Summary
プラナリアSchmidtea メディテラネアは、幹細胞と組織再生を研究するための優れたモデルです。この文書では、化学のアジに動物を公開することによって 1 つの器官、咽頭を選択的に削除する方法について説明します。このプロトコルはまた咽頭再生を監視する方法を説明します。
Abstract
プラナリアは、扁形動物の非常に効率的な再生です。彼らは、任意のタイプの傷害に即応できる幹細胞の数が多いこの能力を借りています。これらの動物の共通の傷害モデルは、複数の臓器に損傷組織の大量を削除します。この広範な組織の損傷を克服するために我々 はSchmidtea メディテラネアプラナリアの咽頭、一つの臓器を選択的に削除する方法をここで説明します。我々 はチトクロム酸化酵素阻害剤アジ化ナトリウムを含む溶液に浸漬の動物によってこれを達成します。アジ化ナトリウムを簡単に暴露により咽頭の押出成形、「化学的切断」と呼ばれる動物から化学切断全体の咽頭を削除し、咽頭が腸へアタッチ小さな傷を生成します。広範な洗浄後は、すべての切断された動物は、約 1 週間で咽頭が完全に機能を再生成します。体の残りの部分の幹細胞は、新しい咽頭の再生を駆動します。ここで、詳細な提供化学切断のプロトコルおよび成功の切断と再生を評価する組織と行動の両方の方法について説明します。
Introduction
再生は、再生能力ある無脊椎動物の完全なボディ再生から脊椎動物1のより制限された能力に至るまで動物界全体が発生する現象です。機能的な組織の交換は複雑なプロセスであり、種類の細胞の同時復元をしばしば伴います。たとえば、サンショウウオの四肢、骨芽細胞、軟骨細胞、神経細胞、筋肉とする上皮細胞に必要なを再生成するには、2を置き換えられます。これらの細胞が新たに生成された型はまた新しい下肢の機能を容易にするために適切に編成する必要があります。これらの複雑なプロセスを理解すると、特定の細胞のタイプおよび器官への統合の再生に焦点を当てる技術が必要です。
再生反応に関する研究を簡素化する採用戦略は、いずれかの特定の細胞型のターゲットの切除や組織の大規模な収集があります。たとえば、ゼブラフィッシュ、特定の細胞型でニトロの式はメトロニダゾールの3、4を適用した後彼らの破壊に します。ショウジョウバエ幼虫の組織特異的発現プロモーター下プロ アポトーシス遺伝子を表現するには成虫ディスク5,6の特定の領域を切除できることは選択的に。両方これらの戦略の急速な制御された損傷の原因し、再生の分子・細胞メカニズムを解剖に使用されています。
本稿では、我々 はSchmidtea メディテラネアプラナリアの咽頭と呼ばれる全体の器官を選択的に切除する方法をについて説明します。プラナリアが再生、その多作の再生能力で知られての古典的なモデルも分の断片が全体動物7,8を再生することができます。彼らは幹細胞の多能性細胞と前駆細胞の血統制限9,,1011から成る大規模な異種の人口があります。これらの細胞は、増殖し、咽頭、神経系、消化と排泄系と筋上皮細胞9,10,12など、すべての不足している組織を置換するを区別します。これらの幹細胞が再生を開始することを私たちは知っている、すべてのこれらの異なった細胞のタイプを交換するそれらを駆動する分子メカニズムは完全に納得しません。正確な幹細胞応答を引き出す定義の人が負傷した方法は、この複雑なプロセスを明確に役立ちます。
咽頭の授乳に必要な大規模な円筒形のチューブであり、神経細胞、筋肉、上皮細胞と分泌細胞13,29を含んでいます。通常動物の腹部の側面のポーチに隠された、それは食品の存在を感じる時に開く動物の単一ボディに引かれます。咽頭を選択的に切断、化学と呼ばれるナトリウムのアジ化物、線虫14,15,16の一般的に使用される麻酔薬でプラナリアを浸します。プラナリアのアドラーらによって報告された。、201412で。アジ化ナトリウムへの露出の数分以内プラナリア押し出し、pharynges と穏やかな攪拌と咽頭を動物から切り離します。私たちは「化学切断」として咽頭の完全かつ選択的損失額を参照してください。切断後 1 週間完全に機能的な咽頭は復元された12です。咽頭は、供給する必要があるので、機能再生は摂食行動を監視することによって測定できます。化学の切断および咽頭の再生と摂食行動の回復を評価するためのプロトコルをご紹介いたします。
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Protocol
1. 準備
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プラナリア水の準備17
- 1 X Montjuïc 塩溶液でプラナリアを維持します。水をプラナリアを準備するには、個々 の在庫ソリューション 1 M CaCl2, 1 M MgSO4, 1 M MgCl2の 1 M の KCl と純水で 5 M の NaCl を確認します。0.2 μ m ボトル上部フィルターの長期的なストレージを持つフィルター滅菌します。
注:モンジュイックに塩を準備する (18.2 MΩ 25 ° C での電気抵抗) と超高純度の脱イオン水だけを使用します。 - 5 X 塩溶液の 1 L 在庫を準備、1 M CaCl2、1 M MgSO4MgCl2、1.6 mL 900 mL 純水に食塩を 5 M の KCl の 0.5 mL の 0.5 mL の 5 mL の 5 mL を組み合わせます。このソリューションに 0.504 NaHCO3 g を加えて混ぜ合わせます。塩酸と 7.0 に pH を調整します。
- 希釈原液を大容量カーボイなど滅菌コンテナーにおける超純水の使用濃度 X 1 X この 5 (材料の表を参照してください)。無性のプラナリアを維持するには、この 1 の X ソリューションを使用します。
注:モンジュイック食塩の代わりに、ローカル購入のばね水または市販の水槽の塩を含む超純水を使用濃度 of0.5 g/L18(材料の表を参照) をミックスします。 - 19静置培養で細菌の感染を防ぐためには、抗生物質を含む水でプラナリアを維持します。超純水中の硫酸ゲンタマイシンの原液 50 mg/mL を準備し、フィルター殺菌します。動物の保管場所のコンテナーにゲンタマイシン硫酸塩を最終濃度 50 μ g/mL (1: 1000 希釈) に追加します。
- 1 X Montjuïc 塩溶液でプラナリアを維持します。水をプラナリアを準備するには、個々 の在庫ソリューション 1 M CaCl2, 1 M MgSO4, 1 M MgCl2の 1 M の KCl と純水で 5 M の NaCl を確認します。0.2 μ m ボトル上部フィルターの長期的なストレージを持つフィルター滅菌します。
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レバー ペーストの準備
- プラナリアは、オーガニックの食事で繁栄する、牧草飼育牛レバー、新鮮な肝臓を購入、24 時間内のプロセス削除そっと剥がして肝臓をカプセル化膜カプセル。〜 1 cm キューブに肝臓を切るし、刃を使用してこすり、すべての肝静脈と動脈を破棄します。
- 食品工場やフード プロセッサを使用して肝臓の部分を漬け込むし、ワイヤー メッシュの食品ストレーナを通過します。ペストリー袋に結合し、注射器や 35 mm シャーレに分注します。授乳前に空気の泡を削除に軽く遠心します。
- 年および使用する前に解凍まで-80 ° C で肝臓の因数を格納します。解凍後、再冷凍、残った肝臓は一度、または 24 h まで 4 ° C で保存します。
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動物のメンテナンス
- プラナリアは成長し、給餌の頻度に応じて様々 なサイズに縮小します。1 週間毎 (14 日に一度) プラナリアをフィードします。長期の大量培養 (材料表参照) 様々 なサイズのプラスチック製の容器を使用します。
- 動物の飼料、金属のヘラまたはプラスチック ピペットを使用してボックスに肝臓の豆粒大のドロップを配置します。ボックスをクリーニングする前に食べる 1-2 削除残りの食糧のために動物を許可します。
- 供給できない場合 (直接授乳後一度と一度 2 日後) を供給する場合週 2 回または週に一度ワームをきれい。きれいに慎重にボックスでプラナリアを維持しながら水を注ぐことによってプラスチック ビーカーに水を排出します。ボックス紙タオルで表面を拭くし、箱がきれいになるまで、すべての側面に繰り返します。
- (ボックスのボリュームの約 3/4) に水を交換し、50 μ G/ml の最終的な集中にゲンタマイシンを追加します。暗いキャビネットまたは 20 の ° C の定温器で動物を格納します。
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ワーム各種
- 5-7 日前に供給されたワームを選択します。
注:最近 (切断の前に 1-2 日) を供給されているワームから pharynges を切断するため困難です。動物を供給、またアジ化ナトリウムに敏感。 - 約 6 ミリメートルの長さは、ワームを選択します。ワームのサイズを見積もるには、プラスチックの転送ピペットを使用してシャーレにそれを転送します。フラット 6 の定規またはペトリ皿の下に 5 mm × 5 mm 方眼紙を置き、それをクロール中にワームの長さを測定します。
注:長さ 6 mm より小さいワームは、切断しにくい。
- 5-7 日前に供給されたワームを選択します。
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アジ化ナトリウムの準備
- プラナリア水でナトリウム アジ化物粉末を溶解することにより 100 ミリメートルのソリューションを準備します。
注意:アジ化ナトリウムは毒性があり慎重に処理する必要があります。排水溝にアジ化ナトリウムを廃棄しないでください。次を使用、有害廃棄物としての処分のために個別に収集します。
- プラナリア水でナトリウム アジ化物粉末を溶解することにより 100 ミリメートルのソリューションを準備します。
2. 咽頭切断
- 場所は、35 mm 径シャーレのワームします。お皿からプラスチック製のピペットを使用してすべてのプラナリア水を慎重に取り外します。
注:最大 20 の 6 mm のワームはこのサイズのディッシュ快適収容できます。 - 顕微鏡下で皿を置き、複数のワームを同時に見ることができるように倍率を調整 (例えば10 倍)。プラナリア水を 100 mM アジ化ナトリウム溶液に置き換えます。
注:35 mm のペトリ皿のアジ化ナトリウムの約 5 mL で十分です。ソリューションは、プラナリアを水没完全にする必要があります。大きい皿のための解決の容積を必要に応じて調整します。 - 顕微鏡と最初の 3 〜 4 分の皿を移動するからリフレインの下で動物を監視します。
- 顕微鏡; で咽頭の押出を観察します。咽頭は咽頭嚢から突出し、完全に拡張 (長さ約 1 mm)図 1 bに示すように。
注:咽頭はさらに進む前に完全に拡張を完了するまで待機することが重要です。咽頭は、動物から出て、一度完全な拡張は約 1 分かかります。 - プラスチック ピペットを使用して、皿の周りに動物を噴出します。ピペットに動物を吸うし、強制的にそれらを解放、皿に幾つかの時間。咽頭が完全に場合、この積極的なピペッティングを解除を引き起こすが。
- また、図 1に示すように、その長さに沿って垂直方向、または水平方向に微細鉗子 (材料の表を参照してください) のペアを使用して円周に沿って咽頭を把握します。鉗子で咽頭、メニスカスに向かって上向きに動物を持ち上げます。動物が上昇するにつれて、表面張力は動物からデタッチする咽頭になります。
注:このメソッドは、強制的な旋回が不十分 (長さ 1-3 mm) な小動物の pharynges を削除する使用できます。突きまたはそれ以外の場合、動物の体を負傷を避けます。 - ピペットを使用して、切断された動物を新鮮なプラナリア水を含んでいる新しい皿に移動します。
- 一度転送、リンスは完全に水を 3 回交換、プラナリア水で徹底的に動物を切断しました。50µg/ml のゲンタマイシンのプラナリア水を含んでいる新しい皿に転送します。
注:これらの 3 つの洗浄の間に完全なバッファー交換は、アジ化ナトリウムの除去を確実に不可欠です。 - 次の日、ゲンタマイシンの 50 μ g/mL を含む新鮮なプラナリア水皿の水に置き換えます。その後にすべての他の日を繰り返します。
3. 切断後咽頭除去の評価
- 図 2 aに示すように、ダーク スポットが、咽頭の成功の除去後登場しているかどうかを判断する (10-20 倍の倍率) と顕微鏡下で動物を検討します。
- また、修正し、ピアソンらによって記述されたプロトコルに従って動物をブリーチ20。 ソーク動物 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) または蛍光標識ストレプトアビジンで一晩 (1 X 0.3% を含有したリン酸バッファー生食 1 Mg/ml に希釈 1: 500 トリトン X)。80% glycerol/20% 1 X リン酸バッファー生理食塩水と蛍光顕微鏡 (図 2 b) 下の画像のスライドの動物をマウントします。
注:この原稿のすべての画像は、1.0 X 目的で蛍光顕微鏡で捕えられました。
4. 摂食行動を測定することにより咽頭再生の評価
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肝臓の準備
- 遠心または円錐管にレバー ペーストの必要量を転送します。空気の泡を削除する簡単にスピンします。肝臓の容積を推定し、その量の 1/5、赤い食品着色料の合計の容積の 2% にプラナリア水を追加します。たとえば、肝臓の 1000 μ L に貼り付け、プラナリア水の 200 μ L と 24 μ L の食品着色料を追加します。
- 食品着色料が均一でレバー ペーストになるまで徹底的にミックス プラスチック杵、ピペット チップまたは金属のヘラを使用する。もう一度簡単にスピンします。レバー ペーストは、24 h の 4 ° C で保存または因数長期保存用-80 ° C で凍結できます。
- 最大 25 の動物をテストする場合は、一皿 (約 1 μ L あたり動物のレバー ペーストの) レバー ペーストを 25 μ l 添加を準備します。
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摂食動物
- 化学切断後 7 日間は、新しいシャーレに動物を譲渡します。10-15 動物をテストする場合を使用して、35 mm ディッシュ;以上 15 の動物は、60 mm のペトリ皿にテスト必要があります。暗闇の中、邪魔されない、供給する前に約 1 時間で動物を飼います。
- はさみを使用して、トリミング大体狭い端の ½ の cm で P200 ピペット チップの幅を広げます。ピペット 25 μ L の皿に赤いレバー ペースト。
注:最後をトリミング ピペッティング粘性のレバー ペーストの方が簡単になります。肝臓が表面に浮かぶことを防ぐために調剤中皿の底に先端に触れます。 - 30 分を供給する動物を許可します。
- 白地に動物を配置するまたは 10-20 倍の倍率での顕微鏡の下でそれらを調べることによって食べている動物の数を獲得します。
- 授乳後お皿から肝臓を削除し、きれい。
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Representative Results
アジ化ナトリウムへの暴露は、プラナリア、原因を伸ばし、身をよじる動物の通常の運動を混乱させます。これらの動きを強制的に咽頭、動物の腹部の側面から出てくるとアジ化ナトリウム溶液で約 6 分後、咽頭の白の先端を見ることができる(図 1 bの左側のパネル)。数分後、動物は積極的に契約し、強制的にボディからそれを押すことによって咽頭までのばします。(図 1 bの中央のパネル)。約アジ化暴露後 11 分、動物および咽頭おくつろぎください。この段階で、咽頭の特徴的なベル形がはっきりと見える(図 1 bの右側のパネル)。簡単切断、リラックスして咽頭を待機する重要です。
咽頭が、大きいので削除、組織の無着色の質量は切断された動物(図 2 a)の背側に暗いスポットの外観の結果します。この暗い領域は、生きている動物の正常な切断の視覚的なインジケーターです。スポットは切断後すぐが表示されると次の日をより顕著になります。咽頭は再生し、この地域を明るきます。咽頭再生をより正確に監視するため、DAPI や蛍光標識ストレプトアビジンと動物を汚すことができる一夜に(図 2 b)。咽頭再生の程度を定量的に評価するには、ImageJ ソフトウェアを使用してその領域を測定できます。
咽頭は、そのと食品摂取の重要な器官です。再生中にこれらの関数が復元されるとき、動物の行動を監視するのに餌の試金を使用しました。組み合わせることでレバー ペーストで着色食品、それらない(図 3 a)を食べた動物を区別することができました。私たちは、機能的な咽頭を持つ動物の割合を評価するために赤い動物の数を定量化しました。図 3Bに示す結果に基づき、成功の摂食行動を示す、咽頭摘出後 1 週間動物が再生成機能咽頭切断後 7 日が復元されました。ナトリウムのアジ化物の露出に摂食行動が影響を受けるかどうかをテストするため我々 はアジ化ナトリウムに動物を浸漬が咽頭放出直前にそれを洗っています。1 日後、給餌のアッセイとナトリウム アジ化露出によって食品を求める行動が変更されたかどうか評価しました。ナトリウムのアジ化物の露出を食べた後そのまま咽頭を保持すべての動物、咽頭を欠けている化学的に切断された動物と対照をなして (n = 各条件に対して 30 動物) 料理。この結果は、咽頭はそのまま残っている限り、ナトリウムのアジ化物の露出が摂食行動を与えないことを示します。
図 1.咽頭イジェクトや切断します。(A)プラナリア解剖学の概略図。(B) 100 mM アジ化ナトリウムに浸漬時に咽頭の放出を示す生きている動物の画像。赤い矢印は、咽頭を強調表示します。スケール バー = 750 μ m。 (C)生きている動物 (左) と概略図 (右) 鉗子による切断のイメージ。パネルは、咽頭を握る 2 つの異なるオプションを表示します。動物の腹側が上を向きます。スケール バー = 500 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.咽頭の切断と再生の評価。(A)で生きている動物の代表的な画像指定した時間前に、切断後。中央のパネルは、切断、破線のホワイト ボックスで強調表示された後咽頭付近でダーク スポットを示しています。背側が上を向きます。スケール バー = 500 μ m の範囲で Alexa488 ストレプトアビジンとステンド グラス動物の(B)の代表的な画像指定した時間前に、切断後。中央のパネルは、切断後咽頭の欠如を示しています。咽頭領域が白いボックスで強調表示されます。腹側が上を向きます。スケール バー = 500 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。咽頭再生の評価。(A)画像およびアッセイ、60 mm シャーレの中央に肝臓の 25 μ l を配置することによって実施を餌の模式図。回路図 (左上隅)、イメージ (中央) をそのまま pharynges と動物の摂食行動。食べている動物の上の右画像。回路図 (左下) と切断後 1 日動物の摂食行動の画像 (中)。下右、動物は食べていないこと。スケール バー = 750 μ m アッセイの給餌(B)結果。切断後の特定の時間に (赤い着色によって定量化) 食品を摂取した動物の割合です。各時間ポイント、n = 10 の動物、3 通で繰り返されます。エラー バーの SD を =この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルでは、アジ化ナトリウムを使用して咽頭の選択的アブレーションの方法について説明します。プラナリアの他のアブレーションの対象となる研究は、視細胞21または22ドーパミン作動性ニューロンをアブレーションするのに薬物治療を削除するのに修正手術を使用しています。既存の方法と比べて化学切断の 1 つの重要な利点は、手術が必要ないことです。プラナリアの体の残りの部分に比べ、咽頭の堅い構造くらい柔らかい bodied である動物からの完全な除去が容易になります。また、咽頭は咽頭や大きな手術ツールによって引き起こされたものよりもより再現可能な傷を生成する腸に参加する微小ジョセフソン接合 (食道)30動物からデタッチします。物性および動物の残りの部分に小さな解剖学的連携に基づく、咽頭の除去は、したがって他の外科的切断よりもより均一な傷を生成します。
アジ化ナトリウムへの露出の長さもこの手法の成功のために重要です。ただし、アジ化ナトリウムを簡単に暴露は、プラナリアに悪影響を受けない、長期暴露は毒性があり最終的に動物を殺します。アジ化ナトリウムは、チトクロム酸化酵素23,24の阻害を介してエネルギーに依存するプロセスを阻害するため知られています。さらに、転写と翻訳、ストレス顆粒25のこれらの反作用の主要なコンポーネントの蓄積によって可能性を抑制します。プラナリア、ナトリウムのアジ化物の露出は細胞が増殖12を再開後、24 h の有糸分裂を抑制します。変更アジ化露出の時間を制限する、実験的なデザインで徹底的に洗浄、一過性の細胞分裂抑制のための会計とアジ化を削除することができますなど、これらの制限を克服します。
咽頭と特徴的な放射状対称性の解剖学的位置を一意既存の幹細胞から新しく再生成された咽頭組織の簡単な区別を可能にします。咽頭再生は、ストレプトアビジンと DAPI、免疫組織化学のようなまたはの in situハイブリダイゼーション26組織の汚れを使用して携帯電話や解剖学的なレベルで監視できます。記載されている給餌アッセイここで咽頭の機能再生を試金します。食品に対する走化性咽頭27,28を必要とし、完全に機能的な咽頭なし動物は食物を摂取できません。臓器機能のこの単純な定量的な評価は、したがって構造再生を補完します。また、化学切断行う動物の集団で、同じ怪我で多数の動物を生成することができます。手順は大規模な研究に便利なためです。成熟した咽頭の再生が、幹細胞を必要とするという事実と相まって、これらの利点は、器官再生工学を研究するための理想的なモデルを咽頭切断になります。広範な切断との組み合わせで使用すると、咽頭除去は創傷サイズと解剖学的位置影響の怪我の再生フィールド21で重要な問題に幹細胞の応答についての仮説をテストするために使用できます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
初期の最適化と本手法の開発を支えたアレハンドロ ・ サンチェス アルバラドに感謝したいと思います。キャロリン ・ アドラー研究所での仕事は、コーネル大学スタートアップ資金によってサポートされます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2) | Fisher Chemical | C79-3 | Montjuïc salt solution |
| Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4) | Fisher Chemical | M65-3 | Montjuïc salt solution |
| Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2) | Acros/VWR | 41341-5000 | Montjuïc salt solution |
| Potassium Chloride (KCl) | Acros Organics/VWR | 196770010 | Montjuïc salt solution |
| Sodium Chloride (NaCl) | Acros Organics/VWR | 207790050 | Montjuïc salt solution |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Acros Organics/VWR | 123360010 | Montjuïc salt solution |
| Nalgene autoclavable polypropylene copolymer lowboy with spigot | ThermoFisher Scientific/VWR | 2324-0015 | Storing planaria water |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands | Amazon | Planaria water |
| Gentamicin Sulfate | Gemini Bio-products | 400-100P | Planaria water |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 71970 | Mincing liver |
| Disposable pastry bags-16”, 12 pack | Wilton | Amazon | Liver aliquots |
| 5 mL syringes | BD/VWR | 309647 | Liver aliquots |
| Petri dishes-35mm/60mm | Greiner Bio-One/VWR | 82050-536/82050-544 | |
| Plastic containers (various sizes) | Ziploc | Amazon | Housing planarians in static culture |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Transfer pipette | Globe Scientific | 138030 | |
| Forceps - Dumont Tweezer, Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D (0203-5-PO) | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62247 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher | S11223 | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-1 |
References
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