-afledte celler (fremdaterede) foranlediget af vitamin C (C-vitamin) og 1,25-dihydroxy vitamin D [1,25-(OH)2D3]. Derudover vurderer vi fremdaterede evne til at differentiere i osteocytes, chondrocytter og adipocytter.

Abstract

Mesenchymale stamceller (msc) er til stede i en række forskellige væv og kan opdeles i mange celletyper, herunder osteoblaster. Blandt de dental kilder af MSC'er er periosteum et let tilgængeligt væv, som er blevet identificeret til at indeholde MSCs i cambium lag. Dog, denne kilde har endnu ikke været udbredt undersøgt.

Vitamin D3 og 1,25-(OH)2D3 har påvist for at stimulere in vitro- differentiering af MSCs i osteoblaster. Desuden fremmer C-vitamin kollagen dannelse og knogle cellevækst. Ingen undersøgelse har dog endnu undersøgt effekten af Vitamin D3 og C-Vitamin på MSCs.

Vi præsenterer her, en metode til at isolere MSCs fra menneskelige alveolær periosteum og undersøge den hypotese, at 1,25-(OH)2D3 kan udøve en osteoinduktive virkning på disse celler. Vi også undersøge tilstedeværelsen af MSC'er i den menneskelige alveolær periosteum og vurdere stamcelle vedhæftning og spredning. For at vurdere nøgle muligheden for C-vitamin (som kontrol) og forskellige koncentrationer af 1,25-(OH)2D3 (10−10, 10−9, 10−8og 10−7 M) til at ændre mRNA biomarkører i isolerede MSCs mRNA udtryk af alkalisk fosfatase (ALP), knogle sialoprotein (BSP), core bindende faktor alfa-1 (CBFA1), kollagen-1 og osteocalcin (OCN) måles ved hjælp af real-time Polymerasekædereaktionen (RT-PCR).

Introduction

Selv om mange relevante teknikker er blevet udviklet i de seneste år, bone genopbygningen er stadig begrænset af flere begrænsninger, og estimering af omfanget af nødvendige genopbygning er ofte umuligt. Hårde væv brystforstørrelse er forpligtet til at opnå både æstetiske og funktionelle mål ud over en gunstig langsigtede succesrate. Metoder, der almindeligvis anvendes til sådanne procedurer omfatte autogen og allogen knoglegraft, xenografting og alloplastic knogle podning. Blandt de forskellige typer af knogletransplantation betragtes autogen bone podninger som den mest effektive. Donor site sygelighed, kompromitteret vaskularisering og begrænset væv tilgængelighed1 har dog været store ulemper for autogen knogle podning. Derudover har allogen bone podninger og xenografts været forbundet med smitteoverførsel. I øjeblikket, er syntetisk knogle vin almindeligt anvendt til at løse disse problemer. Men med deres manglende osteogenic potentiale, kliniske resultater har varieret meget. Materialer som cellulose er forbundet med volumen udsving, infektion, og en mangel på styrke.

Knogle augmentation bruger vævsmanipulering har genereret betydelig interesse. I denne teknik bruges mesenchymale stamceller (msc) i første omgang til at fremme osteoblastdannelse differentiering, som er derefter transplanteres til webstedet af knogletab at opnå knogle reparation. Denne procedure er i øjeblikket anvendes i celleterapi. At opnå knogle genopbygning ved at udtrække en begrænset mængde væv er enklere og mindre invasiv sammenlignet med andre metoder.

MSC'er potentielle rolle som et redskab til celle-baserede behandlinger rettet mod dental regenerering er en spirende interesse blandt forskellige forskergrupper. Undersøgelser har bekræftet, at MSC'er kan skelnes fra de følgende typer af væv: knoglemarven, fedt, synovial membran, pericyte, trabekulær knogle, menneskelige navlestreng og dental væv2,3. Almindelige kilder til MSCs omfatter knoglemarven, fedtvæv og dental væv. Sammenlignet med MSCs stammer fra fedtvæv og knoglemarv, er fordelene ved dental stamceller let tilgængelighed og mindre sygelighed efter høst. Sammenlignet med embryonale stamceller, MSCs stammer fra dental væv vises nonimmunogenic og er ikke forbundet med komplekse etiske bekymringer3.

I 2006, International Society for cellulære terapi anbefales ved hjælp af følgende standarder til at identificere MSCs: første MSC'er skal være i stand til at vedhæfte til plast. Andet skal MSC'er være positiv for de overflade antigener, CD105, CD73 og CD90 og negative for markører for monocytter, makrofager og B-celler ud over hæmatopoietisk antigener CD45 og CD344. Som endelige kriterium, MSC'er skal være i stand til at skelne i de følgende tre typer af celler under standardbetingelser for in vitro- differentiering: osteoblaster, adipocytter og chondrocytter4. Til dato har seks typer af menneskelige dental stamceller isoleret og karakteriseret. Den første type var isolerede fra menneskets pulp væv og betegnes postnatal dental pulp stamceller5. Efterfølgende tre yderligere former for dental MSCs er blevet isoleret og karakteriseret: stamceller fra ekspanderet løvfældende tænder6, parodontale ledbånd7og den apikale papilla8. Mere nylig, dental follikel-afledte9, gingival væv-afledte10, dental bud stilk cells(DBSCs)11, og periapical cyste MSCs (hPCy-MSCs)12 er også blevet identificeret.

Friedenstein var først til at definere MSCs13. MSC'er udviser en høj spredning potentielle og kan manipuleres til at differentiere før at blive transplanteret, hvilket tyder på, at de er ideelle kandidater til regenerativ procedurer10.

Selv om de fleste studier har anvendt knoglemarv som en kilde til stamceller, periost-afledte celler (PDC'er) har også været brugt for nylig14. Periosteum er mere let tilgængelige end knoglemarven. Derfor i denne teknik bruger vi alveolær periosteum at eliminere behovet for yderligere indsnit under operation og reducere postsurgical sygelighed hos patienter. Periosteum er det bindevæv, der danner den ydre foring af lange knogler og består af to adskilte lag: den yderste fibrøse lag bestående af fibroblaster, kollagen og elastiske fibre15, og den indre celle-rige cambium lag i direkte kontakt med knoglen overfladen. Cambium lag indeholder en blandet celle population, primært fibroblaster16, osteoblaster17, pericytes18, og en kritisk delpopulation identificeret som MSCs19,20,21. De fleste undersøgelser har rapporteret at fremdaterede er sammenlignelige, hvis ikke overlegent, knoglemarv-afledte stamceller (bMSCs) i knogle heling og regenerering22,23,24. Periosteum er lettilgængeligt og udstiller fremragende regenerativ effektivitet. Men, nogle undersøgelser har fokuseret på periosteum25,26,27.

Med hensyn til knogle reparation involverer den aktuelle kliniske praksis transplantation af periosteal stamceller forstærkes inden for støttende stilladser. Nylige undersøgelser har fokuseret på erhverve stamceller i defekt regioner og beskæftiger stamceller til væv revitalisering20. Tandlæger også forudse fremtidige anvendelse af parodontale knogle regenerering i parodontale behandlinger og tandimplantater. Om webstedet donor periosteum kan nemt høstet af generelle dental surgeons. Det sammenligner positivt mod marv stromale celler, som periosteum kan tilgås under rutinemæssige oral kirurgi. Formålet med denne undersøgelse er således, at etablere en protokol for høst fremdaterede og vurdere morfologi, vedhæftet fil, levedygtighed og spredning af menneskelige periosteum stamceller.

D-vitamin metabolitter påvirker i vivo knogler-mineral dynamisk ligevægt. En undersøgelse rapporteret, at den 24R,25-(OH)2D3 aktive form af D-Vitamin er afgørende for osteoblastic differentiering af menneskelige MSCs (hMSCs)28. Knogle homøostase og reparation er reguleret af et netværk af Vitamin D3 metabolitter, af hvilke 1,25-(OH)2D3 (calcitriol) er de mest biologisk aktive og relevante i reguleringen af knogle sundhed. Vitamin D3 er afgørende for forkalkning29. I en undersøgelse ved hjælp af 2-d-gamle Kunming hvide mus, angivet de embryoid organer i mus, at C-Vitamin og D-Vitamin kosttilskud effektivt fremmes differentiering af ESC-afledte osteoblaster30. Blandt dens andre biologiske aktiviteter stimulerer 1,25-(OH)2D3 in vitro- differentiering af hMSCs til osteoblaster, som kan overvåges baseret på stigningen i alkalisk fosfatase (ALP) enzymaktivitet eller OCN gen udtryk.

