Summary
そのネイティブなバインディング先のコンテキストと生物物理特性 x 線蛍光と radiometal の吸収を提示してその基板の内容でペリプラズム遷移金属シャペロンの抽出のためのプロトコル。
Abstract
我々 は細胞質から細菌ペリプラズムの分離のためのスケーラブルな方法を示します。生物物理学的特性とペリプラズム、細胞質コンパートメント間測定基板搬送を目的としてペリプラズム蛋白質を浄化するために用いられます。慎重に制限するペリプラズム、細胞質から区切られた時間と、実験者は興味の蛋白質を抽出し、コンパートメント間繰越汚染なし基板に対して個別に各区画を分析できます。分別から抽出されたタンパク質は、三次元構造の決定または基質結合プロファイルをさらに分析できます。また、別の細菌のコンパートメントの間で合計のパーセント吸収としてトレーサーの分布を決定する (およびそれ故に金属の輸送) するラジオト レーサーの孵化後このメソッドを実行できます。実験、検査は生理基板と artefactual 基板、mismetallation によって引き起こされるものなどの区別を助けることができます。
蛍光 x 線は、成長条件、精製条件および/または結晶化条件の製品として金属混入で生じる変化を測定し同様、サンプル、金属混入の有無を発見する使用ことができます。蛍光 x 線も異常 x 線散乱データの収集に使用する最高の金属エネルギー吸収ピークを決定する使用ことができますそれぞれの金属の豊かさの指標を提供します。Radiometal の取り込みは、蛍光 x 線検出基板の生理的特性を検証するだけでなく、新規基板の検出をサポートする方法として使用できます。
Introduction
グラム陰性菌は、遷移金属原子の細胞質のプールを増加し、内膜に金属の転流を軽減する内膜 ABC (ATP 結合カセット) 輸入者によって補充されます。ペリプラズム クラスター A-1 基質結合タンパク質 (SBPs) は、金属原子を直接バインドし、同種の ABC の輸入業者の1にそれらを提供するペリプラズムを介してそれらをフェリー シャペロンのグループを作成します。キレート金属 (クラスター A-2)、(クラスター B と D-1)、炭水化物、アミノ酸などの基質の輸送に専念して SBPs の他のクラスター (クラスター B、C、F-2 と F-4);それにもかかわらず、関係なく、基板、SBPs c クランプ倍の進化的に保存されている2に従ってください。SBP 基板搬送機構一般化された提案には、一連のハエトリグサ3のようにこじつけ c クランプが含まれています。一般に、これら SBPs の研究は実験4のための蛋白質の apo (メタルフリー) フォームを生成するの難しさによって制限されますが、クラスター A-1 SBPs はホロ (金属-バインド) 形式で浄化します。までに、apo を研究するための戦略クラスター A-1 SBPs は変異誘発・透析・ エチレンジアミン酸 (EDTA) キレート剤5,6,7,8部分変性に限られています。,9,10,11. これらの実験からの構造データは、クラスター A-1 SBPs がハエトリグサ メカニズムに正確に従っていないことを示唆しています。Apo クラスター A-1 SBPs生体内の生理学的な結合パートナーを使用しての製造方法は、文献から現在行方不明します。
YfeA、ペストからクラスター A-1 SBP、YfeBCDE ABC その生理学的な同種の輸入業者との対話を通じて apo 形式に変換されたペストの病原体を浄化するためにセル分別を使用して最初の時間を示すセル。YfeA は、エネルギー分散型 x 線分光 (EDS)、として知られている蛍光 x 線による apo フォームを紹介します。また、外側の膜の間で金属の取り込みと内膜の間で金属のインポートと区別するために機密性の高い放射性金属吸収研究細胞分画を組み合わせることによって YfeBCDE 機能を示します。このような技術として誘導結合プラズマ質量分析法 (ICP-MS) または原子吸光分析 (原子吸光) の pg/L 金属、検出限界よりはるかに低い量の検出のため放射性トレーサーの使用が可能します。検討されているシステムの最小限の摂動が可能になります。さらに、大量のサンプル、追加の後処理とターンアラウンド時間が長く、ラジオト レーサーの試金のために典型的ではない頻繁に記載されている従来の方法が必要です。したがって、するラジオト レーサーを使用して金属分布と細胞内取り込みを監視するための便利で簡単なメソッドを提供します。クラスター A-1 SBP はこのメソッドを使用して生成される apo apo タンパク質を生成するために使用する現在の慣行から構造観察をエコーでしょうかどうか決定するが残っています。
セル分別は分離12でその内容を具体的にプロービングの暗黙の目的のための細胞コンパートメントを分離するための確立された方法です。セル分別は、細胞周期の間に分子の場所を確認または特定区画13の活動を測定する使用されます。たとえば、金属輸送活動は、金属基板の細胞コンパートメントをプロービングによって試金することができます。セル分別の統合により、区別と外側の膜の間で金属の取り込みと内膜を介した金属転送と比較できます。これらのプロセスは、その後は時間をかけて測定順番できます。蛋白質の浄化、セル換散の最も一般的な方法と非水溶性成分の水溶性成分の分離が機械的破壊 (すなわち、粉砕、ブレンド)、高圧均質化 (すなわち、フランス圧力セル出版、セル撹乱物質) と超音波の周波数 (すなわち。、超音波)14。細胞を溶解する超音波の周波数を使用は、一般的に小さなボリュームに最適ただし、超音波は、タンパク質を変性することが過度の熱を生成する知られています。過度の熱を生成する避けるために、超音波の周波数はシーケンシャルの短いバーストは、時間がかかることが誤って小さな断片に DNA 分子を低下でき、通常に適用されます。また、複数の高価な超音波プローブと、各プローブには処理することができますサンプル ボリュームの限られた範囲にことがあります分取および分析実験のため必要。セル換散の中に溶解する前にフランス圧力セル プレス部品を低温または寒い部屋など寒冷環境下で細胞攪乱を動作によって過度の熱を生成する細胞を溶解する高圧の使用を回避できます。超音波プローブのようなフランス圧力セル プレス部品の複数のセットはサンプル ボリュームの広い範囲を処理する購入する必要があります。アセンブリは、簡単に接続しますが、動作し、きれいな、厄介なフランス圧力セル出版は移動する重いことができ、密なサンプルから目詰まりしやすい。細胞を溶解する超音波の周波数および高圧システムを使用する利点は、高回収、最小限の交差汚染と複数のサンプルを処理する能力と、調節可能なせん断力、換散の最適化に対応できます。サンプルの種類の広い範囲。超音波の周波数を調整することによって最適化することができます発生するバースト、ピストン圧力ポンド平方インチ (psi)、マスコミを通じてパス数あたりの期間。細胞を溶解する機械の中断のセル換散のため技術的には最も簡単な少なくとも高価な戦略があります。機械的破壊サンプル回復に課題を提示することができます、複数のサンプルの処理には適していません。機械的破壊サンプルより高圧や超音波の周波数よりも高スループットではありません、非能率的な換散になりやすいです。機械的破壊、高圧均質化と超音波周波数の重要な実験的制限は全体の細胞構造の手に負えない中断すべて水溶液中の細胞成分の混合溶解後、一緒に。さらに、すべての細胞コンパートメントを同じ時に中断しません。したがって、早く溶解するコンパートメントの内容は遅く溶解コンパートメントの内容よりも長く継続的な破壊的な影響されることが。セル分別分離でき、安価な技術的に簡単に、効率的なコンパートメントに基づくセルの内容の高価な機器と厳しく、破壊的な力をサンプルの露出のための必要性を回避しながら。
、SBP の場合インポートされた基板はアポ蛋白質潜在的に再導入し、下流クロマトグラフィーまたはその他の浄化技術の前に、換散の中にホロ タンパク質を再生します。溶解中に EDTA キレート剤の封入は、蛋白質の浄化の第一歩として金属アフィニ ティーが可能な EDTA はクロマトグラフィー樹脂から金属を除去し、15を結合蛋白質を防ぐため、追加の障害を示します。シンプルで安価なソリューションは、差動遠心分離および共通の研究用試薬は、慎重に十分な蛋白質の機能解析を抽出する調査官を有効に浸透圧刺激による細胞分画です。高浸透圧刺激の分別は、別の細胞コンパートメントに浸透圧の 2 段階変化を利用しています。まず、高張バッファーにより細胞水の葉各セルと第二に、低張性のバッファーが膨らむように水を再入力の各セルにセルに crenate。外側の膜細胞がどのくらい膨らむを精緻に制御、(のために入って来る水から浸透圧の蓄積)、選択的に分離することができますこのようにバッファーにその内容を空にします。内側の粘膜の保全により、細胞質の内容スフェロプ ラストで保持される遠心分離でペリプラズム内容から簡単に区切られます。
YfeA は、polyspecific SBP 鉄, マンガンおよび亜鉛原子16をバインドすることが可能です。株式会社金属の相対的な割合成長、中に金属の補充によって変わることが、よう x 線蛍光アッセイ アルゴンヌ国立研究所の高度な光子源16で利用できます。蛍光 x 線により短時間を必要とせず金属の広いアセンブリをプロファイリングする捜査官大または回折品質結晶タンパク質沈殿物またはタンパク質溶液からデータを収集することができますも。
蛍光 x 線すぐに明らかにできる予期しない結果といった、この場合、亜鉛をされているプライマリ YfeA 基板と、文書化された生理学的基質鉄やマンガンではない16。X 線散乱データを収集する前に使用する蛍光 x 線は異常 x 線散乱データの収集に使用する金属エネルギー エッジなど、実験的なデザインの調査官を知らせることができます。金属、蛍光 x 線の相対的な豊かさはまた金属が存在しないかどうかを判断できますを決定するようにちょうど有用なサンプル ホロ タンパク質からアポ蛋白質を含んでいると推定金属結晶を分離する迅速な方法を提供する信号強度時間のかかるデータ処理の必要性なし信号が強い金属サンプルを識別、多波長異常分散 (MAD) スキャンで異常 x 線散乱データの収集に使用する正確な波長を決定できます。
この詳細なプロトコルは、新しい実験者正常にセル分別を行い総金属含有量をプロファイル化し金属結合タンパク質の研究を進める放射光ビームライン ハードウェアの効果的な利用を支援するものです。
Protocol
1. 細菌スターター文化 (1 日目)
- 200 mL のベベル フラスコ ルリア ベルターニカミラ スープ (LB)大腸菌BL21 CodonPlus (DE3) 株を 30 mL に接種-RIPL 細胞含む pYFE3 プラスミド16。
- ピペットと 200 μ L チップ吸引によってフラスコに 30 μ L アンピシリン 50 mg/mL を追加します。37 ° C で 225 rpm で一晩横に振る。
2. 補われた M9 最小媒体を準備 (2 日目)
注: これは Amresco マニュアルから適応です。
- 以下の手順で液体媒体の 6 L を準備します。2 L のベベル フラスコで M9 最小媒体の 10.5 g を超純水 H2o ・ オートクレーブ 121 ° C 20 分間で 1 L に追加し、部屋の温度に冷却してから。
- 無菌次滅菌補足ソリューションを追加: 1 mL/L アンピシリン 50 mg/mL の 0.1 mL/L 1 M CaCl2w/v グルコース 20 %10 mL/L 1 M MgSO4の 2 mL/L。生物学的安全キャビネットの無菌環境を維持するために、この手順を実行します。37 ° C にメディアを温めます。
3. 細菌サブカルチャー
- M9 最小媒体に自動ピペット 5 mL ヒントと吸引で一晩スターター文化の 5 mL/L を追加します。9 h の 37 ° C で 225 rpm で継続的にサブカルチャーを振る。
注: この手順中に YfeABCDE 過剰発現ネイティブから autoinduction によって雄ペストプロモーター。 - 4 ° C で 30 分間 4,500 × g で遠心分離によって細胞を回復します。ピペット、1 mL 先端吸引で 50 ml の冷たいリン酸緩衝液 (20 mM Na2HPO4 pH 7.6, 50 mM NaCl) の細胞を再懸濁します、-80 ° C で一晩を凍結します。
4. セル分別 (3 日目)
- 雪解けの 4 ° C で 20 分間 4,000 x g で 4 ° C とペレットの細胞を再懸濁。自動ピペットと 25 mL 先端吸引で 50 ml の冷たい高塩バッファー (200 mM トリス塩酸 pH 8.0、400 ミリメートル、塩化ナトリウム、2 ミリメートルの EDTA) の細胞を再懸濁します。時折反転を混合するために 20 分間氷の上の懸濁液を孵化させなさい。
- 4 ° C で 20 分間 4,500 x g で細胞をペレットします。自動ピペットと 25 mL 先端吸引で 50 mL の冷たい低塩バッファー (10 mM トリス塩酸 pH 8.0) で細胞を再懸濁します。時折反転を混合するために 20 分間氷の上の懸濁液を孵化させなさい。
- 4 ° C で 20 分間 4,500 x g でスフェロプ ラストをペレットします。ペリプラズムを含む上清を回復します。ペレットのスフェロプ ラストをリン酸緩衝食塩液 (ステップ 3.2) で自動ピペットと 25 mL の先端、吸引によって再懸濁します、1500 psi でフランス圧力セル出版物の 3 つのサイクルで細胞を溶解させます。
注: フランス圧力セル出版は動作しにくい場合、セル換散を駆動する油圧ポンプを使用しています。油圧ポンプ、押す、ピストンの適切なアライメントを確保し、油圧ポンプのハンズフリーを従事するときは、注意を使用します。 - 4 ° C で 20 分間 50,000 x g で細胞の残骸をペレットします。細胞質を含む上清を回復します。必要に応じて、分別された16の外側と内側の膜がさらにすることができます。
5 FPLC を使用して蛋白質の浄化
- 直後に分別、0.45 μ m 膜ユニットを使用してペリプラズム画分をフィルターします。使いやすさと急速濾過、ルアーロック シリンジ フィルターを使用します。20 mM トリス pH 7.6, 0.05 %w/v ナン3 5 mL/min の流量でバッファーを読み込むを使用して 5 mL Q 陰イオン交換カラムを平衡します。
- 20 mM トリス pH 7.6, 0.05 %w/v ナン3 20 mM Tris pH 7.6 を使用して 5 mL Q 陰イオン交換カラムを洗浄する続行 2 mL/分の流量でバッファーを読み込むを使用してあらかじめ釣合い 5 mL Q 陰イオン交換カラムにペリプラズム濾液をロードします。、0.05 %w/v ナン3読み込みバッファー 5 mL/min の流量で A280 のベースライン読書を達成するまで。
- 20 mM Tris pH 7.6, を使用してバインドされたタンパク質を溶出 0.05 %w/v ナン30 - 1 M の NaCl280ピーク結合分画 5 mL/分の流量で線形グラデーション以上 10 列ボリュームを。Apo YfeA は、200 mM の NaCl と 300 mM の NaCl とた。
- ボリューム ~ 5 mL に達するまで、遠心濃縮器による溶出液を集中します。
- 20 mM ビス トリス ph 6.3, 50 mM NaCl、2.5 mL/分の流量で 0.05 %w/v ナン3ゲルろ過バッファー Superdex 200 pg のゲル濾過のコラムを平衡させ。
- 負荷集中の陰事前釣合い Superdex 200 pg ゲルろ過カラムに溶出液を交換し、2.5 mL/分の流量でステップ 5.5 からゲル濾過のバッファーを使用して浄化を組み合わせて 〜 30 に対応する280ピークを含む分数kda タンパク質。
メモ: 次のリファレンスは、FPLC プロトコル17を実証する実験例です。
6. タンパク質の結晶化
- 22 mg/mL の最終的なタンパク質濃度に遠心濃縮器によるゲルろ過溶出液を集中します。
- 蛋白質の集中を計算する、1.276 mg/mL を読んで A280を割る。この理論の消散係数は、ExPASY ProtParam18によって予測されました。
注: A280サンプル朗読 5.104 の AU は 4.000 mg/mL ソリューションに対応5.104 AU ÷ 1.276 mg/mL = 4.00 mg/mL。
- 蛋白質の集中を計算する、1.276 mg/mL を読んで A280を割る。この理論の消散係数は、ExPASY ProtParam18によって予測されました。
- ピペットと 10 μ L チップ吸引によってドロップ セットアップを吊り下げたり、ドロップを座っているの w/v 30% PEG 4000、50 mM NaCl、20 mM ビス トリス pH 6.3, 0.05 w/v ナン3の 1.5 μ L でタンパク質のミックス 1.5 μ。
- 293 K で結晶化ドロップを 2-4 週間にインキュベートします。
- フラッシュ凍結結晶シンクロトロンへの出荷のための液体窒素のプールに。
7. x 線蛍光 (GM/CA ビームライン ソフトウェアを使用)
- 使用エネルギーに対してエネルギーを 10.0 に設定する [ハッチ] タブに移動して、keV です。
- インタラクティブタブ マウント サンプルにスキャンのタブ移動に移動します。
- 最適化蛍光信号を選択します。入力 4.00 s時間小見出しの下。蛍光スペクトルを取るを選択します。[プロット] タブを使用してスペクトルを表示します。
8. MAD スキャン金属エネルギー吸収ピーク (GM/CA ビームライン ソフトウェアを使用)
- ビームからサンプルを移動します。周期表タブをスキャンタブ移動への移動は、目的の要素の K エッジを選択します。
注:エネルギー小見出しのエネルギー値は eV です。 - ハッチタブ使用エネルギー小見出し keV でステップ 8.1 で値にエネルギーを設定するに移動します。
- 梁にサンプルを移動します。自動タブ入力 2.00 の時間サブヘッダーの下にスキャンのタブ移動に移動します。
- スタートをスキャンを選択します。[プロット] タブを使用して MAD スキャンを表示します。
注:ピーク小見出しのエネルギー値は keV よりもむしろ eV です。 - 蛍光を選択します。
- ビームからサンプルを移動します。ハッチタブ使用ステップ 8.4 で値にエネルギーを設定するエネルギーに対して次の eV に切り上げに移動 (すなわち、ピーク: 9658.3 eV 9659 ev のエネルギーの設定)。
- 梁にサンプルを移動します。データ セットを収集します。ステップ 8.1 8.6 関心のすべての金属に対して繰り返します。
9. 分析放射性金属取り込みアッセイ プロトコル
- 14 mL 培養管の大腸菌 BL21 CodonPlus (DE3)と LB の 5 mL に接種-RIPL 細胞含む pYFE3 プラスミド16。ピペットと 10 μ L チップ吸引 50 mg/mL アンピシリンの 5 μ L を追加します。7 h の 37 ° C で 225 rpm で横に振る。
- 卓上遠心力を利用して常温で 1 分間 15,000 × g で細胞をペレットします。先端のピペット、1 mL で吸引によって補われた M9 最小媒体の 1 mL のセルを洗浄します。もう一度繰り返します。
- 50 mL の円錐管には、30 mL にサブカルチャー セルは、M9 最小媒体を先端のピペット、1 mL で吸引によって補われます。9 h の 37 ° C で 225 rpm で横に振る。
- 1 分 (cpm) あたり約 100,000 カウントを達成するために必要な放射能の量を決定します。
注: これはラジオ アイソトープと検出に使用される楽器によって異なります。たとえば、 52Mn の 7.4 kilobecquerel (kBq) (0.2 マイクロ キュリー (µCi)) が含まれているサンプルは、自動ガンマ検出器 (NaI) の 550,000 cpm の読書を与えます。したがって、100,000 cpm のカウントを取得するために必要な放射能の量が次の式を使用して決定できます: (100,000 cpm/550,000 cpm) * 7.4 kBq (0.2 µCi) = 1.35 kBq (0.036 µCi)。
注意: 放射性崩壊は有害である電離放射線の放出の結果します。放射能を操作するときは常に適切なシールドを使用し、距離が増加し、露光時間を削減しながらシールドのとして低として合理的に達成可能な (ALARA) の原則に従います。訓練された人員だけは、放射性物質の使用のためのライセンスは、特別に指定された所で放射能を扱うべきです。 - 必要な放射能の総量を決定するためのサブカルチャーの総量で計算ステップ 9.4 に必要な放射能を乗算します。(できれば、50-100 μ L の少量) で額を 100,000 cpm/mL と 30 もの渦があるように、サブカルチャーを含むチューブに追加 s。
注記: サブカルチャーの 31 mL 必要な放射能の総量は 31 mL = 41.3 kBq (1.12 µCi) x 1.35 kBq (0.036 µCi)。 - 因数個々 1.5 mL 遠心分離機にサブカルチャー (今放射性トレーサーを含む) の 1 mL 管先端のピペット、1 mL で吸引によって、1 × g 十分な管の 3 つがあります、含めるにボルテックスとの 37˚C thermomixer の場所をそれぞれの複製基準として使用する 3 つの追加の複製と同様、測定を希望 (脇に基準、基準の分別分析を実行しません)。
注: 1、2、および 4 h で試金 12 管総必要になります。 - インキュベーション後、チューブ 30 15,000 × g で遠心分離機の s (4 ° C に冷却できれば) ベンチトップ遠心分離機を使用して、培養上清を捨てます。
- 氷冷 1 mL の細胞を再中断、高塩ピペット、1 mL 先端吸引によってバッファーの (手順 4.1)、すぐに 20 分間氷の上。
- 30 15,000 × g で再び細胞のペレット (4 ° C に冷却できれば) ベンチトップ遠心分離機を使用して s と培養上清を捨てます。
注: 上清には、関連付けられていない金属自由にはが含まれています。 - 氷冷のセルを再中断、低塩ピペット、1 mL 先端吸引によって (ステップ 4.2) バッファーに格納し、20 分間氷の上を孵化させなさい。
注: この手順のピペットで優しく吸引することが重要です。 - 30 15,000 × g で細胞のペレット s、および収集各培養上清を新しい 1.5 mL チューブを遠心します。今の時点ごとに六つのチューブをする必要があります。
注: 上清はペリプラズム画分を含み、ペレットが入っている、膜と細胞質画分。我々 は細胞質画分としてペレットを参照してください。 - 各画分 (時点あたり 6 管) だけでなくステップ 9.6 脇基準で放射能を測定します。すべてのサンプルに追加した放射能の総量を決定するのに基準の放射能の量を使用します。
- ペリプラズムに放射性の取り込みのパーセンテージを決定するには、次の式を使用: (標準のペリプラズム画分/平均インプレッション単価の平均 cpm) x 100。
- 細胞質における放射性吸収量のパーセンテージを決定するには、次の式を使用: (基準の細胞質分画/平均インプレッション単価の平均 cpm) x 100。
- % 総摂取量を決定する次の式を使用: ((ペリプラズム画分 + 対応する細胞質画分の平均インプレッション単価の平均 cpm) (基準のインプレッション単価を平均)/) x 100。
Representative Results
SDS ページのゲル、ゲルろ過クロマト グラムは、分取ペリプラズム分別から蛋白質の浄化の質を評価する収集されました。YfeA が以前にされているホロの浄化説明16;ただし、apo YfeA の浄化は報告されていません。Apo YfeA この手法で説明を浄化するために戦略が特に 1 つの蛋白質イムノブロット (すなわちタグ)、およびモノクローナル抗体のために使用できるあらゆるの種類の親和性タグが含まれていない組換え野生型構成要素を使用します。記載されていない YfeA を認識しています。したがって、質量分析は、YfeA の浄化を確認に利用されました。分画によって YfeA を浄化するためには、陰イオン交換クロマトグラフィー (図 1) の溶出の線形グラデーションを使用することをお勧めします。溶出の線形グラデーションは、デンシトメトリー (図 1) によって計算された陰イオン交換製品の 49% にペリプラズム画分の約 8 割を占めることから YfeA 濃縮を著しく向上します。この組成物はゲル濾過により 61% に改善し、アポ蛋白質の溶出量はホロ蛋白質 (図 2) の溶出量と同じです。質量分析では、50 のユニークなポリペプチド スペクトル 24 ユニークなペプチド、246 合計 YfeA ポリペプチド スペクトル YfeA アミノ酸 92.5% 検出による YfeA の浄化を確認します。また、ステップのグラジエントから製品の線形グラデーション製品を対照的には、YfeA は 250 mM の NaCl (図 1) の溶出のステップによって 50 mm NaCl 続いて洗浄ステップの陰イオン交換精製しました。ステップ グラデーションわずかデンシトメトリーによって計算された陰イオン交換製品の 18% にペリプラズム画分の 17% を構成するから YfeA を豊かに。ステップ グラジエント豊か蛋白質汚染バンドその質量分析法による同様の分子量の複数のエシェリヒア属大腸菌SBPs が検出されました。ハイロード 26/600 Superdex 200 pg、分子量と汚染 SBPs の構造の類似性の解像度限界ゲル濾過わずか YfeA 濃縮ゲルろ過製品の 20% に向上しました。線形溶出グラデーション達成されるべきない陰イオン交換、それこれらの汚染物質を除去するために必要な塩化ナトリウムの濃度を識別するために 25-50 mM NaCl 単位で複数のステップ洗浄を探索することをお勧めします。
精製 apo とホロ apo とホロの YfeA 結晶の形態のイメージを示す apo とホロの結晶成長の違い YfeA 状態 (図 3) が、YfeA が同じ結晶化条件で結晶化します。質量分析法の検証に加えてこの法で精製タンパク質から結晶から収集した x 線回折データ (表示されていません) は精製と YfeA の結晶化を確認しました。蛍光 x 線スペクトル (図 4) をキャプチャすることによりコンパートメント汚染 (細胞質亜鉛ペリプラズム画分にホロ蛋白質 apo を元に戻す) の範囲を評価できます。亜鉛は主基板組換え YfeA16にバインドされているため、蛍光 x 線スペクトルで急速にホロ YfeA (図 4 a)、十字を示すものに見合った強力な亜鉛信号を含んでいる YfeA サンプル区別できます。汚染、または弱い亜鉛シグナルの apo YfeA と最小交差汚染 (図 4 b) の示唆に富む。M9 最小媒体の誘導結合プラズマ質量分析確認遷移金属レベルは、サブ マイクロモルの範囲 (表示されていません)。したがって、次の成功の分別のみ最小限微量遷移金属の検出が予想されます。分析分別 (図 5) は、radiometal トランスポートの速度を測定し、機能データのキャプチャに使用できます。スナップショット YfeA を発現する大腸菌細胞のペリプラズム、細胞質画分を比較するだけで完全 YfeABCDE トランスポーター、YfeABCDE コンポーネントのどれも単一の組換え蛋白質の表現の結果を明らかにする 60 分またはタンパク質の合成金属吸収 (図 6)。組換え蛋白質を表現するエシェリヒア属大腸菌細胞は輸送約52Mn ペリプラズムに最小限保持した細胞質をメディアに追加の半分です。この否定的な制御は、内因性マンガン輸送を表します。組換え YfeA を発現する大腸菌細胞は、 52Mn ペリプラズムに保持されます別の四半期と細胞質にメディアに追加のおよそ四分の一を運ばれます。ペリプラズム、細胞質に限られたトランスポートでマンガン保持 Yfe トランスポーターの不在で YfeA を生産することによってボトルネックとなる代謝需要を示します。組換え YfeABCDE トランスポーターを発現する大腸菌細胞輸送52Mn ペリプラズムに最小限保持した細胞質をメディアに追加のほぼ 100%。拡張マンガン輸送細胞質には、マンガン輸送 Yfe トランスポーターの寄与を示しています。
図 1。YfeA 分別精製します。A. Yfe トランスポーターの仮説的モデル。B. YfeA 陰イオン交換溶出の線形グラデーションを使用してペリプラズム画分精製の SDS ページのゲル。SDS ページのゲルは YfeA の充実を示しています (30 kDa) 浄化のステップ。黒い矢印は、YfeA の電気泳動の移動の位置を表します。分子の重量基準は右に表示されます。(1) ペリプラズム画分。(Q 2) 陰イオン交換カラムを通過。(Q 3) 陰イオン交換カラム ピーク溶出。(4) superdex 200 pg ゲルろ過カラム ピーク。C. YfeA 濃縮-良い例。Bからの SDS ページのゲルの画像処理は、デンシトメトリーによるゲルろ過製品の 61% にペリプラズム画分の 8% から増加する YfeA の全体的な濃縮を計算します。ブルー ボックスは、YfeA/総信号密度測定の計算に使用を示します。第 4 レーンでボックス化されたバンドの質量分析検出 259/280 YfeA アミノ酸、緑色でハイライトで紹介します。成熟したポリペプチドにアミノ酸は大文字黒太字で表され、切断信号ペプチドを構成するアミノ酸は、イタリック体の小文字の灰色のテキストで表されます。D. YfeA 濃縮 - 悪い例。SDS ページのゲル ペリプラズム画分からの YfeA の浄化のステップ グラジエント陰イオン交換からを用いるします。SDS ページのゲルは、浄化のステップにわたって YfeA の充実を示しています。黒い矢印は、陰イオン交換クロマトグラフィーの中に強化された主要な蛋白質の汚染物質の電気泳動の移動の位置を表します。分子の重量基準は右に表示されます。(1) superdex 200 pg ゲルろ過カラム ピーク。(Q 2) 陰イオン交換コラム 250 mM NaCl ステップ グラジエント。(3) ペリプラズム画分。Dからの SDS ページのゲルの画像処理は、デンシトメトリーによるゲルろ過製品の 20% の最大 YfeA 全体的な豊かな限界を計算します。ブルー ボックスは、YfeA/総信号密度測定の計算に使用を示します。多くの分光分析、レーンに黒矢印で示されるバンドの 1 LivJ の 26 のユニークなペプチドが検出 (39 kDa) EfeO の 25 のユニークなペプチド (41 kDa) と LivK の 17 のユニークなペプチド (39 kDa)。すべての 3 つの汚染物質、大腸菌ペリプラズム SBPsこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
図 2。ゲルろ過クロマト グラムの Apo YfeA とホロ YfeA.黒い矢印は、ボイドの位置を表します。ゲルろ過ピーク apo YfeA (黒い曲線) と YfeA (青の曲線) を示す両方蛋白質ホロ ペリプラズム画分から精製した YfeA、apo は、ホロの合計から精製した YfeA と同様の流体力学的半径を示す同じ溶出で溶出フランス語プレスの後に携帯電話コンテンツ。
図 3。Apo YfeA とホロ YfeA 結晶形態。ホロ YfeA は、apo YfeA は一般的に同一の結晶化条件の双晶を生成しながらモノリシック水晶として結晶します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4。Apo YfeA とホロ YfeA x 線蛍光スペクトル。A. ホロ追加遷移金属添加、緑曲線と M9 最小媒体から浄化された YfeA の x 線蛍光スペクトル。特徴的なピークは、マンガン、鉄、亜鉛に付いています。B. YfeBCDE のコンテキストで YfeA サンプルから蛍光 x 線スペクトルが生成されます。特徴的なピークは、マンガン、鉄、亜鉛に付いています。青の曲線です。YfeBCDE のコンテキスト細胞質の遷移金属やホロ YfeA タンパク質の混入を最小限ペリプラズム画分の成功した分画から精製 YfeA の x 線蛍光スペクトル。赤の曲線。過剰な換散および細胞質の遷移金属やホロ YfeA タンパク質の重要な汚染から失敗した分別と YfeBCDE のコンテキストから精製した YfeA の x 線蛍光スペクトル。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5。分別のワークフローを一般化します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6. 60 分放射性金属吸収分別データ。それぞれの実験を 3 回行ったし、エラーバーは標準偏差を示します。赤色のバー。Yfe トランスポーターを含まないエシェリヒア属大腸菌細胞は 60 分後、細胞質に Mn 52の ~ 50% 程度を輸送し、ペリプラズム52Mn。青いバーの低レベルを維持します。エシェリヒア属大腸菌のセル Yfe のトランスポーター輸送 > 60 後細胞質に Mn 52の 90% 分およびペリプラズム52Mn。緑色のバーの低レベルを維持します。YfeA のみが含まれているエシェリヒア属大腸菌細胞は細胞質に Mn 52~ 25% を輸送し、60 分後ペリプラズムに Mn 52~ 25% を保持します。
使った作品、 52Mn radiometal (t1/2 = 5.59 d)、自然な Cr ターゲットのプロトン照射による UAB サイクロトロン施設 (バーミンガム、アラバマ) で制作され、以前に報告された19として精製します。注意: 52Mn は陽電子のエミッター (β+avg = 242 keV、29.4%)、また高い強度といくつかの高エネルギーのガンマ線を放出して (Eγ = 1434.0、935.5 744.2 keV;私 90.0%、94.5%、100% を =)。これらの理由から、実験実施しなければならないアララの放射線保護原則に従う上記します。放射性廃棄物として指定されたすべての項目は適切に含まれている、明確にラベル付けおよび確立された手順に従って破棄する必要があります。
Discussion
セル分別は細胞内コンパートメントの内容を具体的にプロービングのための便利なツールを金属原子など小さな分子だけでなく、タンパク質などの高分子を抽出するための有用なツールとして使用できます。それはそのセル分別は、絶対的な方法と混合/再懸濁、培養温度、培養時間に細心の注意なしでミスをすることができますは注目に値するです。最小限の膜溶解およびこうして無視分別結果不完全混合、室温で分別が細胞質の内容のペリプラズム画分の汚染の結果として両方の膜の急速な溶解を引き起こすことができ、拡張インキュベーション時間は過剰な換散そしてこうして分数汚染にも します。(内膜を維持する) しながら効率的かつ比較的完全な外膜の溶解を達成するための合理的な妥協は、低張性分別バッファーに氷の上 20 分インキュベーションです。別の考慮事項は、揺れまたは渦流による過酷な抽出が蛋白質の集合の原因など抽出物の品質を妥協できる抽出方法です。ヘラ、反転または下流解析のための高品質の素材を維持するためにピペットで吸引によってなど、穏やかに混合することをお勧めします。精製分取セル分別は変数を効率化図 1によって証明されるように発生します。1 つの実験では、YfeA は、抽出されたペリプラズム コンテンツ (図 1) の 8% として始まったペリプラズム コンテンツ (図 1) の 17% として, 別の実験で YfeA を始めた。これらの違いが可変式の条件 (成長媒体に EDTA が Yfe のプロモーターの毛皮規制などの飢餓のメカニズムによって調整される遺伝子の発現を高めることができますを追加) などのいくつかの理由から発生する可能性の繰り返された使用冷凍永久的な在庫とヒューマン エラー。インキュベーション時間を調整するのではなく、スケール アップ準備することをお勧めします。ペリプラズム画分精製を線形勾配溶出陰イオン交換クロマトグラフィーによるステップを含むように推奨します。ステップのグラジエント溶出戦略移動相組成で使用して離散と急激な変化は、(すなわち。、0 mM の NaCl、50 mM NaCl、 150 mM の NaCl など。)。線形グラデーションの溶出は携帯で漸進的な変更を使用して溶出戦略相組成(すなわち、 0 mM 塩化ナトリウム、塩化ナトリウム、5 mM 10 mM の NaCl など)。ステップのグラデーションは静止した段階の異なる親和性を持つ分子を分割するのに役立ち、線形グラジエントは静止した段階のため同様の親和性を持つ分子を分割するのに役立ちます。ユニークなタンパク質種で豊富である細胞コンパートメントから人工精製タグのない (固定相への親和性を高める) に蛋白質を浄化、場合可能性があります noninterest の蛋白質を分けるのに線形勾配溶出お勧め興味の蛋白質として固定相に似たような親和性があります。その内因性から YfeA を表現する文化の各リットルから精製した apo YfeA の 1-2 mg の利回りを期待する一般的に、 Y. ペストプロモーター。
蛍光 x 線は、調査担当者が、迅速に、サンプルでは金属コンテンツを判断し、それ以外の場合、知られているとありますが予想外の金属混入について調査官に知らせることができる手法です。EDTA は、緩く関連付けられているまたは無料の金属を削除する高張分別バッファーに含まれる、ペリプラズム画分から派生した YfeA は、いくつかのホロの蛋白質を含めることができます。金属輸送は、動的なプロセスは、おそらくホロのタンパク質含有量は、その貨物 YfeBCDE に寄付しなかったまだ YfeA から起きる。蛍光 x 線だけ総金属含有量を測定し、金属が結晶格子を命じたかどうか、または特にタンパク質と結合を示しません注目に値するです。金属は結晶格子を命じたおよび蛋白質分子に具体的にバインドされているかどうかの決定、x 線散乱データの収集と処理が必要です。それにもかかわらず、蛍光 x 線金属汚染や残留ホロ蛋白質の統合のクイック サンプル評価できます。放射時間は限られて、常にすべてのサンプルに x 線散乱データを収集するための戦略を考案する時間がない、従って蛍光 x 線は多くの水晶をスクリーニングおよびサンプル x 線の優先順位を付けるのための貴重な技術散乱データを収集する必要があります。さらに、蛍光 x 線は、x 線を回折がないサンプルからデータを収集できます。X 線蛍光データの収集、時に信号することができます非常に弱いと uninformative 結果のスペクトル。蛍光 x 線や狂牛病のスキャンのいずれかは、信号の強度を改善するために露光時間を増やすことや、x 線ビームの減衰を減少を検討してください。蛍光 x 線、放射線損傷を最小限に抑えるため、データの品質を向上させるためにスキャン MAD に使われていたものよりもサンプルの別の部分に x 線散乱データを収集するために x 線散乱データを収集するためのサンプルが判明したら、お勧めコレクション、異常信号の減少のための潜在性を最小限に抑える。
放射性トレーサーの検出はナノモル数量材料以下を必要とし、分子追跡エージェントとしてこれらのトレーサーの使用細胞プロセスをプロービングのシンプルかつ機密性の高いメソッドを提供します。上記 radiometal のアッセイは、金属マグネシュウムの吸収率と同様、細胞コンパートメント全体に分布を決定する使用できます。確かに、時間の各データ ポイント必要 40 分分別;しかし、時間の各ポイントに達すると、細胞はすぐにペレット、高い塩バッファー (図 5の手順 1) で培養します。後 (図 5、手順 3) メディア, 高破棄された salt のバッファー (図 5の手順 1)、ペリプラズム、細胞質画分の Radiometal 測定を示す高塩バッファー インキュベーションは、正常にすべてを削除します残りの時間ポイントに達した後初期の遠心分離の後に残っている金属の関連付けられていない自由。高塩バッファー内のインキュベーションも追加残りの関連付けられていない金属の自由を削除した後、初期の遠心分離は関連付けられていない無料金属・遠心分離のほとんど (80% まで) を削除します。40 分分別中金属輸送の影響を大幅には、任意の残留関連付けられていない無料の金属は想定されていません。細胞内の金属輸送上 40 分分別の影響は、慎重なデータ解釈のための別の考慮事項です。事実上全体の分別のプロトコル手順の間 30 秒遠心から離れて、氷の上に発生します。金属の輸送時間コース実験金属輸送20,21,22; を放棄 4 ° C で細胞を維持することが示されています。したがって、氷の上実験が行われ、40 分分別、細胞質のペリプラズムにおける金属濃度を大幅増強されないため金属の濃度が予想されるセルがあった時点の代表最初 centrifugalized。
別の細胞コンパートメントにおける相対的な吸収量の定量はさらにメカニズムの分子の詳細を調査する研究者を有効にすると同様 XFS データを知らせる、基板の生理的特性を裏付けるを助けることができます。たとえば、radiometal 吸収実験する遺伝的変異の追加機能の残基を強化する直接法またはに関わる分子群の基質輸送。Radiometal 吸収実験と解析の利点は、迅速、高スループット、高再現性、成長の状態および遺伝的構造の比較実験の並列化に含まれます。
Disclosures
著者は、彼らが利益相反のあるを宣言します。
Acknowledgments
データは、GM/CA@APS の全部または一部 (ACB-12002) 国立がん研究所、国立科学研究所の一般医療 (AGM-12006) から連邦政府の資金で賄われているでも収集されました。この研究に使用するリソースの高度な光子ソース (AP) の科学ユーザー施設米国エネルギー省 (DOE) オフィス運営契約号下アルゴンヌ国立研究所によって雌しか科学局デ-AC02-06CH11357。光子の高度なソースの使用は、米国エネルギー省、科学局、オフィスの基本的なエネルギー科学研究科契約番号の下に支えられW-31-109-Eng-38。
質量分析の UAB の包括的がんセンター - 質量分析法/プロテオミクス共有施設 (P30CA13148-38) を認めることを思います。
C.D.R. は、アラバマ大学バーミンガムのオフィスの多様性、公平および介在物からの助成金によって支えられました。L.L.R. は、アラバマ大学バーミンガム校の放射線によって支えられました。エネルギー省科学局同位体プログラム サポート52Mn 生産し下 A.V.F.M. は DESC0015773 を付与します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Polyethylene glycol 4000, EMD Millipore | Fisher | M1097270100 | |
| Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder) | Fisher | BP1760-5 | |
| AMRESCO M9 Medium Broth | Fisher | NC9688886 | |
| Bis-Tris, Fisher BioReagents | Fisher | BP301-100 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (Certified ACS) | Fisher | C79-500 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydrous (Granular Powder/Certified ACS) | Fisher | D16-500 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | S311-100 | |
| Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller | Fisher | BP1426-500 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | M63-500 | |
| Sodium Azide, White Powder | Fisher | BP922I-500 | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | S271-500 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Granular or Powder/Certified ACS) | Fisher | S374-500 | |
| Tris Hydrochloride (Small White Flakes/Molecular Biology) | Fisher | BP153-500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cryschem Plate | Hampton | HR3-158 | |
| EMD Millipore Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Fisher | UFC903024 | |
| EMD Millipore Millex Sterile Syringe Filters: Durapore PVFD Membrane | Fisher | SLHV013SL | |
| GE Healthcare HiLoad 26/600 Superdex 200 pg | Fisher | 28-9893-36 | |
| GE Healthcare HiTrap IEX HP Prepacked Columns | Fisher | 17-1154-01 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| Agilent Technologies BL21-CODON PLUS RIPL CELLS | Fisher | 230280 |
References
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