Summary
真涡虫Schmidtea mediterranea 是研究干细胞和组织再生的优良模型。本刊物描述一种方法, 选择性地移除一个器官, 咽, 通过暴露动物的化学叠氮化钠。本议定书还概述了监测咽部再生的方法。
Abstract
三角涡虫是虫非常有效的再生。他们把这种能力归功于大量的干细胞, 这些细胞能够迅速应对任何类型的损伤。在这些动物中常见的伤害模型去除大量的组织, 损害了多个器官。为了克服这种广泛的组织损伤, 我们这里描述了一种方法, 有选择地移除一个器官, 咽, 在真涡虫Schmidtea mediterranea。我们通过在含有细胞色素氧化酶抑制剂叠氮化钠的溶液中浸泡动物来实现这一目标。对叠氮化钠的短暂接触会导致咽部从动物身上挤出, 我们称之为 "化学截肢"。化学截肢除去整个咽部, 并产生一个小伤口, 咽附着在肠道。经过广泛的冲洗, 所有被截肢的动物在大约一周内再生一个完全功能的咽。身体其他部位的干细胞驱动新咽的再生。在这里, 我们提供了一个详细的化学截肢协议, 并描述了组织学和行为方法, 以评估成功的截肢和再生。
Introduction
再生是整个动物王国发生的一种现象, 其再生能力从某些无脊椎动物的全身再生到脊椎动物的限制性能力为1。更换功能组织是一个复杂的过程, 往往需要同时恢复多种细胞类型。例如, 要再生蝾螈肢, 成骨细胞, 软骨细胞, 神经元, 肌肉和上皮细胞需要被替换为2。这些新产生的细胞类型也需要适当组织, 以促进新的肢体功能。了解这些复杂的过程需要的技术, 重点是再生的特定细胞类型和他们融入器官。
用于简化再生反应研究的策略之一是对某些细胞类型或较大的组织集合进行靶向消融。例如, 在斑马鱼中, nitroreductase 在特定细胞类型中的表达在应用甲硝唑3、4后导致其破坏。在果蝇幼虫中, 在组织特定的启动子下表达亲凋亡基因可以选择性地消融形象盘56的特定区域。这两种策略都造成了快速但受控的损伤, 并被用来解剖分子和细胞机制负责再生。
在这篇手稿中, 我们描述了一个方法, 有选择地消融整个器官称为咽在真涡虫Schmidtea mediterranea。三角涡虫是一种经典的再生模型, 以其多产的再生能力著称,其中即使是微小的碎片也能再生整个动物7, 8.它们有一个大的异构的干细胞群, 由多潜能细胞和受血统限制的祖细胞组成,9,10,11。这些细胞增殖和分化, 以取代所有缺失的组织, 包括咽, 神经, 消化系统和排泄系统, 肌肉和上皮细胞9,10,12。虽然我们知道这些干细胞开始再生, 但我们并不完全理解促使它们取代所有这些不同细胞类型的分子机制。定义的伤人方法, 使精确的干细胞反应可以帮助描绘这个复杂的过程。
咽是一个大的, 圆柱管需要喂养, 并包含神经元, 肌肉, 上皮和分泌细胞13,29。通常藏在动物腹侧的眼袋里, 在感觉到食物的存在时, 它会通过动物的单一身体开放。为了选择性地切除咽, 我们将三角涡虫浸泡在一种叫做叠氮化钠的化学物质中, 一种常用的麻醉剂,在线虫 14, 15, 16.它在三角涡虫中的使用首先由阿德勒et al 报告, 在2014年12。在接触叠氮化钠的几分钟内, 三角涡虫挤压他们的 pharynges, 并与温和的搅拌, 咽分离的动物。我们指的是这种完全和选择性的咽部 "化学截肢" 的损失。截肢后一周, 完全功能性咽部恢复为12。由于咽是需要喂养, 功能再生可以通过监测喂养行为来衡量。下面, 我们描述了化学截肢的协议, 以及评估咽部的再生和喂养行为的恢复。
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Protocol
1. 准备
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涡水的制备17
- 在1X 蒙锥山盐溶液中保持三角涡虫。要准备真涡虫水, 请在超纯水中制作1米CaCl2、1米MgSO4、1米氯化镁2、1米氯化钾和5米氯化钠的个人库存解决方案。过滤-消毒与0.2 µm 瓶顶 filterfor 长期储存。
注意:只使用超纯去离子水 (电阻率为 18.2 MΩ在25摄氏度), 以制备蒙锥山盐。 - 要准备 1 L 的5X 盐溶液的股票, 结合5毫升1米 CaCl2, 5 毫升 1 M MgSO4, 0.5 毫升氯化镁2, 0.5 毫升的氯化钾和1.6 毫升的5米氯化钠溶液在900毫升超纯水。对于此解决方案, 添加 0.504 g NaHCO3并搅拌混合。用盐酸将 pH 值调整为7.0。
- 稀释此5X 库存解决方案, 以1X 的工作浓度在无菌容器, 如大容量卡博 (见材料表) 的超纯水。使用此1X 解决方案, 以保持无性三角涡虫。
注意:作为蒙锥山盐溶液的替代品, 请使用本地购买的泉水或超纯水, 其中含有商业上可用的水族盐混合物 (参见材料表), 浓度为of0.518。 - 为防止静态培养中的细菌感染19, 在含有抗生素的水中保持三角涡虫。在超纯水和过滤杀菌中制备硫酸庆大霉素的50毫克/毫升溶液。对于保存动物的容器, 将硫酸庆大霉素添加到最终浓度为50µg/毫升 (1:1000 稀释)。
- 在1X 蒙锥山盐溶液中保持三角涡虫。要准备真涡虫水, 请在超纯水中制作1米CaCl2、1米MgSO4、1米氯化镁2、1米氯化钾和5米氯化钠的个人库存解决方案。过滤-消毒与0.2 µm 瓶顶 filterfor 长期储存。
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肝膏的制备
- 随着三角涡虫生长在一个有机的, 草喂养的牛肉肝脏的饮食, 购买新鲜的肝脏和过程中的24小时内. 取出膜胶囊, 轻轻剥离肝脏。把肝脏切成1厘米的立方体, 用刀片刮掉所有的肝静脉和动脉。
- 浸渍肝片使用食品厂或食品处理器, 然后通过丝网食品过滤器。组合成糕点袋, 并免除注射器或35毫米培养皿。在加料前, 离心机轻轻地去除气泡。
- 储存整除数的肝脏在-80 摄氏度, 长达一年, 并解冻之前使用。解冻后, 再冷冻任何残留的肝脏一次, 或储存在4摄氏度, 高达24小时。
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动物的维护
- 三角涡虫将生长和缩小到不同的大小取决于喂养的频率。每隔一周喂一次三角涡虫 (每14天一次)。对于长期散装文化, 请使用各种大小的塑料容器 (请参阅材料表)。
- 为了喂养动物, 用金属铲或塑料转移吸管将豌豆大小的肝脏放在盒子里。允许动物吃1-2 小时. 在清洗盒子之前, 先取出剩余的食物。
- 清洁蠕虫每周两次, 如果喂养 (一次直接喂养后, 两天后), 或每周一次, 如果不喂养。为了清洁, 把水倒入塑料烧杯中, 小心地浇出水, 同时保留三角涡虫在盒子里。用纸巾擦拭盒子表面, 然后在所有侧面重复, 直到盒子干净。
- 更换水 (大约¾盒容积), 并添加庆大霉素到最后浓度的50µg/毫升。把动物存放在黑暗的柜子里或20摄氏度的孵化器里。
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蠕虫的选择
- 选择5-7 天前喂食的蠕虫。
注意:从最近喂过的蠕虫 (截肢前1-2 天) 中切除 pharynges 是非常困难的。喂食动物对叠氮化钠也更敏感。 - 选择长度大约为6毫米的蠕虫。要估计蠕虫的大小, 请使用塑料转移吸管将其转移到培养皿中。在培养皿下面放置6英寸尺或5毫米 x 5 毫米的图形纸, 并在爬行时测量蠕虫的长度。
注意:长度小于6毫米的蠕虫更难截肢。
- 选择5-7 天前喂食的蠕虫。
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叠氮化钠的制备
- 在涡水中溶解叠氮化钠粉, 制备100毫米溶液。
警告:叠氮化钠是有毒的, 应该小心处理。不要在排水管里丢弃叠氮化钠。使用后, 分开收集, 作为危险废物处置。
- 在涡水中溶解叠氮化钠粉, 制备100毫米溶液。
2. 咽部截肢
- 将蠕虫放置在直径为35毫米的培养皿中。用塑料转移吸管小心地从盘子里取出所有的真涡虫水。
注意:最大的 20 6 毫米蠕虫可以舒适地容纳在这种大小的菜肴。 - 将盘子放在显微镜下, 调整放大倍数, 这样可以同时查看多个蠕虫 (例如10X 放大倍数)。用100毫米叠氮化钠溶液取代真涡虫水。
注意:对于35毫米培养皿, 约5毫升叠氮化钠是足够的。解决方案应该完全淹没三角涡虫。根据需要调整大盘子的溶液体积。 - 在显微镜下监视动物, 避免把盘子移到前3-4 分钟。
- 通过显微镜观察咽部的挤压;咽将从咽囊中伸出并完全伸展 (大约1毫米), 如图 1B所示。
注意:重要的是要等到咽完成了完全伸展, 然后再继续。一旦咽从动物身上冒出来, 完全伸展大约需要1分钟。 - 使用塑料转移吸管在盘子周围喷动物。把动物吸进吸管, 然后强行把它们放进盘子里几次。如果咽完全延长, 这种剧烈的吹打将导致它分离。
- 或者, 用一对细钳 (参见材料表), 沿其长度垂直地抓住咽, 或沿其圆周水平进行, 如图 1C所示。在钳中掐咽后, 将动物向上抬向半月板。当动物被饲养时, 表面张力会导致咽部与动物分离。
注意:这种方法可以用来去除 pharynges 的小动物 (长度为1-3 毫米), 那里的强力旋转不充分。避免戳或以其他方式伤害动物的身体。 - 使用转移吸管, 将被截肢的动物移到含有新鲜涡水的新盘子里。
- 一旦转移, 彻底冲洗切除动物在涡水, 完全交换水三次。转移到含有涡水的新皿中, 50µg/毫升庆大霉素。
注意:在这三洗涤过程中完成缓冲交换是确保去除叠氮化钠的必要条件。 - 第二天, 用含有50µg/毫升庆大霉素的新鲜涡水代替菜中的水。此后每隔一天重复一次。
3. 截肢后咽部切除术的评估
- 检查显微镜下的动物 (用10-20X 放大) 来确定是否在成功切除咽后出现了黑点, 如图 2A所示。
- 另外, 根据皮尔逊et ) 所描述的协议修复和漂白动物。20. 在 4 ', 6-diamidino 2-苯基吲哚 (DAPI) 或荧光共轭链亲和素 (1 毫克/毫升稀释1:500 在1X 磷酸盐缓冲盐水含0.3% 海卫 x) 中浸泡动物过夜。登上动物在 80% glycerol/20%@unit@ 磷酸盐缓冲盐水和图像在荧光显微镜下的幻灯片 (图 2B)。
注意:本手稿中的所有图像都是在一个1.0X 目标的荧光显微镜上捕获的。
4. 通过测量喂养行为评估咽再生
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肝脏的制备
- 将所需数量的肝膏转移到离心或锥形管中。简单地旋转以去除气泡。估计肝脏体积, 然后添加涡水1/5 的体积, 和2% 的总体积的红色食品着色。例如, 对1000µL 肝膏, 添加200µL 涡水和24µL 的食品着色。
- 使用塑料杵, 吸管尖端或金属铲, 彻底混合, 直到食物着色均匀分布在肝脏膏。再旋转简要地。肝脏糊可以储存在4°c 24 小时或冷冻在整除数-80 摄氏度, 长期贮存。
- 如果测试多达25种动物, 每道菜准备25µL 肝脏膏 (大约1µL 每只动物的肝脏糊)。
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饲养动物
- 七天后, 化学截肢, 转移动物到一个新的培养皿。如果试验10-15 只动物, 请使用35毫米菜;15多只动物应该在60毫米的培养皿中进行测试。保持动物在黑暗中, 不受干扰, 大约1小时喂养前。
- 使用剪刀, 增加 P200 吸管尖端的宽度, 通过修剪大致½厘米关闭狭窄的末端。吸管25µL 的红肝糊入盘中。
注意:修剪末端使吹打的粘性肝糊更容易。为了防止肝脏漂浮在表面上, 当配药时, 将笔尖触到盘子的底部。 - 允许动物喂养30分钟。
- 通过将动物放置在白色背景上或用10-20X 放大显微镜检查它们的数量来获得吃掉的动物数目。
- 进食后, 从盘子中取出肝脏并清洗干净。
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Representative Results
接触叠氮化钠扰乱了三角涡虫的正常运动, 导致动物伸展和扭动。这些运动迫使咽从动物腹侧出现, 在叠氮化钠溶液中大约6分钟后, 咽部的白色尖端可以看到(图 1B左面板)。几分钟后, 动物们积极地收缩, 并通过强行将咽从身体里推出来, 从而充分地伸展咽喉。(图 1B-中间面板)。在叠氮化物暴露后约11分钟, 动物和咽部放松。在此阶段, 咽的特征钟形明显可见(图 1B右面板)。为了便于截肢, 等待咽部放松是很重要的。
因为咽是一个大的, 无色的组织, 删除它导致在截肢动物的背部一侧的暗斑出现(图 2A)。这个阴暗的区域是活体动物截肢成功的视觉指标。在截肢后当场可见, 第二天就会变得更加突出。当咽再生时, 这个区域会变亮。为了更精确地监测咽部再生, 动物可以用 DAPI 或荧光共轭链亲和素过夜(图 2B)。为了定量评估咽部再生的程度, 可以用 ImageJ 软件测量其面积。
咽是 chemosensation 和食物摄取的重要器官。为了确定再生过程中恢复这些功能的时间, 我们使用喂食化验来监测动物行为。通过将食物着色与肝脏糊结合起来, 我们能够分辨出那些没有(图 3A)的动物。然后, 我们量化的红色动物的数量, 以评估动物的百分比功能咽。根据图 3B中显示的结果, 在截肢后7天恢复了成功的喂养行为, 表明在咽下一周后, 动物再生了功能性咽。为了检验叠氮化钠暴露是否影响喂养行为, 我们将动物浸泡在叠氮化钠中, 但在咽下弹射前立即将其冲洗掉。一天后, 我们评估了在饲料试验中, 叠氮化钠暴露是否改变了觅食行为。与没有咽的化学截断动物相比, 所有动物在叠氮化钠暴露后保留完整的咽 (n=30 动物为每个情况) 食物。这一结果表明, 叠氮化钠暴露不影响喂养行为, 只要咽保持完好。
图 1.咽部弹射和截肢.(A)真涡虫解剖学示意图。(B)在100毫米叠氮化钠浸泡时显示咽喷出的活动物的图像。红色箭头突出咽。刻度条 = 750 µm. (C)活体动物 (左) 和使用镊子的截肢示意图 (右) 图像。面板显示两个不同的选择, 以抓住咽。动物的腹侧面朝上。刻度条 = 500 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 2.咽部截肢和再生的评估。(A)在截肢前后的指定时间内, 有代表性的活体动物图像。中间板显示截肢后的咽喉区的黑点, 用虚线白盒突出。背侧面朝上。刻度条 = 500 µm. (B) Alexa488-streptavidin 在截肢前后指定时间染色的动物的代表图像。中间板显示截肢后没有咽下。咽区以白盒突出显示。腹侧面朝上。缩放条 = 500 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 3。咽部再生的评价。(A)图像和喂养试验示意图, 通过将25µl 肝脏置于60毫米培养皿的中心进行。示意图 (上, 左) 和图像 (中间) 显示喂养行为的动物与完整的 pharynges。右上, 吃过的动物的形象。示意图 (左下) 和图像 (中间) 动物喂养行为1天后截肢。右下角, 没有吃的动物。缩放条 = 750 µm. (B)喂养化验结果。在截肢后特定时间摄取食物的动物的百分比 (用红色着色来量化)。对于每一个时间点, n=10 动物, 重复三个。错误栏 = SD.请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
本协议描述了用叠氮化钠选择性切除咽部的方法。三角涡虫的其他靶向消融研究使用改良手术去除感光细胞21 或药理治疗消融多巴胺能神经元22。化学截肢对现有方法的一个显著优点是它不需要手术。与真涡虫身体的其余部分相比, 咽部的刚性结构便于它完全从动物身上去除, 这是非常柔软的。此外, 咽与动物在一个小交界 (食管)30连接咽和肠道, 产生一个更可重复的伤口比一个较大的外科工具诱发。根据其物理特性和与动物其余部分的小解剖联系, 咽部切除因此产生比其他外科截肢更均匀的伤口。
接触叠氮化钠的长度对于这项技术的成功也是至关重要的。虽然对叠氮化钠的短暂接触不会对三角涡虫产生负面影响, 但长期暴露是有毒的, 最终会杀死动物。叠氮化钠通过抑制细胞色素氧化酶23,24, 被称为抑制能量依赖的过程。此外, 它抑制转录和翻译, 可能是积累的关键成分, 这些反应在应力颗粒25。在三角涡虫中, 叠氮化钠的暴露抑制了24小时的有丝分裂, 之后细胞恢复增殖12。修改, 如限制叠氮化物的暴露时间, 彻底冲洗去除叠氮, 并核算在实验设计中的瞬态有丝分裂抑制, 可以帮助克服这些限制。
咽部独特的解剖位置及其特征的径向对称性, 使新再生的咽组织能容易地被现有的干细胞所区分。咽再生可以监测在细胞和解剖水平使用组织污渍如链亲和素和 DAPI, 免疫组化, 或通过原位杂交26。这里描述的喂养化验分析咽的功能再生。趋化对食物需要咽27,28和动物没有一个完全功能咽不能摄取食物。因此, 这种简单的, 定量的器官功能评估补充了结构再生。此外, 可以对动物的种群进行化学截肢, 并能产生许多相同伤害的动物。因此, 这一程序对于大规模的研究是方便的。这些优点, 再加上成熟咽的再生需要干细胞, 使咽部截肢成为研究器官再生的理想模型。与更广泛的截肢结合使用, 咽切除可以用来测试假设的伤口大小和解剖位置如何影响干细胞反应的损伤, 这是一个关键问题在再生领域21。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要感谢阿尔瓦拉多, 他支持这项技术的初步优化和发展。在卡罗琳·阿德勒的实验室工作是由康奈尔大学开办基金支持的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2) | Fisher Chemical | C79-3 | Montjuïc salt solution |
| Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4) | Fisher Chemical | M65-3 | Montjuïc salt solution |
| Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2) | Acros/VWR | 41341-5000 | Montjuïc salt solution |
| Potassium Chloride (KCl) | Acros Organics/VWR | 196770010 | Montjuïc salt solution |
| Sodium Chloride (NaCl) | Acros Organics/VWR | 207790050 | Montjuïc salt solution |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Acros Organics/VWR | 123360010 | Montjuïc salt solution |
| Nalgene autoclavable polypropylene copolymer lowboy with spigot | ThermoFisher Scientific/VWR | 2324-0015 | Storing planaria water |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands | Amazon | Planaria water |
| Gentamicin Sulfate | Gemini Bio-products | 400-100P | Planaria water |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 71970 | Mincing liver |
| Disposable pastry bags-16”, 12 pack | Wilton | Amazon | Liver aliquots |
| 5 mL syringes | BD/VWR | 309647 | Liver aliquots |
| Petri dishes-35mm/60mm | Greiner Bio-One/VWR | 82050-536/82050-544 | |
| Plastic containers (various sizes) | Ziploc | Amazon | Housing planarians in static culture |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Transfer pipette | Globe Scientific | 138030 | |
| Forceps - Dumont Tweezer, Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D (0203-5-PO) | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62247 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher | S11223 | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-1 |
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