Nogle undersøgelser har påvist en dosis-respons-forhold af kombinerede behandlinger med C-Vitamin og 1,25-(OH)2D3 i menneskelige fremdaterede med særlig fokus på knogle vævsmanipulering. Derfor, i denne undersøgelse undersøger vi de optimale koncentrationer til enkelt eller kombinerede behandling af 1,25-(OH)2D3 og C-Vitamin for at fremkalde osteogenic differentiering af menneskelige fremdaterede. Målet med denne protokol er at afgøre, om en celle population isoleret fra dental alveolær periosteum indeholder celler med en MSC fænotype og om disse celler kan udvides i kultur (in vitro-) og differentieret til at danne det ønskede væv . Derudover vurderer vi fremdaterede evne til at differentiere i osteocytes, chondrocytter og adipocytter. Den anden del af undersøgelsen evaluerer virkningerne af C-Vitamin og 10−10, 10−9, 10−8og 10−7 M 1,25-(OH)2D3 på fremdaterede osteogenic aktivitet. Det primære formål med denne undersøgelse er at vurdere funktioner af C-Vitamin og 1,25-(OH)2D3 under fremdaterede osteoblastic differentiering af ALP aktivitet, og pro-osteogenic gener, såsom ALP, kollagen-1, OCN, BSP og CBFA1. Desuden, bestemmer denne undersøgelse de optimale osteoinduktive betingelserne for menneskelige fremdaterede baseret på disse resultater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Undersøgelse-protokollen blev godkendt af det institutionelle Review Board af Chang Gung Memorial Hospital. Alle deltagerne givet skriftlig informeret samtykke.

1. væv forberedelse

  1. Høste de periosteal væv fra patienter under dental kirurgi (figur 1). Efter flap refleksion under lokalbedøvelse, tage et stykke periosteum væv fra alveoleknoglen ved hjælp af en periosteal separator31.
  2. Efter høst, skal du gemme periosteal væv skiverne af ca 5 mm × 2 mm i Dulbeccos fosfatbufferet saltopløsning (DPBS) med 300 U/mL af penicillin og 300 mg/mL af streptomycin. Overføre væv til laboratoriet inden for 24 timer.
  3. Hakkekød alveolær periosteal væv fragmenter med skalpeller indtil godt hakket og vedligeholde prøver i passage 0 medium (bestående af 300 U/mL af penicillin og 300 mg/mL af streptomycin, α-MEM og 5% føtal bovint serum [FBS]) kulturperler i en inkubator ved 37 ° C med befugtet luft (5% kuldioxid). Forberede et vandbassin til at opretholde fugtigheden i rugemaskine.
  4. Ændre medium, efter 3 dage og to gange om ugen derefter.
  5. Når cellerne har nået subconfluence (80%), frigive de vedhængende celler med 200 µL af 0,25% trypsin i inkubator (37 ° C) i 3 min, og derefter bruge 4,5 mL medium til at opsige reaktionen.
  6. Plade cellerne igen i frisk passage 1 medium (α-MEM, 10% FBS, 100 enheder/mL af penicillin og 100 μg/mL af streptomycin). Pladen er 5 × 103 celler (som talt af en hemocytometer).
  7. Udføre hver efterfølgende passage, når cellerne opnå 80% sammenløbet31.
    Bemærk: I begyndelsen, mediet bliver orange rød. Efter cirka tre dage, skal den medium farve skifte til en gullig nuance. Den fordobling tid af cellerne er ca 30 – 40 h, har brug for 7 dage for 3-5 generationer.
  8. Kultur de isolerede fremdaterede i α-MEM suppleret med 10% FBS, 100 U/mL af penicillin og 100 mg/mL af streptomycin i en inkubator (37 ° C, 5% CO2).
  9. Observere cellevækst dagligt og erstatte vækstmediet to gange om ugen. Bruge tredje til femte generation celler for alle yderligere eksperimenter.

2. flowcytometri

  1. Høst 1 × 106 celler gennem trypsin fordøjelsen:
    1. Tilføje 200 µL af 0,25% trypsin. Efter 3 min., skal du bruge 4,5 mL af næringssubstratet indeholdende FBS at opsige reaktion af trypsin og indsamle gennem centrifugering (1500 rpm, 5 min, 22 ° C).
    2. Vaske de celle pellets tre gange ved hjælp af 1 x DPBS. Resuspend celler i 200 µL 1 x permeabilization buffer. Tælle celler med en hemocytometer.
  2. Undersøge de udtrykte celleoverflademarkører udtrykt af fremdaterede gennem flow flowcytometri (Fluorescens-aktiveret celle sortering)32. Bruge monoklonale antistof (MAb) mod CD19 (fluorescein isothiocyanat (FITC)), CD34 (FITC), CD44 (Phycoerythrin [PE]), CD45 (FITC), CD73 (PE), CD90 (allophycocyanin [APC]), CD146 (PE), STRØ-1 (Alex) og HLA-DR (FITC)32.
    1. Tilføje antistoffer til prøver og kultur i mørke ved 4 ° C i 30 min.
    2. Cellerne vaskes med 1 x DPBS tre gange.
    3. Fix celler ved hjælp af 2% formaldehyd og fortsætte med flow flowcytometri analyse32.

3. celle vedhæftet fil og levedygtighed med Osteogenic, Adipogenic og Chondrogenic differentiering

Inducere differentiering af celler ind i osteogenic, adipogenic, og chondrogenic lineages ved dyrkning af de periosteal celler i alle tre passager på seks-godt plader med specifikke differentiering medier.

  1. For osteogenic differentiering, kultur celler i α-MEM med en tæthed på 5000 celler pr. brønd på seks-og kultur plader.
    1. På at opnå 80% sammenløb, kultur, cellerne i medier indeholdende α-MEM, 5% FBS, β-glycerophosphate (10 mM), 10−7 M dexamethason (0,1 mM), og 5 mL af ascorbinsyre (100 uM). Kultur den negative kontrol i medier bestående af α-MEM og 5% FBS.
    2. Ændre media to gange om ugen.
    3. Efter 4 uger, vurdere potentialet af cellerne til at differentiere i en osteogenic afstamning ved farvning af celler ved hjælp af en analyse, von Kossa, som adskiller tilstedeværelsen af forkalkede indlån i en kultur33.
      1. Tilføje 10% formalin til fiksering. Inden for 30 min, tilsæt 5% sølvnitrat og behandle under ultraviolet (UV) lys i 1 time ved stuetemperatur.
      2. Tilføj 5% Na2så4 fire gange, så 3 min for hver reaktion. Endelig, cellerne vaskes to gange med destilleret vand.
        Bemærk: Von Kossa farvning er en nedbør reaktion hvor sølv-ioner og fosfat reagere i overværelse af sure materialer; denne farvning teknik er ikke specifikke for calcium. I denne undersøgelse, da de undersøgte celler blev behandlet med sølvnitratopløsning, calcium — som er nedsat af stærkt UV lys — blev erstattet af sølv, som blev synlig som metallisk sølv.
  2. For adipogenic differentiering, kultur celler med en tæthed på 5000 celler pr. brønd på seks-og kultur plader der indeholder α-MEM.
    1. På at opnå 80% sammenløb, kultur, cellerne i medier indeholdende α-MEM, 5% FBS, 0,5 mM 3-isobutylacetophenon-1-Methylxanthin (100 mg/mL), 1% penicillin, 10−6 M dexamethason (1 mM), insulin (5 mg/mL) og indometacin (60 mM).
    2. Kultur den negative kontrol i medier bestående af α-MEM og 5% FBS.
    3. Efter 6 – 9 uger, bruge olie røde O for at plette cellerne og fremhæve lipid dråber, derved bestemme tilstedeværelsen af adipogenic differentiering33:
      1. Tilføje 10% formalin til fiksering. Inden for 30 min, pletten celler med 0,5% olie røde O ved stuetemperatur i 10 min, og derefter cellerne vaskes tre gange med 60% isopropanol i 3 min. hver gang; Endelig, vaske cellerne med destilleret vand.
        Bemærk: Olie rød O er en lysochrome (fedtopløselige) diazo farvestof anvendes til farvning af neutrale lipider, primært triacylglycerol og lipoprotein kolesterol estere. Farvestoffet opløses i lipid dråber i cellen, at dreje lipid dråber rød.
  3. For Chondrocyt differentiering, kultur celler på seks-og kultur plader med hver godt indeholder 5000 celler.
    1. Tilføje en differentiering medium indeholdende α-MEM, 5% FBS, 10−7 M dexamethason (0,1 mM), natrium pyruvat (100 µg/mL), insulin-transferrin-selen-A (1 × ITS), omdanne vækst faktor-β (10 ng/mL) og 5 mL af ascorbinsyre (100 µM).
    2. Kultur den negative kontrol i medier bestående af α-MEM og 5% FBS.
    3. Efter 4-5 uger, skal du bruge Alcian blå farvning for at fremhæve de sure polysakkarider, såsom glycosaminoglycans eller nogle typer af mukopolysakkarider, i brusk celler til at bestemme tilstedeværelsen af Chondrocyt differentiering33.
      1. Tilføje 10% formalin til fiksering. Inden for 30 min, tilsættes 3% eddikesyre, og 2 min til reaktionen. Efterfølgende vaskes med destilleret vand tre gange, tilføje 1% Alcian blå 8GX inkuberes i 30 min og derefter vaskes med destilleret vand. Endelig, tilføje 3% eddikesyre og vask i 3 min, og derefter vaskes med destilleret vand til slut.
        Bemærk: De dele af cellen, der specifikt pletter af dette farvestof bliver blå til blå-grønne efter farvning og kaldes "alcianophilic."

