Summary
Periplasmic Geçiş metalleri refakatçi yerli bağlama ortakları bağlamında ve x-ışını Floresans ve radiometal alımını sundu tarafından substrat içeriğini biyofiziksel karakterizasyonu çıkarılması için bir protokol.
Abstract
Sitoplazma bakteriyel periplasm ayrılması için ölçeklenebilir bir yöntemi göstermektedir. Biyofiziksel karakterizasyonu ve periplasmic ve sitoplazmik bölmeleri arasında ölçü substrat transferi amacıyla periplasmic protein arındırmak için kullanılan bu yöntem. Dikkatle periplasm sitoplazma ayrılır zamanı sınırlayarak, deneyci faiz protein özü ve her bölmesi substrat bölmeleri arasında etkilenmişimdir kirlenme olmadan için tek tek tahlil. Ayırma ayıklanan protein sonra daha fazla üç boyutlu yapısı belirlenmesi veya substrat-bağlama profilleri için analiz edilebilir. Alternatif olarak, bu yöntem kuluçka ile izleyici dağılımı yanı sıra Toplam yüzde alımını belirlemek (ve dolayısıyla metal taşıma için) bir radiotracer sonra farklı bakteriyel bölmeleri arasında gerçekleştirilir. Bir radiotracer ile deneme bir fizyolojik substrat ve olanlar mismetallation tarafından neden olduğu gibi artefactual substrat arasında ayırt etmeye yardımcı.
X-ışını Floresans yanı sıra örnek bir metal birleşme olup keşfetmek metal birleşmesiyle büyüme koşulları, arıtma koşullar ve/veya kristalizasyon koşulları içinde bir ürün olarak ortaya çıkabilecek değişiklikleri ölçmek için kullanılabilir. X-ışını Floresans de bereket anormal x-ışını saçılması veri koleksiyon için kullanmak için en iyi metal enerji emme tepe belirlemek için kullanılan her metal için göreli bir ölçü birimi sağlar. Radiometal alımını yanı sıra x-ışını Floresans tarafından algılanan bir substrat fizyolojik yapısı sağlam temele oturtulmuş roman yüzeylerde keşfi desteklemek için bir yöntem olarak kullanılabilir.
Introduction
Ayagin Gram-negatif bakterilerde geçiş metal atomlarının sitoplazmik havuzları arttı ve metal translocation arasında iç zar azaltmak iç zar ABC (ATP-bağlayıcı kaset) ithalatçılar tarafından doldurulan. Periplasmic küme A-1 substrat bağlanıcı proteinler (SBPs) metal atomları doğrudan bağlamak ve onları soydaş ABC ithalatçılar1' e teslim periplasm aracılığıyla feribot chaperones bir grup oluşturun. Diğer kümeleri SBPs Şelatatlı metal (küme A-2), karbonhidrat (kümeleri B ve D-1) ve amino asitler gibi yüzeylerde taşımacılığının adanmıştır (kümeleri B, C, F-2 ve F-4); Yine de, yüzey ne olursa olsun, bir evrimsel korunmuş c-mengene kat2SBPs izleyin. SBP substrat transfer için Genelleştirilmiş önerilen mekanizma sinekkapan bitkisi3benzer nedenlere bir dizi geçiren c-mengene içerir. Genellikle, bu SBPs çalışma apo (metal içermeyen) formları için deneme4protein üreten zorluk ile sınırlı olsa da küme A-1 SBPs sanal (metal-ilişkili) form arındırmak. Bugüne kadar apo çalışma stratejileri küme A-1 SBPs-si olmak be mutagenesis, diyaliz ve kısmi denatürasyon ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) şelatör5,6,7,8 ile sınırlı , 9 , 10 , 11. Bu deneylerden gelen yapısal veriler öneririz küme A-1 SBPs tam olarak sinekkapan bitkisi mekanizması izleyebilir değil. Şu anda edebiyatından eksik fizyolojik bağlama ortakları kullanarak apo küme A-1 SBPs vivo üreten bir yöntemdir.
Biz YfeA, Yersinia pestisüzerinden bir küme A-1 SBP, apo formu aracılığıyla onun fizyolojik soydaş YfeBCDE ABC İthalatçı ile etkileşim için dönüştürülmüş veba etyolojik Ajan arındırmak için hücre ayırma kullanarak ilk kez göstermek hücrede. Enerji dağıtıcı x-ışını spektroskopisi (EDS), olarak da bilinen x-ışını Floresans tarafından apo formundaki YfeA olduğunu göstereceğiz. Biz de YfeBCDE işlevi hücre ayırma dış membran arasında metal alımı ve metal alma iç membran arasında ayırt etmek için son derece hassas radyoaktif metal alımı çalışmaları ile birleştirerek göstermek. Teknikleri bu tür olarak İndüktif eşleşmiş plazma kütle spektrometresi (ICP-MS) ya da atomik Absorpsiyon spektroskopisi (AAS) için metaller, algılama sınırından çok daha düşük miktarlarda pg/M tespiti için bir radyoaktif izleyici kullanımı sağlar. Bu sistemin okudu en az pertürbasyon için sağlar. Buna ek olarak, geleneksel yöntem sık sık dinlemek daha büyük örnek birimleri, ek Post-işleme ve radiotracer deneyleri için tipik olmayan daha uzun teslimi etrafında zaman, gerektirir. Böylece, bir radiotracer kullanarak metal dağıtım ve alımı hücre içindeki izleme için kullanışlı ve basit bir yöntem sağlar. Bu yöntemi kullanarak küme A-1 SBP üretilen bir apo apo proteini oluşturmak için kullanılan mevcut uygulamaları yapısal gözlemler echo belirlenecek kalır.
