Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Изоляция мезенхимальных стволовых клеток человека надкостницей альвеолярного и эффекты витамина d на Остеогенные активность клеток, надкостницы, полученных

Published: May 4, 2018 doi: 10.3791/57166
Automatic Translation
1,2, 3, 1,4,5,6, 1,7,8
1Chang Gung University, 2Department of Periodontics, Chang Gung Memorial Hospital, 3California Northstate University College of Medicine, 4Department of Nephrology, Clinical Poison Center, Chang Gung Memorial Hospital, 5Kidney Research Center, Chang Gung Memorial Hospital, 6Center for Tissue Engineering, Chang Gung Memorial Hospital, 7Department of Periodontics, Chang Gung Memorial Hospital, 8College of Oral Medicine, Taipei Medical University

Summary

Мы представляем протокол расследовать биомаркеров выражение mRNA надкостницы, полученных клеток (PDC) под воздействием витамина С (витамин C) и 1,25-дигидрокси витамин D [1,25-(OH)2D3]. Кроме того мы оценить способность PDC дифференцироваться в остеоциты, хондроцитов и адипоцитов.

Abstract

Мезенхимальных стволовых клеток (МСК) присутствуют в различных тканях и может быть дифференцирована в многочисленные типы клеток, в том числе остеобластов. Среди Стоматологическая источники MSCs надкостницы является легко доступной ткани, которая была обнаружена содержать MSCs в слой камбия. Однако этот источник имеет еще не изучены широко.

Было продемонстрировано, что витамин D3 и 1,25-(OH)2D3 стимулировать в vitro дифференцировки МСК в остеобластов. Кроме того витамин С способствует рост клеток формирования и костного коллагена. Однако ни в одном исследовании еще изучается воздействие витамина D3 и витамина С на MSCs.

Здесь мы представляем метод изоляции MSCs от человека надкостницей альвеолярного и проверить гипотезу о том, что 1,25-(OH)2D3 может оказывать osteoinductive влияние на эти клетки. Мы также расследовать присутствие MSCs в человека надкостницей альвеолярного и оценить клеточной адгезии и распространения. Оценить способность витамина С (как элемент управления) и различных концентраций 1,25-(OH)2D3 (10−10, 10−9, 10−8и 10−7 М) для изменения ключа мРНК биомаркеров в изолированные выражение MSCs mRNA щелочной фосфатазы (ALP), кости sialoprotein (BSP), ядро привязки фактор альфа-1 (CBFA1), коллаген-1, и остеокальцин (OCN) измеряются с помощью реального времени полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Introduction

Хотя в последние годы были разработаны многочисленные соответствующие методы, кости реконструкции по-прежнему ограничивается несколько ограничений и оценки степени необходимой реконструкции часто невозможно. Для эстетических и функциональных целей в дополнение к благоприятным долгосрочного успеха требуется увеличение жестких тканей. Методы, обычно используемые для таких процедур включают автогенной и аллогенных костной пластики, xenografting и Аллопластические костной пластикой. Среди различных видов костного трансплантата аутогенная костных имплантатов, считаются наиболее эффективным. Однако доноров сайт заболеваемости, нарушенной кровоснабжения и ограниченные ткани доступности1 были основные недостатки для автогенной костной пластикой. Кроме того аллогенной костных имплантатов и ксенотрасплантатов были связаны с передачи болезни. В настоящее время синтетические костных имплантатов широко используются для решения этих проблем. Однако с их отсутствием Остеогенные потенциал, клинические исходы различались. Материалы, такие как целлюлоза, связанные с колебаниями объема, инфекции и отсутствие силы.

Костной аугментации с помощью тканевой инженерии вызвала значительный интерес. В этой технике мезенхимальных стволовых клеток (МСК) первоначально используются для поощрения остеобластов дифференциация, которая затем пересадили на сайт потери костной массы для достижения кости ремонт. В настоящее время эта процедура применяется в клеточной терапии. Достижения реконструкции кости путем извлечения ограниченное количество ткани проще и менее инвазивные по сравнению с другими методами.

Потенциальная роль MSCs как инструмента на основе ячеек терапии, направленной на стоматологические регенерации является формирующейся интерес среди различных исследовательских групп. Исследования подтвердили, что MSCs может быть продифференцированным от следующих типов тканей: костного мозга, жировой, синовиальной мембраны, перицит, Трабекулярная кость, человека пуповины и тканей зуба в2,3. Общие источники MSCs костного мозга и жировой тканей зуба. По сравнению с MSCs, полученные из жировой ткани и костного мозга, преимущества Стоматологическая стволовых клеток являются доступность и менее заболеваемости после сбора урожая. По сравнению с эмбриональных стволовых клеток, MSCs, производный от зубной ткани появляются nonimmunogenic и не связаны с3сложные этические проблемы.

В 2006 году Международного общества клеточной терапии рекомендуется использование следующих стандартов для определения MSCs: во-первых, должна быть способна крепления пластика MSCs. Во-вторых служба MSCs должна иметь для поверхностных антигенов CD105, CD73 и CD90 положительными и отрицательными для маркеров для моноциты, макрофаги и клетки B помимо гемопоэтических антигены CD45 и CD344. Как последний критерий, MSCs должны быть способны дифференцироваться в следующих трех типов клеток при стандартных условиях в vitro дифференциации:4остеобластов, адипоциты и хондроцитов. На сегодняшний день, были изолированы и характеризуется шесть видов Стоматологическая стволовых клеток человека. Первый тип был изолирован от ткани человека целлюлозы и называется послеродовой пульпы зуба стволовых клеток5. Впоследствии, были изолированы и охарактеризовал три дополнительные виды стоматологических MSCs: стволовые клетки из вспученного молочных зубов6, периодонтальной связки7и апикального сосочка8. Совсем недавно также были определены Стоматологическая фолликула, полученных9, десневой ткани производные10, стоматологическая бутон стволовых cells(DBSCs)11и периапикальных кисты MSCs (hPCy-MSCs)12 .

Фриденштайн был первым, чтобы определить MSCs13. MSCs экспонат высокий потенциал распространения и можно манипулировать, чтобы дифференцировать до трансплантации, который свидетельствует о том, что они являются идеальными кандидатами для регенеративной процедуры10.

Хотя большинство исследований использовали как источник стволовых клеток костного мозга, клетки надкостницы производные (PDC) также были использованы недавно14. Надкостницы является более доступным, чем в костном мозге. Таким образом в этой технике, мы используем надкостницей альвеолярного устранить потребность в дополнительных надрезов во время операции и уменьшить послеоперационный заболеваемости пациентов. Надкостницы является соединительной ткани, который формирует наружной облицовки длинных костей и состоит из двух отдельных слоев: волокнистый слой состоит из15фибробластов, коллагеновые и эластичные волокна и внутренние ячейки богатых камбия слоя в прямой контакт с поверхностью кости. Слой камбия содержит смешанные клетки населения, главным образом фибробластов16, остеобласты17, pericytes18и критических субпопуляция, определены как MSCs19,,2021. Большинство исследований сообщили, что PDC сопоставимых, если не превосходит, костного мозга, полученных стволовых клеток (bMSCs) в кость заживление и регенерацию22,23,24. Надкостницы легко доступен и демонстрирует отличную эффективность регенерации. Однако несколько исследований были сосредоточены на надкостницы25,,2627.

Относительно кости ремонт текущий клинической практике предполагает трансплантации периостальная прогениторных клеток усиливается в рамках поддержки подмостей. Недавние исследования были сосредоточены на приобретении стволовых клеток в дефектных регионах и используя клетки-предшественники для регенерации ткани20. Стоматологи также предвидеть будущее применение пародонтальных костной регенерации в лечение пародонта и зубных имплантатов. Относительно донора сайта надкостницы могут быть легко собраны общие зубной хирургов. Это выгодно против стромальных клеток костного мозга, как надкостнице могут быть доступны во время рутинной челюстно-лицевой хирургии. Таким образом цель данного исследования – создать протокол для уборки PDC и для оценки морфологии, привязанности, жизнеспособность и распространения стволовых клеток человека надкостницы.

