Summary
Denne artikel beskriver detaljerede protokoller for økosystemet fabrikation af enheder (EcoFABs) som giver studier af planter og plante-mikrobe interaktioner i stærkt kontrollerede laboratorieforhold.
Abstract
Positive plante-mikrobe interaktioner tilbyder en bæredygtig biologisk løsning med potentiale til at øge produktionen af lav-input mad og bioenergi. En bedre mekanistisk forståelse for disse komplekse plante-mikrobe interaktioner vil være afgørende for at forbedre planteproduktion, som godt som udfører grundlæggende økologiske undersøgelser behandlende anlæg-jord-mikrobe interaktioner. Her, er en detaljeret beskrivelse af økosystemet fabrikation præsenteret, bruger bredt tilgængelige 3D udskrivning teknologier, for at skabe kontrolleret laboratorium levesteder (EcoFABs) til Mekanistiske undersøgelser af plante-mikrobe interaktioner inden for specifikke miljømæssige betingelser. To størrelser af EcoFABs er beskrevet der egner sig til undersøgelse af mikrobielle interaktioner med forskellige plantearter, herunder Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyonog Panicum virgatum. Disse gennemstrømnings-enheder tillader kontrolleres manipulation og prøvetagning af roden microbiomes, root kemi samt imaging root morfologi og mikrobielle lokalisering. Denne protokol indeholder detaljer for at opretholde sterile forhold inde i EcoFABs og montering af uafhængige LED lys systemer på EcoFABs. Detaljerede metoder til tilføjelse af forskellige former for medier, herunder jord, sand, og flydende vækst medier koblet til karakterisering af disse systemer ved hjælp af billedbehandling og metabolomics er beskrevet. Sammen, disse systemer aktiverer dynamisk og detaljerede undersøgelser af plante- og plante-mikrobe konsortier herunder manipulation af microbiome sammensætning (herunder mutanter), overvågning af plantevækst, roden morfologi, ekssudat sammensætning, og mikrobielle lokalisering under kontrollerede miljøbetingelser. Vi forventer, at disse detaljerede protokoller vil tjene som et vigtigt udgangspunkt for andre forskere, ideelt at hjælpe oprette standardiserede eksperimentelle systemer for at undersøge plante-mikrobe interaktioner.
Introduction
Anvendelsen af gavnlige plante mikrober i landbruget tilbyder store muligheder for at øge bæredygtig fødevareproduktion og biobrændstofproduktion at fastsaette en voksende befolkning1,2,3,4. En betydelig mængde af arbejde understøtter vigtigheden af at plante microbiomes i anlægget næringsstof optagelse, tolerance over for belastninger, og resistens over for sygdom5,6,7,8. Det er imidlertid vanskeligt at undersøge disse mekanismer af plante-mikrobe interaktioner i feltet økosystemer på grund af kompleksiteten og tilknyttede irreproducibility og manglende evne til at netop kontrol microbiome sammensætning og Genetik (fx., ved hjælp af mikrobielle mutanter)4,9,10.
Én strategi er at konstruere forenklet model økosystemer til at aktivere kontrolleret, replikerede laboratorieforsøg undersøger plante-mikrobe interaktioner for at generere indsigt, der kan blive yderligere testet i felt10,11, 12. Dette koncept bygger på traditionelle tilgange ved hjælp af planter, der dyrkes i jord-fyldt Potter eller på agar plader i drivhuse eller væksthuse13. Selv om disse sandsynligvis vil forblive mest anvendte metoder, de mangler evnen til at netop overvåge og manipulere plante vækst miljøer. Til disse formål, rhizoboxes og rhizotrons udgør en væsentlig forbedring i evnen til at studere under jorden processer14,15, og første protokoller blev offentliggjort til at analysere rhizosfære metabolitter i jordbunden16. For nylig, for at aktivere høj overførselshastighed analyse, avancerede mikrofluid enheder13,17 plante Chip18,19, RootArray20og RootChip21, har været udviklet som effektive værktøjer for anlægget fænotyper med mikrometer skala rumlige opløsning til at overvåge de tidlige vækst stadier af lille model planten Arabidopsis thaliana i flydende flow medium. For nylig, en to-lags imaging platform blev beskrevet som gør det muligt for root hår billeddannelse af Arabidopsis thaliana på sætteplante fase med en mikrofluid platform22.
Her, er detaljerede protokoller til at konstruere kontrolleret laboratorium udstyr (EcoFABs) forudsat for at studere plante mikrobe interaktioner og vise at de kan bruges til at studere forskellige planter herunder Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyon23, de økologisk vigtige flyvehavre Avena barbata, og bioenergi afgrøde Panicum virgatum (switchgrass). EcoFAB er et sterilt plante vækst platform, der omfatter to primære komponenter: EcoFAB enhed og steril plante mellemstore gennemsigtig beholder. EcoFAB enhed er lavet af en Polydimethylsiloxan (PDMS) fremstillingsprocessen, der indebærer støbning PDMS lag fra en 3D trykte plast skimmel og limning PDMS lag på objektglas med metoder tidligere rapporteret24,25 . De detaljerede procedurer for EcoFAB arbejdsgang, som enheden fabrikation, sterilisation, frø spiring, sætteplante transplantation, mikrobe podning/cocultivation, forberedelse af prøver og analyse, er beskrevet i denne protokol (figur 1). Yderligere ændringer af den grundlæggende arbejdsgang er beskrevet, herunder installation af computeren kontrolleret LED vokse lys og udnyttelse af fast underlag. Udnyttelsen af imaging teknikker til at undersøge root morfologi ændres, mikrobiel kolonisering af rødder, og masse spektroskopiske billeddannelse af roden ekssudater er beskrevet. Vi forventer, at den nemme, prisbillige design baseret på let tilgængelige materialer, samt de detaljerede protokoller, der præsenteres her, vil gøre EcoFAB platform til et samfund indtægt, standardisere plante-microbiome laboratorieundersøgelser.
Protocol
Advarsel: Denne protokol omfatter brugen af farlige kemikalier, skarpe genstande, elektriske enheder, varme genstande og andre risici, som kan resultere i skade. Passende personlige værnemidler (PPE, fx., kemisk resistente handsker, sikkerhedsbriller, laboratoriekittel, lang tøj, lukket-tåede sko, osv.) skal bæres, og de relevante sikkerhedsprocedurer (sikkerhedsuddannelse, brug af et stinkskab etc.) bør følges.
1. EcoFAB enhed fabrikation: Casting PDMS lag (figur 2 og figur 3)
- Konstruere EcoFAB forme ved hjælp af 3D trykteknikker (design-filer er tilgængelige på. Hver skimmel omfatter tre dele: en casting ramme, en Fremhævede skimmel base og et indstik, som vist i figur 2. Udskrive skimmel base og indsætte ud af stive uigennemsigtig polymerer trykområdet ved hjælp af en 3D plastik printer. Udnytte mindst 100 µm opløsning, og udskrive støbning rammen med acrylonitril butadien styren (ABS).
- Bland 40 mL af siloxan elastomer base med hærdning agent i en engangs 1 L beholder. Afhængigt af den ønskede eksperiment (trin 2.1 og 2.2), bruge forskellige nøgletal (v/v) af elastomer base/hærdning agent (5:1, 15:1, eller 30: 1). Fortsæt til trin 1,3 til 1,8 til alle former for blandinger.
Forsigtig: Bære kemisk resistente handsker, sikkerhedsbriller og andre PPEs. - Beholderen anbringes i et vakuumkammer i mindst 30 min til at fjerne luftbobler fra elastomer blanding.
- Hæld blandingen i den forsamlede 3D trykte plast skimmel (figur 3A) og holde formen på en varme blok ved 85 ° C i 4 h (figur 3B).
Forsigtig: Bære PPE at undgå forbrændinger. - Lad formen køle ned i 5 min. Derefter trække ud fra formen forsigtigt (figur 3 c), og derefter langsomt indsætte en hobbykniv mellem støbning ramme og PDMS (størknede elastomer blanding) til at adskille dem (figur 2D).
- Tryk på formen base med PDMS op ud af støbning rammen (figur 3). Brug en kniv eller andre værktøjer til at forsigtigt adskille PDMS lag fra mug base på kanterne (figur 3F), og derefter langsomt skrælle det fra skimmel overflade (figur 3 g).
- Oprette indløb og outlet kanaler på PDMS lag ved at gøre ~1.6 mm huller for tilgangs- og afgangsåbninger med en 15 gauge stump kanyle (figur 3 H, jeg).
Bemærk: Standard formen har en indsugnings- og udstødningsporte port, mens formen wide-outlet behøver kun indløbsstuds (figur 3 H, jeg). - Brug saks til at trimme kanterne af PDMS lag.
Bemærk: De klippede PDMS lag bør være ≥76 mm x 51 mm rektangler til små EcoFAB enheder og ≥102 mm x 83 mm rektangler til store EcoFAB enheder.
2. EcoFAB enhed fabrikation: kemisk vedhæfter PDMS lag på objektglas (figur 3 og figur 4)
- Permanent limning PDMS lag til objektglas
- Skyl limning side af laget PDMS (lavet af 15:1 elastomer base til hærdning agent blanding) og 7.6 × 5 cm mikroskop slide med methanol og derefter blæse tørre med trykluft eller en ultra-ren kvælstof pistol.
Forsigtig: Methanol er giftigt. Arbejde i et stinkskab og slid beskyttende øje belægning, handsker og andre PPEs. - Placer objektglas og PDMS lag til en plasma renere med deres limning sider vender opad (figur 3J). Hvis der ikke findes en plasma renere, springe til trin 2.2.
- Luk kammeret og gas udluftningsanordning ventil af plasma renere, og tænd for vakuum og pumpen ned i salen for 1 min.
- Tænd power af plasma generator, og skifte radio frekvens (RF) niveau til "Hej" til 1 min.
- Slår både vakuumpumpen og plasma magt, og lufte kammer til atmosfæren.
- Tag objektglas og PDMS lag fra plasma kammeret, og tryk hurtigt på alle fire kanter af PDMS lag i diaset med jævnt tryk (figur 3 L). Kontroller, at regionen center oval af PDMS lag (root afdeling) ikke berører diasset.
- Placer forseglede EcoFAB enheden på en 120 ° C varme blok i 20 min. til yderligere sikre permanent limning mellem PDMS lag og objektglas.
- Lad enheden køle ned i 5 min. Trim off ekstra kanter af PDMS lag med en kniv.
- Skyl limning side af laget PDMS (lavet af 15:1 elastomer base til hærdning agent blanding) og 7.6 × 5 cm mikroskop slide med methanol og derefter blæse tørre med trykluft eller en ultra-ren kvælstof pistol.
- Vendbar fysiske forsegling af PDMS lag til objektglas
- Den Vendbar forsegling teknik anvender et sæt brugerdefinerede klemmer (enten udskrives af en 3D plastik printer eller bearbejdet i metal, tegningerne er vist i figur 4).
- Placer objektglas til udskæring på klemme bundplade, og derefter tilpasse laget PDMS (lavet af en 5:1 elastomer base til hærdning agent blanding) på toppen af diaset.
- Top klemme pladen anbringes over PDMS lag. Fastgør de øverste og nederste plader sammen ved hjælp af fire hex cap skruer, orientere skruerne, så at nødder er gevind på fra toppen af klemmen.
- Vedhængende PDMS direkte til objektglas
- Placer PDMS lag (lavet af en 30: 1 elastomer base til hærdning agent blanding) oven på et objektglas.
- Tryk på laget PDMS til diaset. Den bløde, meget klæbende PDMS lag (30: 1) bør holde sig til diaset og oprette en vandtæt forsegling uden permanent kemisk binding eller fysiske tryk fra en klemme (figur 3 L).
- Den Vendbar forsegling teknik anvender et sæt brugerdefinerede klemmer (enten udskrives af en 3D plastik printer eller bearbejdet i metal, tegningerne er vist i figur 4).
3. EcoFABs sterilisation
- Skyl EcoFAB enheder med ultrarent vand.
- Placer en EcoFAB enhed i en EcoFAB beholder, og tilføje 70% ethanol, indtil enheden er neddykket. Luk beholderen låget og Ryst forsigtigt våde alle overflader inde med ethanol. Sørg for rod vækst kammer EcoFAB enheden er fyldt med ethanol, med meget få eller ingen luft bobler.
- Efter 30 min inkubation ved stuetemperatur, hæld 70% ethanol, og Gentag inkubering med 100% ethanol i 5 min.
- Løbe ud ethanol, og Inkuber den steriliseret EcoFAB til 16 h i en laminar flow hætte for at tørre det helt. Hvis det er tilgængeligt, sterilisere systemet ved at dreje på UV lys inden for hood for 1 h.
Forsigtig: Bære passende PPE, når du arbejder med UV lys. - Gemme den steriliseret EcoFABs i en steril hætte eller autoklaveres poser til fremtidig brug.
4. EcoFABs med LED vokse lys (figur 5)
- Vedhæfter LED strips på EcoFAB containere
- Afmærke steder på EcoFAB beholderen til 9 LED klip. Starte med det første klip 120 mm op fra bunden af beholderen langs en kant (figur 5A), og fortsætte med at markere ud klip placeringer i en spiral rundt om containeren med hver næste klip droppe 10 mm. En spiral af 9 klip, der giver mulighed for en 1 m LED strip til wrap rundt om containeren to gange.
- Hot lim en LED klip til hver markeret holdning ved at tilføje to klatter af hot lim container, justeret med holdning af klip monteringshuller. Tryk på klippet huller i disse to klatter af lim, derefter tilføje en anden dab lim på toppen af hullerne. Gentag proceduren for alle klip, indtil 9 klip danner en spiral (figur 5B).
Forsigtig: Bære handsker og andre PPE, når du arbejder med varmt lim til at undgå forbrændinger. - Tråd LED strip gennem klip i en spiral form, med lysdioder vender ind i beholderen. Strimlen skal cirkel rundt to gange (figur 5 c).
- Forbinder LED strips til strømforsyning med en controller (figur 5 d viser en EcoFAB kammer med belyst lys, programmering af controlleren er beskrevet i trin 4.3).
Advarsel: Risiko for elektriske stød: Sørg for, at strømforsyningen er tilsluttet, når du tilslutter ledningerne.- Tilslut de positive og negative terminaler af strømforsyningen til "INPUT: V +" og "INPUT: V-" klemmerne af controlleren ved hjælp af 2-leder kabel (figur 5E viser en skematisk tegning af controller setup).
- Slut den negative bly fra den nøgne ende af en kvinde-til-bare kablet til en "OUTPUT" kanal på controlleren.
Bemærk: Der er fem kanaler på den domænecontroller, der udnyttes i denne protokol, så det kan understøtte op til fem 1 m LED strips. - Tilslut alle positive fører kabler til en kompakt splejsning stik (hvis mere end én kanaler er nødvendigt), og derefter knytte dette stik til "OUTPUT V +" terminalen af controlleren.
- Sæt hver LED strip i hunkønsenden af kabler, så hver LED har sin egen kanal, der skal kontrolleres. Hvis det ønskes, kan du bruge kvinde til mand kabler til at udvide rækkevidden.
- Programmere registeransvarlige for en ønskede lys cyklus efter fabrikantens anvisninger,
5. voksende planter i EcoFABs
- Frø sterilisation og spiring
Bemærk: Frø sterilisation og alle følgende trin med stiklinger skal udføres under sterile forhold. Sterilisationsprocessen diskuteret nedenfor er velegnet til frøene fra Arabidopsis thaliana, Avena barbata, Brachypodium distachyon, og Panicum virgatum. Panicum virgatum frø bør blive suspenderet i 60% svovlsyre til 1 time før sterilisationsprocessen. Det anbefales at forberede 1-2 frø pr. EcoFAB enhed, overvejer spiring mængden og homogeniteten af spireevnen.- Sættetid frøene i 70% ethanol i 2 min.
- Fjerne ethanol med en pipette, og skyl frøene med sterilt vand tre gange.
- Forlade frøene i 10% blegemiddelopløsning i 5 min.
- Fjerne blegemiddelopløsning og grundigt vaske frøene ved hjælp af sterilt vand tre gange.
- Tilføje sterilt vand til frø, og inkuberes microcentrifuge rør i 4 ° C køleskab i 7 dage.
- Jævnt sprede frø på 0,5 Murashige & Skoog (MS) medium med 0,6% phytagel og forsegle plader med micropore tape.
- Vokse planter til roden længde ca 5 mm til overførsel til EcoFABs (figur 6A). For de eksperimenter, der præsenteres her, gælder en 16 h lys/8 h mørke belysning ordning i en 22 ° C vækst kammer, og Inkuber planterne 2-7 d før overførsel til EcoFAB (2 dage for Avena barbata og Brachypodium distachyon, 7 dage for Arabidopsis thaliana og Panicum virgatum).
- Overføre stiklinger til EcoFABs med flydende medium (figur 6)
- Ved hjælp af en steril sprøjte eller mikropipette flush root kammer i en EcoFAB enhed med sterilt vand tre gange, og derefter udfylde root kammer med vækstmediet af interesse, for eksempel 0,5 MS medium (fig. 6B, trin 5.1.6).
- Omhyggeligt indsætte en enkelt sætteplante i anlægget reservoir af EcoFAB enhed (figur 6 c).
Bemærk: Roden skal være fuldt neddykket inde i kammeret rod med skyde stikker ud af reservoiret. - Tilføj 3 mL sterilt vand i beholderen, undgå EcoFAB enhed. Dette vil øge luftfugtigheden og reducere fordampningen af mediet fra roden kammer.
- Luk beholderen, og forsegle låget med micropore tape (figur 6D).
- Opstille EcoFAB i en plante inkubator, eller udnytte EcoFAB belysning system i en kontrolleret temperatur miljø egnet til væksten i de respektive plante (trin 4). For denne undersøgelse, angive salen til 24 ° C.
- Med jævne mellemrum kontrollere EcoFAB for at genopfylde vækst medier inde i roden vækst kammer og tilsæt vand til objektbeholderen. Udfør alle trin under sterile forhold.
Bemærk: For tidlig plante vækststadierne, opfyldning af rod vækst kammer er nødvendigt hver 5 til 7 dage. Senere vækststadierne er en opfyldning hver 2-3 dage. Hvis det ønskes, kan bruge en sprøjte eller pipette til at indsamle root ekssudat løsning fra rod vækst kamre ind i et microcentrifuge rør og gemme det i et-80 ° C fryser; også, billede rod morfologien med en gel imager eller mikroskop.
- Overføre stiklinger til EcoFABs med fast underlag
- Bruge root kamre fabrikeret med en 5:1 blanding af elastomer base til hærdning agent, hvis ved hjælp af et sæt brugerdefinerede klemmer til at knytte det til et objektglas (figur 3 K, figur 4); eller Vælg en PDMS lag lavet af 30: 1 base til hærdning agent blanding, hvis vedhængende PDMS lag til dias direkte (som beskrevet i trin 2.2).
- Sterilisere EcoFAB kamre, som beskrevet i trin 3.
- Omhyggeligt tilføje steriliseret jord/sand ind i roden kammeret, vende PDMS lag op og ned, og Tilføj substrat til roden kammer. Undgå eventuelle partikler falder på det område, der vil være i kontakt med objektglas, da dette vil reducere friktion.
- Placer objektglas oven på laget PDMS, og tryk på alle kanter fast. Omhyggeligt flip EcoFAB enhed, således at ingen jord/sand falder ud af reservoiret åbning.
Bemærk: For EcoFAB enheder fremstillet af et 5:1 base til hærdning agent blanding, bruge en brugerdefineret klemme til at sikre seal. - Flow flydende medium eller vand gennem inlet eller outlet kanalen af EcoFAB enheden, og overføre en sætteplante i sin plante reservoir, som beskrevet i trin 3.3.
- Tilføje mikrober i EcoFABs
- Overføre en mikrobiel koloni til en inkubation tube med 8 mL LB bouillon, og dyrke det til OD 0,5 (ca. 12 h).
- Kultur opløsningen overføres til en 15 mL centrifugeglas, og der centrifugeres det ved stuetemperatur i 5 min på 3000 x g at sammenpresse mikrober.
- Fjern supernatanten, og tilsæt 8 mL af plante vækstmediet bruges i mål EcoFAB. Suspendere pellet af mikrober, og der centrifugeres rør ved stuetemperatur i 5 min på 3000 x g.
- Gentag trin 5.4.3. to gange hen til helt ophæve LB næringsstof spor.
- Tilføje plante vækstmediet til vasket mikrobe pellet, indtil dets optiske densitet er omkring 0,5 på 600 nm.
- Tilføj 20 µL af opløsningen mikrobe ind i roden salen gennem EcoFAB outlet. De stammer, der er anvendt i denne publikation rejste til at plante rødder inden for 2-3 dage, og startede koloniserer root overflader.
- For manipuleret kemiluminescens, Sørg for at medtage inducer (1 mM IPTG) i anlægget vækstmediet at fremkalde luciferase udtryk.
6. metabolit profilering af roden ekssudater fra EcoFABs
- Prøveforberedelse til LC/MS baseret metabolomics analyse
- Sætte microcentrifuge rør med root ekssudater indsamlet fra EcoFABs i en lyophilizer, og slå lyophilizer til at fjerne alt vandet fra rørene.
- Tilsæt 300 µL af LC-MS grade methanol i hver tube, og Læg instrumenterne i ultralydsbad i 30 min.
Forsigtig: Bære PPE, når du arbejder med methanol. - Sted rør i en centrifuge, og centrifugeres dem på 3000 x g i 5 min.
- Overføre de supernatanten løsninger til nye microcentrifuge rør, og fordampe methanol i et vakuum koncentrator.
- Tilsæt 150 µL af methanol med 1 mM LC-MS interne standarder i hver tube, og Inkuber rør i 4 ° C køleskab for 12 timer.
- Centrifugeres rør på 3000 x g i 5 min, og overføre supernatanten til 0,22 µm filter rør.
- Centrifugeres filter rør, og overføre de filtrerede løsninger til 2,0 mL LC/MS hætteglas med 200 µL af skær.
- Placer hætteglas inde i en LC/MS rack, og indlæse rack inde LC/MS auto-sampler.
- Dataanalyse
- Få en adgang af metabolitten Atlas og brugerdefinerede Python scripts26 eller bruge andre data analyse software.
- Identificere metabolitter baseret på m /z -værdier, retentionstid og sammensatte opsplitning mønstre ved hjælp af et bibliotek af metabolitten standarder. 27
7. masse spektroskopiske billeddannelse af planternes rødder i EcoFABs (figur 7)
Bemærk: EcoFAB apparater lavet af 5:1 elastomer base til hærdning agent blanding med brugerdefinerede klemmer (figur 7A) anvendes til roden stempling på nanostrukturer-initiativtager massespektrometri (NIMS) chips,28,29,30 da PDMS lag kan omvendt bundet til overfladen af NIMS chips.
- Sterilisere en NIMS chip overflade med UV-lys for 1 h.
- Vælge en EcoFAB med en voksende plante fra rugemaskinen, og placere den i en steril hætte.
- Åbner EcoFAB beholder, og fjern den øverste plade af klemmen.
- Opløfte PDMS lag sammen med anlæg inde, og omhyggeligt vedhæfte PDMS lag med anlægget på en NIMS chip (figur 7BD, E).
Bemærk: Når roden rører NIMS chip overflade, det skal ikke flyttes. Dette forhindrer "udtværing" root metabolitter. - Forsigtigt Tryk ned på rødder gennem laget PDMS indtil rødderne fuldt kontakt NIMS overflade. Lade rødderne på NIMS overflade i 20 min.
- Løft PDMS lag herunder planten fra NIMS chip, igen at undgå flytning roden på tværs af NIMS overflade. Returnere planten at klemme, hvis det ønskes.
- Vedhæfte NIMS chip på et brugerdefineret MALDI tallerken og læg pladen i en MALDI spektrometer til masse billedbehandling (figur 7C).
- Bruge OpenMSI program til at generere NIMS billede af roden metabolitter (figur 7 d-G)31.
Representative Results
Hver EcoFAB system omfatter en EcoFAB enhed og en plante størrelse gennemsigtig plastikbeholder. En EcoFAB enhed har en plante reservoir, en rod vækst kammer, et 1,6 mm flow indløb og en 1,6 mm afsætningsmulighed for standard EcoFAB enhed (figur 2D & figur 3 H) eller en 10 mm afsætningsmulighed for wide-outlet EcoFAB enhed (figur 2F & figur 3I ). Plante reservoir er designet i en trapez form, der har en 6 mm top åbning og 3 mm bunden åbning, og dette design reducerer chancen for flow lækage ved flydende injektion og også sikrer tilstrækkelig plads for plantevækst. Rod vækst kammer vedtager en oval form med 2 mm dybde passer mange model planter rodsystemer, som vist i figur 2 c og E. Både indsugnings- og kanaler af en standard EcoFAB enhed kan forbindes med PTFE slanger, så næringsstoffer løsninger kan flyde ind i roden vækst kammer uden at åbne EcoFAB beholderen. Wide-outlet EcoFAB enhed kraftigt reducerer flow modstand af forretningen, og fortrinsvis anvendes, når voksende planter med tykke rodsystemer eller periodisk indsamle root ekssudater efter komplekse rodsystemer er afledt af planter.
Støbning forme for opdigte PDMS lag af EcoFAB enheder er lavet i et design software, og derefter 3D trykt i stive uigennemsigtig polymerer trykområdet, som vist i figur 2 og figur 3. Planterne inde i EcoFABs kan observeres direkte med mikroskop ved hjælp af en lang arbejde afstand, at sikre den sterile vokse miljø (figur 8A, Supplerende fil 1). EcoFAB enheder med planter kan også passe ind på en høj opløsning mikroskop scene, som giver mulighed for højere opløsning billeddannelse af plante-mikrobe interaktioner (figur 8B, Supplerende fil 2). Sterilitet bevares ikke i dette miljø, og lang-dagsorden tænkelig er derfor kun egnet til slutpunkt målinger.
EcoFABs er designet til at aktiverer systematiske undersøgelser af planter, såsom deres morfologi, stofskifte og mikrobielle samfund på deres forskellige vækststadierne i hele deres livscyklus. Her, blev EcoFABs undersøgt som en generel platform til at studere en række forskellige plantearter. Figur 8 c -E viser 7 - døgn gammel Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyonog Panicum virgatum vokser i EcoFABs. Alle tre planter fandtes for at vokse godt i EcoFAB for over en måned. Både dicot, Arabidopsis thaliana og monocot, fandtes Brachypodium distachyon lever op til deres reproduktion stadier i EcoFABs.
Vendbar forseglingssystem tillader brug af fast underlag (fx., jord) inden for EcoFABs (trin 2.2). Denne Vendbar forsegling tilgang giver mulighed for indlæsning af solid substrater i rod vækst kamre, og giver også mulighed for prøvetagning fra bestemte regioner af rod rhizospheres. Figur 8F -H viser en gruppe af 14 - dage gamle Brachypodium distachyon vokser i hydroponiske medium, som sand og jord suppleret med hydroponiske medium (sand) og vand (jord). Det tynde faste substrat lag i rod vækst kamre tillader lys at trænge igennem til mikroskopisk billeddannelse af rodsystemer.
Roden morfologi defineres som rumlig konfiguration og distribution af en plante rodsystem og er blevet godkendt som en afgørende fysiologi reaktion på forskellige vækst miljøer, såsom næringsstof eller vand tilgængelighed32,33, 34. EcoFABs giver en praktisk tilgang til at studere plante morfologi over tid eller på forskellige næringsstoffer betingelser. Figur 9A-F viser et eksempel på brugen af EcoFABs til at spore root morfologier af Brachypodium distachyon i de første tre uger. En Brachypodium distachyon sætteplante blev overført til EcoFAB enheden, og dens rod struktur blev optaget af et kamera inde i en BIO-RAD gel imager. Billede behandlingsprogram, som billedet Jørgensen, python og matlab, kan yderligere anvendes til at kvantificere ændringerne af roden morfologier over tid eller på forskellige mellemstore miljøer. Kvantificering af samlede rod område i løbet af tre uger viste en gradvis stigning i den tidlige fase (< 1 uge) efterfulgt af en lineær væksttendens til slutningen af tre uger, som vist i figur 9 g.
En primær motivation til at konstruere EcoFAB er at undersøge plante-mikrobe interaktioner. Som beskrevet i trin 5.4, overføres mikroorganismer i rod vækst kamre af EcoFAB enheder gennem fjorden kanal. Figur 10 viser, en EcoFAB, der indeholder Pseudomonas simea (formerlyfluorescerende) WCS417 (WCS417), en plantevækst, fremme rhizobacteria med kemiluminescens etiketter, blev tilføjet i anlægget rod systemer med en koncentration af 106 celler pr. plante. WCS417 signal blev registreret med en gel imager, som viste en tydelig rumlige fordeling af WCS417 mikrober i rod vækst kamre. I både MS flydende medium med og uden den sand fast substrat koloniseret WCS417 mikrober overflader af de hele rodsystemer med mikrober koncentreret omkring roden tip områder, muligvis på grund af den aktive næringsstoffer produktion af roden tips (figur 10G & H)35. På den anden side WCS417 mikroorganismer i jorden substrat akkumuleret omkring planten reservoir regionen i stedet for root tips (figur 10jeg). Som mikrober blev tilføjet gennem outlet kanal, mikrober var også i stand til at bevæge sig i jord substratet, men ophobes ikke i roden, som observeres i Lage med eller uden sand. Dette kunne tyde på at jorden er en tilstrækkelig næringsstof kilde, og mikrober migreret til plante reservoir for optimal respiration betingelser.
For at studere metabolit profilering af anlægget rod ekssudater samt metabolit optagelse og slippe fra plante-mikrobe interaktioner, ekssudat løsninger fra rod vækst kamre blev indsamlet på tværs af forskellige vækststadierne af planter i EcoFABs. Som beskrevet i trin 6, udvindes ekssudat prøver derefter for LC-MS analyse. Brug denne metode, en vifte af metabolitter exuded af anlægget og forbruges af mikrober blev opdaget, og relaterede metabolit profilering af roden ekssudater med og uden mikrober colonization er i øjeblikket under efterforskning.
Figur 1: The EcoFAB arbejdsproces. Planter er spiret på pladen, og overført til den steriliseret EcoFAB, mikrober kan tilføjes. Ikke-destruktiv prøvetagning: root ekssudater kan udtages og afbildet, og roden morfologi kan visualiseres. Destruktiv prøvetagning giver mulighed for analyse af mikrobe, rod og skyde parametre i detaljer.
Figur 2: komponenterne i 3D trykt forme for EcoFAB indretning fabrikation. (A) top og vippes visninger af en støbning ramme. (B) top og vippes visninger af en insert. (C) Top og vippes visninger af en standard skimmel base. (E) top og vippes visninger af en wide-outlet skimmel base. (D, F) Samlet forme for opdigte standard, og wide-outlet EcoFAB enheder, henholdsvis. De ovale dimensioner er 51 mm x 34 mm til små EcoFAB mug og 76 mm x 62 mm for stor EcoFAB skimmel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: EcoFAB indretning fabrikation. (A) hælde blandingen af elastomer base og hærdning agent i formen. (B) opvarmning mug med blandingen på 85 ° C i 4 h. (C) at fjerne indsatsen fra formen. (D) adskiller PDMS fra støbning ramme. (E) skubber formen base ud af rammen støbning. (F) ved hjælp af en kniv til at adskille PDMS fra mug langs kanterne. (G) peeling PDMS lag langsomt ned af mold basen. (H) Poking huller for både indsugnings- og kanaler af standard PDMS lag. (I) stikke et hul til indløb kanal af wide-outlet PDMS lag. (J) PDMS lag (lavet af 15:1 elastomer base til hærdning agent blanding) og et objektglas skylles og overført til en plasma renere til limning. (K) Brug klemmer til at holde PDMS lag (lavet af en 5:1 elastomer base til hærdning agent blanding) på et objektglas. (L) trykker PDMS lag (lavet af en 30: 1 elastomer base til hærdning agent blanding) direkte på et objektglas. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: design af brugerdefinerede klemmer. (A) top og vippes visninger af en top klemme plade. (B) top og vippes visninger af en bunden klemme plade. (C) Top og vippes udsigt over samlet klemme med fire sæt af hex cap skruer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: installation af LED vokse lys. (A) mærkning ud steder 9 LED udklip i en spiral omkring EcoFAB beholder. (B) LED clips knyttet til objektbeholderen EcoFAB. C threading et LED strip gennem disse klip. (D) tilsluttes en controller, forbundet med et 24V strømforsyning LED strip. (E) skematiske af ledninger til controlleren. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: overførsel af planter i EcoFABs. (A) Brachypodium distachyon planter dyrket i 2 dage på en 0,5 MS plade. (B) påfyldning root kammer med plante vækstmediet. (C) ved hjælp af en pincet omhyggeligt indsætte roden i plante-reservoiret. (D) forsegling EcoFAB beholder med micropore tape, efter tilsætning af 3 mL vand til bunden af beholderen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: NIMS billeddannelse af plante rødder i EcoFABs. (A) en Brachypodium distachyon , vokser i en steril EcoFAB. B montering PDMS lag med anlægget på en NIMS chip for 20 min. (C) brug af kobber tape til at fastgøre NIMS chip på et brugerdefineret MALDI tallerken, og lægger det i en MALDI massespektrometer. (D-G) en 7 - dages gammel og en 20 - dage gamle Brachypodium distachyon plante bruges til NIMS imaging (D, E) og de tilsvarende NIMS billeder (F, G). De fremherskende ioner blev fremhævet i rød, grøn og blå. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: den generelle anvendelse af EcoFABs. (A) direkte fange rodvækst af Brachypodium distachyon i en EcoFAB med en lang arbejde afstand mikroskop setup. B direkte observere root-mikrobe interaktioner med en høj opløsning mikroskop setup. (C-E) 7 - døgn gammel Arabidopsis thaliana (C), Brachypodium distachyon (D) og Panicum virgatum (E) på 0,5 MS hydroponiske medium, (F-H) 14 - dage gamle Brachypodium distachyon dyrkes i 0,5 MS hydroponics (F), i sand (G) og jord (H) substrat leveres med 0,5 MS medium og vand, henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9: ved hjælp af EcoFABs for at studere root morfologi. (A-F) Roden udvikling af Brachypodium distachyon vokser i EcoFABs fyldt med 0,5 MS medium i løbet af første tre uger: (A) 2 dage, (B) 4 dage, (C) 7 dage, (D) 11 dage, (E) 14 dage, f 21 dage af vækst. (G) gennemsnit roden overfladen områder blev anslået ImageJ software. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 10: brug af EcoFABs for at studere root-mikrobe interaktioner. (A, B, C) En gruppe af 15 - dage gamle Brachypodium distachyon koloniserer med Pseudomonas fluorescens WCS417 i forskellige former for medier-MS flydende løsning, sand og jord substrater. (D, E, F) Lysfelt billeder af deres rodsystemer. (G, H, JEG) De tilsvarende kemiluminescens billeder af disse rodsystemer efter 14 dage Co dyrkning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende fil 1. Bruger EcoFAB til at fange rodvækst. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 2. Bruger EcoFAB til at fange root-mikrober interaktioner. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Protokollerne rapporteret her anvende økosystem fabrikation til at oprette EcoFABs giver Fællesskabets ressourcer til systematisk plante biologiske undersøgelser i stærkt kontrollerede laboratorieforhold. Forskud i 3D-printning give bredt tilgængelige teknologier for opbygningen og iterativt raffinering EcoFAB designs. Roden salen præsenteres her er fundet for at være velegnet til imaging mikroskopi og vedligeholdelse af steriliteten, gør det muligt for kontrolleret tilsætning af mikrober til at undersøge plante-mikrobe interaktioner. EcoFAB-platformen er kompatibel med forskellige plantearter. Det er vigtigt at anerkende fysiologiske effekter af dyrkning af planter i smalle root kammeret, således at yderligere eksperimenter vil være forpligtet til at generalisere resultaterne til planter, der vokser i naturlige miljøer.
Brug af sterile kamre og LED grow lys gør det muligt for undersøgelse af virkningerne af forskellige lysforhold, herunder bølgelængde, intensitet og varighed, på planternes vækst og tilhørende fysiologiske parametre parallelt. Vendbar limning root kamre tillade brug af fast underlag samt om rumligt indsamle solid prøver for biokemiske og genetiske analyser. Anvendelser af solid substrater, såsom jord, sand og kvarts perler, tilbyde mulighederne for at anvende EcoFABs til at konstruere mere økologisk relevante laboratorium økosystemer. Men alle de systemer, der er præsenteret her brug mættet væske (hydroponiske kulturer), som ikke er en præcis afspejling af de fleste jorder, og det vil være vigtigt at yderligere forfine disse designs at opretholde luftlommer i jorden, således at de bedre repræsenterer naturlige jordbund.
Brug af både enkle kameraer og mikroskoper er beskrevet til billede rodsystem morfologi udvikling på både bulk til cellulære niveau. Denne egnethed til overvågning root morfologi billedbehandling og kvantificering vil sandsynligvis være nyttige for at forstå reguleringsmekanismer plante fysiologiske og molekylære signaler udløst af plante genotypiske tilpasninger til vækstbetingelser. En begrænsning for at studere fysiologiske rodudvikling er imidlertid den aktuelle vandrette placering af EcoFAB enhed. I naturlige miljøer fører rødder gravitropic svar til en overvejende lodret udvikling af rodsystemet. Således, den horisontale system præsenteres her sandsynligvis adskiller sig på nogle faktorer fra et naturligt miljø, og fabrikation af EcoFAB systemer med lodrette placering af roden salen er et ønskværdigt mål for fremtidige EcoFAB versioner. Selv om de nuværende EcoFAB enheder er placeret vandret, er analyse af roden morfologi parametre i forskellige betingelser, eller som svar på mikrober, muligt. Høj opløsning imaging kan anvendes til at fange root kolonisering dynamics enkelt isolater eller samfund, oplysning om hvilken plante dele er koloniseret i forskellige næringsstoffer tilstrækkelig og mangelfuld betingelser. Det forventes, at sådanne studier giver vigtig ny indsigt i hvordan plante microbiomes er samlet, og hvordan disse dynamikker ændres over tid, for eksempel som rødderne udvikle.
Mikrofluid enheder aktiverer billeddannelse af meget unge planter, og mængden af metabolitter indsamlet er normalt ikke tilstrækkeligt for LCMS analyse. Jord-baserede systemer, såsom rhizotrons, tillade billeddannelse af roden morfologi, når enten planterne er transformeret med kemiluminescens konstruktion (Glo-root) eller med NMR-baseret metoder33,34. Metabolit ekstraktioner fra disse systemer er tidskrævende på grund af stort antal prøver. EcoFABs er en kombination af begge dele: fabrikation er svarende til mikrofluid enheder. EcoFABs var designet til at være enkel og billig at reproducere, men størrelsen af kammeret kan justeres for at dyrke planter med små eller store rodsystemer, op til deres reproduktive faser. Samtidige observationer af roden morfologi ændringer og root udsondring er muligt. Systemet er sterile, gør det muligt for kontrolleret tilsætning af specifikke mikrober.
EcoFABs er designet til at muliggøre kontrolleret indførelse og prøveudtagning af mikrober og metabolitter. Specifikt, er prøver, der opsamlet fra rod vækst kamre fundet for at være tilstrækkelig for masse spektroskopiske metabolit profilering. Integration af massespektrometri imaging (fx., NIMS teknik præsenteres her) giver en ikke-destruktiv tilgang for at studere metabolit rumlige distributioner af rodsystemer. Denne teknik vil sandsynligvis være nyttigt i fremtidige stabil isotop sporing eksperimenter og kortlægning mikrobielle lokalisering til specifikke metabolitter36. Mens denne protokol har fokuseret på enkelt isolater, kan den samme design helt sikkert bruges til mere komplekse samfund. Prøven diskenheder og biomasse inden for EcoFABs er sandsynligvis mere end tilstrækkelig for yderligere integration med DNA-sekventering teknologier, som vil være vigtigt at karakterisere og overvåge mikrobielle samfund struktur og gen udtryk.
Til sidst, denne protokol detaljer fabrikation laboratory økosystemers designet til undersøgelse af plante-mikrobe interaktioner, med vægt på enkle og tilgængelige metoder, der let kan gennemføres og udvides af forskere omkring den verden. Nuværende bestræbelser har til formål at demonstrere reproducerbarhed mellem labs og integration af en temperaturregulator sådan, at hver EcoFAB vil have uafhængigt kontrolleret lys og temperatur. Et yderligere fremskridt af systemet vil være integration af automatiske prøvetagning og genpåfyldning af EcoFAB root kamre og udviklingen af reproducerbare protokoller til oprettelse af relevante plante microbiomes inden for EcoFABs.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af laboratoriet instrueret forskning og udvikling (LDRD) program af Lawrence Berkeley National Laboratory støttet af Office of Science, af det amerikanske Department of Energy under Kontraktnr. DE-AC02-05CH11231 og en pris DE-SC0014079 fra den amerikanske afdeling af energi Office of Science til UC Berkeley. Arbejde på den molekylære Foundry blev støttet under US Department af energi Kontraktnr. DE-AC02-05CH11231. Vi takker også Suzanne M. Kosina, Katherine Louie, Benjamin P. Bowen og Benjamin J. Cole ved Lawrence Berkeley National Laboratory for al deres hjælp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printed custom mold | LBNL | STL files available here www.eco-fab.org; The EcoFABs molds described here were printed by FATHOM: http://studiofathom.com | |
| Dow sylgard 184 silicone elastomer clear kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Air duster spray | VWR | 75780-350 | any compressed gas duster should work |
| 15 gauge blunt needle | VWR | 89166-240 | |
| 5 mL syringe with Luer-Lok Tip | VWR | BD309646 | |
| 3”x2” microscope glass slide | VWR | 48382-179 | |
| 1.75" x 2.56" x 3.56" EcoFAB box | Amazon | B005GAQ25Q | |
| 4” x 3 ¼” microscope glass slide | Ted Pella | 260231 | |
| 4.87" x 4.87" x 5.50" EcoFAB box | Amazon | B00P9QVOS2 | |
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| 3D printed custom clamp | LBNL | STL files available from Trent Northen's lab | |
| Sterile hood | AirClean Systems | AC600 Series PCR Workstations | |
| PTFE syringe tubing | Sigma-Aldrich | Z117315-1EA | |
| Ethanol | VWR | 89125-172 | |
| Bleach | |||
| Murashige and Skoog (MS) Macronutrient Salt Base | Phytotechnologies Laboratories | M502 | |
| Murashige and Skoog (MS) Micronutrient Salt Base | Phytotechnologies Laboratories | M554 | |
| Soil | Hummert International | Pro-Mix PGX | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | 71010-52-1 | |
| Arabidopsis thaliana | Lehle Seeds | WT-24 Col-4 Columbia wild type | |
| Brachypodium distachyon | LBNL | Standard Bd-21 line | Available from John Vogel's lab |
| Panicum virgatum | The Samuel Roberts Noble Foundation | Alamo switchgrass | |
| Micropore tape | VWR | 56222-182 | |
| LC-MS grade methanol | VWR | JT9830-3 | |
| Lyophilizer | LABCONCO | FreeZone 2.5 Plus | |
| SpeedVAC concentrator | Thermo Scientific | Savant™ SPD111 SpeedVac | |
| Ultrafree-MC GV Centrifugal Filter-0.22 µm | Millipore | UFC30GV00 | |
| Liquid chromotography system | Agilent | Agilent 1290 LC system | |
| Q Exactive mass spectrometer | Thermo Scientific | Q Exactive™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap MS | |
| NIMS chip and custom MALDI plate | LBNL | For detailed protocol see: doi:10.1038/nprot.2008.110 | |
| MALDI mass spectrometer | AB Sciex | TOF/TOF 5800 MALDI MS | |
| Nano-coated LED grow light strip | LED World Lighting | HH-SRB60F010-2835 | |
| Power supply | LED World Lighting | MD45W24VA, LV100-24N-UNV-J | |
| TC420 controller | Amazon | B0197U7R8Q | |
| Silicone LED clips | Amazon | B00N9X1GI0 | |
| Hot glue gun | Amazon | B006IY359K | |
| Female-to-bare LED connector cable | LED World Lighting | HH-F05 | |
| Female-to-male LED connector extension cable | LED World Lighting | HH-MF1 | |
| 20AWG 2-wire cable | LED World Lighting | 6102051TFT4 | |
| WAGO 221-415 Splicing Connector | LED World Lighting | 221-415 |
References
- Morrissey, J. P., Dow, J. M., Mark, G. L., O'Gara, F. Are microbes at the root of a solution to world food production. EMBO Rep. 5 (10), 922-926 (2004).
- Farrar, K., Bryant, D., Cope-Selby, N. Understanding and engineering beneficial plant-microbe interactions: plant growth promotion in energy crops. Plant Biotechnol J. 12 (9), 1193-1206 (2014).
- Singh, J. S., Abhilash, P. C., Gupta, V. K. Agriculturally Important Microbes in Sustainable Food Production. Trends Biotechnol. 34 (10), 773-775 (2016).
- Dubey, R. K., Tripathi, V., Dubey, P. K., Singh, H. B., Abhilash, P. C. Exploring rhizospheric interactions for agricultural sustainability: the need of integrative research on multi-trophic interactions. J Clean Prod. 115, 362-365 (2016).
- Hunter, P. Plant microbiomes and sustainable agriculture. EMBO Rep. 17 (12), 1696-1699 (2016).
- van der Heijden, M. G. A., Hartmann, M. Networking in the Plant Microbiome. PLoS Biol. 14 (2), e1002378 (2016).
- Vessey, J. K. Plant growth promoting rhizobacteria as biofertilizers. Plant Soil. 255 (2), 571-586 (2003).
- Yang, J., Kloepper, J. W., Ryu, C. -M. Rhizosphere bacteria help plants tolerate abiotic stress. Trends Plant Sci. 14 (1), 1-4 (2009).
- Reynolds, H. L., Packer, A., Bever, J. D., Clay, K. GRASSROOTS ECOLOGY: PLANT-MICROBE-SOIL INTERACTIONS AS DRIVERS OF PLANT COMMUNITY STRUCTURE AND DYNAMICS. Ecology. 84 (9), 2281-2291 (2003).
- Finkel, O. M., Castrillo, G., Herrera Paredes, S., Salas González, I., Dangl, J. L. Understanding and exploiting plant beneficial microbes. Curr Opin Plant Biol. 38, 155-163 (2017).
- Northen, T. R., Zhang, Z., Gao, J., Swenson, T., Yoshikuni, Y. Advancing Our Understanding of the Chemistry of Soil Microbiomes. National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. 2017. The Chemistry of Microbiomes: Proceedings of a Seminar Series. , The National Academies Press. Washington, DC. (2017).
- Busby, P. E., et al. Research priorities for harnessing plant microbiomes in sustainable agriculture. PLOS Biology. 15 (3), e2001793 (2017).
- Sanati Nezhad, A. Microfluidic platforms for plant cells studies. Lab Chip. 14 (17), 3262-3274 (2014).
- Oburger, E., et al. Evaluation of a novel tool for sampling root exudates from soil-grown plants compared to conventional techniques. Environ Exp Bot. 87, 235-247 (2013).
- Van Der Krift, T. A. J., Berendse, F. Root life spans of four grass species from habitats differing in nutrient availability. Funct Ecol. 16 (2), 198-203 (2002).
- Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. P Natl. Acad. Sci. USA. 114 (17), 4549-4554 (2017).
- Sanati Nezhad, A., Naghavi, M., Packirisamy, M., Bhat, R., Geitmann, A. Quantification of cellular penetrative forces using lab-on-a-chip technology and finite element modeling. P Natl. Acad. Sci. USA. 110 (20), 8093-8098 (2013).
- Jiang, H., Xu, Z., Aluru, M. R., Dong, L. Plant chip for high-throughput phenotyping of Arabidopsis. Lab Chip. 14 (7), 1281-1293 (2014).
- Parashar, A., Pandey, S. Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis. Appl. Phys. Lett. 98 (26), 263703 (2011).
- Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression. Nat Methods. 9 (11), 1101-1106 (2012).
- Grossmann, G., et al. The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science. Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).
- Aufrecht, J. A., Ryan, J. M., Hasim, S., Allison, D. P., Nebenführ, A., Doktycz, M. J., Retterer, S. T. Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform. J. Vis. Exp. (126), (2017).
- Garvin, D. F., et al. Development of Genetic and Genomic Research Resources for Brachypodium distachyon, a New Model System for Grass Crop Research. Crop Sci. 48 (Supplement_1), S69-S84 (2008).
- Lisensky, G. C., et al. Replication and Compression of Surface Structures with Polydimethylsiloxane Elastomer. J. Chem. Educ. 76 (4), 537 (1999).
- Friend, J., Yeo, L. Fabrication of microfluidic devices using polydimethylsiloxane. Biomicrofluidics. 4 (2), 026502 (2010).
- Yao, Y., et al. Analysis of Metabolomics Datasets with High-Performance Computing and Metabolite Atlases. Metabolites. 5 (3), 431-442 (2015).
- Sumner, L. W., et al. Proposed minimum reporting standards for chemical analysis Chemical Analysis Working Group (CAWG) Metabolomics Standards Initiative (MSI). Metabolomics. 3 (3), 211-221 (2007).
- Gao, J., de Raad, M., Bowen, B. P., Zuckermann, R. N., Northen, T. R. Application of Black Silicon for Nanostructure-Initiator Mass Spectrometry. Anal. Chem. 88 (3), 1625-1630 (2016).
- Gao, J., et al. Morphology-Driven Control of Metabolite Selectivity Using Nanostructure-Initiator Mass Spectrometry. Anal. Chem. 89 (12), 6521-6526 (2017).
- Woo, H. -K., Northen, T. R., Yanes, O., Siuzdak, G. Nanostructure-initiator mass spectrometry: a protocol for preparing and applying NIMS surfaces for high-sensitivity mass analysis. Nat. Protoc. 3 (8), 1341-1349 (2008).
- Rübel, O., et al. OpenMSI: A High-Performance Web-Based Platform for Mass Spectrometry Imaging. Anal. Chem. 85 (21), 10354-10361 (2013).
- López-Bucio, J., Cruz-Ramı́rez, A., Herrera-Estrella, L. The role of nutrient availability in regulating root architecture. Curr Opin Plant Biol. 6 (3), 280-287 (2003).
- Lynch, J. P. Steep, cheap and deep: an ideotype to optimize water and N acquisition by maize root systems. Ann. Bot. 112 (2), 347-357 (2013).
- Rellán-Álvarez, R., et al. GLO-Roots: an imaging platform enabling multidimensional characterization of soil-grown root systems. eLife. 4, e07597 (2015).
- Kamilova, F., Validov, S., Azarova, T., Mulders, I., Lugtenberg, B. Enrichment for enhanced competitive plant root tip colonizers selects for a new class of biocontrol bacteria. Environ. Microbiol. 7 (11), 1809-1817 (2005).
- Klitgaard, A., Nielsen, J. B., Frandsen, R. J. N., Andersen, M. R., Nielsen, K. F. Combining Stable Isotope Labeling and Molecular Networking for Biosynthetic Pathway Characterization. Anal. Chem. 87 (13), 6520-6526 (2015).