Hücre ayırma özellikle içeriklerini yalıtım12sondalama örtülü amacı için hücresel kompartmanlarda ayırmak için kurulan bir yöntemdir. Hücre ayırma genellikle hücre döngüsü sırasında bir molekül konumunu onaylayın veya belirli bölmesi13etkinliğini ölçmek için kullanılır. Örneğin, metal taşıma faaliyet metal yüzey için hücresel kompartmanlarda sondalama tarafından denetlesinler. Hücre ayırma entegre ayrım ve dış membran arasında metal alımı ve iç membran arasında metal transferi arasında karşılaştırma sağlar. Bu işlemler sırayla zamanla ölçülebilir. Protein arıtma durumunda, hücre lizis en yaygın yöntemleri ve çözünür bileşenlerinin ayrılması çözünmez bileşenlerinden mekanik bozulma vardır (yani, taşlama, karıştırma), yüksek basınçlı homojenizasyon (Fransız basınç hücre basın, hücre Kırıcı) ve ultrasonik frekansları (i.e., sonication)14. Ultrasonik frekansları hücreleri parçalayıcı kullanımı genellikle en iyi küçük birimler için uygundur; Ancak, sonication protein denatüre aşırı ısı üretmek için bilinir. Ultrasonik frekansları aşırı ısı oluşturulmasını engellemek için genellikle hangi-ebilmek var olmak zaman tüketmek ve yanlışlıkla DNA moleküllerini daha küçük parçalara aşağılamak sıralı kısa öbek halinde uygulanır. Ayrıca, her sonda işlenebilir numune hacmi için sınırlı bir alan olduğu gibi birden çok pahalı sonication probları partiye hazırlık ve analitik deneyler için gerekli olabilir. Fransız basınç hücre basın bileşenleri lizis önce soğutma veya hücre topu soğuk bir oda gibi soğuk bir ortamda faaliyet hücre lizis sırasında aşırı ısı üreten hücreleri parçalayıcı yüksek basınç kullanımını önler. Sonication sondalar gibi Fransız basınç hücre basın bileşenleri birden çok örnek birimleri geniş bir işlemek için satın alınması gerekebilir. Derlemeleri bağlamak kolay ama garip çalışmasına ve temiz, Fransız basınç hücre basın taşımak ağır olabilir ve yoğun örnekleri tıkanma yatkındır. Ultrasonik frekansları ve yüksek basınç sistemleri hücreleri parçalayıcı kullanmanın bir avantajı yüksek örnek kurtarma, en az Çapraz bulaşma ile birden fazla örnekleri işleme yeteneği dahil ve ayarlanabilir güç kesme, hangi lizis optimizasyonu için adapte edilebilir çok çeşitli örnek türleri. En iyi duruma getirme ultrasonik frekans ayarlayarak oluşabilir patlamaları, pistonlu basınç pound başına kare inç (PSI) ve basın üzerinden geçer sayısı süresi. Mekanik bozulma hücreleri parçalayıcı kullanımı hücre lizis için teknik açıdan en önemsiz ve en ucuz strateji olabilir. Mekanik bozulma zorluklar içinde örnek kurtarma yol açabilir ve işleme birden çok örnekleri için ideal değildir. Mekanik bozulma örnekleri için yüksek basınç ya da ultrasonik frekansları, nazik ama yüksek üretilen iş değil ve verimsiz lizis eğilimli. Öyle ki lizis sonra tüm sulu hücre bileşenler karışık bir önemli deneysel mekanik bozulma, yüksek basınçlı homojenizasyon ve ultrasonik frekansları, tüm hücresel mimarisi kontrol edilemez kesintiye uğraması kısıtlamasıdır birlikte. Ayrıca, Bütün hücre bölümler aynı anda bozmak değil; Bu nedenle, erken lyse bölmeleri içeriğini yıkıcı güçleri geç lyse bölmeleri içeriğini uzun süre devam eden tabi olabilir. Pahalı ekipman ve sert, yıkıcı güçleri maruz örnek ihtiyacını kaçınırken ucuz, teknik olarak basit, verimli yuvası tabanlı ayrılması için Hücre içeriğinin hücre ayırma sağlar.
SBP durumunda alınan substrat potansiyel apo protein için yeniden ortaya çıkar ve sanal protein lizis, aşağı akım Kromatografi veya diğer arıtma teknikleri önce sırasında yeniden oluşturur. EDTA şelatör eklenmesi sırasında lizis EDTA Kromatografi reçine metal şerit ve15bağlayıcı protein önlemek çünkü nerede protein saflaştırma bir ilk adım olarak metal benzeşme mümkün değildir ek bir engel sunar. Basit ve ucuz bir çözüm nerede fark Santrifüjü ve ortak laboratuvar Kimyasalları dikkatle fonksiyonel analiz için yeterli protein ayıklamak için Dedektif etkinleştirmek hücre ayırma ozmotik şok tarafından var. Ozmotik şok ayırma konuları hücresel kompartmanlarda ayırmak için bir iki adım değişiklik kullanır. İlk olarak, hücre hipertonik bir arabellek neden olur için küçük su bırakır her hücre ve ikinci olarak, Hipotonik bir arabellek hücreleri su her hücre yeniden girerken şişmeye neden olur. Ne kadar hücreleri şişmeye dikkatle kontrol ederek, dış membran seçerek (osmotik basınç gelen su birikmesi nedeniyle), lysed böylece içeriği arabelleğe boşaltma. İç membranlar korunması sitoplazmik içeriği spheroplasts içinde korunur ve periplasmic içindekiler--dan Santrifüjü tarafından kolayca ayrılır sağlar.
YfeA bir polyspecific SBP demir, manganez ve çinko atomlar16bağlama yeteneğine sahip olduğunu. Göreli oranlarını dahil metal metal takviyesi büyüme sırasında göre değiştirilebilir ve x-ışını Floresans tarafından gibi denetlesinler Argonne Ulusal Laboratuvarı'nın gelişmiş foton kaynak16, kullanılabilir. X-ışını Floresans sağlar hızlı bir şekilde geniş bir derleme için gerek kalmadan metallerin profil için Dedektif büyük veya kırınım kaliteli kristaller ve hatta protein acele veya proteinaceous çözüm verileri toplamaktadır.
X-ışını Floresans hızlı bir şekilde ortaya beklenmeyen sonuçlar gibi bu durumda, çinko varlık birincil YfeA substrat ve değil belgelenmiş fizyolojik yüzeylerde demir ve manganez16. X-ışını saçılması veri toplamayı daha önce kullandıysanız, x-ışını Floresans araştırmacı olduğu gibi anormal x-ışını saçılması verilerinin toplanması için kullanılmasını için metal enerji edge(s) deneysel tasarım bilgilendirebilir. Bir metal, x-ışını Floresans göreli bolluğu da bir metal eksik olup olmadığını belirleyebilir belirleme gibi işe sadece bir örnek, sanal protein apo protein içeren ve tahmin metal kristalleri ayıran, hızlı bir yöntem sağlayan sinyal gücü zaman alan veri işleme gerek olmaksızın. Bir örnek ile güçlü bir metal sinyali belirlenmesi üzerine, anormal x-ışını saçılması verilerinin toplanması için kullanılmasını için kesin dalga boyu çoklu dalga boyu anormal dağılımı (MAD) tarama tarafından belirlenebilir.
Bu ayrıntılı iletişim kuralı başarıyla hücre ayırma gerçekleştirmek ve etkili kullanım-in toplam metal içeriği profil ve metal bağlanıcı proteinler çalışmanın ilerlemek için sinkrotron beamline donanım yapmak yeni Denemecileri yardımcı olmak içindir.
Protocol
1. bakteriyel Starter kültür (1 gün)
- 200 mL eğimli şişeye Luria Bertani suyu (LB) Escherichia coli zorlanma BL21-CodonPlus (DE3) ile 30 mL aşılamak-RIPL hücreleri içeren pYFE3 plazmid16.
- 50 mg/mL Ampisilin 30 µL şişesi için bir pipet ve 200 µL ipucu alıyorum tarafından ekleyin. Gecede, 225 devir / dakikada 37 ˚C sallamak.
2. ilave M9 en az medyası hazırlama (2 gün)
Not: Bu den Amresco Kılavuzu adapte olduğunu.
- Sıvı medya 6 L aşağıdaki yordamla hazırlayın. Bir 2 L eğimli şişesi, ultra-saf H2O. otoklav 121 ˚C 20 dk, 1 L M9 en az medya 10.5 g ekleyin ve sonra oda sıcaklığında cool.
- Aseptik aşağıdaki steril ek çözümler ekleyin: 2 mL/L 1 M MgSO4, 10 mL/L % 20 w/v glikoz, 0.1 mL/L 1 M CaCl2ve 1 mL/L 50 mg/mL Ampisilin. Biyolojik Emanet steril bir ortam sağlamak için kabine bu adımı gerçekleştirin. 37 ˚C medyaya sıcak.
3. bakteriyel alt kültür
- 5 mL/L gecede starter kültür M9 en az ortamına otomatik pipet ve 5 mL ucu ile alıyorum tarafından ekle. Alt kültür sürekli 225 devir / dakikada 9 h 37 ˚C, salla.
Not: Bu adım sırasında YfeABCDE--dan onun yerli autoinduction tarafından overexpressed Y. pestis organizatörü. - Santrifüjü 4500 x g 30 dk 4 ˚C az için de tarafından hücreleri kurtarmak. 50 mL bir buz gibi fosfat tampon çözeltisi (20 mM Na2HPO4 pH 7,6, 50 mM NaCl) hücrelerde bir pipet ve 1 mL ucu ile alıyorum tarafından resuspend ve gecede-80 ˚C Don.
4. hücre ayırma (3. gün)
- Resuspension için 20 dk 4 ˚C az 4.000 x g 4 ° C ve Pelet hücreleri, çözülme. Buz gibi yüksek salt arabellek (200 mM Tris-HCl pH 8.0, 400 mM NaCl ve 2 mM EDTA) 50 mL hücrelerde otomatik pipet ve 25 mL ucu ile alıyorum tarafından resuspend. Süspansiyon karıştırma için ara sıra inversiyon ile 20 dk, buz üzerinde kuluçkaya.
- 4500 x g 20 dk 4 ˚C az için hücreleri cips. Buz gibi düşük salt arabellek (10 mM Tris-HCl pH 8.0) 50 mL hücrelerde otomatik pipet ve 25 mL ucu ile alıyorum tarafından resuspend. Süspansiyon karıştırma için ara sıra inversiyon ile 20 dk, buz üzerinde kuluçkaya.
- Spheroplasts 4500 x g 20 dk 4 ˚C az için de cips. Periplasmiçeren süpernatant kurtarmak. Pelleted spheroplasts fosfat tamponlu tuz çözüm (Adım 3.2) bir otomatik pipet ve 25 mL ucu ile alıyorum tarafından resuspend ve Fransız basınç hücre basın 1500 PSI, üç devir tarafından hücreleri parçalayıcı.
Not: Bir Fransız basınç hücre basın çalıştırmak için zor olabilir ve hücre lizis sürücü için bir hidrolik pompa kullanır. Hidrolik pompa pistonu doğru hizalaması basınla sağlanması ve hidrolik pompanın elleri tutmak, ilgi çekici dikkatli kullanın. - 20 dk 4 ˚C az için 50.000 x g, hücresel enkaz cips. Sitoplazmaiçeren süpernatant kurtarmak. Gerekirse, iç ve dış membran fraksiyonlara16daha fazla olabilir.
5. protein arıtma FPLC kullanarak
- Ayırma hemen sonra periplasmic kesir 0,45 µm membran birimini kullanarak filtre. Radarı kilit şırınga filtre kolay ve hızlı filtrasyon için kullanın. 20 mM Tris pH 7,6, %0.05 w/v NaN3 arabellek bir debisi 5 mL/dk, yükleme kullanarak bir 5 mL Q anyon Satım sütun equilibrate.
- Periplasmic filtrate 20 mM Tris pH 7,6, %0.05 w/v NaN3 2 mL/dak 20 mM Tris pH 7,6 kullanarak 5 mL Q anyon Satım sütun yıkamak için devam debisi, arabellek yükleme kullanarak önceden dengelenmiş 5 mL Q anyon Satım sütuna yükleme , A280 bir temel okuma bir debisi 5 mL/dk elde kadar % 0.05 w/v NaN3 yükleme arabellek.
- 20 mM Tris pH 7,6, kullanarak ilişkili protein elute % 0.05 w/v NaN3, 0 - 1 M NaCl 5 mL/dak bir280 tepe içeren birleştirme kesirler debisi, doğrusal gradyan 10 sütun birimler tarafından. APO YfeA 200 mM NaCl ve 300 mM NaCl arasında elutes.
- Birimin ~ 5 mL ulaşıncaya kadar santrifüj yoğunlaştırıcı tarafından eluate konsantre ol.
- Superdex 200 pg jel filtrasyon sütun 20 mM Bis-Tris pH 6.3, 50 mM NaCl, %0.05 w/v NaN3 jel filtrasyon arabellek adlı bir debisi 2.5 mL/dk ile equilibrate.
- Konsantre anyon eluate önceden dengelenmiş Superdex 200 pg jel filtrasyon sütuna değişimi ve jel filtrasyon arabelleğinden adım 5.5 2.5 mL/dak bir debisi kullanarak arındırmak yük birleştirmek bir ~ 30'a karşılık gelen bir280 tepe içeren kesirler kilodalton (kDa) protein.
Not: Aşağıdaki örnek FPLC deney protokolü17göstermek için referanstır.
6. protein kristalizasyon
- Jel filtrasyon eluate tarafından santrifüj yoğunlaştırıcı son protein konsantrasyonu olarak 22 mg/mL konsantre.
- Protein konsantrasyonu 1.276 mg/mL tarafından okuma A280 bölerek hesaplayın. Bu teorik tükenme katsayısı ExPASY ProtParam18tarafından tahmin edilmiştir.
Not: Bir A280 örnek okuma 5.104 AU karşılık gelen 4.000 mg/mL solüsyon için; 5.104 AU ÷ 1.276 mg / mL = 4.00 mg / mL.
- Protein konsantrasyonu 1.276 mg/mL tarafından okuma A280 bölerek hesaplayın. Bu teorik tükenme katsayısı ExPASY ProtParam18tarafından tahmin edilmiştir.
- Mix 1.5 µL % 30 w/damla oturan veya açılan kurulum bir pipet ve 10 µL ipucu alıyorum tarafından asılı v PEG 4000, 50 mM NaCl, 20 mM Bis-Tris pH 6.3, %0.05 w/v NaN3 1.5 µL ile protein.
- Kristalizasyon damla 293 k 2-4 hafta için kuluçkaya.
- Flaş-donma kristalleri sinkrotron sevkıyata için sıvı azot havuzunda.
7. x-ışını Floresans (GM/CA Beamline yazılım kullanarak)
- Hutch sekmesini enerji 10.0 için ayarlamak için kullanın enerji alt başlığı gidin keV.
- Etkileşimli sekmesini Mount örnek için tarama sekmesini kayıt bul gidin.
- En İyileştir Floresans sinyalseçin. Giriş 4,00 s zaman alt başlığı altında. Floresans spektrum al' ı seçin. Arsa sekmesini kullanarak spektrum görüntüleyin.
8. MAD (GM/CA Beamline yazılım kullanarak) taraması Metal enerji emme tepe
- Örnek ışın dışına taşıyın. Periyodik tablo sekmesini için tarama sekmesini kayıt bul gidin faiz unsuru K kenarını seçin.
Not: Enerji enerji alt başlık eV değerdir. - Hutch sekmesini enerji keV adım 8.1 değerine ayarlamak için enerji alt başlığı kullanmak gidin.
- Örnek kiriş taşıyın. Zaman alt başlığı altında Otomatik sekmesini giriş 2,00 s için tarama sekmesini kayıt bul gidin.
- Başlangıç taramaseçin. MAD arsa sekmesini kullanarak tarama görüntüleyin.
Not: Enerji en yüksek alt başlığı keV yerine eV değerdir. - Floresan ile yapılırseçin.
- Örnek denge aletinin dışına taşıyın. Hutch sekmesini enerji adım 8.4 değerine ayarlamak için enerji alt başlık yuvarlak kadar sonraki eV kullanımı için gidin (yani, en yüksek: 9658.3 eV, ayarla enerji 9659 eV).
- Örnek kiriş taşıyın. Veri kümesi toplamak. 8.1-8,6 ilgi tüm metaller için yineleyin.
9. analitik Protokolü radyoaktif Metal alımı tahlil için
- E. coli zorlanma BL21-CodonPlus (DE3) ile 5 mL lb 14 mL kültür tüpte aşılamak-RIPL hücreleri içeren pYFE3 plazmid16. 50 mg/mL Ampisilin 5 µL bir pipet ve 10 µL ipucu alıyorum tarafından ekleyin. 225 devir / dakikada 7 h 37 ˚C, salla.
- Masa üstü bir santrifüj kullanarak oda sıcaklığında 1 dak için 15.000 x g de hücreleri cips. 1 mL ilave M9 en az medya hücrelerde bir pipet ve 1 mL ucu ile alıyorum tarafından yıkayın. Bir kez yinelenir.
- 50 mL konik tüp 30 mL hücrelere alt kültür M9 en az medya pipet ve 1 mL ucu ile alıyorum tarafından desteklenmiştir. 225 devir / dakikada 9 h 37 ˚C, salla.
- Radyoaktivite yaklaşık 100.000 adet / dakika (BGBM) ulaşmak için gereken miktarını belirlemek.
Not: Bu Radyoizotop ve algılama için kullanılan alet bağlı olarak değişir. Örneğin, 52Mn 7.4 kilobecquerel (kBq) (0.2 microcurie (µCi)) içeren bir örnek 550.000 BGBM bir okuma bir otomatik gama dedektörü (NAI gerekli bilgiyi) verir. Böylece, radyoaktivite 100.000 BGBM sayısını elde etmek için gerekli miktarı aşağıdaki denklemi kullanarak belirlenebilir: (100.000 BGBM/550.000 BGBM) * 7.4 kBq (0.2 µCi) 1,35 kBq (0,036 µCi) =.
Dikkat: radyoaktif bozunma iyonizan radyasyon, sürümü olarak tehlikeli olduğu sonuçlanır. Radyoaktivite ile çalışırken her zaman uygun koruma kullanma ve mesafe artan ve çekim hızı azaltırken koruma ilkeleri, olarak düşük olarak makul ulaşılabilir (ALARA) izleyin. Yalnızca eğitimli personel radyoaktivite radyoaktif malzemelerin kullanımı için lisanslanmıştır özel olarak tasarlanmış laboratuarlarında işlemesi gerekir. - Adım 9,4 radyoaktivite gerekli toplam miktarını belirlemek için alt kültür, Toplam hacim tarafından hesaplanan gerekli radyoaktivite çarpın. Bu tutarı (tercihen 50-100 µL küçük hacmi) vardır ki 100.000 BGBM/mL ve girdap 30 için iyi alt kültür içeren tüp ekleyin s.
Not: alt kültür 31 mL için toplam radyoaktivite gerekli 1,35 kBq (0,036 µCi) x 31 mL = 41.3 kBq (1.12 µCi) miktarıdır. - Bir pipet ve 1 mL ucu ile alıyorum tarafından aliquot (Şimdi radyoaktif izleme içeren) alt kültür bireysel 1,5 mL santrifüj içine 1 mL tüpler ve her biri için 1 × g. yeterli tüpler vardır ki üç içer, vortexing ile bir 37˚C thermomixer yerde çoğaltır İstenen ölçü yanı sıra standartları olarak kullanmak için üç ek çoğaltır (standartları bir kenara koyun, ayırma tahlil standartlarını gerçekleştirmeyin).
Not: 1, 2 ve 4 h raporlaması 12 tüpler toplam gerektirir. - Kuluçka sonra 15.000 × g 30 de tüpler santrifüj kapasitesi (tercihen 4 ˚C soğutmalı) benchtop santrifüj kullanarak s ve supernatants atın.
- Buz soğuk 1 mL hücrelerde yeniden askıya alma, yüksek tuz (Adım 4.1) olan bir pipet ve 1 mL ipucu alıyorum tarafından tampon ve hemen buz 20 dakika yerleştirin.
- Hücreleri tekrar 15.000 × g 30 de cips s (tercihen 4 ˚C soğutmalı) benchtop santrifüj kullanarak ve supernatants atın.
Not: Süpernatant ilişkilendirilmemiş ücretsiz metal içerir. - Buz soğuk, düşük tuz (Adım 4.2) olan bir pipet ve 1 mL ipucu alıyorum tarafından tampon ve 20 dk için buz üzerinde kuluçkaya hücrelerde yeniden askıya alma.
Not: Yavaşça bu adım için pipet ile Aspire edin önemlidir. - Hücreleri 15.000 × g 30 de cips ve tüpler santrifüj kapasitesi toplamak her supernatants, yeni 1,5 mL içine s. Şimdi altı tüpleri her zaman noktası olmalıdır.
Not: Süpernatant periplasmic kesir ve Pelet membranöz içerir ve sitoplazmik kesir. Sitoplazmik kesir olarak Pelet için başvurun. - Adım 9,6 bir kenara standartları yanı sıra her kesir (altı tüpleri her zaman noktası) radyoaktivite ölçmek. Radyoaktivite miktarı standartları radyoaktivite özgün her örnek için eklenen toplam miktarını belirlemek için kullanın.
- Periplasm radyoaktif anlamazdın yüzdesini belirlemek için aşağıdaki denklemi kullanın: (periplasmic kesir/ortalama BGBM standartların ortalama BGBM) x 100.
- Sitoplazmada radyoaktif uptake yüzdesini belirlemek için aşağıdaki denklemi kullanarak: (sitoplazmik kesir/ortalama BGBM standartların ortalama BGBM) x 100.
- % Toplam Alım belirlemek için aşağıdaki denklemi kullanarak: ((periplasmic kesir + karşılık gelen sitoplazmik fraksiyonunun ortalama BGBM ortalama BGBM) / (ortalama BGBM standartları)) x 100.
Representative Results
SDS-sayfa jel ve jel filtrasyon chromatograms protein saflaştırma partiye hazırlık periplasm ayırma üzerinden niteliğini değerlendirmek için toplandı. YfeA daha önce olmuştur sanal arıtma16tarif; Ancak, apo YfeA arınma bildirilmemiştir. APO bu yöntem tarafından açıklanan YfeA arındırmak için strateji bir benzeşme özellikle bir protein immunoblot (Yani, O'nun etiketi) ve bir Monoklonal antikor için kullanılabilecek her türlü etiketi olmasa bir rekombinant vahşi türü yapısı kullanır bu YfeA tarif tanır. Bu nedenle, kütle spektrometresi analiz YfeA arınma doğrulamak için kullanılmıştır. YfeA ayırma tarafından arındırmak için doğrusal elüsyon degrade anyon Satım Kromatografi (şekil 1) kullanmak için önerilir. Doğrusal elüsyon degrade anyon exchange ürün Dansitometresi (şekil 1 c) tarafından hesaplanan % 49 periplasm kesir yaklaşık % 8'yapmaktan YfeA zenginleştirme önemli ölçüde artırır. Bu kompozisyon % 61 jel filtrasyon tarafından artırıldı ve apo protein elüsyon hacmi sanal protein (Şekil 2) elüsyon birime aynıdır. Kütle spektrometresi analiz YfeA arıtma %92.5 YfeA amino asit sıra, 246 toplam YfeA polipeptid spectra, 24 benzersiz peptidler ve 50 benzersiz polipeptid spectra tespiti ile doğrular. Alternatif olarak, bir adım degrade elüsyon ürününden doğrusal degrade ürünüyle kontrast için YfeA 50 mM NaCl takip yıkama adım 250 mm NaCl (şekil 1 d) bir elüsyon adım kullanarak anyon exchange tarafından saflaştırıldı. Adım degrade marjinal anyon exchange ürün Dansitometresi tarafından hesaplanan % 18'i için periplasm fraksiyonunun % 17 beste YfeA zenginleştirir. Adım degrade elüsyon aynı zamanda birden fazla E. coli SBPs benzer Moleküler ağırlığı içerdiği tespit bu kütle spektrometresi protein geçen madde grubu zenginleştiriyor. HiLoad 26/600 Superdex 200 pg, moleküler ağırlık ve bulaşıcı SBPs yapılarının benzerlik çözünürlük sınırları nedeniyle jel filtrasyon marjinal % 20 YfeA zenginlik jel filtrasyon ürün geliştirilmiş. Doğrusal elüsyon degrade anyon değişimi için ulaşılamaz olması halinde, bu birden çok adım yıkar bu kirletici kaldırmak için gereken NaCl konsantrasyonu belirlemek için 25-50 mM NaCl artışlarla keşfetmek için tavsiye edilir.
Arıtılmış apo ve sanal YfeA kristalize aynı kristalizasyon koşullarında olsa da apo ve sanal YfeA kristal türleri Morfoloji görüntülerini kristal büyüme apo ve sanal arasındaki farkları göster: YfeA Birleşik (şekil 3). Kütle spektrometresi doğrulama ek olarak, arıtma ve YfeA kristalleşme (gösterilmez) x-ışını kırınım veri--dan bu yöntemle saf protein yetiştirilen kristalleri toplanan doğruladı. Ölçüde yuvası kirlenme (sitoplazmik çinko apo sanal protein periplasm kesir dönüştürme) x-ışını Floresans spectra (şekil 4) çekimi ile tespit edilebilir. Verilen bu çinko rekombinant YfeA16için ilişkili birincil yüzey, x-ışını Floresans spectra hızla sanal YfeA (şekil 4A), çapraz göstergesi ile orantılı bir güçlü çinko sinyal içeren bir YfeA örnek arasında ayırt edebilir kirlenme veya zayıf bir sinyal apo YfeA müstehcen ve en az Çapraz bulaşma (şekil 4B) çinko. Geçiş metalleri düzeyleri (gösterilmez); alt-micromolar aralığında olan ICP-MS analiz M9 en az medya doğruladı Bu nedenle, geçiş metaller sadece çok az miktarda tespiti başarılı bir ayırma takip beklenmelidir. Analitik ayırma (şekil 5) radiometal taşıma oranları ölçmek ve işlevsel veri yakalamak için kullanılabilir. Bir 60 dakika periplasmic ve sitoplazmik kesirler YfeA ifade E. coli hücre tek, tam YfeABCDE transporter ve YfeABCDE bileşenlerden hiçbiri karşılaştırma anlık görüntü ortaya çıkarır bir tek rekombinant protein ifade sonuçlarını veya bir protein kompleksi metal alımı (şekil 6). Hiç rekombinant protein ifade E. coli hücreleri yaklaşık 52sitoplazma ile periplasm en az saklama ortamına eklenen Mn yarısı nakletti. Bu negatif kontrol endojen manganez taşıma temsil eder. Rekombinant YfeA ifade E. coli hücreleri yaklaşık dörtte biri 52başka bir çeyreklik periplasm içinde muhafaza ile sitoplazma medyaya eklenen Mn nakletti. Manganez saklama periplasm ve sitoplazma içine sınırlı ulaşım metabolik talep ve Yfe ışınlama yokluğunda YfeA üreterek dayatılan performans sorunu gösterir. Rekombinant YfeABCDE ışınlama ifade E. coli hücreleri yaklaşık %100 52sitoplazma ile periplasm en az saklama ortamına eklenen Mn nakletti. Artırılmış manganez taşıma sitoplazma içine Yfe ışınlama manganez taşıma katkısını.
Şekil 1. YfeA arıtma ayırma tarafından. A. Yfe ışınlama için örnek modeli. B. SDS-sayfa jel periplasm kesir, doğrusal gradyan elüsyon anyon Exchange kullanarak üzerinden YfeA arınma. SDS-sayfa jel YfeA zenginlik gösterir (30 kDa) arıtma adımları arasında. Siyah oku elektroforetik geçiş YfeA için konumunu gösterir. Sağ tarafta gösterilen molekül ağırlığı standartları. (1) periplasm kesir. (2) Q anyon Satım sütun akış. (3) Q anyon Satım sütun tepe elüsyon. (4) superdex 200 pg jel filtrasyon sütun tepe. C. YfeA zenginleştirme-iyi bir örnek. Görüntü işleme b SDS-sayfa jel YfeA genel zenginleştirme tarafından Dansitometresi jel filtrasyon ürünün % 61 periplasmic fraksiyonunun % 8 den artırmak için hesaplar. Mavi kutuları YfeA/toplam sinyal Dansitometresi hesaplamaları için kullanılan gösterir. Kütle spektrometresi analiz şeritte 4 kutulu grubun 259/280 YfeA amino asitler, yeşil vurgulamak sunulan algıladı. Olgun polipeptid amino asitler kalın büyük harfli siyah metin olarak temsil edilir ve amino asitler i ciddi sinyal peptid beste italik küçük gri renkte gösterilir. D. YfeA zenginleştirme - kötü örnek. SDS-sayfa jel YfeA arınma periplasm kesir, kimden adım degrade elüsyon anyon Exchange kullanarak. SDS-sayfa jel YfeA zenginleştirme genelinde arıtma adımları gösterir. Siyah oku anyon Satım Kromatografi sırasında gelişmiş büyük protein kirletici elektroforetik göçü konumunu gösterir. Sağ tarafta gösterilen molekül ağırlığı standartları. (1) superdex 200 pg jel filtrasyon sütun tepe. (2) Q anyon Satım sütun 250 mM NaCl adım degrade elüsyon. (3) periplasm kesir. Görüntü işleme SDS-sayfa jel d YfeA marjinal genel zenginleştirme Dansitometresi en fazla jel filtrasyon ürün % 20'si tarafından hesaplar. Mavi kutuları YfeA/toplam sinyal Dansitometresi hesaplamaları için kullanılan gösterir. Kütle spektrometresi analizini şeritte siyah bir ok ile gösterilir grubun 1 LivJ 26 benzersiz peptidler tespit (39 kDa), EfeO 25 benzersiz peptidler (41 kDa) ve LivK 17 benzersiz peptidler (39 kDa). Tüm üç kirletici periplasmic E. coli çoğu SBPs. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. APO YfeA ve sanal YfeA jel filtrasyon chromatograms. Siyah oku geçersiz birim konumunu gösterir. YfeA (siyah eğri) apo için jel filtrasyon doruklarına ve sanal YfeA (mavi eğri) göstermek her iki protein YfeA gelen toplam saf sanal olarak benzer bir hidrodinamik RADIUS periplasm kesir YfeA saf o apo sahip gösteren aynı elüsyon seste elute devletler Fransızca tuşuna bastıktan sonra hücresel içerik.
Şekil 3. APO YfeA ve sanal YfeA kristal türleri Morfoloji. Süre APO YfeA genellikle aynı kristalizasyon durumda kardeş kristalleri üretmek sanal YfeA yekpare bir kristal kadar billurlaşır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4. APO YfeA ve sanal YfeA x-ışını Floresans spectra. A. x-ışını Floresans spectra, sanal hiçbir ek geçiş metal takviyesi, yeşil eğri ile M9 en az ortamdan saf YfeA. Karakteristik tepeler, manganez, demir ve çinko için etiketlenir. B. x-ışını Floresans spectra YfeA örnekten üretilen YfeBCDE bağlamında. Karakteristik tepeler, manganez, demir ve çinko için etiketlenir. Mavi eğrisi. YfeBCDE bağlamında ve periplasm kesir başarılı ayırma sitoplazmik geçiş metaller ve/veya sanal YfeA protein en az kirlenme ile saf YfeA x-ışını Floresans spectra. Kırmızı eğri. X-ışını Floresans spectra, aşırı lizis ve sitoplazmik geçiş metaller ve/veya sanal YfeA protein önemli kirlilik başarısız ayırma ile YfeBCDE bağlamından saf YfeA. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5. Ayırma için iş akışı Genelleştirilmiş. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6. 60 dk radyoaktif metal alımı ayırma veri. Üç kez her deney gerçekleştirilmiş ve hata çubukları standart sapma gösterir. Kırmızı çubuk. Yfe taşıyıcı içermeyen E. coli hücreleri 52Mn sitoplazma içine yaklaşık % ~ 50 60 dakika sonra taşıma ve periplasmic 52Mn. mavi çubukseviyesinin düşük korumak. Yfe taşıyıcı taşıma içeren E. coli hücreler > 52Mn 60 sonra sitoplazma içine % 90 dakika ve periplasmic 52Mn. yeşil bardüşük düzeyde korumak. Sadece YfeA içeren E. coli hücre yaklaşık ~ %25 52Mn sitoplazma içine taşıma ve 60 dakika sonra ~ %25 52Mn periplasm içinde muhafaza.
Bu çalışmada, 52Mn kullanılan radiometal (t1/2 = 5,59 d), UAB Cyclotron tesis (Birmingham, AL) proton bombardımanı bir doğal Cr hedefte tarafından üretilen ve daha önce raporlanmış19saf. Dikkat: 52Mn Pozitron verici olduğunu (β+avg 242 = keV, %29.4) ve aynı zamanda yüksek yoğunluğu ile çeşitli yüksek enerjili gama ışınları yayar (Eγ = 744.2, 935.5, 1434.0 keV; Ben = % 90.0, %94.5, % 100). Bu nedenlerden dolayı deneme ALARA, radyasyon koruma ilkeleri takip yukarıda açıklandığı gibi gerçekleştirilmesi gerekir. Tüm maddeler radyoaktif atık olarak belirlenmiş uygun bulunan, açıkça etiketli ve göre kurulan yordamlar atılır.
Discussion
Hücre ayırma özellikle hücresel bir bölme içeriğini problama için yararlı bir araçtır ve metal atomları gibi küçük moleküller yanı sıra proteinler oluştururlar ayıklamak için yararlı bir araç olarak hizmet verebilir. Bu o cep ayırma mutlak bir teknik değildir ve hata eğilimli karıştırma/resuspension, inkübasyon sıcaklığı ve kuluçka süresi için dikkatli dikkat olmadan olabilir fazlalaştı. En az membranöz lizis ve böylece ihmal edilebilir ayırma eksik karıştırma neden olur, ayırma, oda sıcaklığında periplasmic kesir sitoplazmik içeriği ile kirlenme sonuçlanan her iki membran hızlı lizis neden olabilir ve Genişletilmiş kuluçka kez de aşırı lizis ve böylece kesir kirlenme neden olabilir. Verimli ve nispeten eksiksiz dış membran lizis (iç zar koruyarak) elde etmek için makul bir uzlaşma buz Hipotonik ayırma arabellekte 20 dakika kuluçka bitti. Diğer bir faktör nerede sallayarak veya girdap tarafından sert ayıklama protein toplama neden gibi özü kalitesini tehlikeye atabilecek ayıklama, yöntemidir. Bu gibi spatula, inversiyon veya yüksek kaliteli malzeme akış aşağı analizi için korumak için pipet tarafından alıyorum karışımı yavaşça önerilir. Partiye Hazırlık hücre ayırma saflaştırma değişken verimliliği ile şekil 1tarafından kanıtlanan oluşabilir. Bir deneyde, YfeA çıkarılan periplasmic içeriği (şekil 1 c), yüzde 8 başladı başka bir deneyde ise, YfeA periplasmic içeriği (şekil 1 d) % 17 başladı. Bu farklılıklar tekrarlanan kullanımı (EDTA büyüme medya için ifade gibi kürk düzenleme Yfe organizatörü, açlık mekanizmaları tarafından düzenlenen genlerin artırabilir ekleyerek), değişken ifade koşulları gibi çeşitli nedenlerden ortaya çıkabilir dondurulmuş kalıcı hisse senetleri ve insan hatası. Kuluçka kez ayarlamak yerine, bu ölçek-up hazırlık için tavsiye edilir. Arıtma periplasm kesir üzerinden doğrusal bir degrade elüsyon anyon Satım Kromatografik adım eklemek önerilir. Bir adım degrade elüsyon mobil faz kompozisyon kullanır ayrık ve ani değişimler bir elüsyon stratejisidir (i.e., 0 mM NaCl, 50 mM NaCl, 150 mM NaCl, vs.). Doğrusal bir degrade elüsyon kademeli değişiklik mobil olarak kullanan bir elüsyon stratejisidir aşama kompozisyon (Yani, 0 mM NaCl, 5 mM NaCl, 10 mM NaCl, vs.). Adım degrade durağan faz için farklı benzeşim var molekülleri ayırmak için yararlıdır ve doğrusal bir degrade elüsyon durağan faz için benzer benzeşim var molekülleri ayırmak için yararlıdır. Protein (durağan faz için ilgi geliştirmek için) hiçbir yapay arıtma etiketinden benzersiz protein türler içinde zengin bir hücreyi bölme ile arındırıcı söz konusu olduğunda, doğrusal bir gradyan elüsyon olabilir noninterest proteinlerin ayırmak için tavsiye edilir faiz protein olarak durağan faz için benzer benzeşim var. Genellikle, bir verim arıtılmış apo YfeA 1-2 mg YfeA onun endojen ifade kültür her litre beklenen Y. pestis organizatörü.
X-ışını Floresans hızlı bir örnek metal içeriği belirlemek ve araştırmacı başka bilinmeyen olacağını beklenmeyen metal birleşme hakkında bilgilendirmek için Dedektif sağlayan bir tekniktir. EDTA gevşekçe ilişkili veya ücretsiz metal kaldırmak için hipertonik ayırma arabelleğinde eklenir rağmen YfeA periplasm kesir elde edilen bazı sanal protein içerebilir. Belki metal taşıma dinamik bir süreç olduğunu göz önüne alındığında, sanal protein içeriği hala onun kargo YfeBCDE için bağışladı değil YfeA kaynaklandığı. Bu x-ışını Floresans sadece toplam metal içeriği ölçer ve metal bir kristal kafes emretti, yoksa özellikle bir protein için bağlı olduğunu göstermez dikkati çekiyor. Metal bir kristal kafes emretti ve/veya özel bir protein molekülüne bağlı eğer belirlemek için x-ışını saçılması veri toplama ve işleme gereklidir. Yine de, x-ışını Floresans metal kirlenme ve/veya kalan sanal protein Tümleştirme hızlı örnek değerlendirmesi için sağlar. Sinkrotron radyasyon süresi sınırlıdır ve her zaman her örneğe bağlı x-ışını saçılması veri toplamak için bir stratejisi hazırlamak için zaman değil, bu nedenle x-ışını Floresans birçok kristalleri eleme ve hangi örnekleri X-ray önceliklendirme için değerli bir tekniktir saçılma veriler toplanmalıdır. Ayrıca, x-ışını Floresans röntgen diffract değil örneklerinden veri toplama sağlar. X-ışını Floresans veri toplanırken, zaman sinyal çok zayıf olabilir ve sonuçta elde edilen spectra bilmeyengeceler. İçin x-ışını Floresans veya kızgın tarama, sinyal gücünü artırmak için çekim hızı artan ve/veya röntgen ışını zayıflama azalan göz önünde bulundurun. X-ışını saçılması veri toplamak için bir örnek tanımlandığında, bu örnek ne x-ışını Floresans ve tarama radyasyon hasarı en aza indirmek, verilerin kalitesini geliştirmek için deli için kullanıldı daha farklı bir parçası üzerinde x-ışını saçılması veri toplamak için tavsiye edilir koleksiyon ve herhangi bir anormal sinyal azaltılması için olasılığını en aza indirgemek.
Radyoaktif izleyiciler tespiti nanomolar miktarda malzeme veya daha az gerektirir ve bu tarayıcıları moleküler izleme ajanı olarak kullanımını problama hücresel süreçler basit ve son derece hassas yöntemi sağlar. Yukarıda özetlenen radiometal tahlil toplam metal alımı, hücresel kompartmanlarda yanı sıra gore Alım genelinde dağıtım belirlemek için kullanılabilir. Gerçekten de, her veri zaman noktası 40 dakika ayırma gerektirir; Ancak, her zaman noktası ulaştı olarak hücreleri hemen pelleted ve yüksek salt arabellek (şekil 5Adım 1) inkübe. Yüksek salt arabellek kuluçka başarıyla tüm kaldırır (şekil 5Adım 3) sonra medya, atılan yüksek salt arabellek (şekil 5Adım 1) ve periplasmic ve sitoplazmik kesirler radiometal ölçümleri gösterir zaman noktası ulaştıktan sonra ilk aralıklarla takip oyalandı ilişkilendirilmemiş ücretsiz metal kalan. Kuluçka yüksek tuz arabellek Ayrıca ek kalan ilişkilendirilmemiş ücretsiz metal kaldırdıktan sonra ilk Santrifüjü ilişkilendirilmemiş ücretsiz metal ve Santrifüjü çoğu (% 80'e kadar) kaldırır. Kalan ilişkilendirilmemiş ücretsiz metal metal taşıma 40 dakika ayırma sırasında önemli ölçüde etkiler beklenmiyor. 40 dakika ayırma hücre içi metal taşıma üzerinde etkisi ihtiyatlı veri yorumlanması için başka bir noktadır. Hemen hemen tüm Ayırma Protokolü adımlar arasında 30 ikinci Santrifüjü dışında buz üzerinde oluşur. Taşıma süresinin ders deneyler hücreleri 4 ° C'de muhafaza metal taşıma20,21,22abrogates belirttiler metal; Bu nedenle, buz üzerinde deneyler oluşur çünkü 40 dakika ayırma sitoplazma periplasm metal düzeyleri önemli ölçüde artırmak için beklenen değil ve metal düzeyleri hücreleri edildi zaman Puan temsilcisi olması bekleniyor Başlangıçta centrifugalized.
Farklı hücresel kompartmanlarda göreli anlamazdın belirlenmesi de yardım XFS veri bilgilendirmek, bir substrat fizyolojik doğası teyit olarak daha fazla bir mekanizma moleküler ayrıntılarını incelemek için Dedektif etkinleştirin. Örneğin, genetik mutagenesis radiometal alımını deneyler için ek anahtar işlevsel artıkları güçlendirmek için doğrudan bir yöntem sağlar veya söz konusu olursa molekül substrat taşıma. Radiometal alımını deneyler ve analizleri avantajları hızlı geri dönüş, yüksek işlem hacmi, yüksek tekrarlanabilirlik ve büyüme koşulları ve genetik yapıları karşılaştırma deneyleri parallelization içerir.
Disclosures
Yazarlar onlar-si olmak hayır çatışması beyan ederim.
Acknowledgments
Veri Ayrıca tamamen veya kısmen Ulusal Kanser Enstitüsü (ACB-12002) ve Ulusal Genel tıbbi Bilimler Enstitüsü (AGM-12006) federal fonları ile finanse GM/CA@APS adlı toplanmıştır. Bu araştırma kullanılan kaynaklar Gelişmiş foton kaynak (APS), bir ABD bölümü enerji (DOE) ofis, bilim kullanıcı tesis için DOE Office bilim Sözleşme No altında Argonne Ulusal Laboratuvarı tarafından işletilen DE-AC02-06CH11357. Gelişmiş foton kaynak kullanımı ABD Enerji Bakanlığı, bilim Office, Office temel Enerji Bilimler, Sözleşme No altında tarafından desteklenmiştir W-31-109-Eng-38.
UAB kapsamlı Kanser Merkezi - kütle spektrometresi/proteomik paylaşılan tesisi (P30CA13148-38) kabul etmek için kütle spektrometresi analiz onların yardım istiyoruz.
C.D.R. University of Alabama Birmingham Office çeşitliliğin, sermaye ve dahil, bir hibe tarafından desteklenmiştir. L.L.R. Birmingham Alabama Üniversitesi'nin Radyoloji bölümü tarafından desteklenmiştir. Enerji Bakanlığı, Office bilim, izotop programı 52Mn üretim destekleyen ve A.V.F.M. altında DESC0015773 verin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Polyethylene glycol 4000, EMD Millipore | Fisher | M1097270100 | |
| Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder) | Fisher | BP1760-5 | |
| AMRESCO M9 Medium Broth | Fisher | NC9688886 | |
| Bis-Tris, Fisher BioReagents | Fisher | BP301-100 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (Certified ACS) | Fisher | C79-500 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydrous (Granular Powder/Certified ACS) | Fisher | D16-500 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | S311-100 | |
| Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller | Fisher | BP1426-500 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | M63-500 | |
| Sodium Azide, White Powder | Fisher | BP922I-500 | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | S271-500 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Granular or Powder/Certified ACS) | Fisher | S374-500 | |
| Tris Hydrochloride (Small White Flakes/Molecular Biology) | Fisher | BP153-500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cryschem Plate | Hampton | HR3-158 | |
| EMD Millipore Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Fisher | UFC903024 | |
| EMD Millipore Millex Sterile Syringe Filters: Durapore PVFD Membrane | Fisher | SLHV013SL | |
| GE Healthcare HiLoad 26/600 Superdex 200 pg | Fisher | 28-9893-36 | |
| GE Healthcare HiTrap IEX HP Prepacked Columns | Fisher | 17-1154-01 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| Agilent Technologies BL21-CODON PLUS RIPL CELLS | Fisher | 230280 |
References
- ter Beek, J., Guskov, A., Slotboom, D. J. Structural diversity of ABC transporters. J Gen Physiol. 143 (4), 419-435 (2014).
- Berntsson, R. P., Smits, S. H., Schmitt, L., Slotboom, D. J., Poolman, B. A structural classification of substrate-binding proteins. FEBS Lett. 584 (12), 2606-2617 (2010).
- Mao, B., Pear, M. R., McCammon, J. A., Quiocho, F. A. Hinge-bending in L-arabinose-binding protein. The "Venus's-flytrap" model. J Biol Chem. 257 (3), 1131-1133 (1982).
- Hoeppner, A., et al. Proteins and Their Ligands: Their Importance and How to Crystallize Them. Advanced Topics on Crystal Growth. , InTech. Rijeka, Croatia. (2013).
- Lee, Y. H., et al. The crystal structure of Zn(II)-free Treponema pallidum TroA, a periplasmic metal-binding protein, reveals a closed conformation. J Bacteriol. 184 (8), 2300-2304 (2002).
- Wei, B., Randich, A. M., Bhattacharyya-Pakrasi, M., Pakrasi, H. B., Smith, T. J. Possible regulatory role for the histidine-rich loop in the zinc transport protein, ZnuA. Biochemistry. 46 (30), 8734-8743 (2007).
- Yatsunyk, L. A., et al. Structure and metal binding properties of ZnuA, a periplasmic zinc transporter from Escherichia coli. J Biol Inorg Chem. 13 (2), 271-288 (2008).
- McDevitt, C. A., et al. A molecular mechanism for bacterial susceptibility to zinc. PLoS Pathog. 7 (11), e1002357 (2011).
- Couñago, R. M., et al. Imperfect coordination chemistry facilitates metal ion release in the Psa permease. Nat Chem Biol. 10 (1), 35-41 (2014).
- Abate, F., et al. Apo, Zn2+-bound and Mn2+-bound structures reveal ligand-binding properties of SitA from the pathogen Staphylococcus pseudintermedius. Biosci Rep. 34 (6), e00154 (2014).
- Ahuja, S., et al. Structural analysis of bacterial ABC transporter inhibition by an antibody fragment. Structure. 23 (4), 713-723 (2015).
- Alberts, B., et al. Fractionation of Cells. Molecular Biology of the Cell. , 4th edition, Garland Science. New York, NY. (2002).
- Zhao, H., Martinis, S. A. Isolation of bacterial compartments to track movement of protein synthesis factors. Methods. 113, 120-126 (2017).
- Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. J R Soc Interface. 5, S131-S138 (2008).
- Bornhorst, J. A., Falke, J. J. Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Methods Enzymol. 326, 245-254 (2000).
- Radka, C. D., et al. Crystal structure of Yersinia pestis virulence factor YfeA reveals two polyspecific metal-binding sites. Acta Crystallogr D Struct Biol. 73 (7), 557-572 (2017).
- Elgundi, Z., Sifniotis, V., Reslan, M., Cruz, E., Kayser, V. Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody. J Vis Exp. (119), e55153 (2017).
- Gasteiger, E., et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. The Proteomics Protocols Handbook. Walker, J. N. , Humana Press. 571-607 (2005).
- Wooten, A. L., Aweda, T. A., Lewis, B. C., Gross, R. B., Lapi, S. E. Biodistribution and PET Imaging of pharmacokinetics of manganese in mice using Manganese-52. PLoS One. 12 (3), e0174351 (2017).
- Inman, R. S., Wessling-Resnick, M. Characterization of transferrin-independent iron transport in K562 cells. Unique properties provide evidence for multiple pathways of iron uptake. J Biol Chem. 268 (12), 8521-8528 (1993).
- Makui, H., et al. Identification of the Escherichia coli K-12 Nramp orthologue (MntH) as a selective divalent metal ion transporter. Mol Microbiol. 35 (5), 1065-1078 (2000).
- Forbes, J. R., Gros, P. Iron, manganese, and cobalt transport by Nramp1 (Slc11a1) and Nramp2 (Slc11a2) expressed at the plasma membrane. Blood. 102 (5), 1884-1892 (2003).
