Summary
Planarian Schmidtea התיכון ונמצא היא דוגמנית מעולה ללימוד בתאי גזע והתחדשות רקמות. פרסום זה מתאר שיטה להסרת איבר אחד, הלוע, באופן סלקטיבי על ידי חשיפת לבעלי חיים אזיד הנתרן כימי. פרוטוקול זה גם מתאר שיטות לניטור הלוע התחדשות.
Abstract
Planarians הם תולעים שטוחות כי הם מאוד יעילים התחדשות. הם חייבים את היכולת הזאת מספר גדול של תאי גזע יכולים להגיב במהירות לכל סוג של פגיעה. דגמים נפוצים פגיעה בבעלי חיים אלה להסיר כמויות גדולות של רקמות, אשר פוגעת באיברים רבים. כדי להתגבר על הנזק רקמות רחב, נתאר כאן שיטה להוציא איבר יחיד, הלוע, planarian Schmidtea התיכון ונמצאבאופן סלקטיבי. נוכל להשיג זאת על ידי השריית החיות בתמיסה המכילה את אזיד הנתרן מעכב ציטוכרום אוקסידאז. חשיפה קצרה אזיד הנתרן גורמת ההבלטה של הלוע של החיה, שאנו מכנים "כימי קטיעה." קטיעה כימי מסיר הלוע כולו, ויוצרת פצע קטן שבו הלוע מייחסת המעי. לאחר שטיפה נרחב, כל החיות הקטוע להתחדש הלוע באופן תקין לחלוטין בעוד כשבוע. תאי גזע בשאר חלקי הגוף כונן התחדשות של הלוע החדש. כאן, אנו מספקים מפורטת פרוטוקול עבור קטיעה כימי, ולתאר היסטולוגית והתנהגותיים שיטות להערכת קטיעה מוצלחת והתחדשות.
Introduction
התחדשות היא תופעה המתרחשת בכל רחבי ממלכת החי, עם יכולות משובי החל גוף מלא התחדשות של חסרי חוליות מסוימים ליכולות מוגבל יותר חוליות1. החלפת רקמות פונקציונלי הוא תהליך מורכב, לעתים קרובות כרוך שיקום בו זמנית של מספר סוגי תאים. לדוגמה, לחדש את האיבר סלמנדרה תאי העצם, chondrocytes, נוירונים, השרירים, לתאי האפיתל צריך להיות מוחלף2. אלה סוגי תאים החדש שנוצר גם צריך להיות מאורגן כראוי כדי להקל על תפקוד האיבר החדש. הבנת התהליכים המורכבים האלה דורשת טכניקות להתמקד התחדשות של סוגי תאים מסוים ואת השתלבותם איברים.
אחת האסטרטגיות מועסק כדי לפשט את המחקר של תגובות רגנרטיבית היא אבלציה יישוב של או תא סוגים מסוימים או אוספים גדולים של רקמות. לדוגמה, בדג זברה, ביטוי של nitroreductase סוגי תאים ספציפיים שמוביל את ההרס שלהם לאחר היישום של מטרונידזול3,4. בדרוזופילה הזחלים, ביטוי גנים פרו-אפופטוטיים להיפגע תחת היזמים רקמות ספציפיות יכול באופן סלקטיבי ablate אזורים ספציפיים של דמותי דיסק5,6. של אסטרטגיות אלו גורמים נזק מהיר אך מבוקרת, והן שימשו כדי לנתח את המנגנונים המולקולריים הסלולר אחראי על התחדשות.
כתב יד זה, אנו מתארים שיטה באופן סלקטיבי ablate איבר שלם שנקרא הלוע planarian התיכון ונמצא Schmidtea. Planarians הם מודל קלאסי של התחדשות, ידועה פורה הרגנרציה שלהם, שבו שברי אפילו דקה ניתן לשחזר חיות כל 7,8. יש להם אוכלוסיה גדולה, הטרוגניות של תאי גזע המורכב תאים pluripotent והן מוגבלת לשושלת אבות9,10,11. תאים אלה להתרבות, להבדיל להחלפת רקמות חסרות כל, כולל את הלוע, מערכות עצבים, עיכול, excretory, שרירים ו בתאי אפיתל9,10,12. בזמן שאנו יודעים כי אלה בתאי גזע ליזום התחדשות, נעשה לא לגמרי להבין את המנגנונים המולקולריים להסיע אותם כדי להחליף את כל סוגי התאים הללו. שיטות ופצעו מוגדרת זה להפיק תאי גזע מדויק תגובות יכול לעזור ניסחו את התהליך המורכב הזה.
הלוע הוא צינור גדול, גלילי הדרושים עבור האכלה, מכיל נוירונים, שריר, תאי אפיתל, הפרשה13,29. בדרך כלל מוסתרים בתוך תיק. על הצד הבטני של החיה, זה מרחיב דרך גוף יחיד החיה פתיחה על חישת הנוכחות של מזון. כדי לקטוע באופן סלקטיבי הלוע, אנחנו להשרות planarians אזיד הנתרן שנקרא כימי, הרדמה נפוץ ב- C. elegans14,15,16. השימוש בו planarians דווחה לראשונה על ידי אדלר et al., ב- 201412. תוך דקות של חשיפה אזיד הנתרן, planarians ' הבלטת ממד ' pharynges שלהם, עם עצבנות עדין, הלוע לניתוק מהחיה. אנחנו מתייחסים לירידה זו בררני ושלמה של הלוע כמו "קטיעה כימי". שבוע לאחר קטיעה, הלוע תקינים הוא משוחזר12. מאחר הלוע נדרש האכלה, התחדשות פונקציונלי נמדד על ידי פיקוח על התנהגות האכילה. בהמשך נתאר את הפרוטוקול על קטיעה כימיים ועל הערכת לרגנרציה של הלוע ושיקום של האכלה התנהגות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנה
-
הכנת planaria מים 17
- לשמור על planarians בפתרון מלח 1 X Montjuïc. כדי להכין planarian מים, ליצור פתרונות ייחודיים מניות של 1 מ' CaCl2, 1 מ' MgSO4, M MgCl 12, 1 מ' אשלגן ו- 5 M NaCl במים הנדסה גנטית. מסנן-לחטא עם בקבוק-העליון filterfor 0.2 µm לאחסון לטווח ארוך.
הערה: השתמש רק מים יונים הנדסה גנטית (עם resistivity של MΩ 18.2 25 ° c) כדי להכין מונז'ואיק מלחים. - כדי להכין מלאי 1 ליטר של תמיסת מלח 5 X, לשלב 5 מיליליטר CaCl 1 מ'2, 5 מ של MgSO 1 מ'4, 0.5 מ של MgCl2, 0.5 מ"ל של אשלגן כלורי ו- 1.6 מ של 5 מ' פתרונות NaCl ב 900 מל מים הנדסה גנטית. לפתרון זה, להוסיף 0.504 גר' NaHCO3 ומערבבים לערבב. להתאים את ה-pH אל 7.0 עם חומצת מלח.
- לדלל הזה 5 X מניות לפתרון 1 X ריכוז בעבודה במים הנדסה גנטית במיכל סטרילי כגון carboy קיבולת גבוהה (ראה את הטבלה של חומרים). השתמש הפתרון X 1 עבור שמירה על planarians אל-זוויגית.
הערה: כחלופה תמיסת מלח (montjuïc), השתמש מעיין נרכש באופן מקומי או הנדסה גנטית מים המכילים מלח אקווריום זמינים מסחרית לערבב (ראה טבלה של חומרים) ריכוז of0.5 g/L18. - כדי למנוע זיהום חיידקי תרבות סטטי19, לשמור על planarians במים המכיל אנטיביוטיקה. להכין 50 מ"ג למ"ל פתרון מניות של גנטמיצין סולפט במים הנדסה גנטית, לעקר את המסנן. כדי מכולות שבו נשמרים חיות, להוסיף גנטמיצין סולפט ריכוז סופי של 50 µg/mL (דילול 1:1000).
- לשמור על planarians בפתרון מלח 1 X Montjuïc. כדי להכין planarian מים, ליצור פתרונות ייחודיים מניות של 1 מ' CaCl2, 1 מ' MgSO4, M MgCl 12, 1 מ' אשלגן ו- 5 M NaCl במים הנדסה גנטית. מסנן-לחטא עם בקבוק-העליון filterfor 0.2 µm לאחסון לטווח ארוך.
-
הכנת ממרח כבד
- כפי planarians לשגשג על דיאטה של אורגנית, דשא-fed כבד בקר, לרכוש הכבד טריים, תהליך בתוך 24h. להסיר את הקפסולה עלי הלוואי קרומיים לבצע את הכבד על ידי מתקלפת אותו בעדינות. חותכים את הכבד לקוביות ~ 1 ס"מ, והשתמש להב כדי לגרד את ולמחוק כל הכבד ורידים, עורקים.
- Macerate חתיכות הכבד באמצעות מפעל מזון או מעבד מזון ולאחר מכן להעביר אותו דרך מסננת תיל רשת מזון. לשלב לתוך שקיות זילוף, לוותר על מזרקים או צלחות פטרי 35 מ מ. לפני האכלה, צנטריפוגה בעדינות כדי להסיר בועות אוויר.
- חנות aliquots של הכבד ב-80 מעלות צלזיוס במשך עד שנה להפשיר לפני השימוש. לאחר מפשיר, מחדש להקפיא את כל שאריות מכבד פעם אחת, או לאחסן ב 4 ° C עבור עד 24 שעות.
-
אחזקה של בעלי חיים
- Planarians לגדול, לכווץ כדי בגדלים שונים בהתאם תדירות האכלה. להאכיל planarians בכל שבוע (פעם ימים 14). לשימוש לטווח ארוך תרבויות בתפזורת, מיכלי פלסטיק בגדלים שונים (ראה טבלה של חומרים).
- להאכיל חיות, להשתמש של מרית מתכת או פלסטיק העברה pipet כדי למקם ירידה בגודל אפונה של הכבד בתוך קופסה. מאפשרים לבעלי לאכול במשך 1-2 ה מזון הנותרות הסר לפני ניקוי תיבת.
- מנקה תולעים פעמיים בשבוע אם מוזן (פעם ישירות לאחר האכלה, פעם יומיים לאחר מכן), או פעם בשבוע אם לא מוזנים. כדי לנקות, לנקז מים לתוך גביע פלסטיק על ידי בקפידה זורמים החוצה את המים תוך שמירה על planarians בתיבה. למחוק תיבת משטח עם מגבת נייר ולאחר מכן חזור מכל הצדדים עד התיבה תהיה נקייה.
- להחליף מים (כ ¾ תיבת האחסון) ולהוסיף גנטמיצין ריכוז סופי של 50 µg/mL. חנות חיות בארון חשוך או חממה של 20 ° C.
-
הבחירה של תולעים
- בחר תולעים מוזנים 5-7 ימים מראש.
הערה: . זה משמעותי יותר קשה לקטוע pharynges של תולעים יש לאחרונה הואכלו (1-2 ימים לפני קטיעה). הפדרציה בעלי החיים גם יותר רגישים אזיד הנתרן. - בחר תולעים הנמצאים בערך 6 מ מ אורך. כדי להעריך את הגודל של התולעת, להעביר אותו צלחת פטרי באמצעות פיפטה של העברת פלסטיק. במקום שטוח 6 - ב הסרגל או נייר גרף 5 מ מ x 5 מ מ מתחת הפטרי, למדוד את אורך תולעת בזמן זה זוחל.
הערה: תולעים קטנות יותר מ- 6 מ מ אורך קשים יותר כדי לכרות.
- בחר תולעים מוזנים 5-7 ימים מראש.
-
הכנת אזיד הנתרן
- להכין פתרון 100 מ מ על ידי המסת אבקה אזיד הנתרן במים planaria.
התראה: אזיד הנתרן הוא רעיל, צריך להיות מטופל בקפידה. אל תמחק אזיד הנתרן ירדו לטמיון. בעקבות שימוש, לאסוף אותה בנפרד עבור סילוק ככל פסולת מסוכנת.
- להכין פתרון 100 מ מ על ידי המסת אבקה אזיד הנתרן במים planaria.
2. הלוע קטיעה
- המקום תולעים בקוטר 35 מ מ פטרי. הסר בזהירות כל המים planarian מן המנה באמצעות pipet של העברת פלסטיק.
הערה: מקסימום של 20 מ מ 6 תולעים ניתן לאכלס בנוחות בקערה בגודל זה. - מקם את הכלי מתחת למיקרוסקופ ולהתאים ההגדלה כך שניתן להציג תולעים מרובים בו-זמנית (למשל 10 X הגדלה). להחליף מים planarian פתרון אזיד הנתרן 100 מ מ.
הערה: על צלחת פטרי 35 מ מ, כ- 5 מ של אזיד הנתרן מספיקה. הפתרון צריך להטביע לחלוטין planarians. התאם פתרון אחסון עבור מנות גדולות יותר לפי הצורך. - לפקח על החיות תחת מיקרוסקופ להימנע מלעבור את המנה למשך דקות הראשונות 3-4.
- להתבונן ההבלטה של הלוע מבעד למיקרוסקופ; הלוע בולטות מהתיק לועי ולהרחיב באופן מלא (כ 1 מ מ אורך) כפי שמוצג באיור 1B.
הערה: חשוב להמתין עד הלוע סיים את הרחבת לחלוטין לפני שתמשיך עוד יותר. ברגע הלוע מגיח החיה, בשליפה מלאה לוקח בערך 1 דקות. - השתמש pipet העברת פלסטיק להשפריץ חיות סביב המנה. למצוץ את החיות לתוך pipet, בכפייה לשחרר אותם לתוך קערה כמה פעמים. אם הלוע מוארך, pipetting נמרצת הזה יגרום לנתק.
- לחלופין, לאחוז הלוע או אנכית לאורכו, או אופקית לאורך ההיקף שלה באמצעות זוג מלקחיים בסדר (ראה טבלה של חומרים) כפי שמוצג באיור 1C. עם הלוע צבט ב המלקחיים, הרם את החיה כלפי מעלה לכיוון מניסקוס. כמו החיה מוגבה, מתח תגרום הלוע להתנתק מן החיה.
הערה: בשיטה זו ניתן להשתמש כדי להסיר את pharynges של חיות קטנות יותר (1-3 מ מ אורך) שבהם מתערבל כוחני אינה נאותה. הימנע לדקור או אחרת ופצעו את הגופה של החיה. - שימוש pipet העברה, להעביר חיות הקטוע תבשיל חדש המכיל מים טריים planaria.
- ברגע הועבר, לשטוף חיות הקטוע ביסודיות במים planaria, החלפת לחלוטין את המים שלוש פעמים. העברה תבשיל חדש המכיל מים planaria עם 50µg/mL של גנטמיצין.
הערה: מלאה מאגר exchange במהלך שלושה שוטף אלה היא חיונית כדי להבטיח הסרה של אזיד הנתרן. - למחרת, להחליף מים בצלחת מים planaria טריים המכילים 50 µg/mL של גנטמיצין. חזור על כל יומיים לאחר מכן.
3. הערכה של הסרת הלוע לאחר קטיעה
- בדוק חיות תחת מיקרוסקופ (עם 10-20 X הגדלה) כדי לקבוע אם בנקודה כהה הופיעה לאחר הסרה מוצלחת של הלוע, כפי שמוצג באיור 2A.
- לחלופין, לתקן, אקונומיקה חיות לפי הפרוטוקול המתואר על ידי פירסון. et al. 20. חיות להשרות למשך הלילה 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) או מצומדת fluorescently streptavidin (1 מ"ג/מ"ל מדולל שבערך 1 X Buffered פוספט תמיסת מלח המכיל 0.3% טריטון-X). הר חיות על שקופיות ב- 80% glycerol/20% 1-פוספט Buffered תמיסת מלח ותמונה תחת stereomicroscope פלורסנט (איור 2B).
הערה: כל התמונות כתב יד זה נתפסת של stereomicroscope פלורסנט עם יעד X 1.0.
4. הערכה של התחדשות הלוע על ידי מדידת האכלה התנהגות
-
הכנת הכבד
- להעביר את הכמות הנדרשת של ממרח כבד microcentrifuge או צינור חרוטי. ספין בקצרה כדי להסיר בועות אוויר. להעריך את עוצמת הקול של הכבד, ולאחר מכן להוסיף מים planaria 1/5 של הנפח שלה, ו- 2% מהנפח הכולל של צבע מאכל אדום. לדוגמה, כדי 1000 µL של הכבד להדביק, הוסף 200 µL מים planaria ו- µL 24 של צבע מאכל.
- באמצעות שהעקב פלסטיק, פיפטה עצה או מרית מתכת, מערבבים ביסודיות עד צבע מאכל מופץ באופן שווה העיסה בכבד. ספין שוב בקצרה. ממרח כבד יכול להיות מאוחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה או קפוא aliquots ב-80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך.
- אם בדיקות חיות עד 25, להכין µL 25 של ממרח כבד לכל מאכל (כ 1 µL של ממרח כבד לכל חיה).
-
האכלת בעלי חיים
- שבעה ימים לאחר קטיעה כימי, העברת בעלי חיים צלחת פטרי חדש. אם בדיקות 10-15 חיות, השתמש תבשיל 35 מ מ; יותר מ- 15 חיות צריך להיבדק בצלוחית 60 מ מ. להשאיר בעלי חיים באפלה, ללא הפרעה, עבור 1 h לפני האכלה.
- בעזרת מספריים, להגדיל את הרוחב של קצה פיפטה P200 באמצעות קיטום בערך ½ ס מ ליד הקצה הצר. Pipet 25 µL של דבק אדום כבד לתוך קערה.
הערה: זמירה הסוף גורם pipetting העיסה כבד צמיגה יותר קל. כדי למנוע את הכבד צף על פני השטח, לגעת בקצה לתחתית של המנה תוך dispensing. - מאפשרים לבעלי להאכיל למשך 30 דקות.
- ציון המספר של בעלי חיים, כי אכלו על-ידי הצבת החיות על רקע לבן או בחינת אותם תחת מיקרוסקופ עם 10-20 X הגדלה.
- לאחר האכלה, להסיר את הכבד של המנה ולנקות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
חשיפה אזיד הנתרן משבש תנועתיות רגיל planarians, גורם חיות למתוח מתפתלים. תנועות אלה כוח הלוע לצאת מן הצד הבטני של החיה, לאחר כ 6 דקות בתמיסה אזיד הנתרן, ניתן לראות את קצה לבן הלוע (איור 1B-פאנל שמאלי). כמה דקות מאוחר יותר, בעלי חיים פעיל חוזה ולהרחיב מלא הלוע על ידי בכוח דוחף אותו אל מחוץ לגוף. (איור 1B-לוח האמצעי). כ 11 דקות לאחר החשיפה אזיד, החיות, הלוע להירגע. בשלב זה, צורת פעמון האופיינית של הלוע הוא נראה בבירור (איור 1B-לוח נכון). על קטיעה קל, חשוב להמתין הלוע להירגע.
מכיוון הלוע הוא גדול, unpigmented מסה של רקמה, הסרתו תוצאות במראה של נקודה שחורה בצד הגבי של חיות הקטוע (איור 2 א). האזור החשוך הזה הוא מחוון חזותי של קטיעה מוצלחת בבעלי חיים. הנקודה היא לעין מיד לאחר קטיעה והופך להיות בולטים יותר למחרת. כפי הלוע מחדש, אזור זה מבהיר. כדי לפקח על התחדשות הלוע בצורה מדויקת יותר, בעלי חיים יכול להיות צבעונית עם דאפי או מצומדת fluorescently streptavidin בין לילה (איור 2B). באופן כמותי, כדי להעריך את היקף הלוע התחדשות באזור שלה ניתן למדוד באמצעות תוכנת ImageJ.
הלוע הוא איבר חיוני עבור בליעה chemosensation ואוכל. כדי לקבוע מתי פונקציות אלה ישוחזרו במהלך התחדשות, השתמשנו מבחני האכלה לעקוב אחר התנהגות בעלי חיים. על ידי שילוב מאכל עם ממרח כבד, היינו מסוגלים להבחין חיות שאכל מן אלו לא (איור 3 א). אנחנו מכן לכמת את מספר החיות אדום כדי להעריך את האחוז של בעלי חיים הלוע פונקציונלי. בהתבסס על תוצאות שמוצג באיור 3B, התנהגות האכילה מוצלחת שוחזר 7 ימים לאחר קטיעה, המציין כי שבוע לאחר הסרת הלוע, חיות חידש הלוע פונקציונלי. כדי לבדוק אם החשיפה אזיד הנתרן מושפעות התנהגות האכילה, אנחנו טבולים בעלי חיים אזיד הנתרן אבל שטף את זה מייד לפני הפליטה הלוע. יום אחד מאוחר יותר, אנו מוערכים אם שמחפש אוכל שונה על ידי חשיפה אזיד הנתרן עם האכלה וזמינותו. בניגוד חיות קטעו כימי חסר של הלוע, כל החיות שמירה של הלוע ללא פגע לאחר חשיפה אזיד הנתרן אכל (n = 30 חיות עבור כל תנאי) האוכל. תוצאה זו עולה כי חשיפה אזיד הנתרן אינה משפיעה על התנהגות האכילה, כל עוד הלוע נותר ללא פגע.
איור 1 . הלוע הפליטה, קטיעה. תיאור סכמטי של אנטומיה planarian (א) . (B) תמונות של בעלי חיים מציג הלוע הוצאה לספוג את אזיד הנתרן 100 מ מ. חצים אדומים לסמן את הלוע. גודל ברים = 750 מיקרומטר. (ג) התמונה של החי (משמאל) ו- (מימין) סכמטית קטיעה באמצעות מלקחיים. לוחות הצג שתי אפשרויות שונות עבור כשתפסת הלוע. צד הגחון של החיה פונה. גודל ברים = 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . הערכה של קטיעה הלוע והתחדשות. (א) נציג תמונות של בעלי חיים-שצוין פעמים לפני ואחרי קטיעה. בחלונית האמצעית מראה הכתם האפל באזור הקאה לאחר קטיעה, מודגשת על ידי לבנה מקווקו. בצד הגבי פונה. גודל ברים = 500 מיקרומטר. (B) נציג תמונות של חיות מוכתם Alexa488-streptavidin-שצוין פעמים לפני ואחרי קטיעה. בחלונית האמצעית מראה היעדר הלוע לאחר קטיעה. אזור לועי מודגשת על ידי לבנה. הגחון צד פונה. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3. הערכה של התחדשות הלוע. (א) תמונות, מפרטים טכניים של האכלה assay, שנערך על ידי הצבת µl 25 של הכבד במרכז של 60 מ מ פטרי. מפרטים טכניים (למעלה, משמאל), תמונה (באמצע) הצג האכלה התנהגות בבעלי חיים עם pharynges ללא פגע. נכון, תמונה עליונה של חיה זה אכל. מפרטים טכניים (משמאל למטה), תמונה (באמצע) של האכלה התנהגות בבעלי חיים 1 יום לאחר קטיעה. התחתון צודק, החיה לא אכל. סרגל קנה מידה = 750 מיקרומטר. תוצאות (B) של האכלה וזמינותו. אחוז בעלי חיים כי יש עליו לבלוע מזון (לכמת על ידי צבע אדום) במועדים ספציפיים לאחר קטיעה. עבור כל נקודת זמן, n = 10 חיות, חזר על דולר. קו שגיאה = SD. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר שיטה של אבלציה סלקטיבי של הלוע באמצעות אזיד הנתרן. מחקרים אחרים אבלציה יישוב ב- planarians השתמשו ניתוח שונה כדי להסיר photoreceptors21 או טיפול תרופתי כדי ablate נוירונים דופאמין22. יתרון משמעותי אחד של קטיעה כימי על שיטות קיימות היא כי זה אינו מחייב ניתוח. מבנה נוקשה של הלוע בהשוואה לשאר הגוף planarian מקלה על שלה הסרה מלאה של החיה, אשר הרבה גוף רך. כמו כן, הלוע לניתוק מן החיה צומת קטן (הוושט)30 מצטרף הלוע, המעי, יצירת פצע לשחזור יותר מאשר אחד הנגרם על ידי כלי כירורגי גדול יותר. בהתבסס על סגולות ועל קטן אנטומי הצמדה לכל שאר החיות, הלוע להסרת ולכן יוצר פצעים הומוגנית יותר כריתות כירורגיות אחרות.
משך חשיפה אזיד הנתרן חיוני גם להצלחת בטכניקה זו. למרות חשיפה קצרה אזיד הנתרן לא משפיע לרעה על planarians, חשיפה ממושכת הוא רעיל, בסופו של דבר להרוג בעלי חיים. אזיד הנתרן ידוע לעכב תהליכים תלויי-אנרגיה באמצעות עיכוב של ציטוכרום אוקסידאז23,24. בנוסף, מדכאת תמלול ותרגום, סביר על ידי הצטברות של רכיבי מפתח של תגובות אלו גרגרי מתח25. ב- planarians, חשיפה אזיד הנתרן העלמת מיטוזה במשך 24 שעות, לאחר מכן לחדש תאים התפשטות12. שינויים כגון הגבלת הזמן של אזיד חשיפה, הסרת אזיד עם שטיפה יסודית, חשבונאות לדיכוי mitotic ארעי בהתווית יכול לעזור להתגבר על מגבלות אלה.
המיקום האנטומי הייחודי של הלוע בין סימטריה מוקדית האופיינית שלה מאפשרים ההבחנה קלה לאחרונה מחדש לועי רקמות מתאי גזע הקיימת מראש. הלוע התחדשות ניתן לנטר ברמות אנטומי או סלולרית באמצעות רקמות כתמים כמו streptavidin ודאפי, אימונוהיסטוכימיה, או על-ידי בחיי עיר הכלאה26. האכלה וזמינותו המתוארים כאן מבחני התחדשות פונקציונלי של הלוע. כימוטקסיס מזון דורש את הלוע27,28 , בעלי חיים ללא הלוע מתפקדת במלואה לא יכול לבלוע מזון. זה פשוט, כמותיים הערכת תפקוד האיברים משלים ולכן התחדשות מבנית. בנוסף, קטיעה כימי יכול להתבצע על אוכלוסיות של חיות, יכול ליצור בעלי חיים רבים עם פציעות זהים. ההליך ולכן נוח עבור מחקרים בקנה מידה גדול. יתרונות אלו, בשילוב עם העובדה כי חידוש הלוע בוגר דורש תאי גזע, הופך את הלוע קטיעה מודל אידיאלי ללמוד עוגב התחדשות. משתמשים בה בשילוב עם קטיעות רחבה יותר, ניתן להשתמש להסרת הלוע לבחון השערות לגבי איך גודל הפצע ואת מיקום אנטומי להשפיע את תאי הגזע בתגובה לפציעה, שהיא שאלה מפתח התחדשות שדה21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות אלחנדרו Sánchez אלברדו, שתמכו את אופטימיזציה הראשונית והפיתוח של טכניקה זו. העבודה במעבדה של קרולין אדלר נתמך על ידי אוניברסיטת קורנל ראשונית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2) | Fisher Chemical | C79-3 | Montjuïc salt solution |
| Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4) | Fisher Chemical | M65-3 | Montjuïc salt solution |
| Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2) | Acros/VWR | 41341-5000 | Montjuïc salt solution |
| Potassium Chloride (KCl) | Acros Organics/VWR | 196770010 | Montjuïc salt solution |
| Sodium Chloride (NaCl) | Acros Organics/VWR | 207790050 | Montjuïc salt solution |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Acros Organics/VWR | 123360010 | Montjuïc salt solution |
| Nalgene autoclavable polypropylene copolymer lowboy with spigot | ThermoFisher Scientific/VWR | 2324-0015 | Storing planaria water |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands | Amazon | Planaria water |
| Gentamicin Sulfate | Gemini Bio-products | 400-100P | Planaria water |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 71970 | Mincing liver |
| Disposable pastry bags-16”, 12 pack | Wilton | Amazon | Liver aliquots |
| 5 mL syringes | BD/VWR | 309647 | Liver aliquots |
| Petri dishes-35mm/60mm | Greiner Bio-One/VWR | 82050-536/82050-544 | |
| Plastic containers (various sizes) | Ziploc | Amazon | Housing planarians in static culture |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Transfer pipette | Globe Scientific | 138030 | |
| Forceps - Dumont Tweezer, Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D (0203-5-PO) | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62247 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher | S11223 | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-1 |
References
- Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Dev. Cell. 21, 172-185 (2011).
- Tanaka, E. M. The Molecular and Cellular Choreography of Appendage Regeneration. Cell. 165, 1598-1608 (2016).
- Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat. Protoc. 3, 948-954 (2008).
- White, D. T., Mumm, J. S. The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish. Methods. 62, 232-240 (2013).
- Smith-Bolton, R. K., Worley, M. I., Kanda, H., Hariharan, I. K. Regenerative growth in Drosophila imaginal discs is regulated by Wingless and Myc. Dev. Cell. 16, 797-809 (2009).
- Smith-Bolton, R. Drosophila Imaginal Discs as a Model of Epithelial Wound Repair and Regeneration. Adv. Wound Care. 5, 251-261 (2016).
- Newmark, P. A., Sánchez Alvarado, A. Not your father's planarian: a classic model enters the era of functional genomics. Nat. Rev. Genet. 3, 210-219 (2002).
- Reddien, P. W., Sánchez Alvarado, A. Fundamentals of planarian regeneration. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 20, 725-757 (2004).
- Wagner, D. E., Wang, I. E., Reddien, P. W. Clonogenic neoblasts are pluripotent adult stem cells that underlie planarian regeneration. Science. 332, 811-816 (2011).
- Scimone, M. L., Kravarik, K. M., Lapan, S. W., Reddien, P. W. Neoblast specialization in regeneration of the planarian Schmidtea mediterranea. Stem Cell Reports. 3, 339-352 (2014).
- van Wolfswinkel, J. C., Wagner, D. E., Reddien, P. W. Single-cell analysis reveals functionally distinct classes within the planarian stem cell compartment. Cell Stem Cell. 15, 326-339 (2014).
- Adler, C. E., Seidel, C. W., McKinney, S. A., Sánchez Alvarado, A. Selective amputation of the pharynx identifies a FoxA-dependent regeneration program in planaria. Elife. 3, e02238 (2014).
- Adler, C. E., Sánchez Alvarado, A. PHRED-1 is a divergent neurexin-1 homolog that organizes muscle fibers and patterns organs during regeneration. Dev. Biol. 427, 165-175 (2017).
- Wong, M. C., Martynovsky, M., Schwarzbauer, J. E. Analysis of cell migration using Caenorhabditis elegans as a model system. Methods Mol. Biol. 769, 233-247 (2011).
- Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C elegans chemotaxis assay. J. Vis. Exp. , e50069 (2013).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 177 (2012).
- Tasaki, J., Uchiyama-Tasaki, C., Rouhana, L. Analysis of Stem Cell Motility In Vivo Based on Immunodetection of Planarian Neoblasts and Tracing of BrdU-Labeled Cells After Partial Irradiation. Methods Mol. Biol. 1365, 323-338 (2016).
- Roberts-Galbraith, R. H., Brubacher, J. L., Newmark, P. A. A functional genomics screen in planarians reveals regulators of whole-brain regeneration. Elife. 5, (2016).
- Arnold, C. P., et al. Pathogenic shifts in endogenous microbiota impede tissue regeneration via distinct activation of TAK1/MKK/p38. Elife. 5, (2016).
- Pearson, B. J., et al. Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians. Dev. Dyn. 238, 443-450 (2009).
- LoCascio, S. A., Lapan, S. W., Reddien, P. W. Eye Absence Does Not Regulate Planarian Stem Cells during Eye Regeneration. Dev. Cell. 40, 381-391 (2017).
- Nishimura, K., et al. Regeneration of dopaminergic neurons after 6-hydroxydopamine-induced lesion in planarian brain. J. Neurochem. 119, 1217-1231 (2011).
- Wilson, D. F., Chance, B. Azide inhibition of mitochondrial electron transport. I. The aerobic steady state of succinate oxidation. Biochim. Biophys. Acta. 131, 421-430 (1967).
- Duncan, H. M., Mackler, B. Electron Transport Systems of Yeast: III. Preparation and properties of cytochrome oxidase. J. Biol. Chem. 241, 1694-1697 (1966).
- Buchan, J. R., Yoon, J. H., Parker, R. Stress-specific composition, assembly and kinetics of stress granules in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Sci. 124, 228-239 (2011).
- Cebrià, F. Organization of the nervous system in the model planarian Schmidtea mediterranea: An immunocytochemical study. Neurosci. Res. 61, 375-384 (2008).
- Shimoyama, S., Inoue, T., Kashima, M., Agata, K. Multiple Neuropeptide-Coding Genes Involved in Planarian Pharynx Extension. Zoolog. Sci. 33, 311-319 (2016).
- Ito, H., Saito, Y., Watanabe, K., Orii, H. Epimorphic regeneration of the distal part of the planarian pharynx. Dev. Genes Evol. 211, 2-9 (2001).
- Bueno, D., Espinosa, L., Baguñà, J., Romero, R. Planarian pharynx regeneration in tail fragments monitored with cell-specific monoclonal antibodies. Dev. Genes Evol. 206, 425-434 (1997).
- Hyman, L. The invertebrates: Platyhelminthes and Rhynchocoela, the acoelomate Bilateria. , McGraw-Hill. (1951).