4. virkninger af 25-Dihydroxyvitamin D3 (1,25-(OH)2D3) på Osteogenesis

  1. Opdele P3 til P5 fremdaterede i seks grupper og kultur på 6-godt plader med forskellige medier:
  2. negativ gruppe (α-MEM og 5% FBS);
  3. C-vitamin gruppen (α-MEM, 5% FBS, 10 mM β-glycerophosphate og 10−7 M dexamethason + 100 uM C-Vitamin);
  4. og 10−7 M 1,25-(OH)2D3 gruppe (α-MEM, 5% FBS, 10 mM β-glycerophosphate, og 10−7 M dexamethason + 10−7 M 1,25-(OH)2D3).
  5. Der tilsættes 2 mL af mediet til en inkubator (37 ° C) i hver brønd og ændre mediet to gange hver uge.

5. reverse transkription/kvantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction

  1. Efter 7 d for osteoblastdannelse differentiering, isolere den samlede RNA på is ved hjælp af en kommerciel reagens (Se Tabel af materiale):
    1. Tilsæt 1 mL af isolation reagens til hver brønd. Tilføje 200 µL af bromchlorpropan og orlov til 10 min til at generere lagdelt RNA og derefter centrifugeres ved 10.000 omdr. / min. i 15 min. ved 4 ° C.
    2. Efter centrifugering, skal du tilføje 500 µL af 2-propanol til 500 µL af supernatanten indeholdende RNA. Bundfald RNA på isen og tillade 15 min for reaktionen.
    3. Efter proceduren, der centrifugeres ved 12.000 omdr. / min. i 15 min. ved 4 ° C, hvorefter RNA er placeret i bunden af røret. Efterfølgende, Fjern supernatanten ved hjælp af 1 mL af 75% alkohol til vask og centrifugeres ved 7.500 rpm i 8 min. i 4 ° C.
    4. Fjern supernatanten og bruge en vakuum koncentrator til at producere RNA fra bunden af væsken. Genskab med vand.
  2. Omvendt transskribere RNA (1 μg) ved hjælp af aviær myeloblastosis virus reverse transkriptase. Indstille Polymerasekædereaktionen (PCR) til at køre ved 25 ° C i 10 min efterfulgt af 50 ° C til 60 min og derefter 85 ° C i 5 min, før endelig bevare ved 4 ° C.
  3. Syntetisere første-strenget komplementær DNA (cDNA). Udføre kvantitativ PCR (qPCR) ved hjælp af 5 μL af 1:10 fortyndet cDNA. Gennemføre kvantitativ RT-PCR (qRT-PCR) ved hjælp af primere for ALP, BSP, OCN, CBFA1 og kollagen-1.
    Bemærk: For at undgå DNA kontaminering af signalerne, frem og bak sekvenser af hver primer blev designet på særskilte exons.
  4. Udføre qPCR ved hjælp af en kommerciel PCR Master Mix (Se Tabel af materialer) i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger. Sæt den termiske cycler ved 50 ° C i 2 min. fulgte ved 95 ° C i 10 min og derefter 40 cykler hver ved 95 ° C i 15 s efterfulgt af 60 ° C i 60 s.
    Bemærk: SYBR-protokollen kræver også en smelte kurve fase, som drives ved 95 ° C i 15 s, 60 ° C i 60 s, og derefter 95 ° C i 15 s.
  5. Normalisere cyklus tærskelværdier for ALP, BSP, CBFA1, kollagen-1 og OCN som husholdning gen GAPDH. 34
  6. Primer par er angivet i Tabel af materialer.

6. alkalisk fosfataseaktivitet

  1. Vurdere ALP enzymaktivitet i cellerne ved hjælp af den tidligere beskrevne teknik35, som konverterer p- nitrophenylfosfat fosfat til p- nitrofenol; p- nitrophenylfosfat fosfat er et fosfatase substrat, der forvandler gule når defosforyleret af ALP, som bestemmes ved en 405-nm bølgelængde. Normalisere samlet p- nitrofenol dannet baseret på den samlede protein som fastsat af Bradford assay.
  2. Sammenlign ALP aktiviteter i kontrolelementet (α-MEM, 5% FBS), Vitamin C (α-MEM, 5% FBS, 10 mM β-glycerophosphate, 10−7 M dexamethason + 100 uM Vitamin C), 1,25-(OH)2D3 (α-MEM, 5% FBS, 10 mM β-glycerophosphate, og 10−7 M dexamethason + 10−8 M 1,25-(OH)2D3), og C-Vitamin + 1,25-(OH)2D3 (α-MEM, 5% FBS, 10 mM β-glycerophosphate, 10−7 M dexamethason + 100 uM Vitamin C +1,25-(OH)2D3) grupper efter 1, 2, 3 og 4 uge af kultur.
  3. Udføre en protein ekstraktionsmetode på is:
    1. Skrab celler fra 6-godt plader og tilsæt 50 µL af lysisbuffer. Efterfølgende placere cellerne på isen for 30 min til at ødelægge cellerne og gratis protein.
    2. Efter 30 min, centrifugeres ved 13000 rpm ved 4 ° C i 15 min. Efter centrifugering, udtrække supernatanten til opbevaring og brug.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Til alle kvantitative analyser, er data præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse (SD). Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af Student's t-test. I alt 34 prøver blev opnået med en deltager gennemsnitsalderen af 48,1 ± 12,3 y. elleve af disse prøver var fremstillet af mandlige patienter og 23 fra kvindelige patienter. Tyve-otte prøver blev indhentet fra de molære regioner og seks fra den forreste periferi; 26 blev fremstillet af maxilla og 8 fra underkæbe. Den gennemsnitlige varighed mellem den tandlæge procedure og kultur var 0,5 ± 0,1 h. Af de 34 undersøgte prøver givet 20 med held MSC kolonier, med en vellykket isolation på 58,8%. Ingen væsentlige forskelle blev observeret i nogen af parametrene mellem de med held og uden held isolerede fremdaterede (gennemsnitsalder: 48,8 ± 13,0 vs 47,1 ± 11,5 y, sex: 7 mænd [35] % vs 4 mænd [28,6%], placering: 15 fra kindtand regioner [75%] vs. 13 [92,9%], og 15 fra maxilla [75%] vs 11 [78,6%], henholdsvis).

Celle isolation og morfologi: Osteogenic, chondrogenic, og adipogenic differentiering

Fra dage 1-9, dannet fremdaterede kolonier og sfæriske klynger. De fleste celler udstillet en spindel udseende og var homogene under et fasekontrast mikroskop (figur 2). Efter 14 d af kultur syntes celle morfologi spindel-formet som observeret under fase-kontrast mikroskop. Efter de første generation celler, celler ikke længere voksede i klynger men udstillet udbredt og ensartet spredning.

MSCs var spindel-formet med uregelmæssige processer og fastgjort solidt til fadet, kultur efter 1-3 d af primære kultur (figur 2a). Den oprindelige kultur udstillet små, runde celler og spindel-formede celler under et optisk mikroskop. De dyrkede celler udstillet en homogen, fibroblast-lignende spindel figur fra den første passage (figur 2a). Differentiering undersøgelse afslørede at fremdaterede kunne være subpassaged og opdelte i vitro osteoblaster (figur 2b), chondrocytter (figur 2 c) og adipocytter (figur 2d).

For enden af den osteogenic differentiering angivet von Kossa farvning tilstedeværelsen af kalkaflejringer og osteogenic differentiering (figur 2b). Disse resultater viste kraftigt, at blandt periosteal cellepopulationer, stamceller har potentiale til at differentiere i osteogenic celler.

At vurdere produktionen af proteoglycaner, Alcian blå plet blev brugt som indikator for bestemmelse af Chondrocyt differentiering (figur 2 c). Cellerne differentieret med succes i chondrocytter. Disse resultater foreslog, at blandt periosteal cellepopulationer, stamceller har potentiale til at differentiere i chondrogenic celler.

Cellerne var kulturperler i den tidligere nævnte specifikke medier til at udløse adipogenic differentiering. Efter 8 uger, olie røde O blev brugt til at påvise eksistensen af intracellulære lipider. Følgende farvning, intracellulære mikroskopiske fedt dråber blev observeret i fem differentierede prøver (figur 2d).

Flow cytometric overflade markør udtryk analyse for fremdaterede

En flow cytometric analyse blev udført for at bekræfte udtrykket af mesenchymale overflade markør på overfladen af cellerne. MSC markører CD73, CD90, STRØ-1 og CD44 var stærkt positiv i fremdaterede, mens hæmatopoietisk lineage markører CD19, CD34, CD45 og HLA-DR var negative.

Virkningerne af forskellige Vitamin D 3 koncentrationer på osteogenesis

Selv resultaterne bekræftede, at de positive virkninger af 1,25-(OH)2D3 (calcitriol) på osteogenic aktivitet, blev statistisk signifikante forskelle observeret kun blandt nogle af fold ændringerne i mRNA udtryk af det osteogenic enzymer. Denne analyse kan have været partisk ved de høje værdier, SD, som kan henføres til de individuelle afvigelser blandt værterne.

Messenger RNA udtryk for basisk fosfatase

Fold ændringer i mRNA udtryk for ALP efter 1 uge af kultur var 7.43 (SD = 3,96) i C-Vitamin gruppen og 7.15 (SD = 4,88), 9.30 (SD = 5,63), 12,92 (SD = 7,95), og 6,60 (SD = 6.33) i 10−10, 10−9, 10−8 , og 10−7 M 1,25-(OH)2D3 grupper, henholdsvis (figur 4a). MRNA udtryk niveauer af ALP i C-Vitamin, 10−8 M 1,25-(OH)2D3og 10−9 M 1,25-(OH)2D3 grupper var betydeligt højere (p < 0,05) end dem i de andre grupper, der angiver øget ALP mRNA udtryk i disse grupper. Kontrollen var angivet til værdien 1. De følgende fold stiger i ALP mRNA udtryk blev observeret i denne undersøgelse: 7.43-fold i C-Vitamin-gruppen; 9.30-fold i 10−9 M 1,25-(OH)2D3 gruppe; og 12.92-fold i gruppen 10−8 M 1,25-(OH)2D3 .

Selv om en større fold ændring i ALP mRNA udtryk blev observeret i gruppen 10−8 M 1,25-(OH)2D3 , ingen statistisk signifikante forskelle blev observeret vedrørende disse udtryk niveauer mellem denne gruppe og den negative og Vitamin C grupper (p = 0,20 og p = 0,52, henholdsvis).

ALP er en stærk indikator for bestemmelse af den tidlige osteogenic differentiering af celler. ALP også fungerer som en ectoenzyme for nedbrydning af uorganisk pyrofosfat og frigiver fosfat under mineralisering36. Fremdaterede behandles med Vitamin C og 10−8 og 10−9 M 1,25-(OH)2D3 udstillet betydelige forskelle sammenlignet med dem fra de andre grupper (figur 4a).

Messenger RNA udtryk for knogle sialoprotein

Fold ændringer i mRNA udtryk af BSP efter 1 uge med kultur var 3.21 (SD = 1,20) og 4.18 (SD = 2,55), 10.34 (SD = 10.31), 24.91 (SD = 23,44), og 5,24 (SD = 3,54) i C-Vitamin og 10−10, 10−9, 10−8 , og 10−7 M 1,25-(OH)2D3 grupper, henholdsvis (figur 4b). BSP mRNA udtryk var højere i gruppen 10−8 M 1,25-(OH)2D3 , men med ingen Statistisk signifikans sammenlignet med de tilsvarende udtryk i de andre grupper.

BSP mRNA udtryk i C-Vitamin og 10−10 M 1,25-(OH)2D3 grupper var betydeligt højere (p < 0,05) end i de andre grupper, der angiver, at C-Vitamin og 10−10 M 1,25-(OH) 2 D3 forfremmet BSP udtryk. Kontrol var indstillet til en værdi af 1. Vitamin C og 10−10 M 1,25-(OH)2D3 grupper udstillet en 3,21 og 4.18 gange stigning i BSP mRNA udtryk, henholdsvis. De 10−9 M og 10−8 M 1,25-(OH)2D3 grupper udstillet højere BSP mRNA udtryk end gjorde de andre grupper. De 10−9 og 10−8 M 1,25-(OH)2D3 grupper udstillet en 10.34 og 24.91 gange stigning i BSP mRNA udtryk, henholdsvis, men denne stigning var ikke statistisk signifikant (p > 0,05). En mulig forklaring er, at stamcellerne ikke blev alle fra den samme deltager. Således, de potentielle forskelle kan have øget SD og derfor rammes de statistiske resultater.

Messenger RNA udtryk for CBFA1

Fold ændringer i CBFA1 mRNA udtrykkene efter 1 uge med kultur var 0,96 (SD = 0,10) og 0,90 (SD = 0,26), 1,01 (SD = 0,25), 1,31 (SD = 0,32), og 1.12 (SD = 0,35) i C-Vitamin og 10−10, 10−9, 10−8 , og 10−7 M 1,25-(OH)2D3 grupper, henholdsvis (fig. 4 c). 10−8 M 1,25-(OH)2D3 gruppen udstillet højere CBFA1 mRNA udtryk. Ingen markante ændringer blev observeret i CBFA1 mRNA gen udtryk i grupperne behandling eller i kontrolgruppen. Derudover blev ingen signifikant stigning observeret i udtryk af mRNA markører efter tilsætning af C-Vitamin eller 1,25-(OH)2D3. Desuden, ingen betydelige tværpolitiske forskelle blev observeret.

Messenger RNA udtryk for kollagen-1

Fold ændringer i mRNA udtryk for kollagen-1 efter 1 uge med kultur var 0,98 (SD = 0,17) og 0,85 (SD = 0,16), 1,05 (SD = 0,16), 1.52 (SD = 0,36), og 1,01 (SD = 0,33) i C-Vitamin og 10−10, 10−9, 10−8 , og 10−7 M 1,25-(OH)2D3 grupper, henholdsvis (figur 4 d). Kollagen-1 mRNA udtryk var højere i gruppen 10−8 M 1,25-(OH)2D3 , men med ingen statistisk signifikante forskelle sammenlignet med de tilsvarende udtryk i de andre grupper.

10−8 M 1,25-(OH)2D3 kontrol grupperne og udstillet statistisk signifikante forskelle i deres resultater (Pedersen < 0,05). Kontrol var indstillet til en værdi af 1. En 1.52-fold stigning i kollagen-1 mRNA udtryk blev observeret. 10−10 M 1,25-(OH)2D3 og 10−8 M 1,25-(OH)2D3 grupper udstillet betydelige forskelle i deres resultater (Pedersen < 0,05).

Messenger RNA udtryk for osteocalcin

Fold ændringer i OCN mRNA udtryk efter 1 uge med kultur var 0,60 (SD = 0,1) og 0,78 (SD = 0,18), 1.13 (SD = 0,55), 2,59 (SD = 1,59), og 1.61 (SD = 0,73) i C-Vitamin og 10−10, 10−9, 10−8 , og 10−7 M 1,25-(OH)2D3 grupper, henholdsvis (figur 4e). OCN mRNA udtryk var højere i gruppen 10−8 M 1,25-(OH)2D3 , men med ingen statistisk signifikante forskelle sammenlignet med de tilsvarende udtryk i de andre grupper.

Ingen signifikant stigning blev observeret i udtryk af OCN mRNA markører efter tilsætning af C-Vitamin eller 1,25-(OH)2D3. OCN mRNA udtryk faldt imidlertid efter C-Vitamin behandling. Kontrollen var angivet til værdien 1. De basale OCN udtryk udstillet et betydeligt 0.6-fold fald (p < 0,05) under osteoblastic differentiering. OCN mRNA udtryk var betydeligt højere (p < 0,001) i celler dyrkes i 10−8 M 1,25-(OH)2D3 end i de tilsvarende udtryk fra de andre grupper, som udstillede en gennemsnitlig fold forøgelse af 2,59. disse resultater var dog ikke statistisk signifikant (p > 0,05). En mulig forklaring er, at stamcellerne ikke blev alle fra den samme deltager; således, de potentielle forskelle kan have øget SD og derfor rammes de statistiske resultater.

ALP aktivitet assay

En tidligere undersøgelse viste, at 1,25-(OH)2D3 er mest effektiv i en koncentration på 10−8 M; Derfor, 10−8 M blev brugt i testgruppen til at sammenligne osteogenic evne til 1,25-(OH)2D3 med de negative, Vitamin C, og C-Vitamin + 1,25-(OH)2D3 grupper. Mulighed for osteogenic blev udtrykt af ALP aktivitet. Efter 1 uge af kulturen (figur 5a), fold ændringer i ALP aktivitet var 1,00 (SD = 0,00), 1,92 (SD = 0,89), 3,77 (SD = 1.66), og 1.46 (SD = 0,49) i negativ, C, D, og C + D, henholdsvis. Blandt alle grupperne, statistisk signifikante forskelle kun observeret mellem grupperne D og negativ (p = 0,03; Figur 5a). Efter 2 uger af kultur, var fold ændringer i ALP aktivitet (figur 5b) 1.00 (SD = 0,00), 2.32 (SD = 1,68), 4.98 (SD = 3,02), og 4.86 (SD = 2,73) i negativ, C, D, og C + D, henholdsvis. Ingen statistisk signifikante forskelle blev observeret i nogen af grupperne. Efter 3 uger af kultur, fold ændringer i ALP aktivitet (figur 5 c) var 1,00 (SD = 0,00), 2,93 (SD = 2.15), 5,76 (SD = 3,60), og 5,61 (SD = 3,88) i negativ, C, D, og C + D, henholdsvis. Igen, ingen statistisk signifikante forskelle blev observeret i nogen af grupperne (figur 5 c). Efter 4 uger af kultur, fold ændringer i ALP aktivitet (fig. 5 d) var 1,00 (SD = 0,00), 2.83 (SD = 1,97), 3,79 (SD = 0,77), og 4,24 (SD = 2,87) i negativ, C, D, og C + D, henholdsvis. Her, grupperne D og Negative udstillet statistisk signifikante forskelle (p = 0,00; Figur 5 d).

I uge 1, kun 10−8 M 1,25-(OH)2D3 gruppen udstillet betydelige forskelle sammenlignet med kontrolgruppen (p = 0,03). I uge 2, 10−8 M 1,25-(OH)2D3 og Vitamin C grupper udstillet betydelige forskelle sammenlignet med kontrolgruppen (p = 0.0498). I uge 3 udstillet ingen af grupperne betydelige forskelle sammenlignet med kontrolgruppen. I uge 4 udstillet 10−8 M 1,25-(OH)2D3 gruppen betydelige forskelle sammenlignet med kontrolgruppen. Dette viste, at 10−8 M 1,25-(OH)2D3 forfremmet ALP aktivitet.

Kort sagt, øget 10−8 M 1,25-(OH)2D3 gruppen udstillet ALP og kollagen-1 mRNA udtryk; C-Vitamin gruppen udstillet betydeligt øget ALP og BSP mRNA udtryk; og 10−9 M 1,25-(OH)2D3 gruppen udstillet betydeligt øget ALP mRNA udtryk. I uge 1, blev øget ALP aktivitet observeret i C-Vitamin og 1,25-(OH)2D3 grupper, men med ingen statistisk signifikante forskelle sammenlignet med de tilsvarende udtryk niveauer i de andre grupper. Fra uge 2-4 udstillet Vitamin C og 1,25-(OH)2D3 grupper lignende resultater. Derfor kan disse resultater tydeligvis ikke belyse de synergistiske virkninger af C-Vitamin og 1,25-(OH)2D3 på osteogenic differentiering af celler (ALP aktivitet).

Figure 1
Figur 1: menneskelige alveolær periosteum. Periosteal væv er høstet under dental kirurgi. Stjernen angiver placeringen af alveolær periosteum.

Figure 2
Figur 2: differentiering undersøgelse. MSCs var spindel-formet med uregelmæssige processer og solidt fastgjort til fadet, kultur efter 1-3 d af primære kultur (A; stjernen angiver placeringen af de mesenkymale stamceller). Betingelser i vitro kultur, at MSC'er var subpassaged og opdelte i osteoblaster (B, den sorte stjerne angiver området plettet af von Kossa), chondrocytter (C, den blå stjerne angiver området farves af Alcian blå), og adipocytter (D, den lyserøde stjerne angiver området plettet af olie røde O). Figur 2 er genbrugt fra biomedicinsk forskning International, bind 2016, artikel-ID 352956125. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Flow flowcytometri. Celleoverflademarkører udtrykt af MSCs var CD73 (65.2%), CD90 (75,6%), STRØ-1 (65.2%) og CD44 (88.1%) men ikke CD45 (1.34%), CD34 (1,61%), CD19 (2.18%), eller HLA-DR (2,20%). "%" i figuren angiver et positivt forhold. Kontrolgruppen (α-MEM og 5% FBS) er repræsenteret ved den røde linje. Den eksperimentelle gruppe er repræsenteret ved den blå linje. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: mRNA udtryk. mRNA udtryk for osteoblastdannelse differentiering for uge 1. (A) ALP (B) BSP, (C) CBFA1, (D) COL-jeg, og (E) OCN. p < 0,05 er *, p < 0,01 er **, p < 0,001 er ***. MRNA fold ændring er versus kontrol (α-MEM og 5% FBS). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: basisk fosfataseaktivitet. Alkalisk fosfataseaktivitet assay for osteoblastdannelse differentiering for (A), uge 1, (B) uge 2, (C) uge 3, og (D) uge 4. p < 0,05 er *, p < 0,01 er **, p < 0,001 er ***. Fold ã†ndringen versus kontrol (α-MEM, 5% FBS). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En nyligt udviklede terapeutisk modalitet, nemlig tissue engineering medfører MSC'er, har mange fordele. MSC'er, der er til stede i flere vævstyper, er Multipotente celler, der kan differentiere til en lang række funktionelle mesodermale væv celler37 og andre celler såsom osteoblaster.

Periosteum fungerer som en niche for stamceller og som en rig Vaskulaturen levering til knoglen det indhyller38. I vores undersøgelse af 34 undersøgte prøver, givet 20 med held MSC kolonier, med en vellykket isolation på 58,8%. MSC'er stammer fra periosteum blev valgt i denne undersøgelse baseret på deres spredning og osteogenic differentiering evner. Spredning sats af periosteal cellerne var meget højere end marv stromale celler22. Om osteogenic evne til periosteum, Ousual24 hævdede, at osteogenic evne til periosteum-afledte stamceller (PMSCs) var ringere end BMSCs. Dog attesteret Yoshimura, at den osteogenic evne til PMSCs udkonkurreret af BMSCs39. Hayashi mfl. demonstreret periosteal voksen MSCs som ideelle kandidater til knogle væv revitalisering24. Derudover anses periosteal voksen MSCs for nyttigt i forkorte perioden celle kultur dermed reducere både omkostninger og risiko for kontaminering22. Efter sigende, aldring også påvirker den mitogenic aktivitet af osteoprogenitor celler40. En undersøgelse rapporteret 1,25-(OH)2D3 induceret en højere grad af stimulation af in vitro- osteoblastdannelse differentiering i hMSCs fra yngre deltagere (alderen < 65 y)41. Den nuværende undersøgelse involverede brugen af periosteal celler fremstillet af unge voksne (alderen < 65 y). Yderligere undersøgelser er nødvendige at sammenligne knogle regeneration evne periosteal celler mellem gamle og unge donorer.

I denne undersøgelse blev en celle befolkning isoleret baseret på dens plast-tilhænger ejendom, som beskrevet af Friedenstein al.. 13. den fremdaterede høstet her levet op til celle kultur plast. Esenchymal markører (CD 73, CD 90, STRØ-1 og CD 44) af de overflade antigener cellernes primære kulturer udstillet betydelig udtryk. Derudover var hæmatopoietisk markører (CD 45, CD 34, CD 19 og HLA-DR) fraværende, der angiver, at de dyrkede celler var en mesenchymale oprindelse. Osteogenic, chondrogenic og adipogenic differentiering af fremdaterede kan fremkaldes ved hjælp af specifikke differentiering medier, som beskrevet i andre undersøgelser, evaluering af prøver fra gingival væv og knoglemarv42. Resultaterne af den foreliggende undersøgelse i overensstemmelse med minimumsstandarder for fænotypiske og funktionelle definitionen af menneskelige MSCs accepteret af det internationale samfund for cellulære terapi4. I den foreliggende undersøgelse, blev MSCs fra menneskelige periosteum isoleret og udvidet, som afslørede egenskaber svarende til dem, der typisk beskrevet af BMSCs.

Undersøgelser har foreslået at dexamethason, Ascorbat og β-glycerophosphate forårsage BMSCs til at gennemgå osteogenic differentiering43. En anden undersøgelse viste at 1α, 25-dihydroxyvitamin D3 (1,25-(OH)2D3) i kombination med ascorbinsyre forfremmet stamcelle differentiering44. Derfor, dexamethason, Ascorbat og β-glycerophosphate blev tilføjet i dette studie at fremme stamcelle differentiering. Mønstre observeret var ens i alle tre patient celle prøver. I denne undersøgelse, var MSCs korrekt identificeret fra alveolær periosteum med en isolation på 58,8%. Ingen statistisk signifikante forskelle blev observeret i succesrate med hensyn til alder, køn og placering.

Den nuværende eksperimentel undersøgelse undersøgt to stoffer, nemlig 1,25-(OH)2D3 og C-vitamin, som begge kan stimulere osteogenic differentieringen af stamceller. En 2008 undersøgelse45 angivet at 1,25-(OH)2D3 er afgørende for knogle metabolisme og calcium homeostase og påvirker det kardiovaskulære system gennem mekanismer endnu at være fuldt forstået. I en anden tidligere undersøgelse46stimuleret 1,25-(OH)2D3 in vitro- -differentiering af menneskelige MSC'er til osteoblaster. 1,25-(OH)2D3 evne til at fremkalde udifferentierede BMSCs at differentiere i osteoblastdannelse-lignende celler in vitro- er blevet påvist i flere undersøgelser at udforske forskellige systemer46. Nogle undersøgelser har også vist, at når føjet til kulturer i osteoblastdannelse-lignende celler, 1,25-(OH)2D3 hæmmer cellulære spredning men øger udtryk af osteoblastic markører som ALP, osteopontin, OCN og matrix Gla protein47,48. En tidligere undersøgelse rapporterede, at 1,25-(OH)2D3 typisk hæmmer cellulære spredning og inducerer osteoblastdannelse differentiering49. En in vitro- undersøgelse foretaget på murine celler viste, at 1,25-(OH)2D3 kan fremme de tidlige stadier af osteoblastogenesis9. Derudover foreslog en anden in vitro- undersøgelse, at både tidlige og sene MSCs,1,25-(OH)2D3 kan stimulere osteogenic differentiering markører, herunder ALP, osteopontin, BSP og OCN43.

Begge OCN — anses for ansvarlig for kontrol af matrix syntese — og kollagen 1A1 — den mest rigelige matrix protein — er afgørende sure knogle matrix proteiner, der spiller en afgørende rolle i matrix syntese. Derudover er de karakteristiske modne matrix-dannende osteoblasts. 50 en tidligere undersøgelse rapporterede, at 1,25-(OH)2D3 behandling stimuleret øget kollagen 1A1 udtryk, men ikke CBFA1 eller ALP gen expression34. Vurderinger af gener involveret i osteoblastic differentiering har afsløret, at 1,25-(OH)2D3 behandling øget udtryk for OCN51,52,,53. I vores undersøgelse viste resultaterne, at 1,25-(OH)2D3 udøver positiv virkning på osteogenic aktivitet. Sammenlignet med de andre grupper, påvist 10−8 M 1,25-(OH)2D3 øget mRNA udtryk af ALP, BSP, CBFA1, OCN og Kol1. Blandt disse er nået resultater for ALP og Kol1 Statistisk signifikans. Derfor, optimale betingelser blev opnået ved brug af 10−8 M 1,25-(OH)2D3. mRNA udtryk for BSP i 10−10 M 1,25-(OH)2D3 gruppen steg betydeligt (p < 0,05). Dog blev ingen statistisk signifikante forskelle observeret i fold ændringer i mRNA udtryk af CBFA1 og OCN. Når du gennemgår mRNA genekspression, viste resultaterne af forsøget in vitro- osteogenic differentiering. Baseret på disse resultater, osteogenesis observeret i negativt, Vitamin C, og 10−10, 10−9, 10−7 M 1,25-(OH)2D3 grupper var svagere end i 10−8 M 1,25-(OH)2D3 gruppe. Disse resultater førte til spekulation at 1,25-(OH)2D3 primtal fremdaterede af upregulating matrix proteiner kræves for mineralisering (kollagen 1A1).

En tidligere undersøgelse rapporterede OCN som et oplagt mål for 1,25-(OH)2D3, hvilket markant øget OCN udtryk52. OCN deposition kan ses som en markør for osteogenic differentiering af fremdaterede. Derudover er OCN udtryk blevet vurderet som en sen osteogenic markør54. OCN er en pålidelig markør for knogle dannelse og osteogenesis55. OCN udtryk er derfor generelt vedrører mineralisering evner af celler. OCN er en følsom biomarkør for modne osteoblaster. For en in vitro- osteogenic sammenligning, blev markant forhøjede OCN mRNA udtryk observeret i 10−8 M 1,25-(OH)2D3 gruppen.

En undersøgelse viste, at ALP aktivitet var hæmmet af omdanne vækst faktor beta (0,1-10 ng/mL) og fremmes med 1,25-(OH)2D3 (50 nM)46. Disse resultater betyder, at 10−8 M 1,25-(OH)2D3 fremmer stamcelle modning og knogle udvikling. ALP aktivitet på de optimale observerede koncentrationer af 10−8 M 1,25-(OH)2D3 blev sammenlignet med de tilsvarende koncentrationer af c-Vitamin. Fremdaterede udtrykt ALP aktivitet. Desuden tilføjelsen af 1,25-(OH)2D3 øget ALP aktivitet og fremmet den osteoblastic differentiering i fremdaterede. I alle tre indstillinger, Vitamin C, 10−8 M 1,25-(OH)2D3, og C-Vitamin + 10−8 M 1,25-(OH)2D øget3 ALP aktivitet på uger 1 (figur 4a), 2 (figur 4b), 3 ( Figur 4 c), og 4 (figur 4 d) med flere gange sammenlignet med den negative kontrol gruppe. I uge 1 og 4, ALP aktivitet steg betydeligt i gruppen 10−8 M 1,25-(OH)2D3 . I uge 2, ALP aktivitet steg betydeligt i C-Vitamin og 10−8 M 1,25-(OH)2D3 grupper.

Gennem en sammenlignende undersøgelse af forskellige menneskelige MSCs på passage 3, Sakaguchi mfl. 56 fandt, at BMSCs og PMSCs besidder lignende osteogenic evner. Perioden celle kultur kan derfor sandsynligvis forkortes ved hjælp af periosteal celler, hvilket igen vil reducere omkostninger og forurening risikoen. Brug af tidlig-passage hMSCs undgår de senescent virkninger af ekspansion i kulturen. Ousual og Yoshimura benyttes MSCs på passage 3 og podes 2 uger under osteogenic differentiering betingelser35. Passage tid bør derfor betragtes som når man sammenligner forskellige celle kilder cellulære aktiviteter. I denne undersøgelse, var tredje generation fremdaterede anvendes fordi stamceller senere generationer af fremdaterede osteogenic potentiale er lavere end for stamceller af tredje generation fremdaterede.

Når kulturperler i et humant serum medium, kan periosteum stamceller ikke kun opretholde deres form, men kan også vedhæfte, opretholde aktivitet og opnå cellevækst. I sammendrag, baseret på disse resultater, menneskelige fremdaterede besidder evnen til at overleve, formere sig og differentiere sig til osteogenic slægt i vitro, som er afgørende for vurderingen af effekten i vivo. Periosteum er rig på MSCs og er dermed egnet til vævsmanipulering. Periosteum fremstillet af gingiva medfører færre komplikationer. Den alveoleknoglen er derfor en ideel donor websted. Resultaterne viste klart muligheden for tilsvarende isolere MSCs fra periosteum og opnå deres differentiering af osteoblaster, chondrocytter og adipocytter. I denne undersøgelse, blev virkningerne af C-Vitamin på fremdaterede osteogenic potentiale sammenlignet med dem af 1,25-(OH)2D3 ved forskellige koncentrationer. Den mest effektive koncentration var 10−8 M 1,25-(OH)2D3. De 10−8 M 1,25-(OH)2D3 behandling i hele perioden kultur var en effektiv og økonomisk metode til at inducere osteogenic differentiering i PDC'er. Til sidst vil fremme både C-Vitamin og 1,25-(OH)2D3 fremdaterede osteogenic differentiering. Men disse udstillet ingen væsentlige synergieffekter i ALP aktivitet resultater. I betragtning af den lille stikprøvestørrelse er yderligere prøver behov for yderligere evaluering. Således kan fremdaterede kulturperler osteogenic betingelser være nyttige for knogle vævsmanipulering og tilbyder fordel af højere cellulære spredning.

Kritiske trin i denne protokol omfatter trin 1.2 og 1.3 (Start dyrkningsbaserede proceduren inden for 24 timer efter høst og korrekt vedligeholdelse derefter). Kontaminering af væv skal undgås og anvendelse af aseptisk teknik er obligatorisk. En begrænsning af denne protokol er det, sammenlignet med sourcing stamceller fra knoglemarv eller fedtvæv, sourcing stamceller fra dental væv er begrænset med hensyn til det lave antal celler, der kan opnås gennem denne teknik.

Identifikation og karakterisering af periosteal stamceller kan give værdifulde oplysninger om funktioner og regenerativ potentiale i dette væv samt dens anvendelighed i regenerativ terapi. En optimal tilstand blev opnået ved hjælp af 10−8 M 1,25-(OH)2D3. Derfor, behandling af fremdaterede med 10−8 M 1,25-(OH)2D3 fremmer osteogenic differentiering. Fremtidige studier bør undersøge programmet på vivo 10−8 M 1,25-(OH)2D3 for effektiv og økonomisk knogle vævsmanipulering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Undersøgelse-protokollen blev godkendt af det institutionelle Review Board for klinisk forskning af Chang Gung Memorial Hospital (IRB99-1828B, 100-3019C, 99-3814B, 102-1619C, 101-4728B og 103-4223C). Denne undersøgelse blev støttet af Chang Gung Memorial Hospital (CMRPG392071, CMRPG3A1141, CMRPG3A1142 og NMRPG3C0151). Dette håndskrift blev redigeret af Wallace akademiske redigering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA Gibco 25200-056
2-phospho-L-ascorbic acidtrisodium salt Sigma 49752
35-mm culture dishes Corning 430165
3-isobutyl-1-methylxanthine Sigma I5879
6  well plate Corning 3516
Alkaline phosphatase ABI Hs01029144_m1
Alkaline Phosphatase Activity Colorimetric Assay Kit BioVision K412-500
avian myeloblastosis virus reverse transcriptase Roche 10109118001
CD146 BD 561013
CD19 BD 560994
CD34 BD 560942
CD44 BD 561858
CD45 BD 561088
CD73 BD 561014
CD90 BD 561974
Cell banker1 ZEAOAQ 11888
core binding factor alpha-1 ABI Hs00231692_m1
dexamethasone Sigma D4902
DPBS Gibco 14190250
FBS Gibco 26140-079
GAPDH ABI Hs99999905_m1
HLA-DR BD 562008
indomethacin Sigma I7378
insulin sigma 91077C
insulin–transferrin–selenium-A Sigma I1884
MicroAmp Fast 96 well reaction plate(0.1ml) Life 4346907
MicroAmp optical adhesive film Life 4311971
Minimum Essential Medium 1X Alpha Modification HyClone SH30265.02
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122
Permeabilization buffer eBioscience 00-8333-56
Sodium pyruvate Gibco 11360070
STRO-1 BioLegend 340103
SYBER Green PCR Master Mix AppliedBiosystems 4309155
TaqMan Master Mix Life 4304437
transforming growth factor-β Sigma T7039 
Trizol reagent (for RNA isolation) Life 15596018
β-glycerophosphate Sigma G9422
collagen-1 Invitrogen forward primer 5' CCTCAAGGGCTCCAACGAG-3
reverse primer 5'-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3'
OCN Invitrogen forward primer 5'-GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG-3'
reverse primer 5'-GTCAGCCAACTCGTCACAGT-3'
BSP Invitrogen forward primer 5' AAAGTGAGAACGGGGAACCT-3'
reverse primer 5'-GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3'
Commercial ALP primers
Commercial CBFA1 primers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kao, R. T., Murakami, S., Beirne, O. R. The Use of Biologic Mediators and Tissue Engineering in Dentistry. Periodontol. 50, 127-153 (2000).
  2. Rosenbaum, A. J., Grande, D. A., Dines, J. S. The Use of Mesenchymal Stem Cells in Tissue Engineering: A Global Assessment. Organogenesis. 4, 23-27 (2008).
  3. Yen, T. H., Wright, N. A., Poulsom, R. Bone Marrow Stem Cells: From Development to Therapy. Horizons in Medicine. Franklyn, J. 16, Royal College of Physicians of London. London, UK. 249-257 (2004).
  4. Dominici, M., et al. Minimal Criteria for Defining Multipotent Mesenchymal Stromal Cells. The International Society for Cellular Therapy Position Statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
  5. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal Human Dental Pulp Stem Cells (DPSCs). In Vitro and In Vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 13625-13630 (2000).
  6. Miura, M., et al. Stem Cells from Human Exfoliated Deciduous Teeth. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 5807-5812 (2003).
  7. Seo, B. M., et al. Investigation of Multipotent Postnatal Stem Cells from Human Periodontal Ligament. Lancet. 364, 149-155 (2004).
  8. Sonoyama, W., et al. Mesenchymal Stem Cell-Mediated Functional Tooth Regeneration in Swine. PLOS ONE. 1, e79 (2006).
  9. Morsczeck, C., et al. Isolation of Precursor Cells (PCs) from Human Dental Follicle of Wisdom Teeth. Matrix Biol. 24, 155-165 (2005).
  10. Mitrano, T. I., et al. Culture and Characterization of Mesenchymal Stem Cells from Human Gingival Tissue. J Periodontol. 81, 917-925 (2010).
  11. Di Benedetto, A., Brunetti, G., Posa, F., Ballini, A., et al. Osteogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from Dental Bud: Role of Integrins and Cadherins. Stem Cell Res. 15, 618-628 (2015).
  12. Marrelli, M., Paduano, F., Tatullo, M. Cells Isolated from Human Periapical Cysts Express Mesenchymal Stem Cell-like Properties. Int J Biol Sci. 9 (10), Published online Nov 16 1070-1078 (2013).
  13. Friedenstein, A. J., Piatetzky-Shapiro, I. I., Petrakova, K. V. Osteogenesis in Transplants of Bone Marrow Cells. J Embryol Exp Morphol. 16, 381-390 (1966).
  14. Perka, C., Schultz, O., Spitzer, R. S., Lindenhayn, K., Burmester, G. R., Sittinger, M. Segmental Bone Repair by Tissue-Engineered Periosteal Cell Transplants with Bioresorbable Fleece and Fabrin Scaffolds in Rabbits. Biomaterials. 21, 1145-1153 (2000).
  15. Taylor, J. F. The Periosteum and Bone Growth. Hall, B. K. , CRC Press. Boca Raton. Bone Growth VI (1992).
  16. Squier, C., Ghoneim, S., Kremenak, C. Ultrastructure of the Periosteum from Membrane Bone. J Anat. 171, 233-239 (1990).
  17. Aubin, J., Triffitt, J. Mesenchymal Stem Cells and Osteoblast Differentiation. Principles of Bone Biology. Bilezikian, J., Raisz, L. G., Rodan, G. A. , Academic Press. San Diego. 59-81 (2002).
  18. Diaz-Flores, L., Gutierrez, R., Lopez-Alonso, A., Gonzalez, R., Varela, H. Pericytes as a Supplementary Source of Osteoblasts in Periosteal Osteogenesis. Clin Orthop Relat Res. 275, 280-286 (1992).
  19. Lim, S. M., Choi, Y. S., Shin, H. C., Lee, C. W., Kim, S. L., Kim, D. I. Isolation of Human Periosteum-Derived Progenitor Cells Using Immunophenotypes for Chondrogenesis. Biotechnol Lett. 27, 607-611 (2005).
  20. Stich, S., et al. Human Periosteum-Derived Progenitor Cells Express Distinct Chemokine Receptors and Migrate Upon Stimulation with CCL2, CCL25, CXCL8, CXCL12, and CXCL13. Eur J Cell Biol. 87, 365-376 (2008).
  21. Choi, Y. S., et al. Multipotency and Growth Characteristic of Periosteum-Derived Progenitor Cells for Chondrogenic, Osteogenic, And Adipogenic Differentiation. Biotechnol Lett. 30, 593-601 (2008).
  22. Agata, H., et al. Effective Bone Engineering with Periosteum-Derived Cells. J Dent Res. 86, 79-83 (2007).
  23. Ribeiro, F. V., et al. Periosteum-Derived Cells as an Alternative to Bone Marrow Cells for Bone Tissue Engineering Around Dental Implants. A Histomorphometric Study in Beagle Dogs. J Periodontol. 81, 907-916 (2010).
  24. Hayashi, O., et al. Comparison of Osteogenic Ability of Rat Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow, Periosteum and Adipose Tissue. Calcif Tissue Int. 82, 238-247 (2008).
  25. Hong, H. H., Hong, A., Yen, T. H., Wang, Y. L. Potential Osteoinductive Effects of Calcitriol onthe m-RNA of Mesenchymal Stem Cells Derived from Human Alveolar Periosteum. BioMed Res Int. , Article ID 3529561 (2016).
  26. Knothe, U. R., Dolejs, S., Miller, R. M., Knothe Tate, M. L. Effects of Mechanical Loading Patterns, Bone Graft, and Proximity to Periosteum on Bone Defect Healing. J Biomech. 43, 2728-2737 (2010).
  27. McBride, S. H., Dolejs, S., Brianza, S., Knothe, U. R., Knothe Tate, M. L. Net Change in Periosteal Strain During Stance Shift Loading After Surgery Correlates to Rapid de novo Bone Generation in Critically Sized Defects. Ann Biomed Eng. 39, 1570-1581 (2011).
  28. Curtis, K. M., Aenlle, K. K., Roos, B. A., Howard, G. A. 24R,25-Dihydroxyvitamin D3 Promotes the Osteoblastic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. Mol Endocrinol. 28 (5), 644-658 (2014).
  29. Mostafa, N. Z., et al. Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells Cultured with Dexamethasone, Vitamin D3, Basic Fibroblast Growth Factor, and Bone Morphogenetic Protein-2. Connect Tissue Res. 53 (2), 117-131 (2012).
  30. Sun, Y., Yang, X., Li, F., Dou, Z. Study on Differentiation of Embryonic Stem Cells into Osteoblast in vitro Inducing by 1,25(OH)2VD3. Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi. 22 (9), 1117-1120 (2008).
  31. Ishii, M., Koike, C., Igarashi, A., et al. Molecular Markers Distinguish Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells from Fibroblasts. Biochem Biophys Res Commun. 332, 297-303 (2005).
  32. Maund, S. L., Barclay, W. W., Hover, L. D., et al. Interleukin-1α Mediates the Antiproliferative Effects of 1,25-Dihydroxyvitamin D3 in Prostate Progenitor/Stem Cells. Cancer Res. 71, 5276-5286 (2011).
  33. Mitrano, T. I., Grob, M. S., Carrión, F., Nova-Lamperti, E., Luz, P. A., Fierro, F. S., Quintero, A., Chaparro, A., Sanz, A. Culture and Characterization of Mesenchymal Stem Cells From Human Gingival Tissue. J Periodontol. 81 (6), 917-925 (2010).
  34. Curtis, K. M., Aenlle, K. K., Roos, B. A., Howard, G. A. 24R,25-Dihydroxyvitamin D3 Promotes the Osteoblastic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. Mol Endocrinol. 28, 644-658 (2014).
  35. Ippolito, G., Schiller, P. C., Ricordi, C., Roos, B. A., Howard, G. A. Age Related Osteogenic Potential of Mesenchymal Stromal Stem Cells from Human Vertebral Bone Marrow. J Bone Miner Res. 14, 1115-1122 (1999).
  36. D'Stucki, U., et al. Temporal and Local Appearance of Alkaline Phosphatase Activity in Early Stages of Guided Bone Regeneration. A Descriptive Histochemical Study in Humans. Clin Oral Implants Res. 12, 121-127 (2001).
  37. Caplan, A. I., Bruder, S. P. Mesenchymal stem cells: building blocks for molecular medicine in the 21st century. Trends Mol Med. 7, 259-264 (2001).
  38. Knothe Tate, M. L., Falls, T., McBride, S. H., Atit, R., Knothe, U. R. Mechanical Modulation of Osteochondroprogenitor Cell Fate. Int J Biochem Cell Biol. 40, 2720-2738 (2008).
  39. Yoshimura, H., Muneta, T., Nimura, A., Yokoyama, A., Koga, H., Sekiya, I. Comparison of Rat Mesenchymal Stem Cells Derived from Bone Marrow, Synovium, Periosteum, Adipose Tissue, and Muscle. Cell Tissue Res. 327, 449-462 (2007).
  40. Tanaka, H., Ogasa, H., Barnes, J., Liang, C. T. Actions of bFGF on Mitogenic Activity and Lineage Expression in Rat Osteoprogenitor Cells: Effect of Age. Mol Cell Endocrinol. 150, 1-10 (1999).
  41. Zhou, S., et al. Clinical characteristics influence in vitro action of 1,25-dihydroxyvitamin D(3) in human marrow stromal cells. J Bone Miner Res. 27 (9), 1992-2000 (1992).
  42. Pittenger, M. F., et al. Multilineage Potential of Adult Human Mesenchymal Stem Cells. Science. 284, 143-147 (1999).
  43. Jørgensen, N. R., Henriksen, Z., Sorensen, O. H., Civitelli, R. Dexamethasone, BMP-2, and 1,25-dihydroxyvitamin D enhance a more differentiated osteoblast phenotype: validation of an in vitro model for human bone marrow-derived primary osteoblasts. Steroids. 69, 219-226 (2004).
  44. Khanna-Jain, R., et al. Vitamin D(3) Metabolites Induce Osteogenic Differentiation in Human Dental Pulp and Human Dental Follicle Cells. J Steroid BiochemMol Biol. 122 (3), 133-141 (2010).
  45. Lee, J. H., O'Keefe, J. H., Bell, D., Hensrud, D. D., Holick, M. F. Vitamin D Deficiency an Important, Common, and Easily Treatable Cardiovascular Risk Factor? J Am Coll Cardiol. 52, 1949-1956 (2008).
  46. Liu, P., Oyajobi, B. O., Russell, R. G., Scutt, A. Regulation of osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells: interaction between transforming growth factor-beta and 1,25(OH)(2) vitamin D(3) In vitro. Calcif Tissue Int. 65 (2), 173-180 (1999).
  47. Beresford, J. N., Gallagher, J. A., Russell, R. G. G. 1,25-Dihydroxyvitamin D3 and Human Bone-Derived Cells In Vitro: Effects on Alkaline Phosphatase, Type I Collagen and Proliferation. Endocrinology. 119, 1776-1785 (1986).
  48. Price, P. A., Baukol, S. A. 1,25-Dihydroxyvitamin D3 Increases Synthesis of the Vitamin K-Dependent Bone Protein by Osteosarcoma Cells. J Biol Chem. 255, 11660-11663 (1986).
  49. Kawase, T., Oguro, A. Granulocyte Colony-Stimulating Factor Synergistically Augments 1, 25-Dihydroxyvitamin D3-Induced Monocytic Differentiation in Murine Bone Marrow Cell Cultures. Horm Metab Res. 36, 445-452 (2004).
  50. Fujisawa, R., Tamura, M. Acidic Bone Matrix Proteins and Their Roles in Calcification. Front Biosci. (Landmark Ed). 17, 1891-1903 (2012).
  51. van Driel, M., et al. Evidence that Both 1α,25 Dihydroxyvitamin D3 and 24-Hydroxylated D3 Enhance HuMan Osteoblast Differentiation and Mineralization. J Cell Biochem. 99, 922-935 (2006).
  52. Atkins, G. J., et al. Metabolism of Vitamin D3 in Human Osteoblasts: Evidence for Autocrine and Paracrine Activities of 1 α ,25-Dihydroxyvitamin D3. Bone. 40, 1517-1528 (2007).
  53. Kerner, S. A., Scott, R. A., Pike, J. W. Sequence Elements in the Human Osteocalcin Gene Confer Basal Activation and Inducible Response to Hormonal Vitamin D3. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4455-4459 (1989).
  54. Viereck, V., et al. Differential Regulation of Cbfa1/Runx2 and Osteocalcin Gene Expression by Vitamin-D3, Dexamethasone, and Local Growth Factors in Primary Human Osteoblasts. J Cell Biochem. 86, 348-356 (2002).
  55. Shi, X., et al. In-vitro osteogenesis of synovium stem cells induced by controlled release of bisphosphate additives from microspherical mesoporous silica composite. Biomaterials. 30, 3996-4005 (2009).
  56. Sakaguchi, Y., Sekiya, I., Yagishita, K., Muneta, T. Comparison of Human Stem Cells Derived from Various Mesenchymal Tissues: Superiority of Synovium as a Cell Source. Arthritis Rheum. 52, 2521-2529 (2005).

Tags

Bioteknologi spørgsmålet 135 alveolær Periosteum mesenkymale stamceller 1,25-(OH)2D3 Vitamin D3 Calcitriol periost
Isolering af mesenkymale stamceller fra menneskelige alveolær Periosteum og effekter af D-Vitamin på Osteogenic aktivitet af Periosteum-afledte celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, Y. L., Hong, A., Yen, T. H.,… More

Wang, Y. L., Hong, A., Yen, T. H., Hong, H. H. Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells. J. Vis. Exp. (135), e57166, doi:10.3791/57166 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter