Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

המערכת האקולוגית פרוטוקולים פבריקציה נוספת (EcoFAB) להקמת מערכות אקולוגיות מעבדה שנועדה ללמוד אינטראקציות צמח-חיידק

Published: April 10, 2018 doi: 10.3791/57170
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 2, 2, 4, 1,2
1Environmental Genomics and Systems Biology Division, Lawrence Berkeley National Laboratory, 2Joint Genome Institute, Department of Energy, 3Joint BioEnergy Institute, 4Department of Environmental Science Policy and Management, University of California

Summary

מאמר זה מתאר מפורטת פרוטוקולים עבור ייצור המערכת האקולוגית של התקנים (EcoFABs) המאפשרים את הלימודים של הצמחים והאינטראקציות צמח-חיידק בתנאי מעבדה מבוקרת מאוד.

Abstract

אינטראקציות צמח מועיל-חיידק להציע פתרון הביולוגי בר קיימא עם פוטנציאל כדי להגביר את ייצור המזון, bioenergy קלט-נמוך. הבנה מכניסטית יותר של אינטראקציות מורכבות צמח-חיידק אלה תהיה מכרעת לשיפור ייצור במפעל כפי אקולוגית כן מבצע basic ללימודי אינטראקציות צמח-אדמת-חיידק החקירה. . הנה, תיאור מפורט של המערכת האקולוגית ייצור מוצג, שימוש נרחב זמין טכנולוגיות הדפסה תלת-ממדית, ליצירת מעבדתית מבוקרת בתי גידול (EcoFABs) ללימודי מכניסטית של אינטראקציות צמח-חיידק בתוך ספציפי סביבתיים תנאים. שתי מידות של EcoFABs מתוארים ומותאם החקירה של חיידקים אינטראקציות עם מיני צמחים שונים, לרבות תודרנית לבנה, עקצר distachyon virgatum ושכנותיה. התקנים אלה זרימה דרך לאפשר עבור מבוקר מניפולציה דגימה של שורש microbiomes, שורש כימיה, כמו גם הדמיה של השורש מורפולוגיה ולוקליזציה מיקרוביאלי. פרוטוקול זה כולל את הפרטים עבור שמירה על תנאים סטריליים בתוך EcoFABs, הרכבה מערכות עצמאיות של אור LED על גבי EcoFABs. שיטות מפורט עבור תוספת של צורות שונות של מדיה, כולל קרקעות, חול, צמיחה נוזל מדיית מצמידים אפיון מערכות אלה באמצעות הדמיה, גליקומיקס מתוארים. יחד, מערכות אלו מאפשרים חקירה דינמי ומפורט של צמח, צמח מיקרוביאליים קונסורציומים כולל המניפולציה של קומפוזיציה microbiome (כולל מוטציות), פיקוח על צימוח, מורפולוגיה שורש, הרכב תפליט, ו לוקליזציה של חיידקים תחת תנאי סביבה מבוקרת. אנו צופים כי פרוטוקולים נתונים היסטוריים אלה ישמש נקודת מוצא חשובה עבור חוקרים אחרים, באופן אידיאלי עוזר ליצור מערכות ניסויות מתוקננת על חקירת אינטראקציות צמח-חיידק.

Introduction

היישום של הצמח מועיל חיידקים בחקלאות מציע פוטנציאל אדיר להגברת ייצור דלק ביולוגי מאצות לספק עבור גידול האוכלוסייה1,2,3,4ואוכל בר קיימא. כמות משמעותית של עבודת תומך את החשיבות של צמח microbiomes צמח ספיגת התזונתי, עמידות בפני לחצים, עמידות בפני מחלות5,6,7,8. עם זאת, קשה לחקור מנגנונים אלה של אינטראקציות צמח-חיידק ב שדה אקולוגיות בשל המורכבות ואת irreproducibility המשויך ואת חוסר היכולת לשלוט בדיוק microbiome הרכב וגנטיקה (למשל., באמצעות חיידקים מוטנטים)4,9,10.

אסטרטגיה אחת היא לבנות מערכות אקולוגיות דגם פשוטה כדי לאפשר מבוקר, משוכפל שמוכר חוקרים אינטראקציות צמח-חיידק ליצירת התובנות יכול להיבדק עוד יותר שדה10,11, 12. המושג הזה בונה על הגישות המסורתיות בעזרת הצמחים גדלו בעציצים מלא אדמה או על אגר לוחות בתוך חממות או חממות13. למרות אלה יוותר הנפוצים ביותר גישות, הם חסרים את היכולת לפקח במדויק ולטפל סביבות גידול הצמח. הקצוות האלה, rhizoboxes, rhizotrons מייצגים על שיפור משמעותי ביכולת ללמוד תהליכים מתחת לקרקע14,15ו הראשונה הפרוטוקולים פורסמו לניתוח rhizosphere מטבוליטים קרקע16. לאחרונה, כדי לאפשר ניתוח תפוקה גבוהה, microfluidic מתקדמים התקנים13,17 כגון צמח שבב18,19, RootArray20RootChip21, היו פיתח כלי יעיל עבור הצמח phenotyping עם רזולוציה מרחבית בקנה מידה מיקרומטר לעקוב אחר השלבים הראשונים צמיחה של צמח מודל קטן תודרנית לבנה במדיום זרימת הנוזל. לאחרונה, פלטפורמה הדמיה דו שכבתי תוארה המאפשרת הדמיה שורש השיער של תודרנית לבנה בשלב שתיל עם פלטפורמה microfluidic22.

. הנה, פרוטוקולים מפורט עבור בניית מכשירי מעבדה מבוקרת (EcoFABs) ניתנים, לימוד אינטראקציות צמח חיידק ולהראות כי הם יכולים לשמש כדי לחקור מגוון צמחים כולל תודרנית לבנה, עקצר distachyon23, את חשובה מבחינה אקולוגית שועל Avena barbata, ועל היבול bioenergy ושכנותיה virgatum (switchgrass). EcoFAB היא פלטפורמה גידול הצמח עקר הכולל שני מרכיביה העיקריים: EcoFAB ההתקן ואת מיכל שקוף בגודל הצמח סטרילי. EcoFAB המכשיר מורכב מ polydimethylsiloxane (PDMS) תהליך זה כרוך הליהוק PDMS הייצור שכבות של תבנית פלסטיק מודפסים 3D ו מליטה PDMS שכבות על גבי שקופיות מיקרוסקופ בשיטות בעבר דיווחו24,25 . ההליכים מפורט של זרימת עבודה EcoFAB, כגון התקן פבריקציה נוספת, עיקור, נביטת הזרעים, השתלת שתיל, חיידק חיסון/cocultivation, הכנת הדוגמא, ניתוח, מתוארים פרוטוקול זה (איור 1). שינויים ותיקונים נוספים של זרימת העבודה הבסיסית מתוארים, הכוללים התקנת המחשב נשלט LED אורות לבין הניצול של סובסטרטים מוצק. הניצול של הדמיה טכניקות כדי לחקור את השורש מורפולוגיה משתנה, מושבת חיידקים של שורשים, ומתוארות הדמיה ספקטרוסקופיות מסה של השורש exudates. אנו צופים כי העיצוב פשוט, זול המבוסס על חומרים זמינים, כמו גם את הפרוטוקולים מפורט המובאים כאן, תהפוך את הפלטפורמה EcoFAB משאב הקהילה, סטנדרטיזציה במחקרי מעבדה צמח-microbiome.

Protocol

התראה: פרוטוקול זה כולל שימוש כימיקלים מסוכנים, חפצים חדים, מכשירי חשמל, עצמים חמים, וסכנות אחרות שעלולים לגרום לפציעה. ציוד מגן אישי המתאים (PPE, למשל., כפפות עמידים כימית, בטיחות משקפיים, חלוק המעבדה, בגדים ארוכים, סגור-נעל, וכו '.) צריך להיות שחוקים, ונוהלי בטיחות המתאים (הדרכות בנושאי בטיחות, השימוש ברדס fume, ועוד). כדאי להיות במעקב.

1. EcoFAB התקן פבריקציה נוספת: השלכת שכבות PDMS (איור 2 & איור 3)

  1. לבנות התבניות EcoFAB בטכניקות הדפסה תלת-ממדית (הקבצים עיצוב הינם זמינים. כל תבנית כוללת שלושה חלקים: מסגרת הליהוק בסיס עובש נבחרים, מוסף, כמוצג באיור2. הדפס את בסיס התבנית ולהוסיף מחוץ נוקשה photopolymers אטום באמצעות מדפסת פלסטיק תלת-ממד. לנצל את מינימום של 100 מיקרומטר רזולוציה, ולהדפיס את המסגרת הליהוק עם styrene טבעי בוטאדיאן (ABS).
  2. מערבבים 40 מיליליטר siloxane elastomer הבסיס עם אשפרה הסוכן בתוך מיכל 1 ליטר חד פעמיות. בהתאם הניסוי הרצוי (שלבים 2.1 ו- 2.2), להשתמש יחסים שונים (v/v) של אלסטומר בסיס אשפרה הסוכן (5:1, 15:1, או שכן). המשך הצעדים 1.3 ל 1.8 עבור כל מיני תערובות.
    התראה: ללבוש כפפות עמידים כימית, בטיחות משקפיים ו PPEs אחרים.
  3. הכנס את המיכל בתוך תא ואקום במשך לפחות 30 דקות להסיר בועות אוויר מן התערובת elastomer.
  4. שופכים את התערובת לתוך שהורכב 3D המודפס פלסטיק כייר (איור 3 א) ולשמור את התבנית על בלוק חימום ב 85 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות (איור 3B).
    התראה: ללבוש את עיקרון השוויון הפוליטי כדי למנוע כוויות.
  5. תן העובש להתקרר למשך 5 דקות. ואז למשוך את הוספה של העובש בעדינות (איור 3C), ולאחר מכן להוסיף לאט סכין יפנית בין יציקת מסגרת PDMS (התערובת elastomer הקרושה) להפריד ביניהם (איור דו-ממדי).
  6. הקש את התבנית עם PDMS על בסיס אל מחוץ למסגרת הליהוק (איור 3E). להשתמש בסכין או כלים אחרים בעדינות להפריד את השכבה PDMS בסיס התבנית בקצוות (איור 3F), ואז לאט לאט מתקלפת זה מפני השטח עובש (איור 3G).
  7. יצירת כניסת ולהערכת ערוצי עודפים על הרבדים PDMS על-ידי הפיכת ~1.6 מ"מ חורים היציאות כניסת ולשקע עם 15 בוטה המחט (איור 3 H, אני).
    הערה: כייר רגיל יש יציאת כניסת ולשקע, בעוד כייר רחב-outlet זקוק רק יציאת כניסת (איור 3 H, אני).
  8. להשתמש במספריים לחתוך את הקצוות של שכבות PDMS.
    הערה: השכבות PDMS החתוך צריך להיות ≥76 מ מ x 51 מ מ מלבנים עבור מכשירים EcoFAB קטנים ≥102 מ מ x 83 מ מ מלבנים עבור התקנים EcoFAB גדולים.

2. EcoFAB התקן פבריקציה נוספת: הצמדת מבחינה כימית PDMS שכבות על גבי שקופיות מיקרוסקופ (איור 3 & 4 באיור)

  1. מליטה לצמיתות את השכבות PDMS על שקופיות מיקרוסקופ
    1. שטיפה לצד מליטה את השכבה PDMS (שבוצעו של אלסטומר 15:1 בסיס אשפרה הסוכן תערובת) ו- 7.6 × 5 ס מ מיקרוסקופ שקופיות עם מתנול, ואז לפוצץ יבש עם אוויר דחוס או ברובה החנקן אולטרה טהור.
      התראה: מתנול רעיל. לעבוד בשכונה fume וללבוש כיסוי העין מגן, כפפות, PPEs אחרים.
    2. מקום שקופיות מיקרוסקופ ושכבת PDMS לתוך מסך פלזמה מנקה עם צדם מליטה פונה כלפי מעלה (איור 3J). אם מסך פלזמה מנקה אינה זמינה, דלג לשלב 2.2.
    3. לסגור את התא ואת בפיזור שסתום הגז של פלזמה מנקה, והפעל את אבק ואת משאבת למטה לחדר עבור 1 דקות.
    4. להפעיל את הכוח של הגנרטור פלזמה, לעבור את רמת בתדר רדיו (RF) "הי" עבור 1 דקות.
    5. כבה את משאבת ואקום וגם הכוח פלזמה, לפרוק את התא לאווירה.
    6. להוציא את שקופיות מיקרוסקופ ואת שכבת PDMS מן החדר פלזמה, והקש במהירות לכל ארבעה קצוות של השכבה PDMS אותן לשקופית עם גם הלחץ (איור 3 L). ודא כי האזור סגלגל מרכז השכבה PDMS (תא שורש) אינו נוגע השקופית.
    7. מניחים את המכשיר EcoFAB אטום על 120 ° C חימום בלוק עבור 20 דקות לאבטח נוספת לקשר קבוע בין השכבה PDMS השקופית מיקרוסקופ.
    8. . תן את המכשיר יירגעו 5 דק לקצץ את הקצוות הנוסף של השכבה PDMS עם סכין.
  2. איטום הפיזי הפיך של השכבות PDMS על שקופיות מיקרוסקופ
    1. הפיך איטום טכניקה מנצל סט תופסנים מותאם אישית (גם להדפסה על-ידי מדפסת פלסטיק תלת-ממד או במכונה ב מתכת, הרישומים מוצגים באיור4).
      1. במקום השקופית מיקרוסקופ לתוך הכרזה על צלחת קלאמפ התחתון ולאחר מכן ליישר את השכבה PDMS (שבוצעו של הבסיס elastomer 5:1 אשפרה הסוכן תערובת) על גבי השקופית.
      2. מקם את הצלחת מהדק העליון מעל השכבה PDMS. אבטח את הצלחות העליון והתחתון יחד באמצעות ארבעה ברגים hex קאפ, המכוונת את הברגים כך האגוזים בנויים כרצפי על מהחלק העליון של המלחציים.
    2. הקפדה PDMS ישירות אל שקופיות מיקרוסקופ
      1. מקמו את השכבה PDMS (עשוי בסיס elastomer שכן של כדי אשפרה הסוכן תערובת) על גבי שקופית מיקרוסקופ.
      2. הקש את השכבה PDMS לשקופית. רך, מאוד דבק PDMS השכבה (שכן) צריכים לדבוק השקופית יצירת חותמת עמיד למים ללא קשרים כימיים קבוע או לחץ פיזי מלחציים (איור 3 L).

3. EcoFABs עיקור

  1. לשטוף EcoFAB מכשירים עם מים הנדסה גנטית.
  2. למקם את התקן EcoFAB אחד מיכל EcoFAB, והוסף אתנול 70% עד המכשיר שקוע. סגור את מכסה מיכל ומנערים בעדינות להרטיב כל המשטחים בפנים עם אתנול. ודא התא צמיחה השורש של המכשיר EcoFAB מתמלא אתנול, עם מעט מאוד או אין אוויר בועות.
  3. לאחר דגירה 30 דקות בטמפרטורת החדר, יוצקים את 70% אתנול, וחזור הדגירה עם אתנול 100% למשך 5 דקות.
  4. לנקז החוצה אתנול, דגירה של EcoFAB סטיריליים עבור 16 ש ח בחודש תא למינארי לייבש את זה לחלוטין. אם הוא זמין, לעקר את המערכת על-ידי הפעלת UV אור בתוך הוד מאובטח.
    התראה: ללבוש עיקרון השוויון הפוליטי המתאים בעת עבודה עם נורות UV.
  5. אחסן את EcoFABs סטיריליים ברדס סטרילי או בלוק שקיות לשימוש עתידי.

4. EcoFABs עם LED לגדול אור (איור 5)

  1. הצמדת LED רצועות על גבי EcoFAB מכולות
    1. לסמן את המיקומים על המכולה EcoFAB 9 LED סרטונים. להתחיל עם הסרטון הראשון 120 מ"מ למעלה מהחלק התחתון של המיכל לאורך קצה (איור 5A), והמשך בכדי לסמן את הקליפ במיקומים ספירלה מסביב למכולה, עם כל קליפ הבא יורד 10 מ מ. ספירלה של קליפים 9 המאפשר רצועה LED 1 מ' לגלוש סביב המכולה פעמיים.
    2. דבק חם סרטון LED לכל אחד מסומן עמדה על-ידי הוספת שני ודבס בדבק חם לתוך המיכל, מיושר עם העמדה של נקבי את הקליפים. לחץ החורים קליפ לתוך אלה ודבס שני של דבק ולאחר מכן להוסיף dab אחר בדבק על החורים. חזור על הפעולות לכל כל קטעי עד 9 סרטונים בצורת ספירלה (איור 5B).
      התראה: ללבוש כפפות, עיקרון השוויון הפוליטי אחרים בעת עבודה עם דבק חם כדי למנוע כוויות.
    3. שרשור לרצועת LED דרך הקליפים בצורת ספירלה, עם נוריות מול לתוך המיכל. רצועת צריכים להקיף פעמיים (איור 5C).
  2. חיבור LED רצועות למקור הכוח עם בקר (מציגדמות 5D תא EcoFAB עם האורות מוארים, התכנות של הבקר מתואר בשלב 4.3).
    התראה: סכנת התחשמלות: לוודא אספקת החשמל מנותק בעת חיבור חוטים.
    1. להתחבר המסופים חיוביים ושליליים של הזרם המסופים "קלט: V +" ו "קלט: V-" של בקר באמצעות כבל תילים (איור 5E מציג שרטוט ציור של ההתקנה בקר).
    2. להתחבר להוביל שלילי מהקצה החשופות של כבל נקבה-כדי-חשופים ערוץ אחד "פלט" בבקר.
      הערה: ישנם חמישה ערוצים בבקר זה מנוצל ב פרוטוקול זה, אז זה יכול לתמוך עד חמש רצועות 1 מ' LED.
    3. להתחבר כל ההפניות חיובי כבלי קומפקטית שחבור מחבר (אם ערוצי אחד או יותר יש צורך), ולאחר מכן לקשר מחבר זה "פלט V +." לתחנה המרכזית של הבקר.
    4. מתחברים כל רצועת LED הסוף הנשי של הכבלים, אז כל LED יש ערוץ משלה כדי להיות נשלט. אם רצונך בכך, להשתמש כבלים נקבה מנקבה-לזכר להאריך להישג.
  3. תוכנית הבקר עבור מעגל האור הרצויים בהתאם להוראות היצרן,

5. גידול צמחים EcoFABs

  1. עיקור זרע, נביטה
    הערה: עיקור זרע את, כל השלבים הבאים עם שתילים חייב להתבצע בתנאים סטריליים. תהליך עיקור בהמשך מתאים זרעי תודרנית לבנה, Avena barbata עקצר distachyon, virgatum ושכנותיה. Virgatum ושכנותיה זרעים המחבוש בחומצה גופרתית 60% לשעה לפני תהליך עיקור. מומלץ להכין 1-2 זרעים לכל מכשיר EcoFAB, שוקל את שיעור הנביטה והומוגניות נביטה.
    1. להשרות את הזרעים אתנול 70% למשך 2 דקות.
    2. הסר אתנול עם פיפטה ולשטוף את הזרעים במים סטריליים שלוש פעמים.
    3. השאירו את הזרעים אקונומיקה 10% הפתרון עבור 5 דקות.
    4. הסר את הפתרון אקונומיקה ולאחר ביסודיות לשטוף את הזרעים במים סטריליים באמצעות שלוש פעמים.
    5. להוסיף הזרעים במים סטריליים ולאחר תקופת דגירה הצינור microcentrifuge במקרר 4 ° C של 7 ימים.
    6. שווה להפיץ את הזרעים על 0.5 בינוני Murashige & Skoog (MS) עם 0.6% phytagel, לאטום את הצלחות עם קלטת micropore.
    7. לגדל את הצמחים לאורך השורש של-5 מ"מ לשם העברה אל EcoFABs (איור 6A). הניסויים שהוצגו כאן, החלת משטר האור/8 תאורה כהה h 16 h בחדר צמיחה 22 ° C, דגירה הצמחים 2-7 d לפני העברת EcoFAB (2 ימים עבור Avena barbata ו- distachyon עקצר, 7 ימים עבור תודרנית לבנה ו- virgatum ושכנותיה).
  2. העברת השתילים לתוך EcoFABs נוזלי בינונית (איור 6)
    1. באמצעות מזרק סטרילי או micropipette, ריקון התא השורש של מכשיר EcoFAB במים סטריליים עבור שלוש פעמים ולאחר מכן למלא את התא שורש עם מדיום הגידול של עניין, לדוגמה 0.5 MS בינוני (איור 6B, שלב 5.1.6).
    2. בזהירות להוסיף נבט יחיד לתוך המאגר צמח של המכשיר EcoFAB (איור 6C).
      הערה: השורש צריך מלא מתחת לפני המים בתוך החדר שורש, עם הצילומים מבצבץ מתוך המאגר.
    3. להוסיף 3 מ ל מים סטריליים לתוך המיכל, הימנעות המכשיר EcoFAB. זה להגביר את הלחות ולצמצם האידוי של המדיום מן החדר שורש.
    4. לסגור את המיכל, לסגור את המכסה עם קלטת micropore (6D איור).
    5. מקם את EcoFAB לתוך החממה הצמח, או לנצל את המערכת הארה EcoFAB בסביבה מבוקרת טמפרטורה מתאימה הגידול של הצמח בהתאמה (שלב 4). במחקר זה, להגדיר את התא 24 ° C.
    6. בדוק מעת לעת את EcoFAB כדי למלא מדיה צמיחה בתוך החדר צמיחה שורש ומוסיפים מים אל המיכל. בצע את כל השלבים בתנאים סטריליים.
      הערה: בשלבים המוקדמים של התפתחות הצמח, מילוי החדר צמיחה השורש הוא הכרחי בכל 5-7 ימים. עבור בשלבים מאוחרים יותר של צמיחה, מילוי מחדש יש צורך כל 2-3 ימים. במידת הצורך, השתמש מזרק או פיפטה כדי לאסוף שורש תפליט פתרון תאי צמיחה השורש לתוך צינור microcentrifuge ואחסן אותו במקפיא-80 ° C; כמו כן, תמונה המורפולוגיה שורש עם ג'ל imager או מיקרוסקופ.
  3. העברת השתילים לתוך EcoFABs עם מצעים מוצק
    1. להשתמש את תאי השורש מפוברק בתערובת 5:1 של אלסטומר הבסיס לסוכן לריפוי, אם באמצעות קבוצת מלחציים מותאם אישית כדי לצרף אותו לשקופית מיקרוסקופ (איור 3 K, איור 4); או בחרו ' שכבה PDMS שבוצעו של שכן הבסיס אשפרה הסוכן תערובת אם הקפדה PDMS שכבות על שקופיות ישירות (כפי שמתואר בשלב 2.2).
    2. לחטא את תאי EcoFAB, כמתואר בשלב 3.
    3. בזהירות להוסיף אדמה מעוקר/חול אל החדר שורש, הפוך את השכבה PDMS והוסף את המצע לתאי השורש. הימנע לכל חלקיקי ליפול על האזור יהיה בקשר עם השקופית מיקרוסקופ, מאז זו תפחית אדהזיה.
    4. מקם את שקופיות מיקרוסקופ מעל השכבה PDMS, ולאחר בחוזקה את כל הקצוות. בזהירות להעיף את המכשיר EcoFAB כך אין אדמה/חול נופל מתוך מאגר פתיחה.
      הערה: עבור התקני EcoFAB שבוצעו של 5:1 בסיס אשפרה הסוכן תערובת, להשתמש במלחצת מותאם אישית כדי לאבטח את החותם.
    5. זרימה בינונית נוזלי או מים דרך ערוץ כניסה או עודפים של המכשיר EcoFAB, העברת שתיל לתוך מאגר צמח שלה, כפי שמתואר בשלב 3.3.
  4. הוספת חיידקים לתוך EcoFABs
    1. להעביר מושבה מיקרוביאלית שפופרת דגירה 8 מ ל מרק ליברות, לגדל את זה למנת יתר 0.5 (כ- 12 שעות).
    2. להעביר את הפתרון תרבות לתוך שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל, centrifuge זה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות ב 3000 g x כדי הצניפה חיידקים.
    3. הסר את תגובת שיקוע, וכן להוסיף 8 מ של מדיום הגידול של הצמח בשימוש המטרה EcoFAB. להשעות בגדר של חיידקים, centrifuge את הצינור בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות ב 3000 x g.
    4. חזור על שלב 5.4.3. פעמיים כדי להסיר לחלוטין את עקבות מזין ליברות.
    5. להוסיף מדיום הגידול של הצמח בגדר חיידק שטף עד צפיפות אופטית שלה הוא בערך 0.5-600 ננומטר.
    6. הוסף 20 µL של הפתרון חיידק אל החדר שורש דרך שקע EcoFAB. זנים המשמשים בפרסום זה נסע לשורשי צמחים תוך 2-3 ימים, התחילה משטחים השורש להמדינות.
    7. עבור הנדסה לאחור chemiluminescent, הקפד לכלול משרן (1 מ מ IPTG) צמח מדיום הגידול לזירוז לוציפראז ביטוי.

6. מטבוליט פרופיל של שורש Exudates מ- EcoFABs

  1. הכנת הדוגמא עבור LC/MS מבוססי מטבולומיקס ניתוח
    1. שים את הצינורות microcentrifuge עם exudates שורש שליקט מן EcoFABs איזה שהוא לופילייזר, והפעל את איזה שהוא לופילייזר כדי להסיר את כל המים מן הצינורות.
    2. הוסף µL 300 של LC-MS כיתה מתנול לתוך כל שפופרת, sonicate במשך 30 דקות.
      התראה: ללבוש עיקרון השוויון הפוליטי בעת עבודה עם מתנול.
    3. למקם את הצינורות צנטריפוגה ולאחר centrifuge אותם ב 3000 g x במשך 5 דקות.
    4. להעביר את הפתרונות supernatant לתוך צינורות microcentrifuge החדש ולאחר להתאדות מתנול ברכז ואקום.
    5. להוסיף 150 µL של מתנול עם 1 מ מ LC-MS סטנדרטים פנימיים לתוך כל שפופרת, דגירה הצינורות במקרר 4 ° C במשך 12 שעות.
    6. Centrifuge הצינורות ב 3000 x g למשך 5 דקות, להעביר את תגובת שיקוע לתוך צינורות 0.22 של מסנן מיקרומטר.
    7. Centrifuge צינורות מסנן ולאחר להעביר פתרונות מסוננים לתוך צלוחיות LC/MS 2.0 מ עם 200 µL של מוסיף.
    8. מקם את הבקבוקונים בתוך ארון תקשורת LC/MS, וטען המדף פנימה הדוגם האוטומטי LC/MS.
  2. ניתוח נתונים
    1. קבל גישה של המטבוליט אטלס, קבצי script מותאמים אישית פיתון26 או בתוכנת ניתוח נתונים אחרים.
    2. לזהות מטבוליטים בהתבסס על m / ערכיz , זמן השמירה ואת פיצול מתחם דפוסי שימוש ספריה של המטבוליט סטנדרטים. 27

7. הדמיה ספקטרוסקופיות מסה של שורשי צמחים ב- EcoFABs (איור 7)

הערה: התקנים EcoFAB שבוצעו של אלסטומר 5:1 הבסיס אשפרה הסוכן תערובת עם תופסנים מותאם אישית (איור 7 א) משמשים בסיס הטבעה על ננו-מבנה-יוזם ספקטרומטר מסה (נימס) צ'יפס,28,29,30 מאז שכבות PDMS יכול להיות reversely מלטשים המשטחים של שבבי נימס.

  1. לעקר את משטח השבב נימס עם אור UV לשעה.
  2. לבחור של EcoFAB עם צמח הגדל של החממה, ולמקם אותו כיסוי סטרילי.
  3. פתח את מיכל EcoFAB, ולהסיר את הפלטה של המלחציים.
  4. הרם את השכבה PDMS יחד עם הצמח בתוך, וצרף בקפידה את השכבה PDMS עם המפעל על גבי שבב נימס (איור 7 בD, E).
    הערה: לאחר השורש נוגע השטח שבב נימס, זה אסור להזיז. פעולה זו מונעת "מריחת" של מטבוליטים שורש.
  5. לחץ בעדינות למטה על השורשים דרך השכבה PDMS עד השורשים לגמרי קשר עם פני השטח נימס. להשאיר את השורשים על פני נימס עבור 20 דקות.
  6. הרם את השכבה PDMS כולל צמח מהשבב נימס, שוב הימנעות עובר השורש על פני השטח נימס. להחזיר את הצמח המלחציים במידת הצורך.
  7. להצמיד את השבב נימס לצלחת MALDI מותאם אישית ואין לטעון את הצלחת לתוך ספקטרומטר MALDI לתפילה הדמיה (איור 7C).
  8. השתמש בתוכנית OpenMSI להפיק תמונה נימס של השורש מטבוליטים (איור 7D-G)31.

Representative Results

כל מערכת EcoFAB כולל התקן EcoFAB, צמח בגודל מיכל פלסטיק שקוף. מכשיר EcoFAB אחד יש מאגר צמח תא צמיחה השורש, כניסת זרימה של 1.6 מ מ, פורקן 1.6 מ מ עבור התקן EcoFAB רגיל (איור דו-ממדי & H איור 3) או שקע 10 מ מ רחב-outlet EcoFAB התקן (איור 2F & דמות 3עכשיו ). המאגר הצמח מתוכנן בצורת טרפז זה כולל פתיחת העליון 6 מ מ, פתיחת התחתון 3 מ מ, עיצוב זה מקטין את הסיכוי של זליגת זרם במהלך הזרקת נוזל ומבטיח גם מספיק מקום לצמיחה צמח. תא צמיחה השורש מאמצת צורה אליפטית עם 2 מ מ עומק כדי להתאים מערכות השורשים של צמחים דגם רבים, כפי שמוצג באיור 2C ו- E. ערוצי כניסת והן עודפים של מכשיר EcoFAB רגיל יכול להיות מחובר עם אבובים PTFE אז פתרונות תזונתיים יכולה לזרום אל החדר צמיחה השורש מבלי לפתוח את מיכל EcoFAB. המכשיר EcoFAB רחב-outlet מאוד מפחית את ההתנגדות זרימה של השקע, ומשמש רצוי כאשר ועציצים עם מערכות שורש עבה או איסוף מעת לעת exudates שורש לאחר מערכות מורכבות שורש הנגזרות מן הצומח.

התבניות ליציקת עבור בדיית PDMS שכבות של EcoFAB התקנים נוצרים תוכנה עיצוב ולאחר מכן 3D שהודפס נוקשה photopolymers אטומה, כפי שמוצג באיור 2 , איור 3. צמחים בתוך EcoFABs ניתן לצפות ישירות עם מיקרוסקופ באמצעות עבודה מרחוק, הקפדה שסטריליות לגדול סביבה (איור 8A, הקבצים המשלימים 1). EcoFAB התקנים עם צמחים יכול להתאים גם על גבי הבמה מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה, המאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של אינטראקציות צמח-חיידק (איור 8 ב', הקבצים המשלימים 2). עקרות שלא נשמר בסביבה זו, דימות ברזולוציה גבוהה מתאים לכן רק הקצה של מדידות.

EcoFABs נועדו לאפשר מחקרים שיטתיים של צמחים, כגון המורפולוגיה שלהם, שיטות ההזנה קהילות מיקרוביאלי בשלבי גדילה שונים שלהם ברחבי מחזורי החיים שלהם. כאן, EcoFABs נבחנו כפלטפורמה כללי ללמוד מגוון רחב של מיני צמחים. איור 8C -E הצג 7 - בן יום תודרנית לבנה, עקצר distachyonו virgatum ושכנותיה גדל ב- EcoFABs. כל שלושת הצמחים נמצאו לגדול היטב EcoFAB מעל לחודש. את dicot, תודרנית לבנה וגם את monocot, distachyon עקצר נמצאו לעמוד בציפיות שלהם שלבים רבייה EcoFABs.

הפיך איטום המערכת מאפשר השימוש של סובסטרטים מוצק (למשל., אדמה) בתוך EcoFABs (שלב 2.2). זה הפיך איטום גישה מאפשר טעינה של סובסטרטים מוצק אל תאי צמיחה השורש, ומאפשרת גם אוסף דוגמאות מאזורים ספציפיים של שורש rhizospheres. איור 8F -H הצג קבוצה של 14 - בן יום distachyon עקצר גדל הידרופוני בינוני, כמו גם חול ואדמה בתוספת הידרופוני בינוני (חול) ומים (אדמה). שכבת מצע מוצק דק ב תאי צמיחה השורש מאפשר לאור לחדור דרך עבור הדמיה מיקרוסקופיים של מערכות השורשים.

מורפולוגיה שורש מוגדר תצורת המרחב והפצה של מערכת השורשים הצמח, אושרה בתור מענה חיוני פיזיולוגיה סביבות גידול מגוונים, כגון חומרי מזון או מים זמינות32,33, 34. EcoFABs מספקים גישה נוחה של הלומדים מורפולוגיה של צמחים לאורך זמן או בתנאים שונים התזונתי. איור 9A-F להראות דוגמה של שימוש EcoFABs כדי לעקוב אחר שורש מורפולוגיות של distachyon עקצר בשלושת השבועות הראשונים. שתיל עקצר distachyon הועבר לתוך המכשיר EcoFAB, מבנהו שורש הוקלט על ידי מצלמה בתוך imager ג'ל ביו-ראד. התוכנית עיבוד תמונה, כגון תמונה J, python ו- matlab, ניתן להחיל יותר לכמת את השינויים של השורש מורפולוגיות לאורך זמן, או בינוני בסביבות שונות. כימות של אזור השורש הכולל במהלך שלושה שבועות הראו עלייה הדרגתית בשלב מוקדם (< שבוע 1) ואחריו למגמת צמיחה לינארית לסופו של שלושה שבועות, כפי שמוצג באיור 9G.

מניע ראשי לבנות את EcoFAB היא לחקור אינטראקציות צמח-חיידק. כפי שמתואר בשלב 5.4, מיקרואורגניזמים מועברים לתוך תאי צמיחה השורש של EcoFAB התקנים דרך ערוץ כניסה. איור 10 מראה, EcoFAB המכיל Pseudomonas simea (לשעברfluorescens) WCS417 (WCS417), גידול הצמח קידום rhizobacteria עם תוויות chemiluminescent, נוספה לתוך המערכות שורש הצמח עם ריכוז 106 תאים לכל צמח. האות WCS417 זוהה עם imager ג'ל, אשר הצביעו בהתפלגות מרחבית ברורים של חיידקים WCS417 בתאי הגידול שורש. שניהם MS נוזלי בינוני עם או בלי מצע מוצק חול, WCS417 חיידקים התנחלו המשטחים של מערכות השורשים כולו עם החיידקים מרוכזים סביב האזורים קצה השורש, כנראה עקב ייצור מזין פעיל של השורש טיפים (איור 10G & H)35. מצד שני, החיידקים WCS417 על מצע אדמה שהצטברו באזור מאגר צמח במקום טיפים שורש (איור 10אני). כמו החיידקים נוספו דרך ערוץ הקניות, החיידקים היו גם מסוגל לנוע במצע אדמה, אבל לא צוברים הבסיס, כפי שנצפתה נוזלי בינוני עם או בלי חול. זה יכול להצביע על כי הקרקע היא מקור מזין מספיק, החיידקים, היגרו אל המאגר צמח תנאים אופטימליים נשימה.

ללמוד מטבוליט פרופיל של הצמח שורש exudates, כמו גם ספיגת מטבוליט ושחרור של אינטראקציות צמח-חיידק, הפתרונות תפליט מ תאי צמיחה השורש נאסף על פני שלבים שונים של צמיחה של צמחים EcoFABs. כפי שמתואר בשלב 6, תפליט דגימות מחולצים ואז לניתוח LC-MS. באמצעות שיטה זו, מגוון של מטבוליטים שידר ליד המפעל, הנצרכים על-ידי חיידקים זוהה, פרופילים המטבוליט קשורים של שורש exudates עם ובלי מושבת חיידקים נמצא כעת תחת חקירה.

Figure 1
איור 1: זרימת העבודה EcoFAB. צמחים הם מונבטים בצלחת, להעביר את EcoFAB מעוקר, החיידקים יכולים להתווסף. דגימה גמישה: שורש exudates ניתן לטעום, עם תמונה, מורפולוגיה השורש, ניתן לאבחן. דגימה הרסני מאפשר ניתוח של חיידק, שורש ופרמטרים לירות בפירוט.

Figure 2
איור 2: הרכיבים של תלת-ממד מודפס ליציקות ייצור ההתקן EcoFAB. (א) העליונה ותצוגת מוטה של מסגרת הליהוק. (ב) העליונה ותצוגת מוטה של מוסף. (ג) העליון ונוף מוטה של בסיס עובש סטנדרטי. (ה) העליונה ותצוגת מוטה של בסיס רחב-outlet עובש. (D, F) התאספו ליציקות בדיית מכשירים EcoFAB רגיל, רחב-outlet, בהתאמה. הממדים סגלגל 51 מ"מ x 34 מ"מ עובש EcoFAB קטנים הינם 76 מ"מ x 62 מ"מ עובש EcoFAB גדולים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: ייצור ההתקן EcoFAB. (א) לשפוך את התערובת של אלסטומר הבסיס, ריפוי סוכן לתבנית. (ב) חימום העובש עם תערובת ב 85 מעלות צלזיוס במשך 4 h (ג) הסרת את תותב העובש. (ד) להפריד את PDMS בין המסגרת הליהוק. (ה) דוחף את התבנית בסיס אל מחוץ למסגרת הליהוק. (ו) באמצעות סכין להפריד את PDMS העובש לאורך שולי. (ז) לקלף את השכבה PDMS לאט מחוץ לבסיס עובש. (H) מציץ חורים עבור ערוצי כניסת והן עודפים של השכבה PDMS רגיל. (I) מציץ חור עבור הערוץ כניסת של השכבה PDMS רחב-outlet. (J) PDMS השכבה (שבוצעו של אלסטומר 15:1 בסיס אשפרה הסוכן תערובת) ושקופית מיקרוסקופ לשטוף, הועבר לתוך מסך פלזמה מנקה עבור מליטה. (K) באמצעות מלחציים להחזיק את השכבה PDMS (שבוצעו של הבסיס elastomer 5:1 אשפרה הסוכן תערובת) לשקופית מיקרוסקופ. (יב) הקשה על השכבה PDMS (עשוי בסיס elastomer שכן של כדי אשפרה הסוכן תערובת) ישירות לשקופית מיקרוסקופ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: עיצוב מותאם אישית מלחציים. (א) העליון ולא מקבילות תצפית מלמעלה תהדק את צלחת. (B) תצוגות העליון ולא מוטה של תחתון תהדק את הצלחת. (ג) העליון ונוף מוטה של קלאמפ התאספו עם ארבע קבוצות של הקס ברגים cap. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: התקנת LED נורות הגידול. (א) סימון החוצה מיקומי פריטים 9 LED בספירלה מסביב למכולה EcoFAB. (ב) LED קליפים מחובר לגורם EcoFAB. (ג) threading רצועה LED דרך סרטונים אלה. (ד) חיבור לרצועת LED על בקר חוטית עם ספק כוח 24V. (ה) תיאור סכמטי של תיל חיבורים אל הבקר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: העברת השתילים לתוך EcoFABs. (א) צמחים עקצר distachyon גדל במשך יומיים על צלחת 0.5 MS. (ב) מילוי תא שורש עם מדיום הגידול של הצמח. (ג) באמצעות פינצטה בזהירות להוסיף השורש לתוך המאגר הצמח. (ד) איטום המכולה EcoFAB עם קלטת micropore, לאחר הוספת 3 מ"ל של מים בתחתית המיכל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7: נימס הדמיה של הצמח שורשים ב- EcoFABs. (א) distachyon עקצר גדל EcoFAB סטרילי. (ב) צירוף השכבה PDMS עם המפעל על גבי שבב נימס עבור מינימום 20 (ג) שימוש נחושת קלטת לצרף את השבב נימס לצלחת MALDI מותאם אישית, טעינתה לתוך ספקטרומטר מסה MALDI. (D-G) 7 - בן יום אחד, אחד 20 - בן יום distachyon עקצר צמח המשמש נימס הדמיה (D, E) ואת התמונות נימס המתאים (F, G). היונים הדומיננטית היו מודגשים, אדום, ירוק וכחול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 8
איור 8: יישומים כלליים של EcoFABs. (א) ישירות לכידה שורש צמיחת עקצר distachyon ב EcoFAB עם מלכודת מיקרוסקופ מרחק עבודה. (ב) ישירות התבוננות שורש-חיידק אינטראקציות עם מלכודת מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה. (ג-ה) 7 - בן יום תודרנית לבנה (C), עקצר distachyon (ד) ו- virgatum ושכנותיה (E) במדיום הידרופוני 0.5 MS, (F-H) 14 - בן יום distachyon עקצר גדל ב- 0.5 MS הידרופוניקה (נ), חול (G), אדמה (H) המצע שסופק עם 0.5 MS בינוני ומים, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 9
איור 9: שימוש EcoFABs ללמוד שורש מורפולוגיה. (A-F) התפתחות שורש עקצר distachyon גדל EcoFABs מלא עם 0.5 MS בינוני במהלך שלושת השבועות הראשונים: (א) 2 ימים, 4 (ב) ימים, (ג) 7 ימים, 11 (ד) ימים, ימים 14 (ה), (ו) 21 ימים של צמיחה. (ז) שורש בממוצע פני שטחים הוערך על ידי תוכנה ImageJ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 10
איור 10: שימוש EcoFABs ללמוד אינטראקציות שורש-חיידק. (A, B, C) קבוצה של 15 - בן יום עקצר distachyon להמדינות עם Pseudomonas fluorescens WCS417 בצורות שונות של סובסטרטים פתרון, חול ואדמה נוזלי מדיה-MS. (D, E, F) שדה בהיר תמונות של מערכות השורשים שלהם. (G, H, אני) התמונות chemiluminescent המקביל של מערכות אלה השורש לאחר 14 ימים שיתוף הטיפוח-תרגול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

קובץ משלים 1. שימוש EcoFAB כדי ללכוד צמיחה השורש. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

קובץ משלים 2. שימוש EcoFAB כדי ללכוד אינטראקציות שורש-חיידקים. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Discussion

הפרוטוקולים דיווחו כאן עבור השימוש במערכת האקולוגית פבריקציה נוספת כדי ליצור ש-ecofabs מספק משאבי הקהילה למפעל שיטתית לימודי ביולוגיה תנאי מעבדה מבוקרת מאוד. ההתקדמות הדפסת תלת-ממד מספקים טכנולוגיות נרחב נגיש עבור בניית וכוונון iteratively EcoFAB עיצובים. תא שורש המוצג כאן הוא נמצא כדי להיות גם מתאים הדמיה במיקרוסקופ ושמירה על עקרות, המאפשרים תוספת מבוקרת של חיידקים כדי לחקור אינטראקציות צמח-חיידק. פלטפורמת EcoFAB הוא תואם עם מיני צמחים שונים. חשוב לזהות את ההשפעות הפיזיולוגיות של גידול הצמחים בתוך תא שורש צרים כאלה ניסויים נוספים יידרשו כדי להכליל ממצאים צמחים הגדלים סביבות טבעיות.

השימוש סטרילי והמעברים LED לגדול אור מאפשר החקירה של ההשפעות של תנאי תאורה שונים, כולל אורך גל, עוצמת ומשך, על צימוח ופרמטרים פיזיולוגיים הקשורים במקביל. מליטה הפיך שורש צ'יימברס מאפשר השימוש של סובסטרטים מוצק כמו גם באשר במרחב לאסוף דגימות מוצק לניתוח הביוכימי ותעשיה. היישומים של מצעים מוצק, כגון קרקעות, חול קוורץ חרוזים, מציעים האפשרויות של שימוש EcoFABs כדי לבנות מערכות אקולוגיות מעבדה רלוונטי יותר אקולוגי. עם זאת, כל המערכות המובאת כאן שימוש רווי נוזלים (תרבויות הידרופוני) אשר אינם שיקוף מדויק של רוב קרקעות וזה יהיה חשוב עוד יותר לחדד עיצובים אלה כדי לשמור על כיסי אוויר בתוך האדמה, כך שהם מייצגים טוב יותר קרקעות טבעי.

השימוש של מצלמות פשוטות והן מיקרוסקופים מתואר להתפתחות תמונת מערכת השורשים מורפולוגיה-הן בתפזורת לרמות הסלולר. זו התאמה עבור ניטור שורש מורפולוגיה הדמיה וכימות צפוי להיות מועיל להבנת מנגנוני הרגולציה של הצמח אותות פיזיולוגיים ומולקולרית מופעלות על ידי צמח adaptions genotypic על תנאי הגידול. אולם, מגבלה לימוד והתפתחות פיזיולוגית השורש הוא המיקום האופקי הנוכחי של המכשיר EcoFAB. סביבות טבעיות, התגובה gravitropic שורשים מוביל להתפתחות בעיקר אנכי של מערכת השורשים. לפיכך, מערכת אופקית המובאת כאן סביר להניח שונה כמה גורמים של סביבה טבעית, הזיוף של מערכות EcoFAB עם המיקום האנכי של תא השורש הוא מטרה רצויה עבור גירסאות עתידיות של EcoFAB. למרות המכשירים EcoFAB הנוכחי ממוקמים אופקית, הניתוח של פרמטרים מורפולוגיה שורש בתנאים שונים, או בתגובה חיידקים, אפשרי. הדמיה ברזולוציה גבוהה ניתן להחיל כדי ללכוד שורש dynamics קולוניזציה של מבודד יחיד או קהילות, מתן מידע על הצמח אילו חלקים הם התנחלו בתנאים שונים מזין מספיק, לקוי. הוא צפוי כי מחקרים כאלה תספק תובנות חדשות חשובות איך צמח microbiomes הם, ו כיצד הדינמיקות האלה משתנים במשך הזמן, למשל כמו שורשי לפתח.

Microfluidic התקנים לאפשר הדמיה של צמחים צעירים מאוד, בדרך כלל הכמות של מטבוליטים שנאספו אינה מספקת עבור ניתוח איכות המזון. מערכות על בסיס אדמה, כגון rhizotrons, לאפשר ההדמיה של השורש מורפולוגיה כאשר גם הצמחים הופכים עם chemiluminescent לבנות (Glo-root) או עם שיטות מבוססות-NMR33,34. מטבוליט ושילוב מערכות אלה הם זמן רב בשל נפח גדול של דוגמאות. EcoFABs הם שילוב של שניהם: הזיוף דומה למכשירים microfluidic. EcoFABs נועדו להיות פשוט וזול להתרבות, אך ניתן לכוונן את הגודל של החדר לגדל צמחים עם מערכות שורשים קטן או גדול, ועד לשלבים הרבייה שלהם. תצפיות סימולטני של שינויים מורפולוגיה שורש, שורש exudation אפשריים. המערכת היא סטרילית, המאפשרים תוספת מבוקרת של חיידקים מסוימים.

EcoFABs נועדו לאפשר מבוא מבוקרת דגימה של חיידקים, מטבוליטים. באופן ספציפי, דגימות שנאסף תאי צמיחה השורש נמצאות להיות מספיק עבור יצירת פרופילים המטבוליט ספקטרוסקופיות המוני. השילוב של הדמיה ספקטרומטר מסה (למשל., נימס הטכניקה המובאת כאן) מספקת גישה גמישה ללמוד מטבוליט הפצות המרחבי של מערכות השורשים. טכניקה זו צפויה להיות מועיל איזוטופ יציב בעתיד עקיבה ניסויים ולוקליזציה מיפוי מיקרוביאלי מטבוליטים ספציפי36. בעוד פרוטוקול זה התמקדה מבודד יחיד, אותו עיצוב בהחלט ניתן לקהילות מורכבים יותר. אמצעי אחסון מדגם של ביומסה בתוך EcoFABs סביר יותר ממספקת. עבור שילוב נוסף עם טכנולוגיות רצף ה-DNA, אשר יהיה חשוב איפיון וניטור מבנה הקהילה מיקרוביאלי והביטוי ג'ין.

לסיכום, פרוטוקול זה פרטים הזיוף של מערכות אקולוגיות מעבדה מיועד החקירה של אינטראקציות צמח-חיידק, עם דגש על שיטות פשוטה ונגישה בקלות שניתן ליישם או המורחבת על ידי חוקרים ברחבי העולם. המאמצים הנוכחיים מכוונים הממחיש את הפארמצבטית בין מעבדות, השילוב של מערכת בקרת טמפרטורה כזה כי כל EcoFAB עצמאי שלטו אור וטמפרטורה. קידום נוסף המערכת יהיו השילוב של דגימה אוטומטית, מילוי מחדש של התאים שורש EcoFAB ופיתוח של פרוטוקולים לשחזור להקמת מפעל הרלוונטיים microbiomes בתוך EcoFABs.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מחקר ביים תוכנית פיתוח (LDRD) של המעבדה הלאומית לורנס ברקלי הנתמכים על ידי המשרד של המדע, של מחלקת האנרגיה של ארצות הברית תחת חוזה מס דה-AC02-05CH11231, פרס דה-SC0014079 ארה ב מחלקת אנרגיה במשרד למדע UC ברקלי. עבודה בבית היציקה מולקולרית נתמך תחת ארה ב המחלקה של אנרגיה חוזה מס דה-AC02-05CH11231. אנו מודים גם סוזן מ קוסינה, קתרין לואי, בנימין עמ' בואן ו בנימין קול ג'יי-המעבדה הלאומית לורנס ברקלי על כל העזרה שלהם.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D printed custom mold LBNL STL files available here www.eco-fab.org; The EcoFABs molds described here were printed by FATHOM: http://studiofathom.com
Dow sylgard 184 silicone elastomer clear kit Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Air duster spray VWR 75780-350 any compressed gas duster should work
15 gauge blunt needle VWR 89166-240
5 mL syringe with Luer-Lok Tip VWR BD309646
3”x2” microscope glass slide VWR 48382-179
1.75" x 2.56" x 3.56" EcoFAB box Amazon B005GAQ25Q
4” x 3 ¼” microscope glass slide Ted Pella 260231
4.87" x 4.87" x 5.50" EcoFAB box Amazon B00P9QVOS2
Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-001
3D printed custom clamp LBNL STL files available from Trent Northen's lab
Sterile hood AirClean Systems AC600 Series PCR Workstations
PTFE syringe tubing Sigma-Aldrich Z117315-1EA
Ethanol VWR 89125-172
Bleach
Murashige and Skoog (MS) Macronutrient Salt Base Phytotechnologies Laboratories M502
Murashige and Skoog (MS) Micronutrient Salt Base Phytotechnologies Laboratories M554
Soil Hummert International Pro-Mix PGX
Phytagel Sigma-Aldrich 71010-52-1
Arabidopsis thaliana Lehle Seeds WT-24 Col-4 Columbia wild type
Brachypodium distachyon LBNL Standard Bd-21 line Available from John Vogel's lab
Panicum virgatum The Samuel Roberts Noble Foundation Alamo switchgrass
Micropore tape VWR 56222-182
LC-MS grade methanol VWR JT9830-3
Lyophilizer LABCONCO FreeZone 2.5 Plus
SpeedVAC concentrator Thermo Scientific Savant™ SPD111 SpeedVac
Ultrafree-MC GV Centrifugal Filter-0.22 µm Millipore UFC30GV00
Liquid chromotography system Agilent Agilent 1290 LC system
Q Exactive mass spectrometer Thermo Scientific Q Exactive™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap MS
NIMS chip and custom MALDI plate LBNL For detailed protocol see: doi:10.1038/nprot.2008.110
MALDI mass spectrometer AB Sciex TOF/TOF 5800 MALDI MS
Nano-coated LED grow light strip LED World Lighting HH-SRB60F010-2835
Power supply LED World Lighting MD45W24VA, LV100-24N-UNV-J
TC420 controller Amazon B0197U7R8Q
Silicone LED clips Amazon B00N9X1GI0
Hot glue gun Amazon B006IY359K
Female-to-bare LED connector cable LED World Lighting HH-F05
Female-to-male LED connector extension cable LED World Lighting HH-MF1
20AWG 2-wire cable LED World Lighting 6102051TFT4
WAGO 221-415 Splicing Connector LED World Lighting 221-415

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Morrissey, J. P., Dow, J. M., Mark, G. L., O'Gara, F. Are microbes at the root of a solution to world food production. EMBO Rep. 5 (10), 922-926 (2004).
  2. Farrar, K., Bryant, D., Cope-Selby, N. Understanding and engineering beneficial plant-microbe interactions: plant growth promotion in energy crops. Plant Biotechnol J. 12 (9), 1193-1206 (2014).
  3. Singh, J. S., Abhilash, P. C., Gupta, V. K. Agriculturally Important Microbes in Sustainable Food Production. Trends Biotechnol. 34 (10), 773-775 (2016).
  4. Dubey, R. K., Tripathi, V., Dubey, P. K., Singh, H. B., Abhilash, P. C. Exploring rhizospheric interactions for agricultural sustainability: the need of integrative research on multi-trophic interactions. J Clean Prod. 115, 362-365 (2016).
  5. Hunter, P. Plant microbiomes and sustainable agriculture. EMBO Rep. 17 (12), 1696-1699 (2016).
  6. van der Heijden, M. G. A., Hartmann, M. Networking in the Plant Microbiome. PLoS Biol. 14 (2), e1002378 (2016).
  7. Vessey, J. K. Plant growth promoting rhizobacteria as biofertilizers. Plant Soil. 255 (2), 571-586 (2003).
  8. Yang, J., Kloepper, J. W., Ryu, C. -M. Rhizosphere bacteria help plants tolerate abiotic stress. Trends Plant Sci. 14 (1), 1-4 (2009).
  9. Reynolds, H. L., Packer, A., Bever, J. D., Clay, K. GRASSROOTS ECOLOGY: PLANT-MICROBE-SOIL INTERACTIONS AS DRIVERS OF PLANT COMMUNITY STRUCTURE AND DYNAMICS. Ecology. 84 (9), 2281-2291 (2003).
  10. Finkel, O. M., Castrillo, G., Herrera Paredes, S., Salas González, I., Dangl, J. L. Understanding and exploiting plant beneficial microbes. Curr Opin Plant Biol. 38, 155-163 (2017).
  11. Northen, T. R., Zhang, Z., Gao, J., Swenson, T., Yoshikuni, Y. Advancing Our Understanding of the Chemistry of Soil Microbiomes. National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. 2017. The Chemistry of Microbiomes: Proceedings of a Seminar Series. , The National Academies Press. Washington, DC. (2017).
  12. Busby, P. E., et al. Research priorities for harnessing plant microbiomes in sustainable agriculture. PLOS Biology. 15 (3), e2001793 (2017).
  13. Sanati Nezhad, A. Microfluidic platforms for plant cells studies. Lab Chip. 14 (17), 3262-3274 (2014).
  14. Oburger, E., et al. Evaluation of a novel tool for sampling root exudates from soil-grown plants compared to conventional techniques. Environ Exp Bot. 87, 235-247 (2013).
  15. Van Der Krift, T. A. J., Berendse, F. Root life spans of four grass species from habitats differing in nutrient availability. Funct Ecol. 16 (2), 198-203 (2002).
  16. Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. P Natl. Acad. Sci. USA. 114 (17), 4549-4554 (2017).
  17. Sanati Nezhad, A., Naghavi, M., Packirisamy, M., Bhat, R., Geitmann, A. Quantification of cellular penetrative forces using lab-on-a-chip technology and finite element modeling. P Natl. Acad. Sci. USA. 110 (20), 8093-8098 (2013).
  18. Jiang, H., Xu, Z., Aluru, M. R., Dong, L. Plant chip for high-throughput phenotyping of Arabidopsis. Lab Chip. 14 (7), 1281-1293 (2014).
  19. Parashar, A., Pandey, S. Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis. Appl. Phys. Lett. 98 (26), 263703 (2011).
  20. Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression. Nat Methods. 9 (11), 1101-1106 (2012).
  21. Grossmann, G., et al. The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science. Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).
  22. Aufrecht, J. A., Ryan, J. M., Hasim, S., Allison, D. P., Nebenführ, A., Doktycz, M. J., Retterer, S. T. Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform. J. Vis. Exp. (126), (2017).
  23. Garvin, D. F., et al. Development of Genetic and Genomic Research Resources for Brachypodium distachyon, a New Model System for Grass Crop Research. Crop Sci. 48 (Supplement_1), S69-S84 (2008).
  24. Lisensky, G. C., et al. Replication and Compression of Surface Structures with Polydimethylsiloxane Elastomer. J. Chem. Educ. 76 (4), 537 (1999).
  25. Friend, J., Yeo, L. Fabrication of microfluidic devices using polydimethylsiloxane. Biomicrofluidics. 4 (2), 026502 (2010).
  26. Yao, Y., et al. Analysis of Metabolomics Datasets with High-Performance Computing and Metabolite Atlases. Metabolites. 5 (3), 431-442 (2015).
  27. Sumner, L. W., et al. Proposed minimum reporting standards for chemical analysis Chemical Analysis Working Group (CAWG) Metabolomics Standards Initiative (MSI). Metabolomics. 3 (3), 211-221 (2007).
  28. Gao, J., de Raad, M., Bowen, B. P., Zuckermann, R. N., Northen, T. R. Application of Black Silicon for Nanostructure-Initiator Mass Spectrometry. Anal. Chem. 88 (3), 1625-1630 (2016).
  29. Gao, J., et al. Morphology-Driven Control of Metabolite Selectivity Using Nanostructure-Initiator Mass Spectrometry. Anal. Chem. 89 (12), 6521-6526 (2017).
  30. Woo, H. -K., Northen, T. R., Yanes, O., Siuzdak, G. Nanostructure-initiator mass spectrometry: a protocol for preparing and applying NIMS surfaces for high-sensitivity mass analysis. Nat. Protoc. 3 (8), 1341-1349 (2008).
  31. Rübel, O., et al. OpenMSI: A High-Performance Web-Based Platform for Mass Spectrometry Imaging. Anal. Chem. 85 (21), 10354-10361 (2013).
  32. López-Bucio, J., Cruz-Ramı́rez, A., Herrera-Estrella, L. The role of nutrient availability in regulating root architecture. Curr Opin Plant Biol. 6 (3), 280-287 (2003).
  33. Lynch, J. P. Steep, cheap and deep: an ideotype to optimize water and N acquisition by maize root systems. Ann. Bot. 112 (2), 347-357 (2013).
  34. Rellán-Álvarez, R., et al. GLO-Roots: an imaging platform enabling multidimensional characterization of soil-grown root systems. eLife. 4, e07597 (2015).
  35. Kamilova, F., Validov, S., Azarova, T., Mulders, I., Lugtenberg, B. Enrichment for enhanced competitive plant root tip colonizers selects for a new class of biocontrol bacteria. Environ. Microbiol. 7 (11), 1809-1817 (2005).
  36. Klitgaard, A., Nielsen, J. B., Frandsen, R. J. N., Andersen, M. R., Nielsen, K. F. Combining Stable Isotope Labeling and Molecular Networking for Biosynthetic Pathway Characterization. Anal. Chem. 87 (13), 6520-6526 (2015).

Tags

מדעי הסביבה נושא 134 מעבדה אקולוגיות EcoFAB אינטראקציות צמח-חיידק microbiome מורפולוגיה שורש שורש exudates LC-MS נימס גליקומיקס הדמיה מיקרוסקופיים
המערכת האקולוגית פרוטוקולים פבריקציה נוספת (EcoFAB) להקמת מערכות אקולוגיות מעבדה שנועדה ללמוד אינטראקציות צמח-חיידק
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gao, J., Sasse, J., Lewald, K. M.,… More

Gao, J., Sasse, J., Lewald, K. M., Zhalnina, K., Cornmesser, L. T., Duncombe, T. A., Yoshikuni, Y., Vogel, J. P., Firestone, M. K., Northen, T. R. Ecosystem Fabrication (EcoFAB) Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions. J. Vis. Exp. (134), e57170, doi:10.3791/57170 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter