Summary
Planarian Schmidtea mediterranea är en utmärkt modell för att studera stamceller och vävnadsregeneration. Denna publikation beskriver en metod för att selektivt avlägsna ett organ, svalget, genom att utsätta djur för att de kemiska natriumazid. Detta protokoll beskrivs också metoder för övervakning av svalget regenerering.
Abstract
Planarians är plattmaskar som är extremt effektiva på förnyelse. De är skyldiga denna förmåga att ett stort antal stamceller som kan svara snabbt på någon typ av skada. Gemensamma skada modeller i dessa djur ta bort stora mängder vävnad, som skadar flera organ. För att övervinna denna breda vävnadsskada, beskriver vi här en metod för att selektivt ta bort ett enda organ, svalget, i planarian Schmidtea mediterranea. Detta uppnår vi genom blötläggning djur en lösning innehållande cytokrom oxidas hämmare natriumazid. Kort exponering för natriumazid orsakar extrudering i svalget från djuret, som vi kallar ”kemiska amputation”. Kemiska amputation tar bort hela svalget och genererar ett litet sår där svalget fäster tarmen. Efter omfattande sköljning, regenerera alla amputerade djur en fullt fungerande svalget i ungefär en vecka. Stamceller i resten av kroppen kör regenerering av nya svalget. Här, vi ger en detaljerad protokoll för kemiska amputation och beskriva både histologiska och beteendevetenskapliga metoder för att bedöma framgångsrika amputation och förnyelse.
Introduction
Förnyelse är ett fenomen som uppstår i hela djurriket, med regenerativ kapacitet från hela kroppen förnyelse i vissa ryggradslösa djur till mer begränsade förmågor i ryggradsdjur1. Byte av funktionella vävnader är en komplex process och ofta innebär samtidig återställandet av flera celltyper. Till exempel att regenerera den salamander lem, osteoblaster, kondrocyter, nervceller, muskler och epitelceller behöver vara ersatt2. Dessa nyligen genererade celltyper behöver också organiseras korrekt att underlätta nya lem funktion. Förstå dessa komplexa processer kräver tekniker som fokuserar på förnyelse av specifika celltyper och deras integrering i organ.
En av de strategier som används för att förenkla studiet av regenerativ svaren är riktade ablation av antingen vissa celltyper eller större samlingar av vävnader. Till exempel i zebrafiskar leder uttryck för nitroreductase i specifika celltyper till deras förstörelse efter applicering av metronidazol3,4. I Drosophila larver, kan uttrycker pro-apoptotiska generna under vävnadsspecifika initiativtagare selektivt avlägsna specifika regioner av imaginal skiva5,6. Båda dessa strategier snabb men kontrollerade skada, och har använts för att dissekera de molekylära och cellulära mekanismerna som ansvarar för regenerering.
I detta manuskript beskriver vi en metod för att selektivt avlägsna hela organ kallas svalget i planarian Schmidtea mediterranea. Planarians är en klassisk modell av förnyelse, kända för sin produktiva regenerativ förmåga, där även minuten fragment kan återföds hela djur 7,8. De har en stor, heterogen befolkning av stamceller som består av både pluripotenta celler och härstamning-begränsad föräldraparets9,10,11. Dessa celler föröka sig och differentiera för att ersätta alla saknade vävnader, inklusive svalget, nervös-, mag- och utsöndringsorganen system och muskel och epitelceller9,10,12. Även om vi vet att dessa stamceller initiera regenerering, förstår vi inte fullt ut de molekylära mekanismer som driver dem att ersätta alla dessa olika celltyper. Definierade skadade metoder att framkallar exakt stamceller Svaren kan hjälpa till att avgränsa denna komplicerade process.
Svalget är ett stort, cylindriska rör som krävs för utfodring och innehåller nervceller, muskler, epitelial och sekretoriska celler13,29. Normalt dold i en påse på ventrala sida av djuret, det sträcker sig genom djurets enda kropp öppning vid avkänning förekomsten av mat. För att selektivt amputera svalget, Blötlägg vi planarians i en kemisk kallas natriumazid, en vanliga bedövningsmedel i C. elegans14,15,16. Dess användning i planarians rapporterades först av Adler et al., i 201412. Inom minuter efter exponering för natriumazid, planarians pressa deras pharynges, och med mild agitation, svalget lossnar från djuret. Vi kallar denna kompletta och selektiv förlust i svalget ”kemiska amputation”. En vecka efter amputation, är en fullt fungerande svalget återställda12. Eftersom svalget krävs för utfodring, kan funktionell förnyelse mätas genom att övervaka utfodring beteende. Vi beskriver nedan, protokollet för kemiska amputation och för bedömningen av regenerering av svalget och restaurering av utfodring beteende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning
-
Beredning av planaria vatten 17
- Upprätthålla planarians i en 1 X Montjuïc salt lösning. För att förbereda planarian vatten, göra individuella stamlösningar av 1 M CaCl2, 1 M MgSO4, 1 M MgCl2, 1 M KCl och 5 M NaCl i ultrarent vatten. Filter-sterilisera med ett 0,2 µm flaska-top filterfor långsiktig lagring.
Obs: Använd endast ultrarent avjoniserat vatten (med en resistivitet på 18,2 MΩ vid 25 ° C) att förbereda Montjuïc salter. - För att förbereda en 1 L lager av 5 X saltlösning, kombinera 5 mL 1 M CaCl2, 5 mL 1 M MgSO4, 0,5 mL av MgCl2, 0,5 mL av KCl och 1,6 mL 5 M NaCl lösningar i 900 mL ultrarent vatten. Till denna lösning, tillsätt 0.504 g NaHCO3 och rör för att blanda. Justera pH till 7,0 med saltsyra.
- Späd ut denna 5 X stamlösning till en 1 X arbetar koncentration i ultrarent vatten i en steril behållare såsom en stor kapacitet KORGFLASKA (se Tabell för material). Använd denna 1 X lösning för att upprätthålla asexuell planarians.
Obs: Som ett alternativ till Montjuïc salt lösning, använda lokalt inköpta källvatten eller ultrarent vatten som innehåller ett kommersiellt tillgängliga akvarium salt blanda (se Tabell för material) vid en koncentration of0.5 HB18. - För att förhindra bakteriell infektion i statisk kultur19, upprätthålla planarians i vatten som innehåller ett antibiotikum. Förbereda en 50 mg/mL stamlösning av gentamicin sulfat i ultrarent vatten och filter-sterilisera. Behållare där djur hålls, lägga till gentamicin sulfat till en slutlig koncentration på 50 µg/mL (1: 1000 utspädning).
- Upprätthålla planarians i en 1 X Montjuïc salt lösning. För att förbereda planarian vatten, göra individuella stamlösningar av 1 M CaCl2, 1 M MgSO4, 1 M MgCl2, 1 M KCl och 5 M NaCl i ultrarent vatten. Filter-sterilisera med ett 0,2 µm flaska-top filterfor långsiktig lagring.
-
Beredning av leverpastej
- Planarians trivs på en diet av ekologiska, gräs nötkött lever, köpa färska levern och process inom 24 h. ta bort membranös kapseln encapsulating levern genom att dra bort det försiktigt. Skär levern i ~ 1 cm kuber, och använda en kniv att skrapa bort och kasta alla nedsatt vener och artärer.
- Lös upp levern bitar med en mat kvarn eller en matberedare och sedan passera den genom en wire mesh mat SIL. Kombinera till konditorivaror väskor, och fördela i sprutor eller 35 mm petriskålar. Före utfodring, Centrifugera försiktigt för att ta bort luftbubblor.
- Lagra alikvoter av levern vid-80 ° C i upp till ett år och Tina innan du använder. Efter upptining skall frysas på nytt några överblivna levern en gång, eller förvaras vid 4 ° C i upp till 24 h.
-
Underhåll av djur
- Planarians kommer att växa och krympa till olika storlekar beroende på frekvensen av utfodring. Foder planarians varannan vecka (en gång var 14: e dag). För långsiktiga bulk kulturer, använda plast behållarna i olika storlekar (se Tabell för material).
- För att mata djur, Använd en metall spatel eller plast överföring Pipettera för att placera en ärtstor droppe levern i en låda. Tillåta att djur äter för 1-2 h. ta bort återstående mat innan du rengör rutan.
- Rengör masken två gånger i veckan om utfodras (en gång direkt efter utfodring och en gång två dagar senare), eller en gång i veckan om inte utfodras. För att rengöra, rinna vatten i en plast bägare genom att försiktigt hälla ut vattnet bibehållen planarians i rutan. Torka rutan ytan med en pappershandduk, sedan upprepa på alla sidor tills rutan är ren.
- Ersätta vatten (till cirka ¾ av rutan volymen) och lägga gentamicin till en slutlig koncentration på 50 µg/mL. Förvara djur i ett mörkt skåp eller i en 20 ° C inkubator.
-
Urval av maskar
- Välj maskar som matades 5-7 dagar före.
Obs: Det är betydligt svårare att amputera pharynges från maskar som har utfodrats nyligen (1-2 dagar före amputation). Utfodrade djur är också mer känsliga för natriumazid. - Välj maskar som är ungefär 6 mm i längd. För att uppskatta storleken på masken, överföra den till en petriskål med plast överföring pipett. Placera antingen platta 6 - in linjalen eller 5 x 5 mm rutat papper under petriskål och Mät längden mask medan det kryper.
Obs: Maskar som är mindre än 6 mm i längd är svårare att amputera.
- Välj maskar som matades 5-7 dagar före.
-
Beredning av natriumazid
- Bered en 100 mM av upplösning natrium natriumazid pulvret i planaria vatten.
Varning: Natriumazid är giftig och bör hanteras försiktigt. Kasta inte natriumazid i avloppet. Efter användning, samla in det separat för bortskaffande som farligt avfall.
- Bered en 100 mM av upplösning natrium natriumazid pulvret i planaria vatten.
2. svalget Amputation
- Plats maskar i en 35 mm diameter petriskål. Ta försiktigt bort alla planarian vatten från skålen med hjälp av en plast överföring Pipettera.
Obs: Högst 20 6-mm maskar kan bekvämt bo i en maträtt av denna storlek. - Placera skålen under mikroskopet och justera förstoringen så att flera maskar kan ses samtidigt (t.ex. 10 X förstoring). Ersätta planarian vatten med 100 mM natrium natriumazid lösning.
Obs: För en 35 mm petriskål räcker cirka 5 mL natriumazid. Lösningen bör helt dränka planarians. Justera lösning för större rätter som behövs. - Övervaka djuren under mikroskopet och avstå från att flytta skålen för de första 3-4 min.
- Observera extrudering av svalget genom mikroskopet; svalget kommer att sticka ut från faryngala påsen och utvidga fullt (cirka 1 mm i längd) som visas i figur 1B.
Obs: Det är viktigt att vänta tills svalget har avslutat förlängning helt innan du går vidare. När svalget framträder från djuret, tar helutdrag ungefär 1 min. - Använd en plast överföring Pipettera för att spruta djur runt skålen. Suga djuren i Pipettera och tvingas släppa dem i skålen ett par gånger. Om svalget är fullt utdragen, kommer att detta kraftfulla pipettering orsaka att lossa.
- Alternativt, tag svalget antingen lodrätt längs dess längd, eller horisontellt längs dess omkrets med ett par fina pincett (se Tabell för material) som visas i figur 1 c. Med svalget nöp i tången, lyft djuret uppåt mot menisken. Som djuret föds upp, kommer att ytspänning orsaka svalget kopplas loss från djuret.
Obs: Denna metod kan användas att ta bort pharynges av mindre djur (1-3 mm i längd) där kraftfull virvlande inte är tillräcklig. Undvik att peta eller annars skadar kroppen på djuret. - Använder en överföring Pipettera, flytta amputerade djur till en ny maträtt som innehåller färska planaria vatten.
- När överförts, skölj amputerade djur noga i planaria vatten, helt utbyta vattnet tre gånger. Överföra till en ny maträtt som innehåller planaria vatten med 50µg/mL gentamicin.
Obs: Komplett buffert utbyte under dessa tre tvättar är avgörande för avlägsnande av natriumazid. - Nästa dag, byta vatten i skålen med färska planaria vatten innehållande 50 µg/mL gentamicin. Upprepa varannan dag därefter.
3. bedömning av svalget borttagning efter Amputation
- Undersöka djur under ett mikroskop (med 10-20 X förstoring) för att avgöra huruvida en mörk fläck har dykt upp efter lyckad borttagning i svalget, som visas i figur 2A.
- Alternativt, fixa och bleka djur enligt protokollet beskrivs av Pearson et al. 20. blöt djur övernattning i 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) eller fluorescently-konjugerad streptividin (1 mg/mL utspädd 1: 500 1 X fosfat fosfatbuffrad saltlösning som innehåller 0,3% Triton-X). Montera djur på bilderna i 80% glycerol/20% 1 X fosfat fosfatbuffrad koksaltlösning och avbildning under en fluorescerande stereomikroskopet (figur 2B).
Obs: Alla bilder i detta manuskript fångades på en fluorescerande stereomikroskopet med ett 1,0 X-objektiv.
4. bedömning av svalget regenerering genom att mäta utfodring beteende
-
Beredning av levern
- Överföra erforderliga mängden av leverpastej i en mikrocentrifug eller koniska rör. Spinn kort för att avlägsna luftbubblor. Beräkna volymen av levern, och sedan lägga planaria vatten till 1/5 av dess volym, och 2% av den totala volymen i röd karamellfärg. Exempelvis till 1000 µL av levern pasta, tillsätt 200 µL planaria vatten och 24 µL av karamellfärg.
- Med plast mortel, pipettspetsen eller metall spatel, blanda tills karamellfärg fördelas jämnt i leverpastej. Snurra igen kort. Leverpastej kan lagras vid 4 ° C under 24 h eller fryst i alikvoter vid-80 ° C för långsiktig lagring.
- Om testning upp till 25 djur, förbereda 25 µL av leverpastej per maträtt (cirka 1 µL leverpastej per djur).
-
Utfodring djur
- Sju dagar efter kemiska amputation, överföra djur till en ny petriskål. Om testning 10-15 djur, använda en 35 mm maträtt; Mer än 15 djur bör testas i en 60 mm petriskål. Hålla djur i mörkret, ostört, för ca 1 h före utfodring.
- Med sax, öka bredden för en P200 pipettspetsen genom putsning ungefär ½ cm bort av den smala änden. Pipettera 25 µL av röda leverpastej i skålen.
Obs: Trimma slutet gör pipettering den trögflytande leverpastej lättare. För att förhindra levern flyter på ytan, på spetsen till botten av skålen medan dispensering. - Tillåta att djur foder i 30 min.
- Poäng antalen djur som har ätit genom att placera djuren på en vit bakgrund eller att undersöka dem i Mikroskop med 10-20 X förstoring.
- Efter utfodring, ta bort levern från skålen och rengör.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Exponering för natriumazid stör den normala motiliteten av planarians, orsakar djuren att sträcka och vrida. Dessa rörelser tvinga svalget växa fram från den ventrala sidan av djuret, och efter ca 6 min i natrium natriumazid lösning, den vita spetsen i svalget kan ses (figur 1B-vänstra panelen). Några minuter senare, djur kontrakt aktivt och förlänga fullt svalget genom kraftfullt trycka den ut ur kroppen. (Figur 1B-mellersta panel). Ca 11 min efter natriumazid exponering, djuren och svalget slappna av. I detta skede formen karakteristiska bell i svalget syns tydligt (figur 1B-högra panelen). För lätt amputation är det viktigt att vänta på svalget att slappna av.
Eftersom svalget är en stor, resulterar unpigmented massa av vävnad, ta bort det i uppkomsten av en mörk fläck på ryggsidan av amputerade djur (figur 2A). Denna mörka region är en visuell indikator av framgångsrika amputation med levande djur. Plats syns omedelbart efter amputation och blir mer framträdande nästa dag. Som svalget regenererar, lättar denna region. För att övervaka svalget regenerering mer exakt, djur kan färgas med DAPI eller fluorescently-konjugerad streptividin över natten (figur 2B). Att kvantitativt bedöma omfattningen av svalget regenerering, kan dess område mätas med ImageJ programvara.
Svalget är ett viktigt organ för chemosensation och mat intag. För att avgöra när dessa funktioner återställs under regenerering, används vi utfodring analyser för att övervaka djurens beteende. Genom att kombinera Livsmedelsfärgämnen med leverpastej, kunde vi urskilja djur som åt från dem som gjorde inte (figur 3A). Vi kvantifieras då antalet röda djur att bedöma andelen djur med en funktionell svalget. Baserat på resultaten i figur 3B, återställdes framgångsrika utfodring beteende 7 dagar efter amputation, som anger att en vecka efter svalget borttagning, djur har återskapas en funktionell svalget. För att testa om natrium natriumazid exponering påverkas utfodring beteende, vi indränkt djur i natriumazid men sköljde omedelbart före svalget utmatning. En dag senare, utvärderat vi huruvida mat söker beteende förändrades av natrium natriumazid exponering med utfodring analys. I motsats till kemiskt-amputerade djur saknar ett svalg, alla djuren behålla en intakt svalget efter natrium natriumazid exponering åt (n = 30 djur för varje villkor) mat. Detta resultat visar att natrium natriumazid exponering inte påverkar utfodring beteende, så länge svalget förblir intakt.
Figur 1 . Svalget utmatning och amputation. (A) Schematisk bild av planarian anatomi. (B) bilder av levande djur visar svalget utmatning vid blötläggning i 100 mM natriumazid. Röda pilarna Markera svalget. Skala barer = 750 µm. (C) bilden av levande djur (vänster) och Schematisk (höger) av amputation med pincett. Paneler visar två olika alternativ för att greppa svalget. Ventrala sida av djuret vänt uppåt. Skala barer = 500 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2 . Bedömning av svalget amputation och förnyelse. (A) representativa bilder av levande djur vid angivna tidpunkter före och efter amputation. Mellersta panelen visar mörk fläck i faryngeala regionen efter amputation, markerade med streckad vit ruta. Ryggsidan vänt uppåt. Skala barer = 500 µm. (B) representativa bilder av djur som färgas med Alexa488-streptividin vid angivna tidpunkter före och efter amputation. Mellersta panelen visar avsaknad av svalget efter amputation. Faryngeala regionen belysts av vit ruta. Ventral sidan vänd uppåt. Skalstapeln = 500 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3. Utvärdering av svalget regenerering. (A) bilder och Schematisk bild av utfodring assay, utförs genom att placera 25 µl av lever mitt i en 60 mm petriskål. Schematiska (överst, vänster) och bilden (mitten) Visa utfodring beteende hos djur med intakt pharynges. Övre högra, bilden av djur som har ätit. Schematiska (nederst till vänster) och bilden (mitten) av utfodring beteende hos djur 1 dag efter amputation. Botten höger, djur som inte har ätit. Skalstapeln = 750 µm. (B) resultaten av utfodring assay. Andelen djur som har intagit mat (kvantifieras av rödfärgning) vid specifika tidpunkter efter amputation. För varje tidpunkt, n = 10 djur, upprepas i tre exemplar. Felstapel = SD. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det här protokollet beskriver en metod för selektiv ablation av svalget med natriumazid. Andra riktade ablation studier i planarians har använt modifierade operation ta bort fotoreceptorer21 eller farmakologisk behandling att ablatera dopaminerga nervceller22. En betydande fördel med kemiska amputation över befintliga metoder är att det inte kräver kirurgi. Svalget jämfört med resten av planarian kroppen styv struktur underlättar dess avlägsnande från djuret, vilket är mycket mjukare arbetsföra. Också, svalget lossnar från djuret en liten junction (matstrupen)30 förbinder svalget och tarmen, generera ett mer reproducerbar sår än en inducerad av ett större kirurgiska verktyg. Baserat på dess fysiska egenskaper och små anatomiska kopplingen till resten av djuret, genererar svalget borttagning därför mer homogen sår än andra kirurgiska amputationer.
Längden på exponering för Natriumazid är också avgörande för att lyckas med denna teknik. Även om kort exponering för natriumazid inte påverkar negativt planarians, långvarig exponering är giftigt och kommer så småningom att döda djur. Natriumazid är kända för att hämma energiberoende processer genom hämning av cytokrom oxidas23,24. Dessutom, dämpar det transkription och translation, sannolikt av ansamling av viktiga komponenter i dessa reaktioner i stress granulat25. I planarians dämpar natrium natriumazid exponering Mitos för 24 h, varefter celler återuppta spridning12. Ändringar övervinna såsom att begränsa tiden för natriumazid exponering, ta bort natriumazid med noggrann sköljning och redovisning för övergående mitotiska dämpningen i experimentell design kan hjälpa dessa begränsningar.
Svalget och dess karakteristiska radiell symmetri unika anatomiska ställning möjliggör lätt skillnaden av nyligen regenererad faryngala vävnad från redan existerande stamceller. Svalget regenerering kan övervakas på cellulär och anatomiska nivåer använder vävnad fläckar som streptividin och DAPI, immunohistokemi, eller i situ -hybridisering-26. Utfodring analysen beskrivs här analyser funktionell förnyelse i svalget. Chemotaxis mot mat kräver i svalget27,28 och djur utan en fullt fungerande svalget kan inte svälja mat. Denna enkla, kvantitativ bedömning av organfunktion kompletterar därför strukturella regenerering. Dessutom kemiska amputation kan utföras på populationer av djur och kan generera många djur med identiska skador. Förfarandet är därför praktiskt för storskaliga studier. Dessa fördelar, tillsammans med det faktum att regenerering av en mogen svalget kräver stamceller, gör svalget amputation en idealmodell att studera orgel regenerering. Används i kombination med bredare amputationer, kan svalget borttagning användas för att testa hypoteser om hur såret storlek och anatomisk position påverkar stamceller svaret på skadan, som är en nyckelfråga i regenerering fält21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka Alejandro Sánchez Alvarado, som stödde det ursprungliga optimering och utveckling av denna teknik. Arbete i Carolyn Adlers laboratorium stöds av Cornell University nystartade fonder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2) | Fisher Chemical | C79-3 | Montjuïc salt solution |
| Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4) | Fisher Chemical | M65-3 | Montjuïc salt solution |
| Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2) | Acros/VWR | 41341-5000 | Montjuïc salt solution |
| Potassium Chloride (KCl) | Acros Organics/VWR | 196770010 | Montjuïc salt solution |
| Sodium Chloride (NaCl) | Acros Organics/VWR | 207790050 | Montjuïc salt solution |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Acros Organics/VWR | 123360010 | Montjuïc salt solution |
| Nalgene autoclavable polypropylene copolymer lowboy with spigot | ThermoFisher Scientific/VWR | 2324-0015 | Storing planaria water |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands | Amazon | Planaria water |
| Gentamicin Sulfate | Gemini Bio-products | 400-100P | Planaria water |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 71970 | Mincing liver |
| Disposable pastry bags-16”, 12 pack | Wilton | Amazon | Liver aliquots |
| 5 mL syringes | BD/VWR | 309647 | Liver aliquots |
| Petri dishes-35mm/60mm | Greiner Bio-One/VWR | 82050-536/82050-544 | |
| Plastic containers (various sizes) | Ziploc | Amazon | Housing planarians in static culture |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Transfer pipette | Globe Scientific | 138030 | |
| Forceps - Dumont Tweezer, Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D (0203-5-PO) | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62247 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher | S11223 | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-1 |
References
- Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Dev. Cell. 21, 172-185 (2011).
- Tanaka, E. M. The Molecular and Cellular Choreography of Appendage Regeneration. Cell. 165, 1598-1608 (2016).
- Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat. Protoc. 3, 948-954 (2008).
- White, D. T., Mumm, J. S. The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish. Methods. 62, 232-240 (2013).
- Smith-Bolton, R. K., Worley, M. I., Kanda, H., Hariharan, I. K. Regenerative growth in Drosophila imaginal discs is regulated by Wingless and Myc. Dev. Cell. 16, 797-809 (2009).
- Smith-Bolton, R. Drosophila Imaginal Discs as a Model of Epithelial Wound Repair and Regeneration. Adv. Wound Care. 5, 251-261 (2016).
- Newmark, P. A., Sánchez Alvarado, A. Not your father's planarian: a classic model enters the era of functional genomics. Nat. Rev. Genet. 3, 210-219 (2002).
- Reddien, P. W., Sánchez Alvarado, A. Fundamentals of planarian regeneration. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 20, 725-757 (2004).
- Wagner, D. E., Wang, I. E., Reddien, P. W. Clonogenic neoblasts are pluripotent adult stem cells that underlie planarian regeneration. Science. 332, 811-816 (2011).
- Scimone, M. L., Kravarik, K. M., Lapan, S. W., Reddien, P. W. Neoblast specialization in regeneration of the planarian Schmidtea mediterranea. Stem Cell Reports. 3, 339-352 (2014).
- van Wolfswinkel, J. C., Wagner, D. E., Reddien, P. W. Single-cell analysis reveals functionally distinct classes within the planarian stem cell compartment. Cell Stem Cell. 15, 326-339 (2014).
- Adler, C. E., Seidel, C. W., McKinney, S. A., Sánchez Alvarado, A. Selective amputation of the pharynx identifies a FoxA-dependent regeneration program in planaria. Elife. 3, e02238 (2014).
- Adler, C. E., Sánchez Alvarado, A. PHRED-1 is a divergent neurexin-1 homolog that organizes muscle fibers and patterns organs during regeneration. Dev. Biol. 427, 165-175 (2017).
- Wong, M. C., Martynovsky, M., Schwarzbauer, J. E. Analysis of cell migration using Caenorhabditis elegans as a model system. Methods Mol. Biol. 769, 233-247 (2011).
- Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C elegans chemotaxis assay. J. Vis. Exp. , e50069 (2013).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 177 (2012).
- Tasaki, J., Uchiyama-Tasaki, C., Rouhana, L. Analysis of Stem Cell Motility In Vivo Based on Immunodetection of Planarian Neoblasts and Tracing of BrdU-Labeled Cells After Partial Irradiation. Methods Mol. Biol. 1365, 323-338 (2016).
- Roberts-Galbraith, R. H., Brubacher, J. L., Newmark, P. A. A functional genomics screen in planarians reveals regulators of whole-brain regeneration. Elife. 5, (2016).
- Arnold, C. P., et al. Pathogenic shifts in endogenous microbiota impede tissue regeneration via distinct activation of TAK1/MKK/p38. Elife. 5, (2016).
- Pearson, B. J., et al. Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians. Dev. Dyn. 238, 443-450 (2009).
- LoCascio, S. A., Lapan, S. W., Reddien, P. W. Eye Absence Does Not Regulate Planarian Stem Cells during Eye Regeneration. Dev. Cell. 40, 381-391 (2017).
- Nishimura, K., et al. Regeneration of dopaminergic neurons after 6-hydroxydopamine-induced lesion in planarian brain. J. Neurochem. 119, 1217-1231 (2011).
- Wilson, D. F., Chance, B. Azide inhibition of mitochondrial electron transport. I. The aerobic steady state of succinate oxidation. Biochim. Biophys. Acta. 131, 421-430 (1967).
- Duncan, H. M., Mackler, B. Electron Transport Systems of Yeast: III. Preparation and properties of cytochrome oxidase. J. Biol. Chem. 241, 1694-1697 (1966).
- Buchan, J. R., Yoon, J. H., Parker, R. Stress-specific composition, assembly and kinetics of stress granules in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Sci. 124, 228-239 (2011).
- Cebrià, F. Organization of the nervous system in the model planarian Schmidtea mediterranea: An immunocytochemical study. Neurosci. Res. 61, 375-384 (2008).
- Shimoyama, S., Inoue, T., Kashima, M., Agata, K. Multiple Neuropeptide-Coding Genes Involved in Planarian Pharynx Extension. Zoolog. Sci. 33, 311-319 (2016).
- Ito, H., Saito, Y., Watanabe, K., Orii, H. Epimorphic regeneration of the distal part of the planarian pharynx. Dev. Genes Evol. 211, 2-9 (2001).
- Bueno, D., Espinosa, L., Baguñà, J., Romero, R. Planarian pharynx regeneration in tail fragments monitored with cell-specific monoclonal antibodies. Dev. Genes Evol. 206, 425-434 (1997).
- Hyman, L. The invertebrates: Platyhelminthes and Rhynchocoela, the acoelomate Bilateria. , McGraw-Hill. (1951).