Метаболиты витамина D влияет на динамического равновесия в vivo кости минеральные. Одно исследование сообщало, что 24R,25-(OH)2D3 активная форма витамина D имеет важное значение для osteoblastic дифференциация человека MSCs (использования)28. Кость гомеостаза и ремонт регулируются сети3 метаболитов витамина D, из которых 1,25-(OH)2D3 (кальцитриола) является наиболее биологически активных и соответствующие в регулировании здоровья костей. Витамин D3 имеет важное значение для кальцификации29. В одном исследовании с использованием 2-d старый Куньмин белых мышей embryoid органов в мышей указал, что витамин С и витамин D добавки эффективно способствует дифференциации ESC-производные остеобластов30. Среди его биологической деятельности 1,25-(OH)2D3 стимулирует дифференциация в vitro использования остеобластов, которые могут контролироваться исходя из увеличения активность фермента щелочной фосфатазы (ALP) или OCN гена выражение.

Несколько исследований обнаружили доза-ответная реакция комбинированного лечения с витамином С и 1,25-(OH)2D3 человека PDC с особым упором на кости тканевой инженерии. Таким образом в этом исследовании, мы изучить оптимальные концентрации для одного или комбинированного лечения 1,25-(OH)2D3 и витамина С для стимулирования Остеогенные дифференциация человека PDC. Целью настоящего Протокола является определить, содержит ли популяции клеток, изолированных от стоматологических альвеолярного надкостницы ячейки с MSC фенотипа и ли эти клетки могут быть расширены в культуре (в пробирке) и дифференцированной сформировать желаемый ткани . Кроме того мы оценить способность PDC дифференцироваться в остеоциты, хондроцитов и адипоцитов. Вторая часть исследования оценивает эффекты витамина C и 10−10, 10−9, 10−8и 10−7 1,25-(OH) М2D3 на Остеогенные активность PDC. Основная цель этого исследования заключается в оценке функции витамина С и 1,25-(OH)2D3 во время osteoblastic дифференциация PDC ALP активности, и про Остеогенные генов, например, ALP, коллаген-1, OCN, BSP и CBFA1. Кроме того это исследование определяет условия оптимального osteoinductive для человека PDC, основываясь на этих выводах.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Протокол исследования был одобрен институционального обзора Совет из Чанг Gung Мемориальный госпиталь. Все участники представили письменного информированного согласия.

1. Подготовка тканей

  1. Урожай периостальная тканей от пациентов во время стоматологической хирургии (рис. 1). После отражения лоскут под местной анестезией Возьмите кусок ткани надкостницы от альвеолярной кости с помощью периостальная сепаратор31.
  2. После сбора урожая, хранения периостальная тканей ломтиками примерно 5 мм × 2 мм в Дульбекко фосфатный буфер (DPBS) с 300 ед/мл пенициллина и 300 мг/мл стрептомицина. Передача тканей в лабораторию в течение 24 ч.
  3. Фарш фрагментов альвеолярного периостальная ткани с скальпелей до тех пор, пока хорошо фарша и сохранить образцы в Средний проход 0 (состоящий из 300 ед/мл пенициллина и 300 мг/мл стрептомицина, α-MEM и 5% плода бычьим сывороточным [FBS]) культивировали в инкубаторе при 37 ° C с увлажненный воздух (5% двуокиси углерода). В инкубаторе готовят водный бассейн для поддержания влажности.
  4. После 3 дней и два раза в неделю после этого измените средство.
  5. Когда клетки достигли subconfluence (80%), отпустите адэрентных клеток с 200 мкл трипсин 0.25% в инкубатор (37 ° C) 3 мин, а затем использовать 4.5 мл среды прекратить реакции.
  6. Пластина клетки снова в свежих проход 1 среднего (α-MEM, 10% FBS, 100 единиц/мл пенициллина и стрептомицина 100 мкг/мл). Плита – 5 × 103 клеток (считается Горяева).
  7. Выполнение каждого последующего прохода после того, как клетки достичь 80% слияния31.
    Примечание: В начале, носитель будет оранжевый красный. После примерно трех дней средний цвет следует изменить на желтоватый оттенок. Время удвоения клеток составляет примерно 30-40 ч, нуждающихся 7 дней за 3-5 поколений.
  8. Культуры изолированных PDC в α-MEM дополнена 10% FBS, 100 ед/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина в инкубатор (37 ° C, 5% CO2).
  9. Наблюдать рост клеток ежедневно и заменить средство роста два раза в неделю. Использование третьего пятого поколения клетки для всех дальнейших экспериментов.

2. проточной цитометрии

  1. Урожай 1 × 106 клеток через пищеварение трипсина:
    1. 200 мкл трипсин 0.25%. После 3 минут используйте 4,5 мл питательной среды, содержащие FBS прекратить реакцию трипсина и собирать путем центрифугирования (1500 об/мин, 5 мин, 22 ° C).
    2. Вымойте клетки окатышей, три раза с использованием 1 x DPBS. Ресуспензируйте клеток в 1 x 200 мкл буфера permeabilization. Подсчет количества ячеек с Горяева.
  2. Изучите выраженных поверхностных маркеров, выразил от PDC через поток цитометрии (сортировки активирован флуоресценции клеток)32. Использование моноклональных антител (МАБ) против CD19 (флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC)), CD34 (FITC), CD44 (фикоэритрин [PE]), CD45 (FITC), CD73 (PE), CD90 (аллофикоцианин [APC]), CD146 (PE), си-1 (Алекс) и HLA-DR (FITC)32.
    1. Добавьте антитела к образцы и культуре в темноте при температуре 4 ° C за 30 мин.
    2. Вымойте клетки с 1 x DPBS три раза.
    3. Исправить ячейки, используя 2% формальдегида и продолжите потока cytometry анализ32.

3. сотовый привязанности и жизнеспособности с остеогенные, адипогенном и дифференциации хондрогенном

Побудить дифференциации в клетках в остеогенном, адипогенном и хондрогенном линий, культивирование периостальная клетки всех трех проходов на шесть ну пластины с конкретными дифференциация СМИ.

  1. Остеогенные дифференциации культура клетки в α-MEM на плотности 5000 клеток на колодец на шесть ну культуры пластин.
    1. По достижении 80% слияния, культура клетки в средствах массовой информации, содержащие α-MEM, 5% FBS, β-Глицерофосфат (10 мм), 10−7 М дексаметазон (0,1 мм) и 5 мл аскорбиновой кислоты (100 мкм). Культура отрицательного контроля в средствах массовой информации, состоящей из α-MEM и 5% FBS.
    2. Измените СМИ дважды в неделю.
    3. После 4 недель оценить потенциал клетки дифференцироваться в остеогенном линии путем окрашивания клеток, используя assay фон Kossa, который отличает наличие Кальцифицированный месторождений в культуре33.
      1. Добавьте 10% формалина для фиксации. В течение 30 мин добавить 5% нитрата серебра и лечить под ультрафиолетового (УФ) света за 1 ч при комнатной температуре.
      2. Добавить 5% Na24 четыре раза, что позволило 3 мин для каждой реакции. Наконец Вымойте клетки дважды с дистиллированной водой.
        Примечание: Фон Kossa окрашивание является реакция осадков где ионы серебра и фосфат реагируют в присутствии кислых материалов; Эта техника окрашивания не является специфичным для кальция. В этом исследовании, когда исследуемых клеток лечили раствор нитрата серебра, кальций — который уменьшается на сильного ультрафиолетового света — был заменен на серебро, которое стало видно, как серебристый металлик.
  2. Для дифференциации адипогенном культура клетки на плотность 5000 клеток в колодец на шесть ну культуры пластин, содержащие α-MEM.
    1. По достижении 80% слияния, культура клетки в средствах массовой информации содержащей α-MEM, 5% FBS, 0.5 мм 3-изобутил-1-метилксантина (100 мг/мл), 1% пенициллин, 10−6 М дексаметазона (1 мм), инсулин (5 мг/мл) и индометацин (60 мм).
    2. Культура отрицательного контроля в средствах массовой информации, состоящей из α-MEM и 5% FBS.
    3. После 6-9 недель, используйте масло красный O запятнать клетки и выделить липидного капель, таким образом определяя наличие адипогенном дифференциация33:
      1. Добавьте 10% формалина для фиксации. В течение 30 мин, запятнать клетки с 0,5% масло красный O при комнатной температуре в течение 10 минут, а затем вымыть клетки три раза с 60% изопропиловый спирт на 3 мин каждый раз; Наконец Вымойте клетки с дистиллированной водой.
        Примечание: Масло красный, O является lysochrome (fat-soluble) диазо-краситель, используемый для окрашивания нейтральные липиды, главным образом триацилглицеринов, липопротеидов и холестерин эфиры. Краска растворяется в липидного капель в ячейке, поворачивая красный капелек липидов.
  3. Для дифференциацию хондроцитов, культуры клеток на шесть ну культуры пластины с каждым хорошо содержащих 5000 клетки.
    1. Добавление дифференциации среднего содержащие α-MEM, 5% FBS, 10−7 М дексаметазона (0,1 мм), пируват натрия (100 мкг/мл), инсулин трансферрина Селена A (1 × ее), преобразование фактор роста β (10 нг/мл) и 5 мл аскорбиновой кислоты (100 мкм).
    2. Культура отрицательного контроля в средствах массовой информации, состоящей из α-MEM и 5% FBS.
    3. После 4-5 недель используйте Альциановый синий пятнать выделить кислотные полисахариды, например гликозаминогликанов или некоторые виды мукополисахаридов, в хрящевых клеток для определения присутствия дифференциацию хондроцитов33.
      1. Добавьте 10% формалина для фиксации. В течение 30 мин добавить 3% уксусной кислоты и позволяют 2 мин для реакции. Впоследствии промыть дистиллированной воды три раза, добавить 1% Альциановый синий 8GX инкубировали в течение 30 минут и затем вымыть с дистиллированной водой. Наконец добавить 3% уксусной кислоты и мыть за 3 мин, а затем вымыть с дистиллированной водой до конца.
        Примечание: Части ячейки, которые специально пятно этот краситель, становятся голубыми до сине зелёного после окрашивания и называют «alcianophilic.»

4. эффекты 25-Dihydroxyvitamin D3 (1,25-(OH)2D3) на Остеогенез

  1. P3 для P5 PDC разделены на шесть групп и культуры на 6-ну пластины с различными СМИ культуры:
  2. отрицательный группы (α-MEM и 5% FBS);
  3. Витамин C группа (α-MEM, 5% FBS, β-Глицерофосфат 10 мм и 10−7 M дексаметазон + 100 мкм витамина C);
  4. и 10−7 М 1,25-(OH)2D3 группы (α-MEM, 5% FBS, 10 мм β-метронидазол и 10−7 M дексаметазон + 10−7 M 1,25-(OH)2D3).
  5. Добавьте 2 мл среды в инкубатор (37 ° C) в каждой скважине и измените среды дважды каждую неделю.

5. Обратная транскрипция/количественные реального времени полимеразная цепная реакция

  1. После 7 d остеобластов дифференциации, изолировать всего РНК на льду с использованием коммерческих реагента (см. Таблицу материалы):
    1. Добавьте 1 mL реагента изоляции для каждой скважины. 200 мкл bromochloropropane и оставить на 10 мин для создания многоуровневой РНК и затем центрифуги на 10000 об/мин, 15 мин при 4 ° C.
    2. После центрифугирования добавьте 500 мкл 2-пропанол 500 мкл супернатанта содержащие РНК. Осадок РНК на льду и позволит 15 мин для реакции.
    3. После процедуры центрифуги на 12000 об/мин, 15 мин при температуре 4 ° C, после чего РНК расположен в нижней части трубки. Впоследствии удалить супернатант с помощью 1 мл 75% спирта для мытья и центрифуги при 7500 об/мин за 8 минут в 4 ° C.
    4. Удалить супернатант и использовать вакуумные концентраторы для производства РНК из нижней части жидкости. Восстановите с водой.
  2. Реверс транскрибировать РНК (1 мкг) с помощью птичьего myeloblastosis вирус обратной транскриптазы. Установите полимеразной цепной реакции (ПЦР) для запуска при 25 ° C в течение 10 мин, после чего 50 ° C 60 мин и затем 85 ° C за 5 мин, прежде чем наконец поддержание при 4 ° C.
  3. Синтезировать перв стренги комплементарной ДНК — (cDNA кДНК). Выполнять количественного PCR (ПЦР) с помощью 5 мкл 1:10 разбавленный cDNA. Проведение количественного RT-PCR (qRT ПЦР) с праймерами для ALP, BSP, OCN, CBFA1 и коллаген-1.
    Примечание: Чтобы избежать загрязнения ДНК по сигналам, прямой и обратной последовательности каждого праймера были разработаны на собственный экзонов.
  4. Выполнять ПЦР с использованием коммерческих ПЦР Master Mix (см. Таблицу материалы) в соответствии с инструкциями производителя. Установите тепловая велосипедист при 50 ° C за 2 мин, после чего 95 ° C в течение 10 мин и затем 40 циклов, каждый на 95 ° C 15 s следуют 60 ° C для 60 s.
    Примечание: SYBR протокол также требует этап кривой расплава, который запускается при 95 ° C в течение 15 сек, 60 ° C 60 s, а затем 95 ° C 15 s.
  5. Нормализации цикла пороговые значения для ALP, BSP, CBFA1, коллаген-1 и OCN, уборки гена GAPDH. 34
  6. Грунтовка пар, перечислены в Таблице материалов.

6. щелочной фосфатазы

  1. Оценить ALP ферментативной активности клеток, используя ранее описанные техника35, который преобразует фосфат - нитрофенил p p- нитрофенола; p- нитрофенил фосфатов является фосфатазы субстрат, который желтеет, когда dephosphorylated, ALP, как определено на длине волны 405 нм. Нормализации общей p- нитрофенола формируется на основе общего белка определяется assay Брадфорд.
  2. Сравните ALP деятельности управления (α-MEM, 5% FBS), витамин С (α-MEM, 5% FBS, β-Глицерофосфат 10 мм, 10−7 M дексаметазон + 100 мкм витамин С), 1,25-(OH)2D3 (α-MEM, 5% FBS 10 мм β-метронидазол и 10−7 М Дексаметазон + 10−8 М 1,25-(OH)2D3) и витамин С + 1,25-(OH)2D3 (α-MEM, 5% FBS, β-Глицерофосфат 10 мм, 10−7 M дексаметазон + 100 мкм витамин C +1,25-(OH)2D3) группы после 1, 2, 3 и 4 недели культуры.
  3. Выполните процедуру извлечения белков на льду:
    1. Скрип клетки от 6-ну пластин и добавьте 50 мкл буфера lysis. Впоследствии место клетки на льду для 30 минут, чтобы разрушать клетки и свободного белка.
    2. После 30 мин центрифуги на 13000 об/мин при 4 ° C на 15 мин. После центрифугирования экстракт супернатант для хранения и использования.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Для всех количественных анализов данные представлены как среднее ± стандартное отклонение (SD). Все статистические анализы были проведены с использованием студента t-теста. В общей сложности 34 образцы были получены с средний возраст участников 48,1 ± 12.3 ю. Одиннадцать из этих образцов были получены из пациентов мужского пола и 23 из пациенток. Двадцать восемь образцы были получены от молярной регионов и шесть от передней регионов; 26 были получены из верхней челюсти и 8 из нижней челюсти. Средняя продолжительность между стоматологическая процедура и культуры был 0,5 ± 0,1 ч. Из 34 исследуемых образцов 20 успешно принесли MSC колоний, с успешной изоляции размере 58,8%. Никаких существенных различий наблюдались в любой из параметров между успешно и безуспешно изолированных PDC (средний возраст: 48.8 ± 13,0 против 47.1 ± 11,5 y, секс: 7 мужчин [35%] против 4 мужчин [28,6%], Местоположение: 15 от молярной регионов [75%] против 13 [92,9%] и 15 из верхней челюсти [75%] против 11 [78,6%], соответственно).

Сотовый изоляции и морфология: остеогенные, хондрогенном и адипогенном дифференциация

От дней 1-9 PDC сформировал колоний и сферических кластеров. Большинство клеток выставлены шпинделя внешний вид и были однородными под микроскопом фазово контрастной (рис. 2). После 14 d культуры морфологию клеток появился веретеновидной формы, как заметил под микроскопом фазово контрастной. После первого поколения клетки клетки больше не вырос в кластерах, но выставлены широко и равномерное распространение.

MSCs были сформированы шпинделя с нерегулярных процессов и прочно прикреплены к культуре блюдо после 1-3 d основной культуры (рис. 2a). Первоначальный культуры выставлены маленькие, круглые клетки и клетки, веретеновидной формы, под оптический микроскоп. Культивируемых клеток выставлены фигуру однородной, фибробластоподобных шпинделя от первого прохода (рис. 2a). Дифференциация исследование показало, что PDC может быть subpassaged и дифференцированной в пробирке в остеобластов (рис. 2b), хондроцитов (рис. 2 c) и адипоцитов (Рисунок 2d).

В конце Остеогенные дифференциации фон Kossa окрашивание указано наличие отложения кальция и остеогенном дифференциации (рис. 2b). Эти результаты сильно указали, что среди населения периостальный клеток, клеток-предшественников обладать способны дифференцироваться в Остеогенные клетки.

Для оценки производства протеогликаны, Альциановый синий краситель использовался в качестве показателя для определения наличия дифференциацию хондроцитов (рис. 2 c). Клетки успешно дифференцированы в хондроцитов. Эти результаты свидетельствуют о том, что, среди периостальная клеточных популяций, клетки-предшественники обладают потенциалом дифференцироваться в хондрогенном клетки.

Клетки были культивировали в ранее упомянутых конкретных средств массовой информации вызвать адипогенном дифференциации. После 8 недель масло красный O был использован для обнаружения существование внутриклеточных липидов. Следующие окрашивание, внутриклеточный микроскопических жира, капли были замечены в пяти дифференцированной образцов (Рисунок 2d).

Анализ потока гранулярных поверхности маркер выражения для PDC

Пробирного гранулярных поток был проведен для подтверждения выражение мезенхимальных поверхности маркер на поверхности клеток. MSC маркеров CD73, CD90, УВСР-1 и CD44 были сильно положительный в PDC, тогда как маркеры гемопоэтических линии CD19, CD34, CD45 и HLA-DR были отрицательными.

Эффекты различных витамина d 3 концентрации на Остеогенез

Хотя результаты подтвердили положительные эффекты 1,25-(OH)2D3 (кальцитриола) на Остеогенные активность, статистически значимые различия были замечены только среди некоторых из изменений раза в выражениях мРНК Остеогенные ферменты. Этот анализ может пристрастный высокой SD значений, которые можно отнести к индивидуальных отклонений между узлами.

Матричная РНК выражение щелочной фосфатазы

Фолд изменения экспрессии мРНК ALP после 1 недели культуры был 7.43 (SD = 3.96) в группе витамина С и 7.15 (SD = 4.88), 9.30 (SD = 5,63), 12,92 (SD = 7,95) и 6,60 (SD = 6,33) в 10−10, 10−9, 10−8 и 10−7 М 1,25-(OH)2D3 группы, соответственно (рис. 4a). Уровни mRNA выражение ALP в Vitamin C, 10−8 M 1,25-(OH)2D3и 10−9 M 1,25-(OH)2D3 группы были значительно выше (p < 0,05) чем те, в других группах, показывающее увеличение выражение ALP mRNA в этих группах. Элемент управления был установлен в значение 1. В этом исследовании были замечены раза возрастает в выражениях ALP мРНК: 7.43-fold в группе витамина C; 9.30-fold в 1,25-(OH)9 M 10−2D3 группы; и 12.92-fold в группе 10−8 M 1,25-(OH)2D3 .

Хотя больше раз изменения в выражениях ALP мРНК наблюдалось в группе 10−8 M 1,25-(OH)2D3 , никаких статистически значимых отличий наблюдались относительно этих уровней выражения между этой группой и негативные и витамин C групп (p = 0,20 и p = 0,52, соответственно).

ALP является сильным показателем для определения ранних Остеогенные дифференцировки клеток. ALP также служит ectoenzyme для деградации неорганических пирофосфата и освобождает фосфат при минерализации36. PDC обработаны с витамином С и 10−8 и 10−9 M 1,25-(OH)2D3 выставлены существенные различия по сравнению с теми, от других групп (рис. 4a).

Матричная РНК выражение кости sialoprotein

Раз изменений в мРНК выражениях BSP после 1 недели культуры были 3.21 (SD = 1.20) и 4.18 (SD = 2,55), 10.34 (SD = 10,31), 24.91 (SD = 23.44) и 5.24 (SD = 3.54) в Vitamin C и 10−10, 10−9, 10−8 и 10−7 М 1,25-(OH)2D3 группы, соответственно (рис. 4В). BSP мРНК выражения были выше в группе3 1,25-(OH)2D 10−8 М, но не статистической значимости по сравнению с соответствующими выражениями в других группах.

BSP мРНК выражения в Vitamin C и 10−10 М 1,25-(OH)2D3 группы были значительно выше (p < 0,05) чем в других группах, указав, что витамин C и 10−10 М 1,25-(OH) 2 D3 поощрять выражение BSP. Элемент управления был установлен в значение 1. Витамин C и 10−10 М 1,25-(OH)2D3 группы выставлены 3.21 - и 4.18 раза повышение в выражениях BSP мРНК, соответственно. 10−9 М и 10−8 M 1,25-(OH)2D3 группы экспонируются выше выражения BSP мРНК, чем другие группы. 10−9 и 10−8 M 1,25-(OH)2D3 группы выставлены 10.34 - и 24.91 раз увеличение в выражениях BSP мРНК, соответственно, но это увеличение не было статистически значимым (p > 0,05). Возможным объяснением является, что стволовые клетки не все были получены от же участника. Таким образом потенциальные различия могли бы увеличили SD и соответственно воздействие статистические результаты.

Матричная РНК выражение CBFA1

Раз изменений в выражениях мРНК CBFA1 после 1 недели культуры были 0,96 (SD = 0,10) и 0.90 (SD = 0.26), 1.01 (SD = 0,25), 1.31 (SD = 0,32) и 1.12 (SD = 0,35) в Vitamin C и 10−10, 10−9, 10−8 и 10−7 М 1,25-(OH)2D3 группы, соответственно (рис. 4 c). 10−8 M 1,25-(OH)2D3 группе выставлены выше выражения CBFA1 мРНК. Отмеченные изменения не были замечены в выражения гена CBFA1 мРНК в группах лечения или в группе управления. Кроме того было отмечено никакого существенного увеличения экспрессии мРНК маркеров после добавления витамина С или 1,25-(OH)2D3. Кроме того наблюдались не межгрупповые различия.

Матричная РНК выражение коллагена-1

Сгиб изменения экспрессии мРНК коллагена-1 после 1 недели культуры были 0,98 (SD = 0,17) и 0.85 (SD = 0,16), 1,05 (SD = 0,16), 1.52 (SD = 0,36) и 1.01 (SD = 0,33) в Vitamin C и 10−10, 10−9, 10−8 и 10−7 М 1,25-(OH)2D3 группы, соответственно (рис. 4 d). Коллаген-1 мРНК выражения были выше в группе 10−8 M 1,25-(OH)2D3 , но никаких статистически значимых отличий по сравнению с соответствующими выражениями в других группах.

10−8 M 1,25-(OH)2D3 управления группы и продемонстрировал статистически значимых различий в их результаты (p < 0,05). Элемент управления был установлен в значение 1. Было отмечено увеличение коллагена-1 мРНК выражения на 1.52-fold. 10−10 M 1,25-(OH)2D3 и 10−8 M 1,25-(OH)2D3 групп выставлены существенные различия в их результаты (p < 0,05).

Выражение РНК остеокальцин

Раз изменений в выражениях OCN мРНК после 1 недели культуры были 0,60 (SD = 0.1) и 0,78 (SD = 0,18), 1,13 (SD = 0,55), 2.59 (SD = 1,59) и 1,61 (SD = 0,73) в Vitamin C и 10−10, 10−9, 10−8 и 10−7 М 1,25-(OH)2D3 группы, соответственно (Рисунок 4e). OCN мРНК выражения были выше в группе 10−8 M 1,25-(OH)2D3 , но никаких статистически значимых отличий по сравнению с соответствующими выражениями в других группах.

После добавления витамина С или 1,25-(OH)2D3в выражениях OCN мРНК маркеров было отмечено никакого существенного увеличения. Однако OCN мРНК выражения сократилась после лечения витамином С. Элемент управления был установлен в значение 1. Базальные выражения OCN выставлены значительное уменьшение 0.6-fold (p < 0,05) во время osteoblastic дифференциации. OCN мРНК, выражения были значительно выше (p < 0,001) в клетки культивировали в 10−8 M 1,25-(OH)2D3 чем в соответствующие выражения других групп, которые выставлены средняя раз увеличение 2.59. Однако эти результаты не были статистически значимыми (p > 0,05). Возможное объяснение состоит в том, что стволовые клетки были не все полученные от же участника; Таким образом потенциальные различия могли бы увеличили SD и соответственно воздействие статистические результаты.

ALP деятельности пробирного

Предыдущие исследования показали, что 1,25-(OH)2D3 является наиболее эффективным в концентрации 10−8 М; Таким образом 10−8 M был использован в тестовую группу для сравнения Остеогенные способности с этим негативных 1,25-(OH)2D3 , витамин С и витамин С + 1,25-(OH)2D3 групп. Остеогенные способность была выражена деятельности ALP. После 1 недели культуры (Рисунок 5a), раз изменения в ALP деятельности были 1.00 (SD = 0.00), 1.92 (SD = 0,89), 3.77 (SD = 1,66) и 1,46 (SD = 0,49) в отрицательной, C, D и C + D, соответственно. Среди всех групп, статистически значимого различия наблюдались только между группами D и отрицательной (p = 0,03; Рисунок 5a). После 2 недель культуры, фолд изменения в ALP активности (Рисунок 5b) были 1.00 (SD = 0.00), 2.32 (SD = 1,68), 4.98 (SD = 3.02) и 4.86 (SD = 2.73) в отрицательной, C, D и C + D, соответственно. Статистически значимой разницы не наблюдались в любой из групп. После 3 недель культуры, фолд изменения в ALP активности (рис. 5 c), 1.00 (SD = 0.00), 2,93 (SD = 2.15), 5.76 (SD = 3,60) и 5.61 (SD = 3,88) в отрицательной, C, D и C + D, соответственно. Опять же никаких статистически значимых отличий наблюдались в любой из групп (рис. 5 c). После 4 недель культуры, фолд изменения в ALP активности (рис. 5 d) были 1.00 (SD = 0.00), 2.83 (SD = 1,97), 3.79 (SD = 0,77) и 4.24 (SD = 2,87) в отрицательной, C, D и C + D, соответственно. Здесь, группы D и отрицательной выставлены статистически значимых различий (p = 0.00; Рисунок 5 d).

В 1 неделю, только 10−8 M 1,25-(OH)2D3 группе выставлены существенные различия по сравнению с контрольной группой (p = 0,03). В 2 недели, 10−8 M 1,25-(OH)2D3 и витамина С группами выставлены существенные различия по сравнению с контрольной группой (p = 0.0498). В 3 недели ни одна из групп представлены существенные различия по сравнению с контрольной группой. В 4 недели 10−8 M 1,25-(OH)2D3 группе выставлены существенные различия по сравнению с контрольной группой. Это показало что 10−8 M 1,25-(OH)2D3 способствует деятельность ALP.

Короче говоря 10−8 M 1,25-(OH)2D3 группе выставлены увеличился ALP и выражение mRNA коллаген-1; Витамин C Группа выставлены значительно расширенной ALP и выражение BSP mRNA; и 10−9 M 1,25-(OH)2D3 группа exhibited существенное укрепление выражение ALP mRNA. В 1 неделю повышенная активность ALP было отмечено в группах3 2D Витамин С и 1,25-(OH), но с никаких статистически значимых отличий по сравнению с соответствующими уровнями выражение в других группах. От 2 недель до 4 витамин С и 1,25-(OH)2D3 группы выставлены аналогичные результаты. Таким образом эти результаты не могут четко разъяснить синергическое воздействие витамина С и 1,25-(OH)2D3 на Остеогенные дифференцировки клеток (ALP деятельность).

Figure 1
Рисунок 1: человека надкостницей альвеолярного. Периостальный тканях собрано в стоматологической хирургии. Звездочки обозначает расположение альвеолярного надкостницы.

Figure 2
Рисунок 2: исследование дифференцировки. MSCs были сформированы шпинделя с нерегулярных процессов и прочно прикреплены к культуре блюдо после 1-3 d основной культуры (A; звездочки обозначает расположение мезенхимальных стволовых клеток). В vitro условиях культуры MSCs были subpassaged и дифференцированной в остеобластов (B, черный звездочка указывает области запятнана фон Kossa), хондроцитов (C, синий звездочка указывает область, окрашенных по Альциановый синий) и адипоцитов (D, розовый звездочка указывает области запятнана масло красный O). Рисунок 2 повторно из биомедицинских исследований международного, объем 2016, 3529561 ID статьи25. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: проточная цитометрия. Поверхностных маркеров, выраженные MSCs были CD73 (65,2%), CD90 (75,6%), си-1 (65,2%) и CD44 (88,1%) но не CD45 (1,34%), CD34 (1,61%), CD19 (2.18%), или HLA-DR (2,20%). «%» на рисунке обозначает положительное отношение. В контрольной группе (α-MEM и 5% FBS) представлен красной линией. Экспериментальная группа представлена «голубой линии». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: выражения мРНК. мРНК выражения остеобластов дифференциации на 1 неделю. BSP ALP (B) (A), (C) CBFA1, (D) COL-я и (E) OCN. Это p < 0,05 *, p < 0,01 — **, p < 0,001 — ***. МРНК раз меняется по сравнению с контролем (α-MEM и 5% FBS). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: активность щелочной фосфатазы. Активность щелочной фосфатазы пробирного остеобластов дифференциации для (A) 1 неделя, 2 недели (B), (C) неделя 3 и неделя 4 (D). p < 0,05 — *, p — < 0,01 **, p < 0,001 — ***. Сгиб изменяется по сравнению с контролем (α-MEM, 5% FBS). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Недавно разработанные терапевтические модальности, а именно ткани инженерных, влекущее за собой MSCs, имеет многочисленные преимущества. MSCs, которые присутствуют в нескольких типов тканей, являются Multipotent с клетки, которые могут дифференцироваться в различных функциональных mesodermal ткани клетки37 и других клеток, таких как остеобластов.

Надкостницы служит ниша для клеток-предшественников и как богатые сосудистую поставок для кости он обволакивает38. В нашем исследовании, 34 исследуемых образцов 20 успешно принесли MSC колоний, с успешной изоляции размере 58,8%. MSCs, производный от надкостницы были выбраны в этом исследовании, основанный на их распространение и остеогенном дифференциация способностей. Уровень распространения периостальная клеток был гораздо выше, чем у стромальные клетки костного мозга22. Отношении Остеогенные способности надкостницы Ousual24 утверждали, что Остеогенные способность надкостницы производные стволовых клеток (ЧВОК) было хуже, чем BMSCs. Однако Иосимура свидетельствует, что Остеогенные способность ЧВОП обогнали, BMSCs39. Хаяси и др. продемонстрировал периостальная взрослых MSCs как идеальные кандидаты для костной ткани регенерации24. Кроме того периостальный взрослых MSCs считаются полезными в сокращении периода культуры клеток, тем самым уменьшая стоимость и риск загрязнения22. Как сообщается старение также влияет на митогенный активность клеток osteoprogenitor40. Исследования сообщили, что 1,25-(OH)2D3 индуцированной более высокой степенью стимуляции дифференцировки в vitro остеобластов в использования от молодых участников (65 лет < y)41. Настоящее исследование предусматривали использование периостальная клеток, полученных от молодых людей (65 лет < y). Для сравнения способность регенерации кости периостальная клеток между старыми и молодыми доноров требуются дальнейшие исследования.

В этом исследовании популяции клеток был изолирован на основе его пластика сторонник свойства, как описано в Фриденштайн и др. 13. PDC, найденным здесь придерживаться пластической культуры клеток. Esenchymal маркеры (CD 73, CD 90, УВСР-1 и CD 44) поверхностных антигенов этих первичных культур клеток выставлены значительные выражения. Кроме того кроветворные маркеры (CD 45, CD 34, CD 19 и HLA-DR) отсутствовали, указывающие, что искусственный клетки mesenchymal происхождения. Остеогенные, хондрогенном и адипогенном дифференциации PDC могут быть вызваны с помощью конкретных дифференциация средств массовой информации, как описано в других исследований, оценивающих образцы, полученные из десневой ткани и костного42. Результаты настоящего исследования соответствуют минимальным стандартам для фенотипических и функциональное определение человека MSCs, принятым международным обществом для клеточной терапии4. В настоящем исследовании MSCs от человека надкостницы были изолированы и расширена, выявившей характеристики, аналогичные тем, которые обычно описан из BMSCs.

Исследования предложили, что дексаметазон, аскорбат и β-Глицерофосфат вызвать BMSCs для прохождения Остеогенные дифференциация43. Другое исследование показало что 1α, 25-dihydroxyvitamin D3 (1,25-(OH)2D3) в сочетании с аскорбиновой кислоты способствует клеточной дифференцировки44. Таким образом дексаметазон, аскорбат и β-Глицерофосфат были добавлены в этом исследовании для содействия дифференцировки стволовых клеток. Характер были похожи во всех трех образцах клеток пациента. В этом исследовании MSCs были успешно определены с надкостницей альвеолярного изоляции составляет 58,8%. Статистически значимой разницы не наблюдались в успех ставки в отношении возраста, пола и местоположение.

Экспериментальные исследования исследованы два вещества, а именно: 1,25-(OH)2D3 и витамина С, оба из которых могут стимулировать Остеогенные дифференцирования стволовых клеток. Исследование 2008 года45 указал, что 1,25-(OH)2D3 имеет решающее значение для метаболизма костной ткани и гомеостаз кальция и влияет на сердечно-сосудистой системы через механизмы еще не в полной мере понять. В другой предыдущие исследования461,25-(OH)2D3 стимулируется в vitro дифференциация человека MSCs в остеобластов. 1,25-(OH)2D3 возможность побудить дифференцироваться в остеобластов подобных клеток в vitro недифференцированных BMSCs была продемонстрирована в ходе нескольких исследований, изучения различных систем46. Некоторые исследования также показали, что при добавлении культуры остеобластов подобных клеток, 1,25-(OH)2D3 препятствует пролиферации, но увеличивает выражение osteoblastic маркеров, например, ALP, Остеопоэтин, OCN и матрицей Gla белка47,48. Предыдущие исследования сообщили, что 1,25-(OH)2D3 обычно препятствует пролиферации и индуцирует остеобластов дифференциация49. Один в vitro исследования на мышиных клетки указал, что 1,25-(OH)2D3 может способствовать на ранних стадиях osteoblastogenesis9. Кроме того другое в vitro исследование показало, что, раннего и позднего MSCs,1,25-(OH)2D3 может стимулировать Остеогенные дифференциация маркеров, в том числе ALP, Остеопоэтин, BSP и OCN43.

Обе OCN — считается ответственным для элемента матрицы синтеза — и коллаген 1A1 — наиболее распространённый матрица белка — являются важнейшим кислой кости матрица белки, которые играют жизненно важную роль в синтезе матрицы. Кроме того они являются характерным Зрелые матрица формирование остеобластов. 50 предыдущего исследования сообщили, что 1,25-(OH)2D3 лечение стимулировали увеличение коллагена 1A1 выражение, но не CBFA1 или ALP ген выражение34. Оценки генов, участвующих в osteoblastic дифференциация показали, что 1,25-(OH)2D3 лечение увеличение выражение OCN51,52,53. В нашем исследовании результаты показали, что 1,25-(OH)2D3 оказывает положительное влияние на Остеогенные активность. По сравнению с другими группами, 10−8 М 1,25-(OH)2D3 продемонстрировал увеличение выражение mRNA ALP, BSP, CBFA1, OCN и Col1. Среди них результаты Алп и Col1 достигло статистической значимости. Таким образом оптимальные условия были получены при использовании 10−8 М 1,25-(OH)2D3. выражение mRNA BSP в 10−10 М 1,25-(OH)2D3 группе значительно увеличилось (p < 0,05). Однако в лоно изменения в выражениях мРНК CBFA1 и OCN наблюдались никаких статистически значимых отличий. При рассмотрении выражение mRNA гена, результаты эксперимента показали в vitro Остеогенные дифференциация. Основываясь на этих выводах, остеогенез, наблюдается отрицательный, витамин C и 10−10, 10−9, 10−7 M 1,25-(OH)2D3 группы был слабее, чем в 10−8 М 1,25-(OH)2D3 группа. Эти результаты вели к спекуляции, что 1,25-(OH)2D3 простых PDC по upregulating матрица белки, необходимые для минерализации (коллаген 1A1).

Предыдущие исследования сообщили OCN как главной мишенью 1,25-(OH)2D3, которая заметно увеличилась OCN выражение52. OCN осаждения можно рассматривать как маркер для Остеогенные дифференциации PDC. Кроме того OCN выражение оценивается как поздно Остеогенные маркер54. OCN — надежный маркер для кости формирования и Остеогенез55. Таким образом OCN выражение обычно связаны с минерализацией способности клеток. OCN является чувствительной биомаркеров зрелых остеобластов. В vitro Остеогенные сравнения заметно повышенных выражение OCN mRNA было отмечено в группе3 M 1,25-(OH)2D 10−8 .

Одно исследование показало, что деятельность ALP тормозится преобразования фактор роста бета (0.1-10 нг/мл) и повышен с 1,25-(OH)2D3 (50 Нм)46. Эти результаты предполагают, что 10−8 М 1,25-(OH)2D3 способствует развитию созревания и кости стволовых клеток. ALP активности при оптимальной наблюдаемых концентрациях 10−8 М 1,25-(OH)2D3 был по сравнению с в соответствующих концентрациях витамина C. PDC выраженной активностью ALP. Кроме того добавление 1,25-(OH)2D3 ALP активность и способствует osteoblastic дифференциация в PDC. Во всех трех параметров, витамин С, 10−8 М 1,25-(OH)2D3и витамин С + 10−8 М 1,25-(OH)2D3 повышение активности ALP на недели 1 (рис. 4a), 2 (рис. 4b), 3 ( Рисунок 4 c) и 4 (рис. 4 d) по несколько раз по сравнению с отрицательным контрольной группы. В недели 1 и 4 ALP деятельности значительно возросли в группе3 M 1,25-(OH)2D 10−8 . В 2 недели ALP деятельности значительно возросли в Vitamin C и 10−8 М 1,25-(OH)2D3 групп.

Через сравнительное исследование различных человеческих MSCs на проход 3 Сакагути и др. 56 найдено, что BMSCs и ЧВОК обладают аналогичными Остеогенные способностями. Таким образом период культура клеток вероятно может быть сокращен с помощью периостальная клетки, которые в свою очередь уменьшит риск стоимость и загрязнения. Использование раннего проход использования избегает стареющей последствия экспансии в культуре. Ousual и Иосимура используется MSCs на проход 3 и subcultured 2 недели под Остеогенные дифференциации условий35. Таким образом время прохода должны рассматриваться при сравнении клеточной деятельности различных источников клеток. В этом исследовании третьего поколения PDC были использованы, потому что Остеогенные потенциал стволовых клеток более поздних поколений PDC ниже, чем у стволовых клеток третьего поколения PDC.

Когда культивировали в сыворотке крови человека среде, надкостницы стволовые клетки можно не только поддерживать их форму, но можно также прикрепить, поддерживать деятельность и достичь роста клеток. В целом на основе этих результатов, человека PDC обладают способностью выживать, размножаться и дифференцироваться в остеогенном линии в пробирке, что имеет решающее значение при оценке эффективности в естественных условиях. Надкостницы богат MSCs и таким образом подходит для тканевой инженерии. Надкостница, полученные из десны создает меньше осложнений. Таким образом альвеолярной кости считается идеальным донора сайта. Результаты четко продемонстрировали возможность аналогичным образом изолируя MSCs от надкостницы и достижение их дифференцировку в остеобластов, хондроцитов и адипоцитов. В этом исследовании влияние витамина С на Остеогенные потенциал PDC были по сравнению с 1,25-(OH)2D3 в различных концентрациях. Наиболее эффективная концентрация была 10−8 М 1,25-(OH)2D3. 10−8 М 1,25-(OH)2D3 лечения на протяжении всего периода культуры был эффективным и экономичным методом индукции Остеогенные дифференциации в PDC. В заключение витамин С и 1,25-(OH)2D3 содействовать Остеогенные дифференциация PDC. Однако они выставлены без значительных синергетических эффектов в ALP результаты деятельности. С учетом небольшого размера выборки для дальнейшей оценки требуются дополнительные образцы. Таким образом PDC, культивированный Остеогенные условиях может быть полезным для тканевой инженерии костей и предлагают преимущество выше пролиферации.

Важнейшие шаги настоящего Протокола включают шаги 1.2 и 1.3 (начиная процедуре культивирования в течение 24 часов после уборки и надлежащего обслуживания после этого). Следует избегать загрязнения ткани и использование асептической техники является обязательным. Одно ограничение этого протокола является то, что, по сравнению с источники стволовых клеток из костного мозга и жировой ткани, снабжением стволовые клетки от зубной ткани ограничены с точки зрения низкое количество клеток, которые могут быть получены через эту технику.

Определение и характеристика периостальная стволовых клеток может обеспечить ценную информацию относительно функций и регенеративный потенциал этой ткани, а также его применимость в восстановительной терапии. Оптимальное состояние было получено с помощью 10−8 М 1,25-(OH)2D3. Таким образом лечение PDC с 10−8 М 1,25-(OH)2D3 способствует Остеогенные дифференциации. Будущие исследования должны изучить в естественных условиях применения 10−8 М 1,25-(OH)2D3 для эффективного и экономичного кости тканевой инженерии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Протокол исследования был одобрен Советом по рассмотрению институциональных для клинических исследований из Чжан Гун Мемориальный госпиталь (IRB99-1828B, 100-3019C, 99-3814B, C 102-1619, 101-4728B и 103-4223C). Это исследование было поддержано Чжан Гун Мемориальный госпиталь (CMRPG392071, CMRPG3A1141, CMRPG3A1142 и NMRPG3C0151). Этот манускрипт был отредактирован Уоллес академических редактирования.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA Gibco 25200-056
2-phospho-L-ascorbic acidtrisodium salt Sigma 49752
35-mm culture dishes Corning 430165
3-isobutyl-1-methylxanthine Sigma I5879
6  well plate Corning 3516
Alkaline phosphatase ABI Hs01029144_m1
Alkaline Phosphatase Activity Colorimetric Assay Kit BioVision K412-500
avian myeloblastosis virus reverse transcriptase Roche 10109118001
CD146 BD 561013
CD19 BD 560994
CD34 BD 560942
CD44 BD 561858
CD45 BD 561088
CD73 BD 561014
CD90 BD 561974
Cell banker1 ZEAOAQ 11888
core binding factor alpha-1 ABI Hs00231692_m1
dexamethasone Sigma D4902
DPBS Gibco 14190250
FBS Gibco 26140-079
GAPDH ABI Hs99999905_m1
HLA-DR BD 562008
indomethacin Sigma I7378
insulin sigma 91077C
insulin–transferrin–selenium-A Sigma I1884
MicroAmp Fast 96 well reaction plate(0.1ml) Life 4346907
MicroAmp optical adhesive film Life 4311971
Minimum Essential Medium 1X Alpha Modification HyClone SH30265.02
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122
Permeabilization buffer eBioscience 00-8333-56
Sodium pyruvate Gibco 11360070
STRO-1 BioLegend 340103
SYBER Green PCR Master Mix AppliedBiosystems 4309155
TaqMan Master Mix Life 4304437
transforming growth factor-β Sigma T7039 
Trizol reagent (for RNA isolation) Life 15596018
β-glycerophosphate Sigma G9422
collagen-1 Invitrogen forward primer 5' CCTCAAGGGCTCCAACGAG-3
reverse primer 5'-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3'
OCN Invitrogen forward primer 5'-GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG-3'
reverse primer 5'-GTCAGCCAACTCGTCACAGT-3'
BSP Invitrogen forward primer 5' AAAGTGAGAACGGGGAACCT-3'
reverse primer 5'-GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3'
Commercial ALP primers
Commercial CBFA1 primers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kao, R. T., Murakami, S., Beirne, O. R. The Use of Biologic Mediators and Tissue Engineering in Dentistry. Periodontol. 50, 127-153 (2000).
  2. Rosenbaum, A. J., Grande, D. A., Dines, J. S. The Use of Mesenchymal Stem Cells in Tissue Engineering: A Global Assessment. Organogenesis. 4, 23-27 (2008).
  3. Yen, T. H., Wright, N. A., Poulsom, R. Bone Marrow Stem Cells: From Development to Therapy. Horizons in Medicine. Franklyn, J. 16, Royal College of Physicians of London. London, UK. 249-257 (2004).
  4. Dominici, M., et al. Minimal Criteria for Defining Multipotent Mesenchymal Stromal Cells. The International Society for Cellular Therapy Position Statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
  5. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal Human Dental Pulp Stem Cells (DPSCs). In Vitro and In Vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 13625-13630 (2000).
  6. Miura, M., et al. Stem Cells from Human Exfoliated Deciduous Teeth. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 5807-5812 (2003).
  7. Seo, B. M., et al. Investigation of Multipotent Postnatal Stem Cells from Human Periodontal Ligament. Lancet. 364, 149-155 (2004).
  8. Sonoyama, W., et al. Mesenchymal Stem Cell-Mediated Functional Tooth Regeneration in Swine. PLOS ONE. 1, e79 (2006).
  9. Morsczeck, C., et al. Isolation of Precursor Cells (PCs) from Human Dental Follicle of Wisdom Teeth. Matrix Biol. 24, 155-165 (2005).
  10. Mitrano, T. I., et al. Culture and Characterization of Mesenchymal Stem Cells from Human Gingival Tissue. J Periodontol. 81, 917-925 (2010).
  11. Di Benedetto, A., Brunetti, G., Posa, F., Ballini, A., et al. Osteogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from Dental Bud: Role of Integrins and Cadherins. Stem Cell Res. 15, 618-628 (2015).
  12. Marrelli, M., Paduano, F., Tatullo, M. Cells Isolated from Human Periapical Cysts Express Mesenchymal Stem Cell-like Properties. Int J Biol Sci. 9 (10), Published online Nov 16 1070-1078 (2013).
  13. Friedenstein, A. J., Piatetzky-Shapiro, I. I., Petrakova, K. V. Osteogenesis in Transplants of Bone Marrow Cells. J Embryol Exp Morphol. 16, 381-390 (1966).
  14. Perka, C., Schultz, O., Spitzer, R. S., Lindenhayn, K., Burmester, G. R., Sittinger, M. Segmental Bone Repair by Tissue-Engineered Periosteal Cell Transplants with Bioresorbable Fleece and Fabrin Scaffolds in Rabbits. Biomaterials. 21, 1145-1153 (2000).
  15. Taylor, J. F. The Periosteum and Bone Growth. Hall, B. K. , CRC Press. Boca Raton. Bone Growth VI (1992).
  16. Squier, C., Ghoneim, S., Kremenak, C. Ultrastructure of the Periosteum from Membrane Bone. J Anat. 171, 233-239 (1990).
  17. Aubin, J., Triffitt, J. Mesenchymal Stem Cells and Osteoblast Differentiation. Principles of Bone Biology. Bilezikian, J., Raisz, L. G., Rodan, G. A. , Academic Press. San Diego. 59-81 (2002).
  18. Diaz-Flores, L., Gutierrez, R., Lopez-Alonso, A., Gonzalez, R., Varela, H. Pericytes as a Supplementary Source of Osteoblasts in Periosteal Osteogenesis. Clin Orthop Relat Res. 275, 280-286 (1992).
  19. Lim, S. M., Choi, Y. S., Shin, H. C., Lee, C. W., Kim, S. L., Kim, D. I. Isolation of Human Periosteum-Derived Progenitor Cells Using Immunophenotypes for Chondrogenesis. Biotechnol Lett. 27, 607-611 (2005).
  20. Stich, S., et al. Human Periosteum-Derived Progenitor Cells Express Distinct Chemokine Receptors and Migrate Upon Stimulation with CCL2, CCL25, CXCL8, CXCL12, and CXCL13. Eur J Cell Biol. 87, 365-376 (2008).
  21. Choi, Y. S., et al. Multipotency and Growth Characteristic of Periosteum-Derived Progenitor Cells for Chondrogenic, Osteogenic, And Adipogenic Differentiation. Biotechnol Lett. 30, 593-601 (2008).
  22. Agata, H., et al. Effective Bone Engineering with Periosteum-Derived Cells. J Dent Res. 86, 79-83 (2007).
  23. Ribeiro, F. V., et al. Periosteum-Derived Cells as an Alternative to Bone Marrow Cells for Bone Tissue Engineering Around Dental Implants. A Histomorphometric Study in Beagle Dogs. J Periodontol. 81, 907-916 (2010).
  24. Hayashi, O., et al. Comparison of Osteogenic Ability of Rat Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow, Periosteum and Adipose Tissue. Calcif Tissue Int. 82, 238-247 (2008).
  25. Hong, H. H., Hong, A., Yen, T. H., Wang, Y. L. Potential Osteoinductive Effects of Calcitriol onthe m-RNA of Mesenchymal Stem Cells Derived from Human Alveolar Periosteum. BioMed Res Int. , Article ID 3529561 (2016).
  26. Knothe, U. R., Dolejs, S., Miller, R. M., Knothe Tate, M. L. Effects of Mechanical Loading Patterns, Bone Graft, and Proximity to Periosteum on Bone Defect Healing. J Biomech. 43, 2728-2737 (2010).
  27. McBride, S. H., Dolejs, S., Brianza, S., Knothe, U. R., Knothe Tate, M. L. Net Change in Periosteal Strain During Stance Shift Loading After Surgery Correlates to Rapid de novo Bone Generation in Critically Sized Defects. Ann Biomed Eng. 39, 1570-1581 (2011).
  28. Curtis, K. M., Aenlle, K. K., Roos, B. A., Howard, G. A. 24R,25-Dihydroxyvitamin D3 Promotes the Osteoblastic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. Mol Endocrinol. 28 (5), 644-658 (2014).
  29. Mostafa, N. Z., et al. Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells Cultured with Dexamethasone, Vitamin D3, Basic Fibroblast Growth Factor, and Bone Morphogenetic Protein-2. Connect Tissue Res. 53 (2), 117-131 (2012).
  30. Sun, Y., Yang, X., Li, F., Dou, Z. Study on Differentiation of Embryonic Stem Cells into Osteoblast in vitro Inducing by 1,25(OH)2VD3. Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi. 22 (9), 1117-1120 (2008).
  31. Ishii, M., Koike, C., Igarashi, A., et al. Molecular Markers Distinguish Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells from Fibroblasts. Biochem Biophys Res Commun. 332, 297-303 (2005).
  32. Maund, S. L., Barclay, W. W., Hover, L. D., et al. Interleukin-1α Mediates the Antiproliferative Effects of 1,25-Dihydroxyvitamin D3 in Prostate Progenitor/Stem Cells. Cancer Res. 71, 5276-5286 (2011).
  33. Mitrano, T. I., Grob, M. S., Carrión, F., Nova-Lamperti, E., Luz, P. A., Fierro, F. S., Quintero, A., Chaparro, A., Sanz, A. Culture and Characterization of Mesenchymal Stem Cells From Human Gingival Tissue. J Periodontol. 81 (6), 917-925 (2010).
  34. Curtis, K. M., Aenlle, K. K., Roos, B. A., Howard, G. A. 24R,25-Dihydroxyvitamin D3 Promotes the Osteoblastic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. Mol Endocrinol. 28, 644-658 (2014).
  35. Ippolito, G., Schiller, P. C., Ricordi, C., Roos, B. A., Howard, G. A. Age Related Osteogenic Potential of Mesenchymal Stromal Stem Cells from Human Vertebral Bone Marrow. J Bone Miner Res. 14, 1115-1122 (1999).
  36. D'Stucki, U., et al. Temporal and Local Appearance of Alkaline Phosphatase Activity in Early Stages of Guided Bone Regeneration. A Descriptive Histochemical Study in Humans. Clin Oral Implants Res. 12, 121-127 (2001).
  37. Caplan, A. I., Bruder, S. P. Mesenchymal stem cells: building blocks for molecular medicine in the 21st century. Trends Mol Med. 7, 259-264 (2001).
  38. Knothe Tate, M. L., Falls, T., McBride, S. H., Atit, R., Knothe, U. R. Mechanical Modulation of Osteochondroprogenitor Cell Fate. Int J Biochem Cell Biol. 40, 2720-2738 (2008).
  39. Yoshimura, H., Muneta, T., Nimura, A., Yokoyama, A., Koga, H., Sekiya, I. Comparison of Rat Mesenchymal Stem Cells Derived from Bone Marrow, Synovium, Periosteum, Adipose Tissue, and Muscle. Cell Tissue Res. 327, 449-462 (2007).
  40. Tanaka, H., Ogasa, H., Barnes, J., Liang, C. T. Actions of bFGF on Mitogenic Activity and Lineage Expression in Rat Osteoprogenitor Cells: Effect of Age. Mol Cell Endocrinol. 150, 1-10 (1999).
  41. Zhou, S., et al. Clinical characteristics influence in vitro action of 1,25-dihydroxyvitamin D(3) in human marrow stromal cells. J Bone Miner Res. 27 (9), 1992-2000 (1992).
  42. Pittenger, M. F., et al. Multilineage Potential of Adult Human Mesenchymal Stem Cells. Science. 284, 143-147 (1999).
  43. Jørgensen, N. R., Henriksen, Z., Sorensen, O. H., Civitelli, R. Dexamethasone, BMP-2, and 1,25-dihydroxyvitamin D enhance a more differentiated osteoblast phenotype: validation of an in vitro model for human bone marrow-derived primary osteoblasts. Steroids. 69, 219-226 (2004).
  44. Khanna-Jain, R., et al. Vitamin D(3) Metabolites Induce Osteogenic Differentiation in Human Dental Pulp and Human Dental Follicle Cells. J Steroid BiochemMol Biol. 122 (3), 133-141 (2010).
  45. Lee, J. H., O'Keefe, J. H., Bell, D., Hensrud, D. D., Holick, M. F. Vitamin D Deficiency an Important, Common, and Easily Treatable Cardiovascular Risk Factor? J Am Coll Cardiol. 52, 1949-1956 (2008).
  46. Liu, P., Oyajobi, B. O., Russell, R. G., Scutt, A. Regulation of osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells: interaction between transforming growth factor-beta and 1,25(OH)(2) vitamin D(3) In vitro. Calcif Tissue Int. 65 (2), 173-180 (1999).
  47. Beresford, J. N., Gallagher, J. A., Russell, R. G. G. 1,25-Dihydroxyvitamin D3 and Human Bone-Derived Cells In Vitro: Effects on Alkaline Phosphatase, Type I Collagen and Proliferation. Endocrinology. 119, 1776-1785 (1986).
  48. Price, P. A., Baukol, S. A. 1,25-Dihydroxyvitamin D3 Increases Synthesis of the Vitamin K-Dependent Bone Protein by Osteosarcoma Cells. J Biol Chem. 255, 11660-11663 (1986).
  49. Kawase, T., Oguro, A. Granulocyte Colony-Stimulating Factor Synergistically Augments 1, 25-Dihydroxyvitamin D3-Induced Monocytic Differentiation in Murine Bone Marrow Cell Cultures. Horm Metab Res. 36, 445-452 (2004).
  50. Fujisawa, R., Tamura, M. Acidic Bone Matrix Proteins and Their Roles in Calcification. Front Biosci. (Landmark Ed). 17, 1891-1903 (2012).
  51. van Driel, M., et al. Evidence that Both 1α,25 Dihydroxyvitamin D3 and 24-Hydroxylated D3 Enhance HuMan Osteoblast Differentiation and Mineralization. J Cell Biochem. 99, 922-935 (2006).
  52. Atkins, G. J., et al. Metabolism of Vitamin D3 in Human Osteoblasts: Evidence for Autocrine and Paracrine Activities of 1 α ,25-Dihydroxyvitamin D3. Bone. 40, 1517-1528 (2007).
  53. Kerner, S. A., Scott, R. A., Pike, J. W. Sequence Elements in the Human Osteocalcin Gene Confer Basal Activation and Inducible Response to Hormonal Vitamin D3. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4455-4459 (1989).
  54. Viereck, V., et al. Differential Regulation of Cbfa1/Runx2 and Osteocalcin Gene Expression by Vitamin-D3, Dexamethasone, and Local Growth Factors in Primary Human Osteoblasts. J Cell Biochem. 86, 348-356 (2002).
  55. Shi, X., et al. In-vitro osteogenesis of synovium stem cells induced by controlled release of bisphosphate additives from microspherical mesoporous silica composite. Biomaterials. 30, 3996-4005 (2009).
  56. Sakaguchi, Y., Sekiya, I., Yagishita, K., Muneta, T. Comparison of Human Stem Cells Derived from Various Mesenchymal Tissues: Superiority of Synovium as a Cell Source. Arthritis Rheum. 52, 2521-2529 (2005).

Tags

Биоинженерия выпуск 135 альвеолярного надкостницы мезенхимальных стволовых клеток 1,25-(OH)2D3 витамин D3 кальцитриол надкостницы
Изоляция мезенхимальных стволовых клеток человека надкостницей альвеолярного и эффекты витамина d на Остеогенные активность клеток, надкостницы, полученных
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, Y. L., Hong, A., Yen, T. H.,… More

Wang, Y. L., Hong, A., Yen, T. H., Hong, H. H. Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells. J. Vis. Exp. (135), e57166, doi:10.3791/57166 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter