Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Økosystem fabrikasjon (EcoFAB) protokoller for bygging av laboratoriet økosystemer designet anlegg-mikrobe interaksjoner

Published: April 10, 2018 doi: 10.3791/57170
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 2, 2, 4, 1,2
1Environmental Genomics and Systems Biology Division, Lawrence Berkeley National Laboratory, 2Joint Genome Institute, Department of Energy, 3Joint BioEnergy Institute, 4Department of Environmental Science Policy and Management, University of California

Summary

Denne artikkelen beskriver detaljert protokoller økosystem fabrikasjon enheter (EcoFABs) som aktiverer studier av planter og plante-mikrobe interaksjoner i kontrollerte laboratorieforhold.

Abstract

Fordelaktig plante-mikrobe interaksjoner tilbyr en bærekraftig biologisk løsning med potensial til å øke lav-input mat og bioenergi produksjonen. En bedre mekanistisk forståelse av disse komplekse anlegg-mikrobe interaksjoner vil være avgjørende å forbedre planteproduksjon så vel som utfører grunnleggende økologiske studier undersøker plante-jord-mikrobe interaksjoner. Her er en detaljert beskrivelse av økosystemet fabrikasjon presentert, bruker allment tilgjengelig 3D Trykkemetoder, for å lage kontrollert laboratorium habitater (EcoFABs) for mekanistisk studier av plante-mikrobe interaksjoner i spesifikke miljø forhold. To størrelser av EcoFABs er beskrevet som er egnet for etterforskningen av mikrobielle interaksjon med forskjellige plantearter, inkludert Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyonog Panicum virgatum. Enhetene gjennomflytsenhet tillater kontrollert manipulasjon og prøvetaking av roten microbiomes, rot kjemi samt imaging rot morfologi og mikrobiell lokalisering. Denne protokollen inneholder detaljene for opprettholde sterile forhold innenfor EcoFABs og montering uavhengig LED lys systemer til EcoFABs. Detaljert metoder for tillegg av ulike medier, inkludert jord, sand, og flytende vekst medier koblet til karakterisering av disse systemene med imaging og metabolomics er beskrevet. Sammen disse systemene aktiverer dynamisk og detaljert undersøkelse av anlegg og plante-mikrobiell konsortier inkludert manipulering av microbiome komposisjon (inkludert mutanter), overvåking av plantevekst, rot morfologi, sårvæske komposisjon, og mikrobiell lokalisering under kontrollerte forhold. Vi forventer at disse detaljert protokollene vil tjene som et viktig utgangspunkt for andre forskere, ideelt å skape standardisert eksperimentelle systemer for å undersøke plante-mikrobe interaksjoner.

Introduction

Anvendelsen av fordelaktig plante mikrober i landbruket tilbyr stort potensial til å øke bærekraftig mat og biodrivstoffproduksjon å sørge for en voksende befolkning1,2,3,4. En betydelig mengde arbeid støtter betydningen av anlegget microbiomes i anlegget nærings-opptak, toleranse for påkjenninger og motstand mot sykdom5,6,7,8. Det er imidlertid vanskelig å undersøke disse mekanismene av plante-mikrobe interaksjoner i feltet økosystemer kompleksitet og tilknyttede irreproducibility og manglende evne til å kontrollere nøyaktig microbiome sammensetning og genetikk (f.eks., bruke mikrobiell mutanter)4,9,10.

En strategi er å konstruere forenklet modell økosystemer aktivere kontrollert, repliserte laboratorieforsøk undersøker plante-mikrobe samhandlinger for å generere innsikt som kan bli ytterligere testet i feltet10,11, 12. Dette konseptet bygger på tradisjonelle tilnærminger bruker planter dyrket i jord-fylt Potter eller agar plater i veksthus eller inkubatorer13. Selv om dette vil trolig være mest brukte tilnærminger, de mangler nøyaktig overvåke og manipulere anlegget vekst miljøer. Disse endene, rhizoboxes og rhizotrons representerer en stor forbedring i evnen til å studere under-bakken prosesser14,15, og første protokollene ble utgitt for å analysere rhizosphere metabolitter i jord16. Flere nylig, for å aktivere høy gjennomstrømning analyse, avansert microfluidic enheter13,17 som plante Chip18,19, RootArray20og RootChip21, har vært utviklet som effektive verktøy for anlegget phenotyping med mikrometer skala romlig oppløsning til å overvåke de tidlige vekst stadiene av lite anlegget Arabidopsis thaliana i flytende flyt medium. Nylig ble en to-lags tenkelig plattform beskrevet som gjør at roten håret avbildning av Arabidopsis thaliana på frøplante scenen med en microfluidic plattform22.

Her, er detaljert protokoller for å konstruere kontrollert laboratorium enheter (EcoFABs) angitt, for å studere anlegget mikrobe interaksjoner og viser at de kan brukes til å studere ulike planter inkludert Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyon23, økologisk viktige wild havre Avena barbata, og bioenergi beskjære Panicum virgatum (switchgrass). EcoFAB er en steril anlegget vekst plattform som inkluderer to primære komponenter: EcoFAB enheten og sterile anlegget størrelse gjennomsiktig containeren. EcoFAB enhet er laget av en polydimethylsiloxane (PDMS) produksjonsprosess som involverer støping PDMS lag fra 3D trykt plast mold og liming PDMS lag på objektglass bruke metoder tidligere rapportert24,25 . Detaljerte prosedyrer for EcoFAB arbeidsflyten, for eksempel enheten fabrikasjon, sterilisering, frø spiring, frøplante transplantasjon, mikrobe inoculation/cocultivation, prøve forberedelse og analyse, er beskrevet i denne protokollen (figur 1). Ytterligere modifiseringer av grunnleggende arbeidsflyten er beskrevet, inkludert installasjon av datamaskin kontrollert LED vokse lysene og utnyttelse av solid underlag. Utnyttelsen av imaging teknikker for å undersøke rot morfologi endres, mikrobielle kolonisering av røtter, og masse spektroskopiske avbilding av root eksudater beskrives. Vi forventer at enkle, rimelige design basert på tilgjengelige materialer, samt detaljert protokollene som presenteres her, vil bli EcoFAB plattformen til et fellesskap ressurs, standardisering plante-microbiome laboratoriestudier.

Protocol

Advarsel: Denne protokollen inkluderer bruk av farlige kjemikalier, skarpe gjenstander, elektriske enheter, varme objekter og andre farer som kan resultere i skade. Riktig personlig verneutstyr (PVU, f.eks., kjemisk motstandsdyktige hansker, vernebriller, laboratoriefrakk, lang klær, lukket-toed sko, osv.) bør brukes, og de aktuelle sikkerhetsprosedyrer (sikkerhetsopplæring, bruk av avtrekksvifte, osv.) bør følges.

1. EcoFAB apparat fabrikasjon: støping PDMS lag (figur 2 og Figur 3)

  1. Konstruere EcoFAB formene med 3D utskrift teknikker (design-filer er tilgjengelig på. Hver mold omfatter tre deler: en avstøpning ramme, utvalgte mold base og insert, som vist i figur 2. Skrive ut en mold base og sett av stive ugjennomsiktig photopolymers 3D plast skriveren. Bruke minst 100 µm oppløsning, og skrive ut avstøpning rammen med akrylonitril butadien styren (ABS).
  2. Bland 40 mL av siloxane elastomer base med herding agent i en engangs 1 L beholder. Avhengig av ønsket eksperimentet (trinn 2.1 og 2.2), bruker du ulike forhold (v/v) av elastomer base/herding agent (5:1, 15:1, eller 30: 1). Fortsett til trinn 1.3 til 1,8 for alle typer blandinger.
    Forsiktig: Bruk kjemisk motstandsdyktige hansker, vernebriller og andre PPEs.
  3. Plass beholderen i et vakuum kammer i minst 30 min å fjerne luftbobler fra elastomer blandingen.
  4. Hell blandingen i sammensatte 3D trykt plast mold (figur 3A) og holde formen på oppvarming blokk på 85 ° C 4 h (figur 3B).
    Forsiktig: Bruk PPE å unngå brannskader.
  5. La mold avkjøles i 5 min. Trekk ut sett inn fra mold forsiktig (Figur 3 c), og langsomt setter inn et verktøy kniv mellom avstøpning rammen og PDMS (befestet elastomer blandingen) skille dem (figur 2D).
  6. Trykk mold base med PDMS opp ut av støping rammen (figur 3E). Bruk en kniv eller andre verktøy til å forsiktig skille PDMS laget fra mold base på kantene (figur 3F), og deretter sakte løsner det fra mold overflaten (Figur 3 g).
  7. Opprett innløp og utløp kanaler på PDMS lag ved å gjøre ~1.6 mm hull for en 15 innløp og utløp portene måle stump p (Figur 3 H, jeg).
    Merk: Standard formen har en innløp og utløp port, mens wide-uttaket mold trenger bare innløp porten (Figur 3 H, jeg).
  8. Bruk saks til å klippe kantene på PDMS lag.
    Merk: Trimmet PDMS lagene skal ≥76 mm x 51 mm rektangler for små EcoFAB enheter og ≥102 mm x 83 mm rektangler for store EcoFAB enheter.

2. EcoFAB apparat fabrikasjon: kjemisk feste PDMS lag på objektglass (Figur 3 & Figur 4)

  1. Permanent bånd PDMS lagene til objektglass
    1. Skyll siden binding av PDMS laget (laget av en 15:1-elastomer base herding agent blandingen) og 7,6 × 5 cm mikroskop lysbilde med metanol og deretter blåse tørr trykkluft eller en ultra ren nitrogen pistol.
      Forsiktig: Metanol er giftig. Arbeide i avtrekksvifte og bruke beskyttende øye dekker, hansker og andre PPEs.
    2. Plass microscope skyve og PDMS laget i en plasma renere med sine bånd sider opp. (figur 3J). Hvis en plasma renere ikke er tilgjengelig, gå til trinn 2.2.
    3. Lukk kammeret og vent gassventilen plasma renere, og slå på vakuum og pumpe ned kammeret for 1 min.
    4. Slå på strømmen av plasma generatoren, og bytte radiofrekvens (RF) nivået til "Hei" for 1 min.
    5. Slå av både vakuumpumpe og plasma kraften og ventilere kammeret til atmosfæren.
    6. Ta ut microscope skyve og PDMS lag fra plasma kammeret, og raskt trykk alle fire kanter på det PDMS laget på lysbildet med jevnt trykk (Figur 3 L). Kontroller at center ovale regionen PDMS laget (roten kammeret) ikke touch lysbildet.
    7. Plass forseglet EcoFAB enheten på en 120 ° C oppvarming blokk for 20 min å ytterligere sikre den permanent bånd mellom PDMS laget og microscope skyve.
    8. La enheten avkjøles i 5 min. Trim av ekstra kantene av PDMS laget med en kniv.
  2. Reversibel fysiske tetting av PDMS lagene til objektglass
    1. Reversibel tetting teknikk benytter et sett med egendefinerte klemmer (enten hos en 3D plast skriver eller maskinert i metall, tegningene er vist i Figur 4).
      1. Plassere microscope skyve i utsparingen på klemmen bunnplaten og deretter justere PDMS laget (laget av en 5:1 drivverk herding agent blandingen) på lysbildet.
      2. Plass øverste klemme platen over PDMS laget. Sikre topp og bunn plater sammen med fire hex cap skruer, orientere skruene slik at nøtter er gjenget på fra toppen av klemmen.
    2. Overholde PDMS direkte til objektglass
      1. Plasser PDMS laget (laget av en 30: 1 drivverk herding agent blandingen) over et mikroskop lysbilde.
      2. Trykk PDMS laget i lysbildet. Myk, svært lim PDMS laget (30: 1) bør holde seg til lysbildet å lage en vanntett forsegling uten permanent kjemisk binding eller fysisk trykk fra en klemme (Figur 3 L).

3. EcoFABs sterilisering

  1. Skyll EcoFAB enheter med ultrapure vann.
  2. Plasser en EcoFAB enhet i en EcoFAB beholder, og legge 70% etanol til enheten er neddykket. Lukk beholder lokket og rist forsiktig for å våt alle flater i med etanol. Kontroller at roten vekst kammeret av EcoFAB enheten er fylt med etanol, med svært få eller ingen luft bobler.
  3. Etter 30 min incubation ved romtemperatur, hell av 70% etanol, og gjenta inkubering med 100% etanol for 5 min.
  4. Ut etanol og ruge sterilisert EcoFAB 16 h i laminær strømning hette å tørke den. Hvis sterilisere systemet ved å slå på UV lys i panseret 1t.
    Forsiktig: Bruk passende PPE når du arbeider med UV lys.
  5. Lagre den sterilisert EcoFABs i sterilt hette eller autoklaveres poser for fremtidig bruk.

4. EcoFABs med LED vokse lysene (figur 5)

  1. Feste LED strimler på EcoFAB beholdere
    1. Merke ut steder på beholderen EcoFAB for 9 LED klipp. Start med det første klippet 120 mm opp fra bunnen av beholderen en kant (figur 5A), og fortsetter å markere klippet steder i en spiral rundt beholderen, med hver neste klipp slippe 10 mm. En spiral av 9 klipp som lar en 1 m LED stripe brytes rundt beholderen to ganger.
    2. Varmt lim en LED klipp hver merket posisjon ved å legge til to dabs av varmt lim på beholderen, justert med plasseringen av monteringshullene klippene. Trykk klipp hullene i disse to dabs av lim, deretter legge en skvett av lim over hullene. Gjenta prosedyren for alle utklipp til 9 klipp danner en spiral (figur 5B).
      Forsiktig: Bruk hansker og andre PPE når du arbeider med varmt lim å unngå brannskader.
    3. Tre LED-List gjennom klippene i en spiral form, med lysdioder vender inn i beholderen. Stripen bør sirkel rundt to ganger (figur 5C).
  2. Koble LED strimler til strømforsyningen med en kontroller (figur 5 d viser en EcoFAB kammer med belyst lys, programmering av kontrolleren er beskrevet i trinn 4.3).
    Advarsel: Elektrisk støt: Kontroller at strømforsyningen er koblet fra når du kobler ledningene.
    1. Koble positive og negative terminalene på strømforsyningen til "INPUT: V +" og "INPUT: V-" terminalene på kontrolleren med 2-tråds kabel (figur 5E viser en skjematisk tegning av kontrolleren).
    2. Koble negative ledelsen fra bare slutten av en kvinne-til-bare kabel til en "OUTPUT" kanal på kontrolleren.
      Merk: Det er fem kanaler på kontrolleren som er benyttet i denne protokollen, så det kan støtte opptil fem 1 m LED strimler.
    3. Koble alle positiv fører av kabler til en kompakt skjøting kontakten (Hvis flere kanaler er nødvendig), og deretter koble denne kontakten til "OUTPUT V +" terminalen av kontrolleren.
    4. Koble hver LED-List til den kvinnelige slutten av kabler, så hver LED har sin egen kanal å bli kontrollert. Eventuelt kan du bruke hunn-til-mann kabler for å utvide rekkevidden.
  3. Programmet kontrolleren for en ønsket lyset sykle i henhold til produsentens instruksjoner,

5. voksende planter i EcoFABs

  1. Frø sterilisering og spiring
    Merk: Frø sterilisering og alle følgende av må utføres i sterile forhold. Steriliseringsprosessen beskrives er egnet til frø av Arabidopsis thaliana, Avena barbata, Brachypodium distachyonog Panicum virgatum. Panicum virgatum frø bør bli suspendert i 60% svovelsyre 1t før steriliseringsprosessen. Det anbefales å forberede 1-2 frø per EcoFAB enhet, vurderer spiring hastigheten og ensartethet innen spiring.
    1. Bløtlegg frø i 70% etanol i 2 minutter.
    2. Fjern etanol med en pipette, og skyll frøene med sterilt vann tre ganger.
    3. La frøene i 10% blekemidler løsning for 5 min.
    4. Fjern den bleike løsningen, og grundig vask frøene med sterilt vann tre ganger.
    5. Legg sterilt vann med frø, og ruge microcentrifuge røret i 4 ° C kjøleskap i 7 dager.
    6. Jevnt spredt frøene i 0,5 Murashige & Skoog (MS) medium med 0,6% phytagel og forsegle platene med micropore tape.
    7. Vokse planter til roten lengde på cirka 5 mm for overføring til EcoFABs (figur 6A). Eksperimentene presentert her, gjelder et 16 h lys/8 h mørke belysning regime i en 22 ° C vekst kammer og ruge planter 2-7 d før overføring til EcoFAB (2 dager for Avena barbata og Brachypodium distachyon, 7 dager for Arabidopsis thaliana og Panicum virgatum).
  2. Overføre planter i EcoFABs med flytende medium (figur 6)
    1. Bruker en sterile sprøyter eller brønnene, flush roten kammeret av en EcoFAB enhet med sterilt vann for tre ganger, og deretter fylle roten kammeret med vekstmediet av interesse, for eksempel 0,5 MS medium (figur 6B, trinn 5.1.6).
    2. Nøye inn en enkelt frøplante anlegget reservoaret EcoFAB enheten (figur 6C).
      Merk: Roten bør være fullstendig neddykket inne i roten kammeret, med skyte stikker ut av reservoaret.
    3. Legge til 3 mL sterilt vann i beholderen, unngå EcoFAB enheten. Dette øker fuktigheten og redusere fordampning av mediet fra roten kammeret.
    4. Lukk beholderen, og forsegle lokket med micropore tape (figur 6D).
    5. Legg til EcoFAB i en plante inkubator, eller benytter EcoFAB belysning systemet i en kontrollert temperatur miljø egnet for veksten av respektive anlegget (trinn 4). Denne studien satt kammeret til 24 ° c
    6. Periodisk sjekk EcoFAB for å fylle veksten mediene i roten vekst kammeret og legge vann til beholderen. Utføre alle skritt i sterile forhold.
      Merk: For tidlige anlegget vekst stadier, påfylling av roten vekst kammeret er nødvendig hver 5 til 7 dager. For vekst fasen er en påfylling nødvendig hver 2-3 dager. Eventuelt bruk en sprøyte eller pipette å samle rot sårvæske løsning fra roten vekst kammer i en microcentrifuge rør og lagre den i en fryser for-80 ° C; også bilde rot morfologi med gel imager eller mikroskop.
  3. Overføre planter i EcoFABs med fast underlag
    1. Bruke rot kamrene fremstille med en 5:1 blanding av elastomer base til herding agent Hvis bruker et sett med egendefinerte klemmer til å feste den til en microscope skyve (Figur 3 K, Figur 4); eller velg et PDMS lag laget av 30: 1 base herding agent blandingen hvis overholde PDMS lag lysbilder direkte (som beskrevet i trinn 2.2).
    2. Sterilisere EcoFAB chambers, som beskrevet i trinn 3.
    3. Forsiktig legge sterilisert jord/sand inn i roten kammeret, snu PDMS laget opp ned og legge til underlaget i roten kammeret. Unngå at partikler fallet på området som vil være i kontakt med mikroskopet lysbildet, siden dette vil redusere vedheft.
    4. Plasser microscope skyve oppå PDMS laget, og trykke alle kanter fast. Vend forsiktig EcoFAB enheten slik at ingen jord/sand faller ut av reservoaret åpning.
      Merk: For EcoFAB enheter laget av 5:1 base herding agent blandingen, kan du bruke en egendefinert klemme for å sikre segl.
    5. Flyt flytende medium eller vannet gjennom kanalen innganger og utganger av EcoFAB enheten, og overføre en frøplante til anlegget reservoaret, som beskrevet i trinn 3.3.
  4. Tilføyer mikrober i EcoFABs
    1. Overføre en mikrobiell koloni til en inkubasjon rør med 8 mL av LB kjøttkraft, og vokse den til OD 0,5 (ca 12 timer).
    2. Overføre kultur løsningen til et 15 mL sentrifuge rør og sentrifuge det ved romtemperatur for 5 min på 3000 x g til pellets mikrober.
    3. Fjern nedbryting, og legge til 8 mL plante oppblomstringen medium brukes i målet EcoFAB. Suspendere pellet av mikrober og sentrifuge røret ved romtemperatur for 5 min på 3000 x g.
    4. Gjenta trinn 5.4.3. to ganger for å fjerne noen LB næringsstoffer spor.
    5. Legge til plante oppblomstringen medium vasket mikrobe pellets til tettheten optisk er ca 0,5 på 600 nm.
    6. Legge til 20 µL av mikrobe løsningen inn i roten kammeret gjennom EcoFAB utløp. Stammene i denne publikasjonen reiste til planterøttene innen 2-3 dager, og startet koloniserende rot overflater.
    7. For utviklet chemiluminescent, sørg for å inkludere induser (1 mM IPTG) i plante oppblomstringen medium å indusere luciferase uttrykk.

6. metabolitten profilering av Root eksudater fra EcoFABs

  1. Eksempel forberedelse til LC/MS basert metabolomics analyse
    1. Sett microcentrifuge rør med root eksudater samlet fra EcoFABs i en lyophilizer, og aktivere lyophilizer å fjerne alt vannet fra rørene.
    2. Legger 300 µL av LC-MS klasse metanol i hver rør og sonicate i 30 min.
      Forsiktig: Bruk PPE når du arbeider med metanol.
    3. Plasser rør i en sentrifuge, og sentrifuge dem 3000 x g i 5 min.
    4. Overføre supernatant løsningene til nye microcentrifuge rør og fordampe metanol i en vakuum konsentrator.
    5. Legg 150 µL av metanol med 1 mM LC-MS intern standarder i hver retning, og ruge rør i 4 ° C kjøleskap 12 h.
    6. Sentrifuge rør 3000 x g i 5 min og overføre nedbryting til 0.22 µm filter rør.
    7. Virvel filter rør, og overføre de filtrerte løsningene til 2.0 mL LC/MS ampuller med 200 µL av innstikk.
    8. Plasser hetteglass inne en LC/MS rack, og laste rack innenfor den LC/MS auto-sampler.
  2. Dataanalyse
    1. Få tilgang til metabolitten Atlas og egendefinerte Python skript26 eller bruke andre dataanalyse programvare.
    2. Identifisere metabolitter basert på m /z -verdier, tiden og sammensatte fragmentering mønstre ved hjelp av et bibliotek av metabolitten standarder. 27

7. masse spektroskopiske Imaging av plante røtter i EcoFABs (figur 7)

Merk: EcoFAB enheter laget av en 5:1 elastomer base herding agent blandingen med egendefinerte klemmer (figur 7A) brukes for rot stempling på nanostructure-initiatoren massespektrometri (NIMS) chips,28,29,30 siden PDMS lag kan bli reversert bånd til overflaten NIMS sjetonger.

  1. Sterilisere en NIMS chip overflate med UV lys 1t.
  2. Velg en EcoFAB med en voksende plante settefiskanlegg, og plasserer den i sterilt hette.
  3. Åpne beholderen EcoFAB og fjern topplaten av klemmen.
  4. Løft opp PDMS laget sammen med anlegget inni, og nøye feste PDMS laget med anlegget på en NIMS chip (figur 7BD, E).
    Merk: Når roten berører NIMS chip overflaten, det bør ikke flyttes. Dette hindrer "smøre" på roten metabolitter.
  5. Forsiktig trykk ned på røttene gjennom PDMS laget til røttene fullt kontakt NIMS overflaten. La røttene på NIMS overflaten for 20 min.
  6. Løft PDMS laget inkludert anlegget fra NIMS chip, atter unngår flytte roten over NIMS overflaten. Tilbake anlegget til klemmen hvis ønskelig.
  7. Fest NIMS chip på en egendefinert MALDI plate og laste inn platen i en MALDI spectrometer for masse imaging (figur 7C).
  8. Bruke OpenMSI programmet generere NIMS bildet rot metabolitter (figur 7 d-G)31.

Representative Results

Hver EcoFAB systemet omfatter en EcoFAB enhet og en plante størrelse gjennomsiktig plast container. En EcoFAB enhet har en plante-reservoaret, en rot vekst kammer, en 1,6 mm flyt vik og en 1,6 mm utløp for standard EcoFAB-enhet (figur 2D & Figur 3 H) eller en 10 mm utløp for wide-stikkontakt EcoFAB enhet (figur 2F & figur 3I ). Anlegget reservoaret er designet i en trekantet form som har en 6 mm topp åpning og 3 mm bunnen åpningen, og dette reduserer sjansen for flyt lekkasje i flytende injeksjon og også sikrer tilstrekkelig plass for plantevekst. Roten vekst kammeret vedtar en oval form med 2 mm dybde å passe mange modell planter rot systemer, som vist i figur 2C og E. Både innløp og utløp kanaler med en standard EcoFAB enhet kan kobles med PTFE rørstrekking så næringsstoffer løsninger kan flyte inn i roten vekst kammeret uten å åpne beholderen EcoFAB. Wide-stikkontakt EcoFAB enheten sterkt reduserer flyten motstanden til stikkontakten, og fortrinnsvis brukes når vokser planter med tykk rot systemer eller jevnlig samle root eksudater etter omfattende rotsystem er avledet fra planter.

Støping formene for fabrikasjon PDMS lag av EcoFAB enheter er opprettet i en utforming, og deretter 3D skrevet i stive ugjennomsiktig photopolymers, som vist i figur 2 og Figur 3. Plantene inne EcoFABs kan observeres direkte med et mikroskop med lang arbeid avstand, sikrer den sterile vokse miljø (figur 8A, Utfyllende fil 1). EcoFAB enheter med planter kan også passe på en høyoppløselig mikroskop, som gir høyere oppløsning imaging anlegg-mikrobe samhandlinger (figur 8B, Utfyllende fil 2). Sterilitet opprettholdes ikke i dette miljøet, og høy-resolution tenkelig er derfor bare egnet for sluttpunktet målinger.

EcoFABs er utformet for å aktivere systematiske studier av planter, som deres morfologi, metabolisms og mikrobielle samfunn på sine ulike vekst stadier i livssyklusen. Her ble EcoFABs undersøkt som en generell plattform å studere en rekke plantearter. Figur 8 c -E viser 7 - dagers gammel Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyonog Panicum virgatum vokser i EcoFABs. Alle tre planter ble funnet for å vokse godt i EcoFAB for over en måned. Både dicot, Arabidopsis thaliana og monocot, Brachypodium distachyon ble funnet for å leve opp til sine reproduksjon stadier i EcoFABs.

Reversibel tetting systemet tillater bruk av fast underlag (f.eks., jord) i EcoFABs (trinn 2.2). Denne reversibel tetting tilnærming kan innlasting av solid underlag til roten vekst kammer, og kan også prøvetaking fra bestemte regioner av rot rhizospheres. Figur 8F -H viser en gruppe 14 - dagers gammel Brachypodium distachyon vokser i hydroponic medium, som sand og supplert med hydroponic medium (sand) og vann (jord). Tynn solid substrat laget i roten vekst kammer gjør lyset til å trenge gjennom for mikroskopiske bildebehandling med rotsystem.

Root morfologi defineres som romlig konfigurasjon og distribusjon av en plante rotsystem og har blitt godkjent som en viktig fysiologi svar på ulike vekst miljøer som næringsstoffer eller vann tilgjengelighet32,33, 34. EcoFABs gir en praktisk tilnærming til studere anlegget morfologi over tid eller under ulike næringsstoffer forhold. Figur 9A-F viser et eksempel på bruk av EcoFABs for å spore rot morphologies av Brachypodium distachyon i de første tre ukene. En Brachypodium distachyon frøplante ble overført til EcoFAB enheten, og roten strukturen ble spilt inn av et kamera i en BIO-RADIAN gel imager. Bilde behandlingsprogram, for eksempel bilde J, python og matlab, kan ytterligere brukes for å kvantifisere endringene til rot morphologies over tid eller annet medium miljøer. Kvantifisering av totalt rot i løpet av tre uker viste en gradvis økning på et tidlig stadium (< 1 uke) etterfulgt av en lineær veksttrend på slutten av tre uker, som vist i figur 9G.

En primære motivasjonen for bygging av EcoFAB er å undersøke plante-mikrobe interaksjoner. Som beskrevet i trinn 5.4, overføres mikroorganismer i roten vekst kamre av EcoFAB enheter gjennom innløpet kanalen. Figur 10 viser, en EcoFAB som inneholder Pseudomonas simea (tidligerefluorescens) WCS417 (WCS417), en plantevekst fremme rhizobacteria med chemiluminescent etiketter, ble lagt i plante rot systemer med en konsentrasjon av 106 celler per plante. WCS417 signalet ble oppdaget med en gel imager, som indikerte en distinkt romlige fordelingen av WCS417 mikrober i roten vekst kammer. I begge MS flytende medium med og uten sand solid underlaget kolonisert WCS417 mikrober overflater av hele roten systemer med mikrober konsentrert rundt roten tips områder, muligens på grunn av aktive næringsstoffer produksjon av rot tips (Figur 10 g & H)35. På den annen side, WCS417 mikrobene i jord substrat samlet rundt anlegget reservoaret regionen i stedet for root tips (Figur 10jeg). Som mikrober ble lagt gjennom uttaket kanalen, mikrober var også i stand til å flytte i jord underlaget, men samle ikke på rot, som observert i flytende medium med eller uten sand. Dette kan indikere at jorden er en tilstrekkelig næringsstoffer kilde, og mikrober overført til anlegget reservoaret for optimal åndedrett forhold.

Å studere metabolitten profilering av anlegget root eksudater samt metabolitten opptak og slipp fra plante-mikrobe samspill, sårvæske løsningene fra roten vekst kammer ble samlet inn over ulike vekst stadier av planter i EcoFABs. Som beskrevet i trinn 6, pakkes så sårvæske prøver for LC-MS analyse. Bruker denne metoden, en rekke metabolitter utstrålte anlegget og fortært av mikrober ble oppdaget, og relaterte metabolitten profilering av root eksudater med og uten mikrober colonization er under etterforskning.

Figure 1
Figur 1: The EcoFAB arbeidsflyten. Planter er spirer på plate, og overført til de steriliserte EcoFAB, mikrober kan legges. Ikke-ødeleggende utvalg: root eksudater kan bli samplet fotografert og rot morfologi kan visualiseres. Destruktive prøvetaking kan analyse av mikrobe, rot og skyte parametere i detalj.

Figure 2
Figur 2: komponentene i 3D trykt former for EcoFAB apparat fabrikasjon. (A) topp og skjev utsikt over en avstøpning ramme. (B) topp og skjev utsikt over insert. (C) øverst og skjev utsikt over standard mold base. (E) topp og skjev utsikt over en wide-uttaket mold base. (D, F) Sammensatte former for fabrikasjon standard og bred-stikkontakt EcoFAB enheter, henholdsvis. Oval dimensjonene er 51 x 34 mm for små EcoFAB mold og 76 mm x 62 mm for store EcoFAB mold. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: EcoFAB apparat fabrikasjon. (A) pouring blanding av elastomer base og herding agent i mold. (B) oppvarming mold med blanding på 85 ° C i 4 h. (C) fjerne innsatsen fra mold. (D) skiller PDMS fra støping rammen. (E) presser mold base av støping rammen. (F) bruker en kniv til å skille PDMS fra formen langs kantene. (G) peeling PDMS laget sakte av mold basen. (H) Poking hull for både innløp og utløp kanaler av standard PDMS laget. (I) Poking hull for innløp kanalen av wide-stikkontakt PDMS laget. (J) PDMS lag (laget av en 15:1-elastomer base herding agent blandingen) er en microscope skyve skylt og overført til en plasma renere for binding. (K) ved hjelp av klemmer for å holde PDMS laget (laget av en 5:1 drivverk herding agent blandingen) på en microscope skyve. (L) ved å trykke PDMS laget (laget av en 30: 1 drivverk herding agent blandingen) direkte på et mikroskop lysbilde. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: design av egendefinerte klemmer. (A) topp og skjev utsikt over en topp klemme plate. (B) topp og skjev utsikt over bunnen klemme plate. (C) øverst og skjev utsikt over monterte klemme med fire sett med hex cap skruer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: installere LED vokse lysene. (A) merking ut stedene for 9 LED klipp i en spiral rundt beholderen EcoFAB. (B) LED klipp knyttet til beholderen EcoFAB. (C) threading en LED stripe gjennom disse utklippene. (D) koble LED stripen til en kontroller kablet med en 24V strømforsyning. (E) skjematisk av ledningen forbindelsene til kontrolleren. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: overføring spirene til EcoFABs. (A) Brachypodium distachyon planter dyrket for 2 dager på en 0,5 MS plate. (B) fylle roten kammeret med plante oppblomstringen medium. (C) bruker en tweezer nøye sette inn roten i anlegget reservoaret. (D) tetting beholderen EcoFAB med micropore tape, etter 3 mL vann til bunnen av beholderen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: NIMS avbilding av plante røtter i EcoFABs. (A) en Brachypodium distachyon vokser i et sterilt EcoFAB. (B) koble PDMS laget med anlegget på en NIMS chip for 20 min. (C) bruke kobber tape knytte NIMS chip på en egendefinert MALDI tallerken, og laste den inn i en MALDI masse spectrometer. (D-G) en 7 - dagers gammel og en 20 - dagers gammel Brachypodium distachyon anlegget brukes for NIMS imaging (D, E) og tilsvarende NIMS bilder (F, G). De dominerende ionene ble markert i rødt, grønt og blått. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8: generelle programmer EcoFABs. (A) direkte fange akselerere veksten av Brachypodium distachyon i en EcoFAB med en lang arbeid avstand mikroskop oppsett. (B) direkte observere rot-mikrobe interaksjon med en høy oppløsning mikroskop oppsett. (C-E) 7 - dagers gammel Arabidopsis thaliana (C), Brachypodium distachyon (D) og Panicum virgatum (E) i 0,5 MS hydroponic medium, (F-H) 14 - dagers gammel Brachypodium distachyon vokst i 0,5 MS hydroponics (F), i sand (G) og (H) substrat leveres med 0,5 MS medium og vann, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 9
Figur 9: bruk av EcoFABs rot morfologi. (A-F) Root utvikling Brachypodium distachyon vokser i EcoFABs fylt med 0,5 MS medium under første tre ukene: (A) 2 dager, (B) 4 dager, (C) 7 dager, (D) 11 dager, (E) 14 dager (F) 21 dager av vekst. (G) gjennomsnitt rot flater ble anslått av ImageJ programvare. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 10
Figur 10: bruk av EcoFABs rot-mikrobe interaksjoner. (A, B, C) En gruppe av 15 - dagers gammel Brachypodium distachyon kolonisering med Pseudomonas fluorescens WCS417 i ulike former for media-MS flytende løsning, sand og underlag. (D, E, F) Lyse feltet bilder av deres rotsystem. (G, H, JEG) Tilsvarende chemiluminescent bilder av disse rotsystem etter 14 dager co dyrking. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplerende fil 1. Bruker EcoFAB for å fange rot vekst. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende filen 2. Bruker EcoFAB for å fange rot-mikrober interaksjoner. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Protokollene rapporteres her for å bruke økosystem fabrikasjon opprette EcoFABs inneholder ressurser for systematisk anlegget biologi studier i kontrollerte laboratorieforhold. Fremskritt i 3D-utskrift gir allment tilgjengelige teknologier for bygging og iteratively raffinering EcoFAB design. Roten kammeret presenteres her er funnet for å være godt egnet for imaging mikroskopi og vedlikeholde sterilitet, aktivere kontrollert tilførsel av mikrober å undersøke plante-mikrobe interaksjoner. Den EcoFAB plattformen er kompatibel med forskjellige plantearter. Det er viktig å erkjenne fysiologiske effekter av dyrking av planter i smale roten kammeret slik at flere eksperimenter vil måtte generalisere funn til planter vokser i naturskjønne omgivelser.

Bruk av steril kamre og vokse lampe kan undersøke effekten av ulike lysforhold, inkludert bølgelengde, intensitet og varighet på plantevekst og relaterte fysiologiske parametere parallelt. Reversibel bonding rot kammer tillate bruk av fast underlag også som romlig samle faste stoffer for biokjemiske og genetiske analyser. Programmene av solid underlag, som jord, sand og kvarts perler, tilbyr mulighetene for å bruke EcoFABs til å lage mer økologisk relevante laboratorium økosystemer. Men forbedre alle systemene presenteres her bruk mettet væske (hydroponic kulturer) som ikke er en nøyaktig refleksjon av de fleste jord, og det vil være viktig å ytterligere designene å opprettholde luftlommer i jorda slik at de bedre representerer naturlig jord.

Bruk av både enkle kameraer og mikroskoper beskrives bilde rotsystem morfologi utvikling på begge bulk til mobilnettet nivå. Denne egnethet for overvåking rot morfologi bildebehandling og kvantifisering vil trolig være nyttig for å forstå de regulatoriske mekanismene av anlegget fysiologiske og molekylære signaler utløst av anlegget genotypic tilpasninger vekst forhold. En begrensning for å studere fysiologiske root utvikling er imidlertid gjeldende vannrette plassering av EcoFAB enheten. I naturskjønne omgivelser fører røtter gravitropic svaret til en overveiende vertikal utvikling med rotsystem. Dermed vannrett systemet presenteres her sannsynlig forskjellig i noen faktorer fra et naturlig miljø, og fabrikasjon av EcoFAB systemer med loddrett plassering av roten kammeret er ønskelig mål for fremtidige EcoFAB versjoner. Selv om gjeldende EcoFAB enhetene plasseres horisontalt, er analyse av rot morfologi parametere i ulike forhold, eller som svar på mikrober, mulig. Høyoppløselige bilder kan brukes for å fange rot kolonisering dynamikken i enkelt isolerer eller samfunn, gir informasjon om hvilke anlegg deler er kolonisert i ulike næringsstoffer tilstrekkelig og mangelfulle forhold. Det er forventet at slike studier vil gi viktig ny innsikt i hvordan plante microbiomes er samlet, og hvordan disse dynamikk endres over tid, for eksempel som røttene utvikle.

Microfluidic enheter aktiverer imaging svært unge planter, og vanligvis mengden metabolitter samlet er ikke tilstrekkelig for LCMS analyse. Jord-basert systemer, for eksempel rhizotrons, tillate avbilding av rot morfologi når enten Plantene er forvandlet chemiluminescent konstruksjon (Glo-rot) eller NMR-baserte metoder33,34. Metabolitten utdrag fra disse systemene er tidkrevende store volum av prøver. EcoFABs er en kombinasjon av begge: fabrikasjon ligner microfluidic enheter. EcoFABs var ment å være enkelt og billig å reprodusere, men størrelsen på kammeret kan justeres for å vokse planter med små eller store rotsystem, til sine reproduktive stadier. Samtidige observasjoner av rot morfologi endringer og rot exudation er mulig. Systemet er sterilt, aktivere kontrollert tilførsel av bestemte mikrober.

EcoFABs utformet for å muliggjøre kontrollert introduksjon og utvalg av mikrober og metabolitter. Spesielt er prøver fra roten vekst kammer funnet for å være tilstrekkelig for masse spektroskopiske metabolitten profilering. Integrering av massespektrometri imaging (f.eks., NIMS teknikk presenteres her) gir en ikke-destruktiv tilnærming med å studere metabolitten romlige distribusjoner med rotsystem. Denne teknikken vil trolig være nyttig i fremtiden stabil isotop sporing eksperimenter og kartlegging mikrobiell lokalisering bestemt metabolitter36. Mens denne protokollen har fokusert på enkelt isolerer, kan samme design sikkert brukes for mer komplekse samfunn. Eksempel volumer og biomasse innen EcoFABs sannsynligvis mer enn nok for videre integrasjon med DNA sekvensering teknologi, som vil være viktig å karakterisere og overvåking mikrobielle samfunn struktur og gene expression.

Avslutningsvis denne protokollen detaljer fabrikasjon av laboratoriet økosystemer designet for etterforskningen av plante-mikrobe interaksjoner, med vekt på enkle og tilgjengelige metoder som lett kan gjennomføres og forlenget med forskere rundt den verden. Dagens innsats er rettet mot demonstrere reproduserbarhet mellom laboratorier og integrering av en temperatur control system slik at hver EcoFAB vil ha uavhengig kontrollert lys og temperatur. En ytterligere fremgang av systemet vil være integreringen av automatiserte utvalg og påfylling av EcoFAB rot kammer og utvikling av reproduserbar protokoller for å etablere relevante anlegget microbiomes innenfor EcoFABs.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Laboratory regissert forskning og utvikling (LDRD) program av Lawrence Berkeley National Laboratory støttes av Office of Science, av US Department of Energy under Kontraktnr. DE-AC02-05CH11231 og en pris DE-SC0014079 fra den amerikanske avdelingen av energi Office of Science til UC Berkeley. Arbeid på molekylære støperiet ble støttet under US Department av energi Kontraktnr. DE-AC02-05CH11231. Vi takker også Suzanne M. Kosina, Katherine Louie, Benjamin P. Bowen og Benjamin J. Cole ved Lawrence Berkeley National Laboratory for all deres hjelp.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D printed custom mold LBNL STL files available here www.eco-fab.org; The EcoFABs molds described here were printed by FATHOM: http://studiofathom.com
Dow sylgard 184 silicone elastomer clear kit Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Air duster spray VWR 75780-350 any compressed gas duster should work
15 gauge blunt needle VWR 89166-240
5 mL syringe with Luer-Lok Tip VWR BD309646
3”x2” microscope glass slide VWR 48382-179
1.75" x 2.56" x 3.56" EcoFAB box Amazon B005GAQ25Q
4” x 3 ¼” microscope glass slide Ted Pella 260231
4.87" x 4.87" x 5.50" EcoFAB box Amazon B00P9QVOS2
Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-001
3D printed custom clamp LBNL STL files available from Trent Northen's lab
Sterile hood AirClean Systems AC600 Series PCR Workstations
PTFE syringe tubing Sigma-Aldrich Z117315-1EA
Ethanol VWR 89125-172
Bleach
Murashige and Skoog (MS) Macronutrient Salt Base Phytotechnologies Laboratories M502
Murashige and Skoog (MS) Micronutrient Salt Base Phytotechnologies Laboratories M554
Soil Hummert International Pro-Mix PGX
Phytagel Sigma-Aldrich 71010-52-1
Arabidopsis thaliana Lehle Seeds WT-24 Col-4 Columbia wild type
Brachypodium distachyon LBNL Standard Bd-21 line Available from John Vogel's lab
Panicum virgatum The Samuel Roberts Noble Foundation Alamo switchgrass
Micropore tape VWR 56222-182
LC-MS grade methanol VWR JT9830-3
Lyophilizer LABCONCO FreeZone 2.5 Plus
SpeedVAC concentrator Thermo Scientific Savant™ SPD111 SpeedVac
Ultrafree-MC GV Centrifugal Filter-0.22 µm Millipore UFC30GV00
Liquid chromotography system Agilent Agilent 1290 LC system
Q Exactive mass spectrometer Thermo Scientific Q Exactive™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap MS
NIMS chip and custom MALDI plate LBNL For detailed protocol see: doi:10.1038/nprot.2008.110
MALDI mass spectrometer AB Sciex TOF/TOF 5800 MALDI MS
Nano-coated LED grow light strip LED World Lighting HH-SRB60F010-2835
Power supply LED World Lighting MD45W24VA, LV100-24N-UNV-J
TC420 controller Amazon B0197U7R8Q
Silicone LED clips Amazon B00N9X1GI0
Hot glue gun Amazon B006IY359K
Female-to-bare LED connector cable LED World Lighting HH-F05
Female-to-male LED connector extension cable LED World Lighting HH-MF1
20AWG 2-wire cable LED World Lighting 6102051TFT4
WAGO 221-415 Splicing Connector LED World Lighting 221-415

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Morrissey, J. P., Dow, J. M., Mark, G. L., O'Gara, F. Are microbes at the root of a solution to world food production. EMBO Rep. 5 (10), 922-926 (2004).
  2. Farrar, K., Bryant, D., Cope-Selby, N. Understanding and engineering beneficial plant-microbe interactions: plant growth promotion in energy crops. Plant Biotechnol J. 12 (9), 1193-1206 (2014).
  3. Singh, J. S., Abhilash, P. C., Gupta, V. K. Agriculturally Important Microbes in Sustainable Food Production. Trends Biotechnol. 34 (10), 773-775 (2016).
  4. Dubey, R. K., Tripathi, V., Dubey, P. K., Singh, H. B., Abhilash, P. C. Exploring rhizospheric interactions for agricultural sustainability: the need of integrative research on multi-trophic interactions. J Clean Prod. 115, 362-365 (2016).
  5. Hunter, P. Plant microbiomes and sustainable agriculture. EMBO Rep. 17 (12), 1696-1699 (2016).
  6. van der Heijden, M. G. A., Hartmann, M. Networking in the Plant Microbiome. PLoS Biol. 14 (2), e1002378 (2016).
  7. Vessey, J. K. Plant growth promoting rhizobacteria as biofertilizers. Plant Soil. 255 (2), 571-586 (2003).
  8. Yang, J., Kloepper, J. W., Ryu, C. -M. Rhizosphere bacteria help plants tolerate abiotic stress. Trends Plant Sci. 14 (1), 1-4 (2009).
  9. Reynolds, H. L., Packer, A., Bever, J. D., Clay, K. GRASSROOTS ECOLOGY: PLANT-MICROBE-SOIL INTERACTIONS AS DRIVERS OF PLANT COMMUNITY STRUCTURE AND DYNAMICS. Ecology. 84 (9), 2281-2291 (2003).
  10. Finkel, O. M., Castrillo, G., Herrera Paredes, S., Salas González, I., Dangl, J. L. Understanding and exploiting plant beneficial microbes. Curr Opin Plant Biol. 38, 155-163 (2017).
  11. Northen, T. R., Zhang, Z., Gao, J., Swenson, T., Yoshikuni, Y. Advancing Our Understanding of the Chemistry of Soil Microbiomes. National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. 2017. The Chemistry of Microbiomes: Proceedings of a Seminar Series. , The National Academies Press. Washington, DC. (2017).
  12. Busby, P. E., et al. Research priorities for harnessing plant microbiomes in sustainable agriculture. PLOS Biology. 15 (3), e2001793 (2017).
  13. Sanati Nezhad, A. Microfluidic platforms for plant cells studies. Lab Chip. 14 (17), 3262-3274 (2014).
  14. Oburger, E., et al. Evaluation of a novel tool for sampling root exudates from soil-grown plants compared to conventional techniques. Environ Exp Bot. 87, 235-247 (2013).
  15. Van Der Krift, T. A. J., Berendse, F. Root life spans of four grass species from habitats differing in nutrient availability. Funct Ecol. 16 (2), 198-203 (2002).
  16. Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. P Natl. Acad. Sci. USA. 114 (17), 4549-4554 (2017).
  17. Sanati Nezhad, A., Naghavi, M., Packirisamy, M., Bhat, R., Geitmann, A. Quantification of cellular penetrative forces using lab-on-a-chip technology and finite element modeling. P Natl. Acad. Sci. USA. 110 (20), 8093-8098 (2013).
  18. Jiang, H., Xu, Z., Aluru, M. R., Dong, L. Plant chip for high-throughput phenotyping of Arabidopsis. Lab Chip. 14 (7), 1281-1293 (2014).
  19. Parashar, A., Pandey, S. Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis. Appl. Phys. Lett. 98 (26), 263703 (2011).
  20. Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression. Nat Methods. 9 (11), 1101-1106 (2012).
  21. Grossmann, G., et al. The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science. Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).
  22. Aufrecht, J. A., Ryan, J. M., Hasim, S., Allison, D. P., Nebenführ, A., Doktycz, M. J., Retterer, S. T. Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform. J. Vis. Exp. (126), (2017).
  23. Garvin, D. F., et al. Development of Genetic and Genomic Research Resources for Brachypodium distachyon, a New Model System for Grass Crop Research. Crop Sci. 48 (Supplement_1), S69-S84 (2008).
  24. Lisensky, G. C., et al. Replication and Compression of Surface Structures with Polydimethylsiloxane Elastomer. J. Chem. Educ. 76 (4), 537 (1999).
  25. Friend, J., Yeo, L. Fabrication of microfluidic devices using polydimethylsiloxane. Biomicrofluidics. 4 (2), 026502 (2010).
  26. Yao, Y., et al. Analysis of Metabolomics Datasets with High-Performance Computing and Metabolite Atlases. Metabolites. 5 (3), 431-442 (2015).
  27. Sumner, L. W., et al. Proposed minimum reporting standards for chemical analysis Chemical Analysis Working Group (CAWG) Metabolomics Standards Initiative (MSI). Metabolomics. 3 (3), 211-221 (2007).
  28. Gao, J., de Raad, M., Bowen, B. P., Zuckermann, R. N., Northen, T. R. Application of Black Silicon for Nanostructure-Initiator Mass Spectrometry. Anal. Chem. 88 (3), 1625-1630 (2016).
  29. Gao, J., et al. Morphology-Driven Control of Metabolite Selectivity Using Nanostructure-Initiator Mass Spectrometry. Anal. Chem. 89 (12), 6521-6526 (2017).
  30. Woo, H. -K., Northen, T. R., Yanes, O., Siuzdak, G. Nanostructure-initiator mass spectrometry: a protocol for preparing and applying NIMS surfaces for high-sensitivity mass analysis. Nat. Protoc. 3 (8), 1341-1349 (2008).
  31. Rübel, O., et al. OpenMSI: A High-Performance Web-Based Platform for Mass Spectrometry Imaging. Anal. Chem. 85 (21), 10354-10361 (2013).
  32. López-Bucio, J., Cruz-Ramı́rez, A., Herrera-Estrella, L. The role of nutrient availability in regulating root architecture. Curr Opin Plant Biol. 6 (3), 280-287 (2003).
  33. Lynch, J. P. Steep, cheap and deep: an ideotype to optimize water and N acquisition by maize root systems. Ann. Bot. 112 (2), 347-357 (2013).
  34. Rellán-Álvarez, R., et al. GLO-Roots: an imaging platform enabling multidimensional characterization of soil-grown root systems. eLife. 4, e07597 (2015).
  35. Kamilova, F., Validov, S., Azarova, T., Mulders, I., Lugtenberg, B. Enrichment for enhanced competitive plant root tip colonizers selects for a new class of biocontrol bacteria. Environ. Microbiol. 7 (11), 1809-1817 (2005).
  36. Klitgaard, A., Nielsen, J. B., Frandsen, R. J. N., Andersen, M. R., Nielsen, K. F. Combining Stable Isotope Labeling and Molecular Networking for Biosynthetic Pathway Characterization. Anal. Chem. 87 (13), 6520-6526 (2015).

Tags

Miljøfag problemet 134 laboratorium økosystemer EcoFAB plante-mikrobe interaksjoner microbiome rot morfologi root eksudater LC-MS NIMS metabolomics mikroskopiske bildebehandling
Økosystem fabrikasjon (EcoFAB) protokoller for bygging av laboratoriet økosystemer designet anlegg-mikrobe interaksjoner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gao, J., Sasse, J., Lewald, K. M.,… More

Gao, J., Sasse, J., Lewald, K. M., Zhalnina, K., Cornmesser, L. T., Duncombe, T. A., Yoshikuni, Y., Vogel, J. P., Firestone, M. K., Northen, T. R. Ecosystem Fabrication (EcoFAB) Protocols for The Construction of Laboratory Ecosystems Designed to Study Plant-microbe Interactions. J. Vis. Exp. (134), e57170, doi:10.3791/57170 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter