Summary
Эта статья описывает подробные протоколы для изготовления экосистемы устройств (EcoFABs), которые позволяют исследования растений и завод микробных взаимодействий в очень контролируемой лабораторных условиях.
Abstract
Полезных растений микробных взаимодействий предлагают устойчивого биологического решения с потенциалом для увеличения производства продовольствия и биоэнергии низкозатратных. Лучше механистического понимания этих сложных растений микробных взаимодействий будет иметь решающее значение для улучшения производства завода, как хорошо, как исполняющая основные экологические исследования следственный растение почва микробных взаимодействий. Здесь представлены подробное описание для изготовления экосистемы, использование широко доступных технологий 3D печати, для создания контролируемой лабораторной среды обитания (EcoFABs) для механистический исследования растений микробных взаимодействий в рамках конкретных экологических условий. Два размера EcoFABs описаны которые подходят для расследования микробных взаимодействий с различных видов растений, в том числе Arabidopsis thaliana, особенно distachyonи просо заострённая. Эти потока через устройства позволяют контролируемых манипуляции и выборки из корня microbiomes, корень химии, а также визуализации корень морфологии и микробных локализации. Этот протокол включает в себя сведения о поддержании стерильных условий внутри EcoFABs и монтаж независимых Светодиодных световых систем на EcoFABs. Подробные методы для добавления различных форм средств массовой информации, включая почвы, песка и жидких питательных сред в сочетании с характеристика этих систем с использованием изображений и метаболомики описаны. Вместе, эти системы позволяют динамических и подробное расследование завод и завод микробные консорциумы, включая манипуляции микрофлора состава (включая мутанты), мониторинг роста растений, корень морфологии, состав экссудата, и микробные локализации в контролируемых условиях окружающей среды. Мы ожидаем, что эти подробные протоколы будут служить важной отправной точкой для других исследователей, идеально помогает создавать стандартизированные экспериментальных систем для расследования завод микробных взаимодействий.
Introduction
Приложение полезно завод микробов в сельском хозяйстве предлагает большой потенциал для увеличения устойчивой продовольственной и производство биотоплива для обеспечения для растущего населения1,2,3,4. Значительное количество работ поддерживает важность растений microbiomes растений питательных, терпимости к стрессам и сопротивление болезни5,6,,78. Однако, трудно расследовать эти механизмы растений микробных взаимодействий в области экосистем из-за сложности и связанные невоспроизводимость и неспособность точно контролировать состав микрофлора и генетики (например., используя микробных мутантов)4,9,10.
Одна стратегия заключается в построении упрощенную модель экосистемы для включения контролируемых, реплицируемых лабораторных экспериментов, расследование завод микробных взаимодействий для генерировать идеи, которые далее могут быть проверены в поле10,,11 12. Эта концепция основывается на традиционных подходов с использованием растений, выращенных в горшках, заполненные почвы или на плитах агара в теплицах или инкубаторы13. Хотя они, скорее всего, останется наиболее широко используемых подходов, они лишены возможности точно контролировать и манипулировать среды рост растений. В этих целях rhizoboxes и rhizotrons представляют собой значительное улучшение в способности учиться подземных процессов14,15, и для анализа ризосфере метаболитов в почве16были опубликованы первые протоколы. Совсем недавно чтобы включить анализ высокой пропускной способности, были дополнительно microfluidic приборы13,17 таких растений чип18,19, RootArray20и21RootChip, разработан как эффективные инструменты для растений фенотипа с пространственным разрешением микрометр шкала для мониторинга на ранних стадиях роста маленькая модель растение Arabidopsis thaliana в среде потока жидкости. Недавно двухслойная изображений платформы был описан, позволяющий корневого волоска изображений Arabidopsis thaliana на этапе сеянца с microfluidic платформа22.
Здесь подробные протоколы для построения управляемой лаборатории устройства (EcoFABs) предоставляются, для изучения растений микробных взаимодействий и показать что они могут использоваться для изучения различных растений, включая Arabidopsis thaliana, особенно distachyon23, экологически важных дикий овес barbata Авена и биоэнергетическая культура просо заострённая (switchgrass). EcoFAB представляет собой стерильный завод роста платформу, которая включает два основных компонента: стерильный завод размера прозрачный контейнер и EcoFAB устройство. EcoFAB, которую устройство изготавливается из полидиметилсилоксан (PDMS) производственного процесса, который включает в себя приведение PDMS слои от 3D печатной прессформа и связывания PDMS слои на скольжениях микроскопа, с использованием методов, ранее сообщили24,25 . Подробные процедуры EcoFAB рабочего процесса, например изготовление устройство, стерилизации, прорастание семян, пересадка рассады, микробных иммунизации/cocultivation, пробоподготовки и анализа, описаны в настоящем Протоколе (рис. 1). Дальнейшие модификации базового рабочего процесса описаны, включая установку компьютера контролируемых привело растут огни и использования твердых субстратов. Использование изображений методы для изучения морфологии корень изменения, микробная колонизация корней, и массовых спектроскопических изображений корень экссудата описаны. Мы ожидаем, что простой, недорогой дизайн, основанный на легко доступных материалов, а также подробные протоколы, представленные здесь, превратит EcoFAB платформы в ресурс сообщества, стандартизации завод микрофлора лабораторных исследований.
Protocol
Предупреждение: Этот протокол включает в себя использование опасных химических веществ, острых предметов, электрические приборы, горячие предметы и других опасностей, которые могут привести к травмам. Соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ, например., химически стойкие перчатки, защитные очки, лаборатории пальто, длинные одежды, закрытыми носком туфли, и т.д.) следует носить и процедуры безопасности (подготовка по вопросам безопасности, использование вытяжного шкафа, и т.д.) следует использовать.
1. EcoFAB устройства изготовления: литье PDMS слоев (рис. 2 и рис. 3)
- Построить EcoFAB формы с использованием 3D печати методов (дизайн файлы доступны в. Каждая форма состоит из трех частей: приведение рама, Рекомендуемые плесень базы и insert, как показано на рисунке 2. Печать плесень базы и вставить из жесткой непрозрачный фотополимеры, с использованием пластиковых 3D принтер. Использовать как минимум 100 мкм резолюции и напечатать кадр литья с Акрилонитрил бутадиен стирола (ABS).
- Смешайте 40 мл силоксановых эластомер базы с Вулканизирующий агент в одноразовый контейнер 1 Л. В зависимости от желаемого эксперимент (шаги 2.1 и 2.2) используйте различные соотношения (v/v) эластомера, база/Вулканизирующий агент (5:1, 15:1, или сжатие 30: 1). Перейти к шаги 1,3 до 1,8 для всех видов смесей.
Предупреждение: Носите химически стойкие перчатки, защитные очки и другие трубы. - Поместите контейнер в вакуумной камере по крайней мере 30 минут для удаления пузырьков воздуха из эластомера смеси.
- Вылейте смесь в собранном 3D печатной пластмасс (Рисунок 3А) и держите плесень на Отопление блока на 85 ° C в течение 4 ч (рис. 3B).
Предупреждение: Носить СИЗ, чтобы избежать ожогов. - Плесень, дайте остыть в течение 5 мин. Затем осторожно вытащить вставки из формы (рис. 3 c), а затем медленно вставьте нож между литья и PDMS (смесь затвердевшей эластомер) отделить их (Рисунок 2D).
- Нажмите плесень базы с PDMS вверх из литья кадра (Рисунок 3E). Используйте нож или другие инструменты аккуратно отделить слой PDMS от базы плесень на краях (Рисунок 3F), а затем медленно отделите его от поверхности формы (рис. 3 g).
- Создание входе и выходе каналы на PDMS слои, делая ~1.6 мм отверстия для впускных и выпускных отверстий с 15 датчика тупой иглой (Рисунок 3 H, I).
Примечание: Стандартные формы имеет входного и выходного порта, в то время как широкий выход формы только нужно впускное отверстие (Рисунок 3 H, I). - Используйте ножницы для обрезки краев PDMS слои.
Примечание: Подстриженные PDMS слои должны быть ≥76 мм x 51 мм прямоугольников для небольших устройств, EcoFAB и ≥102 мм x 83 мм прямоугольников для больших EcoFAB устройств.
2. EcoFAB устройство изготовление: химически вложен PDMS слои на скольжениях микроскопа (рис. 3 и рис. 4)
- Постоянно склеивание PDMS слои на скольжениях микроскопа
- Промыть стороне склеивание PDMS слоя (из 15:1 эластомера базы для отверждения агент смесь) и 7,6 × 5 см Микроскоп слайд с метанолом и затем удар сухой сжатым воздухом или пистолет Ультрачистые азота.
Предупреждение: Метанол является токсичным. Работа в зонта и носить защитные глаз покрытия, перчатки и другие трубы. - Место микроскопа и PDMS слой в плазме более чистых с их стороны склеивание вверх (рис. 3J). Если не доступен плазмы чище, перейдите к шагу 2.2.
- Закройте палата и выпускной клапан газовой плазмы более чистых и включите пылесос и насос вниз палате за 1 мин.
- Включите питание генератора плазмы и переключение радиочастотного (RF) уровень «Привет» за 1 мин.
- Выключите вакуумный насос и власть плазменного и вентиляционные камеры в атмосферу.
- Возьмите микроскопа и PDMS слой из плазмы палаты и быстро нажмите всех четырех краев PDMS слоя на слайд с даже давление (рис. 3 L). Убедитесь, что центр овальной региона PDMS слоя (палата корень) не прикасаться слайд.
- Место запечатанный EcoFAB устройство на 120 ° C, Отопление блока для 20 мин для дальнейшего обеспечения постоянной связи между PDMS слой и микроскопа.
- Дайте прибору остыть в течение 5 мин Trim дополнительных края PDMS слоя с ножом.
- Промыть стороне склеивание PDMS слоя (из 15:1 эластомера базы для отверждения агент смесь) и 7,6 × 5 см Микроскоп слайд с метанолом и затем удар сухой сжатым воздухом или пистолет Ультрачистые азота.
- Реверсивные физической уплотнения PDMS слоев на скольжениях микроскопа
- Реверсивные, Уплотнительная техника использует набор пользовательских зажимы (либо печатных пластиковых 3D принтер или смоделированной в металл, чертежи показаны на рис. 4).
- Поместите микроскопа в вырез на нижней пластине зажим, а затем выровнять слой PDMS (из 5:1 эластомер базы для отверждения агент смесь) поверх слайда.
- Место пластину верхнего прижима поверх слоя PDMS. Закрепите верхнюю и нижнюю пластины, вместе с помощью четырех шестнадцатеричных болты, ориентация винты так, что орехи являются многопоточными на из верхней части упора.
- Придерживаясь PDMS непосредственно на скольжениях микроскопа
- Положение слоя PDMS (из эластомера базы 30: 1 для отверждения агент смесь) поверх микроскопа.
- Нажмите PDMS слой к слайду. Мягкие, очень клеевой слой PDMS (30: 1) следует придерживаться слайд, создавая водонепроницаемый печать без постоянного химического связывания или физической пресс с зажим (рис. 3 L).
- Реверсивные, Уплотнительная техника использует набор пользовательских зажимы (либо печатных пластиковых 3D принтер или смоделированной в металл, чертежи показаны на рис. 4).
3. EcoFABs стерилизации
- Промывайте EcoFAB устройств с ультрачистая вода.
- Место одно устройство EcoFAB в EcoFAB контейнере и добавить 70% этанол до тех пор, пока устройство погружен. Закройте крышку контейнера и осторожно встряхнуть для мокрой поверхности внутри этанол. Убедитесь, что корневой рост палата EcoFAB, устройство заполнено с этанолом, с очень мало или пузырьки воздуха не.
- После инкубации в 30 мин при комнатной температуре слить на 70% спирте и повторять инкубации с 100% этанола за 5 мин.
- Слейте из этанола, и инкубировать и стерилизовать EcoFAB для 16 h в Ламинарный шкаф полностью высохнуть. Если возможно, стерилизуйте системы, повернув на УФ света внутри вытяжки за 1 ч.
Предупреждение: Носить соответствующие средства индивидуальной защиты при работе с УФ лампы. - Храните стерилизовать EcoFABs в стерильных капот или автоклавного Сумки для использования в будущем.
4. EcoFABs с привело растут огни (рис. 5)
- Подключая светодиодные полосы на EcoFAB контейнеры
- Марк из мест на EcoFAB контейнер для 9 LED клипов. Начните с первого клипа 120 мм из нижней части контейнера вдоль края (Рисунок 5A) вверх и приступить к выделить места клип в спираль вокруг контейнера, с каждый следующий клип, сбросив 10 мм. Спираль 9 клипов, что позволяет 1 m светодиодные ленты обернуть вокруг контейнера дважды.
- Горячий клей светодиодный клип к каждому отмеченные позиции путем добавления двух мазками горячего клея на контейнер, в соответствие с позицией клипы монтажных отверстий. Нажмите клип отверстия в этих двух мазками клея, а затем добавить другую каплю клея на вершине отверстия. Повторите эту процедуру для всех клипов до 9 клипов формируют спираль (Рисунок 5B).
Предупреждение: Надевайте перчатки и других средств индивидуальной защиты при работе с горячим клеем, чтобы избежать ожогов. - Нить светодиодные полосы через клипы в форме спирали, с LEDs, с которыми сталкиваются в контейнер. Полоса должна круг вокруг дважды (рис. 5 c).
- Подключение светодиодные полосы к источнику питания с контроллером (Рисунок 5 d отображает EcoFAB камеры с освещенной огнями, программирование контроллера описано в шаге 4.3).
Предупреждение: Опасность поражения электрическим током: Убедитесь, что источник питания отключен, при подключении проводов.- Подключите на положительные и отрицательные клеммы питания к клеммам «ввода: V +» и «вход: V-» контроллера с помощью 2-жильный кабель (Рисунок 5E отображается схема, чертеж установки контроллера).
- Подключите отрицательный провод от конца голые девушки голые кабеля к одному каналу «Выход» на контроллере.
Примечание: Существует пять каналов на контроллер, который используется в настоящем Протоколе, поэтому он может поддерживать до пяти полос 1 м LED. - Подключайте все положительные кабелей к компактным сплайсинга-разъем (если требуется более одного каналы), а затем связать этот соединитель «вывода (V +» терминал контроллера.
- Подключите каждый СИД женский конце кабеля, поэтому каждый светодиод имеет свой собственный канал, чтобы управляться. При необходимости, используйте кабели мужчин и женщин для расширения сферы охвата.
- Программа контроллера для желаемого свет цикла согласно инструкциям производителя,
5. растения в EcoFABs
- Стерилизации семян и прорастание
Примечание: Стерилизации семян и все следующие шаги с саженцев должна выполняться в стерильных условиях. Процесс стерилизации, обсуждаются ниже подходит для семена Arabidopsis thaliana, barbata Авена, особенно distachyonи просо заострённая. Просо заострённая семена должны быть приостановлены в 60% серной кислоты за 1 ч до процесса стерилизации. Рекомендуется подготовить семена 1-2 EcoFAB устройство, учитывая однородность прорастания и всхожесть.- Замочите семена в 70% этанол на 2 мин.
- Удаление этанола с пипеткой и сполосните семена с стерильной водой три раза.
- Оставьте семена в растворе отбеливателя 10% за 5 мин.
- Удалить раствор отбеливателя и тщательно вымыть семена, используя стерильную воду три раза.
- Добавьте стерильную воду семена и инкубировать пробки microcentrifuge в холодильнике 4 ° C в течение 7 дней.
- Распространение семян на 0,5 фотосинтетическую & Скуг (МС) средний с 0,6% phytagel и уплотнения пластин с лентой своих равномерно.
- Растут растения в корень длиной около 5 мм-для передачи в EcoFABs (рис. 6A). Для экспериментов представлены здесь, применять режим 16 h свет/8 h темное освещение в камере роста 22 ° C и инкубировать растения 2-7 d до перевода в EcoFAB (2 дня barbata Авена и особенно distachyon, 7 дней для арабидопсиса thaliana и заострённая просо).
- Передача саженцев в EcoFABs с жидкой среды (рис. 6)
- С помощью стерильного шприца или микропипеткой, потолочные камеры корневой EcoFAB устройства с стерильной водой в три раза, а затем заполнить корневой камеры с среднего роста интереса, например 0,5 мс среднего (Рисунок 6B, шаг 5.1.6).
- Осторожно вставьте один саженец в водохранилище завод EcoFAB устройства (рис. 6 c).
Примечание: Корень необходимо полностью погружать в камере корень, с стрелять, торчащие из водохранилища. - Добавьте 3 мл стерильной воды в контейнер, избегая EcoFAB устройство. Это будет увеличить влажность воздуха и уменьшить испарение среды из корня камеры.
- Закройте контейнер и уплотнение крышки с своих ленты (рис. 6 d).
- Поместите EcoFAB в инкубатор завод, или использовать систему освещения EcoFAB в среде с контролируемой температурой, подходит для роста соответствующих растений (шаг 4). Для этого исследования установите камеры до 24 ° C.
- Периодически проверяйте EcoFAB пополнить питательных сред в камере роста корня и добавить воду в контейнер. Выполните все шаги в стерильных условиях.
Примечание: На ранних стадиях роста растений, заправка палаты роста корня необходимо каждые 5-7 дней. Для более поздних стадиях роста заправка необходимо каждые 2-3 дней. При желании, используйте шприца или пипетки для сбора корень экссудата решение от камер роста корня в пробки microcentrifuge и хранить его в холодильнике-80 ° C; Кроме того изображение морфология корня с помощью томографа гель или Микроскоп.
- Передача саженцев в EcoFABs с твердых субстратов
- Использовать корневой камеры изготовлены с 5:1 смесь эластомер базы для отвердителя, если с помощью набора пользовательских зажимы, чтобы прикрепить его к микроскопа (рис. 3 K, рис. 4); или выберите слой PDMS из 30: 1 база для отверждения агент смесь, если соблюдение PDMS слоев слайдов непосредственно (как описано в шаге 2.2).
- Стерилизуйте EcoFAB камер, как описано в шаге 3.
- Тщательно добавить стерилизованные почвы/песок в корень камеру, переверните слой PDMS и добавить субстрата в корень камеру. Избегайте любых твердых падения на область, которая будет находиться в контакте с микроскопа, так как это позволит снизить адгезию.
- Поместите микроскопа поверх слоя PDMS и прижать все края. Тщательно флип EcoFAB устройство, так что без почвы/песок выпадает из открытия водохранилища.
Примечание: Для EcoFAB устройств, изготовленных из 5:1 база для отверждения агент смесь, используйте пользовательские зажим обеспечить печать. - Потока жидкой среды или воды по каналам входе или на выходе устройства EcoFAB и передачи саженец в завод водохранилище, как описано в пункте 3.3.
- Добавление микробов в EcoFABs
- Передача колонии микроорганизмов для инкубации трубка с 8 мл LB отвара и расти ОД 0.5 (примерно 12 ч).
- Передача решения культуры в пластиковых пробирок 15мл и центрифуги при комнатной температуре за 5 мин на 3000 x g для пеллет микробов.
- Удалить супернатант и добавить 8 мл среднего роста растений, используется в целевом объекте EcoFAB. Приостановить Пелле микробов и центрифуги трубки при комнатной температуре за 5 мин на 3000 x g.
- Повторите шаг 5.4.3. дважды, чтобы полностью удалить все следы LB питательных веществ.
- Добавить среднего роста растений Пелле промывают микроба, до тех пор, пока его оптической плотности составляет около 0,5 на 600 Нм.
- 20 мкл раствор микроба, в корень камеру через выход EcoFAB. Штаммы, используемые в настоящей публикации, ездил к корням растений в течение 2-3 дней и началась колонизация поверхности корней.
- Для инженерии хемилюминесцентный, убедитесь, что включать индуктором (1 мм ИПТГ) в средство роста растений побудить Люцифераза выражение.
6. метаболит профилирование корень экссудата из EcoFABs
- Пробоподготовка для LC/МС на основе анализа Метаболомика
- Положите microcentrifuge трубы с корня экссудаты, собранных в EcoFABs лиофилизатор и включите лиофилизатор для удаления воды из трубы.
- Добавить 300 мкл LC-MS класс метанола в каждую пробирку и sonicate на 30 мин.
Предупреждение: Носить СИЗ при работе с метанолом. - Трубы в центрифуги и центрифуги их на 3000 x g за 5 мин.
- Перевести супернатанта решения в новые microcentrifuge трубы и испарения метанола в вакуумной концентратор.
- Добавить 150 мкл рабочего раствора метанола с 1 мм LC-MS внутренних стандартов в каждую пробирку и инкубировать трубы в холодильнике 4 ° C для 12 h.
- Центрифуга трубы на 3000 x g 5 минут и перенесите супернатант в 0,22 мкм фильтр трубы.
- Центрифуга фильтр трубы и передачи фильтрованного решения в 2.0 мл флаконах LC/МС с 200 мкл вставок.
- Место флаконы внутри ранца LC/MS и загрузить стойки внутри авто сборники LC/MS.
- Анализ данных
- Получить доступ метаболит Атлас и пользовательские скрипты Python26 или использовать другое программное обеспечение анализа данных.
- Определить метаболитов, основанные на m /z значения, время удержания и составные фрагментации узоры с использованием библиотеки метаболит стандартов. 27
7. Масса спектроскопических изображений корней растений в EcoFABs (рис. 7)
Примечание: EcoFAB устройств, изготовленных из эластомера 5:1 база для отверждения агент смесь с пользовательских зажимы (рис. 7A) используются для корня тиснения на наноструктур инициатор масс-спектрометрия (NIMS) чипов,28,29,30 поскольку PDMS слои обратно склеиваемых поверхностей NIMS чипов.
- Стерилизуйте NIMS чип поверхности с УФ-излучения на 1 ч.
- Выбрать EcoFAB с растущее растение из инкубатора и поместите его в стерильных Худ.
- Откройте контейнер EcoFAB и удалить верхнюю крышку зажим.
- Поднимите PDMS слоя вместе с завода внутри и тщательно прикрепить PDMS слой с завода в микросхему НИМС (Рисунок 7BD, E).
Примечание: После корня коснется поверхности чипа NIMS, его не следует переносить. Это предотвращает «размазывание» корневого метаболитов. - Аккуратно надавите на корни через слой PDMS корни полностью контактной поверхности NIMS. Оставьте корни на поверхности NIMS за 20 мин.
- Поднимите PDMS слой, включая завод от NIMS чип, снова избегая пересекают NIMS поверхности корня. Вернуть завод зажим, при желании.
- Прикрепите NIMS чип на пользовательских MALDI пластину и загрузить пластину в MALDI спектрометр для массовой обработки изображений (рис. 7 c).
- Используйте программу OpenMSI для создания изображения NIMS корень метаболитов (рис. 7 d-G)31.
Representative Results
Каждая EcoFAB система включает в себя устройство EcoFAB и растение размера прозрачный пластиковый контейнер. Один EcoFAB устройство имеет завод водохранилище, камере роста корня, входного потока 1,6 мм и 1,6 мм для стандартных EcoFAB устройства (2D рисунок и Рисунок 3 H) 10 мм розетку или для всей патрубком EcoFAB устройства (Рисунок 2F и Рисунок 3I ). Водохранилища завода разработан в трапециевидную форму, которая имеет верхней открытия 6 мм и 3 мм нижней открытия, и эта конструкция уменьшает вероятность утечки потока во время впрыска жидкости и также обеспечивает достаточно места для роста растений. Корень рост палата принимает овальной формы с глубиной 2 мм для многих растений модель корневых систем, как показано на рисунке 2 c и E. Впускных и выпускных каналов стандартной EcoFAB устройство могут быть связаны с PTFE Шланги так питательных растворов может течь в камере роста корня без открытия контейнера EcoFAB. Широкий выход EcoFAB устройство значительно снижает сопротивление потока розетки и предпочтительно используется при выращивании растений с густой корневой системы или периодически собирать корень экссудаты, после сложных корневых систем являются производными от растений.
Литейных форм для изготовления PDMS слои EcoFAB устройств создаются в дизайн программного обеспечения, а затем 3D печатается в жесткой непрозрачные фотополимеры, как показано на рисунке 2 и на рисунке 3. Растения внутри EcoFABs можно непосредственно наблюдать с помощью микроскопа с помощью длительной работы расстояния, обеспечивая стерильных расти среды (рис. 8A, Дополнительный файл 1). EcoFAB устройства с растениями могут также помещается на разрешением микроскопа, который позволяет выше резолюции изображений растений микробных взаимодействий (Рисунок 8B, Дополнительный файл 2). Стерильность не поддерживается в этой среде, и поэтому с высоким разрешением изображений подходит только для конечной точки измерений.
EcoFABs предназначены для включения систематические исследования растений, таких как их морфологии, метаболические и микробных сообществ на их различных стадиях их жизненного цикла. Здесь EcoFABs были рассмотрены как общая платформа для изучения различных видов растений. Рисунок 8 c -E шоу 7 - дневных проростках Arabidopsis thaliana, особенно distachyonи заострённая просо растет в EcoFABs. Все три растения были найдены хорошо растут в EcoFAB для более чем одного месяца. Как нелигнифицированного, Arabidopsis thaliana и растения, особенно distachyon были найдены жить до стадии их воспроизводства в EcoFABs.
Реверсивные, уплотнительная система позволяет использовать твердых субстратов (например., почвы) в течение EcoFABs (шаг 2.2). Этот обратимо, герметизация подход позволяет загрузки твердых субстратов в камерах роста корня и также позволяет образец коллекции от конкретных регионов корень rhizospheres. На рисунке 8F -H шоу группа 14 - дневных особенно distachyon увеличение среднего гидропоники, а также песка и почвы, дополненная гидропонных среднего (песок) и воды (почвы). Слой тонкого твердого субстрата в камерах роста корня позволяет свету проникнуть через для микроскопических изображений корневых систем.
Морфология корня определяется как пространственной конфигурации и распределение корневой системы растений и был утвержден в качестве основных физиологии ответа на рост различных средах, таких как питательных веществ или воды, наличие32,33, 34. EcoFABs обеспечивают удобный подход изучения морфологии растений с течением времени или в условиях различных питательных веществ. Рисунок 9A-F показывают пример использования EcoFABs для отслеживания корневого морфологии distachyon особенно в первые три недели. Особенно distachyon саженец был переведен в EcoFAB устройство, и его корневой структуры был записан камерой внутри тепловизор гель BIO-RAD. Программа обработки изображений, например изображение J, python и matlab, может применяться для количественной оценки изменений морфологии корня с течением времени или в различных средних средах. Количественная оценка общей корневой области в течение трех недель показало постепенное увеличение на ранней стадии (< 1 неделя) следуют линейный рост тенденции к концу три недели, как показано на рисунке 9 g.
Основная мотивация для построения EcoFAB — расследовать завод микробных взаимодействий. Как описано в шаге 5.4, микроорганизмы передаются в камеры роста корня EcoFAB устройств через впускной канал. На рисунке 10 показано, EcoFAB, содержащие Pseudomonas simea (ранееfluorescens) WCS417 (WCS417), роста растений, содействие rhizobacteria с хемилюминесцентный этикетки, была добавлена в корневой системы растений с концентрацией 106 клеток на завод. WCS417 сигнал был обнаружен с томографа гель, который указал собственный пространственного распределения WCS417 микробы в камерах роста корня. В обоих МС жидкой среде с и без песок твердый субстрат WCS417 микробы колонизировали поверхности всей корневой системы с микробами, сосредоточены вокруг районов кончика корня, возможно из-за активных питательных производство советы корня (Рисунок каталогу & H)35. С другой стороны WCS417 микробы в почвенного субстрата накопленных вокруг регионе водохранилища завода вместо корня советы (Рисунок 10я). Как микробы были добавлены через канал выход, микробы также смогли переехать в почвенного субстрата, но сделал не накапливаются на корень, как отмечено в жидкой среде с или без песка. Это может означать, что почва достаточно источник питательных веществ, и микробы мигрировали в завод резервуар для условий оптимального дыхания.
Для изучения метаболит профилирование экссудата корня растений, а также метаболиты поглощения и освобождение от завода микробных взаимодействий, экссудата решения от камер роста корня была собрана на различных этапах роста растений в EcoFABs. Как описано в шаге 6, экссудата образцы затем извлекаются для анализа LC-MS. С помощью этого метода, был обнаружен целый ряд метаболитов излучал заводом и потребляются микробами, и смежных метаболит профилирование корень экссудата с и без колонизации микробов в настоящее время проводится расследование.
Рисунок 1: процесс EcoFAB. Растения проросшие на плите и передан стерилизовать EcoFAB, микробы могут быть добавлены. Обратимые выборки: корень экссудата можно отведать образы, и корень морфология могут быть визуализированы. Деструктивные выборки позволяет анализ микроба, корень и стрелять параметров в деталях.
Рисунок 2: компоненты 3D печатных форм для изготовления устройств EcoFAB. (A) верхней и наклонной виды литья кадра. (B) верхней и наклонной вид инструкции insert. (C) верхней и наклонной вид стандартного плесень базы. (E) верхней и наклонной просмотров широкий выход плесень базы. (D, F) Собрал пресс-формы для изготовления стандартных и широкий розетки устройства EcoFAB, соответственно. Овальный размеры являются 51 мм x 34 мм для малых EcoFAB плесени и 76 мм x 62 мм для больших EcoFAB плесени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Изготовление устройство EcoFAB. (A) заливки смеси эластомер базы и полимеризации агента в плесени. (B) Отопление плесень с смеси на 85 ° C в течение 4 ч. (C) удаление прессформы вставки. (D) разделение PDMS от литья кадра. (E) толкает плесень базы из литья кадра. (F) с помощью ножа отделить PDMS от плесени по краям. (G) пилинг PDMS слой медленно покинуть базу плесень. (H) Poking отверстия для впускных и выпускных каналов стандарта PDMS слоя. (I) Poking отверстие впускного канала слоя PDMS широкий выход. (J) PDMS слой (из эластомера 15:1 база для отверждения агент смесь) и микроскопа промыть и переданы в плазме очиститель для склеивания. (K) использование зажимы держаться микроскопа PDMS слой (из 5:1 эластомер базы для отверждения агент смесь). (L) нажав PDMS слой (из эластомера базы 30: 1 для отверждения агент смесь) непосредственно на слайд микроскопа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Дизайн пользовательских зажимы. (A) верхней и наклонной вид сверху зажать пластины. (B) верхней и наклонной просмотров снизу зажима плиты. (C) верхней и наклонной вид собранном зажим с четырьмя наборами шестигранной головкой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: Установка привело растут огни. (A) маркировка из мест 9 LED клипов в спираль вокруг EcoFAB контейнера. (B) светодиод клипы прилагается к контейнеру EcoFAB. (C) Threading LED Газа через эти клипы. (D) подключение светодиодные полосы к контроллеру, проводные с блоком питания 24В. (E) схема соединения проводов к контроллеру. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: передача саженцев в EcoFABs. () Особенно distachyon растения, выращенные на 2 дня на тарелке 0.5 мс. (B) заполнение корневой камеры среднего роста растений. (C) использование пинцет для осторожно вставьте корень в водохранилище завода. (D) герметизации контейнера EcoFAB своих лентой, после добавления 3 мл воды в нижней части контейнера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7: NIMS изображений растений корни в EcoFABs. (A особенно distachyon , растущих в стерильные EcoFAB. (B) крепления PDMS слой с завода в микросхему NIMS для 20 мин (C) использование медной ленты прикрепить NIMS чип на пользовательских MALDI пластину и загрузки его в Малди масс-спектрометр. (D-G) один 7 - дневных и один 20 - дневных особенно distachyon растений, используемых для визуализации NIMS (D, E) и соответствующие изображения НИМС (F, G). Преобладающим ионы были выделены в красный, зеленый и синий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 8: общего применения EcoFABs. (A) непосредственно захват рост корня особенно distachyon в EcoFAB с длительной работы установки расстояния Микроскоп. (B) непосредственно наблюдения корень микробных взаимодействий с высоким разрешением Микроскоп установки. (C-E) 7 - дневных проростках Arabidopsis thaliana (C), особенно distachyon (D) и (E) заострённая просо в гидропонных средний 0,5 мс, 14 - дневных (F-H) особенно distachyon , выращенных в 0,5 мс Гидропоника (F), песок (G) и почвы (H) субстрат, поставляемые с 0,5 мс среднего и воды, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 9: использование EcoFABs для изучения морфологии корня. (A-F) Развитие корня distachyon особенно растет в EcoFABs заполнены с среднего 0,5 мс в течение первых трех недель: (A) 2 дня, (B) 4 дня, (C) 7 дней, (D) 11 дней, (E) 14 дней, (F) 21 дней роста. (G) усредненной корень площадях были оценены ImageJ программного обеспечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 10: использование EcoFABs для изучения корня микробных взаимодействий. (A, B, C) Группа из 15 - дневных колонизировать особенно distachyon с WCS417 Pseudomonas fluorescens в различных формах медиа MS жидкий раствор, песка и почвы субстратов. (D, E, F) Яркие области фотографии их корневой системы. (G, H, I) Соответствующие хемилюминесцентный образы этих корневых систем после 14 дней совместного культивирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительный файл 1. Использование EcoFAB для захвата рост корня. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 2. Использование EcoFAB для захвата корень микробы взаимодействий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Discussion
Протоколы сообщили здесь для создания с помощью экосистемы изготовление EcoFABs предоставляет ресурсы сообщества для систематического завод биологии исследования в очень контролируемой лабораторных условиях. Достижения в 3D печати обеспечивают широко доступных технологий для строительства и итеративно доработки EcoFAB дизайна. Корневой камеры, представленные здесь оказалась хорошо подходит для изображений микроскопии и поддержания стерильности, позволяя контролируемым добавлением микробов расследовать завод микробных взаимодействий. EcoFAB платформа совместима с различными видами растений. Важно признать физиологические эффекты выращивания растений в пределах узких корневой камеры, таким образом, что потребуются дополнительные эксперименты для обобщения выводов для растений в природных условиях.
Использование стерильных палат и СИД растет свет позволяет исследование эффектов различных условиях освещения, включая волны, интенсивности и продолжительности, на рост растений и связанных с ними физиологические параметры параллельно. Реверсивные склеивание корневой камеры позволяют использование твердых субстратов, а также пространственно сбора твердых образцов для анализа биохимических и генетических. Приложения твердых субстратов, например почвы, песка и бусинки кварца, предлагают возможности использования EcoFABs для создания более экологически соответствующих лабораторных экосистем. Однако всех систем, представленных здесь использовать насыщенная жидкость (гидропонные культуры), которые не являются точным отражением большинство почв, и он будет иметь важное значение для дальнейшего уточнения этих конструкций для поддержания воздушные карманы в почве, таким образом, чтобы они лучше представляют естественных почв.
Использование простой камеры и микроскопы описан образ корневой системы морфология развития на обоих оптом на клеточном уровне. Это пригодность для мониторинга корень морфология изображений и количественной оценки, вероятно, будет полезным для понимания механизмов регулирования, завод физиологические и молекулярных сигналов, вызванных генотипической приспособления растений к условиям роста. Однако ограничение для изучения развития физиологических корень является текущее горизонтальное расположение устройства EcoFAB. В природных условиях корни gravitropic реакция приводит к преимущественно вертикальное развитие корневой системы. Таким образом горизонтальные системы, представленные здесь вероятно отличается в некоторых факторов от природной среды, и изготовление EcoFAB систем с вертикального размещения корневой камеры является желательной целью для будущих версий EcoFAB. Хотя текущий EcoFAB устройства расположены горизонтально, анализ корневых морфология параметров в различных условиях, или в ответ на микробы, возможно. Высокое разрешение изображений может применяться для захвата динамика колонизации корень одного изолятов или общин, предоставление информации, о которых завод частей колонизировали в различных питательных веществ достаточной и неудовлетворительных условий. Предполагается, что такие исследования обеспечит важный новый взгляд на как microbiomes завод собираются, и как эти динамики изменения с течением времени, например, как корни развиваться.
Microfluidic приборы позволяют изображений очень молодых растений, и обычно количество метаболитов собранные не является достаточным для анализа LCMS. Почвы-систем, таких как rhizotrons, позволяют изображений корень морфологии, трансформированные либо растения с хемилюминесцентный конструкции (Glo корень) или методы, основанные на ЯМР33,34. Экстракции метаболитов из этих систем являются много времени из-за большого количества образцов. EcoFABs являются сочетанием обоих: Изготовление похож на microfluidic приборы. EcoFABs были разработаны для простой и недорогой воспроизвести, но размер камеры может быть скорректирована выращивать растения с малыми или большими корневой системы, вплоть до стадии их репродуктивного. Одновременного наблюдения изменения морфологии корень и экссудацию корень возможны. Система является стерильной, позволяя контролируемой добавление определенных микробов.
EcoFABs предназначены для включения контролируемых введение и выборки микробов и метаболитов. В частности пробы из камер роста корня находятся должно быть достаточно для массового спектроскопических метаболит профилирования. Интеграции изображений масс-спектрометрия (например., НИМС техника, представленная здесь) обеспечивает неразрушающего подход изучения пространственных распределений метаболит корневых систем. Этот метод, вероятно, будет полезно в будущем стабильного изотопа трассировки экспериментов и картирования микробной локализации для конкретных метаболитов36. Хотя этот протокол была сосредоточена на одном изолятов, тот же дизайн конечно может использоваться для более сложных сообществ. Образец томов и биомассы в EcoFABs, вероятно, более чем достаточно для дальнейшей интеграции с технологиями секвенирования ДНК, который будет важным характеризующие и мониторинга микробных структуры и ген выражение.
В заключение, этот протокол подробности изготовления Лаборатория экосистем, предназначен для исследования растений микробных взаимодействий, с упором на простых и доступных методов, которые легко могут быть реализованы и продлил исследователями вокруг мир. Нынешние усилия направлены на демонстрацию воспроизводимость между лабораториями и интеграция системы контроля температуры, таким образом, что каждый EcoFAB будет независимо контролируемые света и температуры. Дальнейшее развитие системы будет интеграция автоматической выборки и заправки EcoFAB корень камер и разработка воспроизводимых протоколов для установления соответствующих завод microbiomes в пределах EcoFABs.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана лаборатории направлены исследования и развития (МЦРУ) программа Лоуренса Беркли национальной лаборатории, поддерживается управление науки, министерства энергетики США под контракт № ДЕ-AC02-05CH11231 и награду де-SC0014079 из США Департамента энергетики отделение науки в университете Беркли. Работа на молекулярных литейного было поддержано в США Департамента энергетики контракт № ДЕ AC02-05CH11231. Мы также благодарим Сьюзан м. Kosina, Кэтрин Louie, Бенджамин P. Боуэн и Бенджамин д. Коул в национальной лаборатории Лоуренса в Беркли за всю их помощь.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printed custom mold | LBNL | STL files available here www.eco-fab.org; The EcoFABs molds described here were printed by FATHOM: http://studiofathom.com | |
| Dow sylgard 184 silicone elastomer clear kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Air duster spray | VWR | 75780-350 | any compressed gas duster should work |
| 15 gauge blunt needle | VWR | 89166-240 | |
| 5 mL syringe with Luer-Lok Tip | VWR | BD309646 | |
| 3”x2” microscope glass slide | VWR | 48382-179 | |
| 1.75" x 2.56" x 3.56" EcoFAB box | Amazon | B005GAQ25Q | |
| 4” x 3 ¼” microscope glass slide | Ted Pella | 260231 | |
| 4.87" x 4.87" x 5.50" EcoFAB box | Amazon | B00P9QVOS2 | |
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| 3D printed custom clamp | LBNL | STL files available from Trent Northen's lab | |
| Sterile hood | AirClean Systems | AC600 Series PCR Workstations | |
| PTFE syringe tubing | Sigma-Aldrich | Z117315-1EA | |
| Ethanol | VWR | 89125-172 | |
| Bleach | |||
| Murashige and Skoog (MS) Macronutrient Salt Base | Phytotechnologies Laboratories | M502 | |
| Murashige and Skoog (MS) Micronutrient Salt Base | Phytotechnologies Laboratories | M554 | |
| Soil | Hummert International | Pro-Mix PGX | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | 71010-52-1 | |
| Arabidopsis thaliana | Lehle Seeds | WT-24 Col-4 Columbia wild type | |
| Brachypodium distachyon | LBNL | Standard Bd-21 line | Available from John Vogel's lab |
| Panicum virgatum | The Samuel Roberts Noble Foundation | Alamo switchgrass | |
| Micropore tape | VWR | 56222-182 | |
| LC-MS grade methanol | VWR | JT9830-3 | |
| Lyophilizer | LABCONCO | FreeZone 2.5 Plus | |
| SpeedVAC concentrator | Thermo Scientific | Savant™ SPD111 SpeedVac | |
| Ultrafree-MC GV Centrifugal Filter-0.22 µm | Millipore | UFC30GV00 | |
| Liquid chromotography system | Agilent | Agilent 1290 LC system | |
| Q Exactive mass spectrometer | Thermo Scientific | Q Exactive™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap MS | |
| NIMS chip and custom MALDI plate | LBNL | For detailed protocol see: doi:10.1038/nprot.2008.110 | |
| MALDI mass spectrometer | AB Sciex | TOF/TOF 5800 MALDI MS | |
| Nano-coated LED grow light strip | LED World Lighting | HH-SRB60F010-2835 | |
| Power supply | LED World Lighting | MD45W24VA, LV100-24N-UNV-J | |
| TC420 controller | Amazon | B0197U7R8Q | |
| Silicone LED clips | Amazon | B00N9X1GI0 | |
| Hot glue gun | Amazon | B006IY359K | |
| Female-to-bare LED connector cable | LED World Lighting | HH-F05 | |
| Female-to-male LED connector extension cable | LED World Lighting | HH-MF1 | |
| 20AWG 2-wire cable | LED World Lighting | 6102051TFT4 | |
| WAGO 221-415 Splicing Connector | LED World Lighting | 221-415 |
References
- Morrissey, J. P., Dow, J. M., Mark, G. L., O'Gara, F. Are microbes at the root of a solution to world food production. EMBO Rep. 5 (10), 922-926 (2004).
- Farrar, K., Bryant, D., Cope-Selby, N. Understanding and engineering beneficial plant-microbe interactions: plant growth promotion in energy crops. Plant Biotechnol J. 12 (9), 1193-1206 (2014).
- Singh, J. S., Abhilash, P. C., Gupta, V. K. Agriculturally Important Microbes in Sustainable Food Production. Trends Biotechnol. 34 (10), 773-775 (2016).
- Dubey, R. K., Tripathi, V., Dubey, P. K., Singh, H. B., Abhilash, P. C. Exploring rhizospheric interactions for agricultural sustainability: the need of integrative research on multi-trophic interactions. J Clean Prod. 115, 362-365 (2016).
- Hunter, P. Plant microbiomes and sustainable agriculture. EMBO Rep. 17 (12), 1696-1699 (2016).
- van der Heijden, M. G. A., Hartmann, M. Networking in the Plant Microbiome. PLoS Biol. 14 (2), e1002378 (2016).
- Vessey, J. K. Plant growth promoting rhizobacteria as biofertilizers. Plant Soil. 255 (2), 571-586 (2003).
- Yang, J., Kloepper, J. W., Ryu, C. -M. Rhizosphere bacteria help plants tolerate abiotic stress. Trends Plant Sci. 14 (1), 1-4 (2009).
- Reynolds, H. L., Packer, A., Bever, J. D., Clay, K. GRASSROOTS ECOLOGY: PLANT-MICROBE-SOIL INTERACTIONS AS DRIVERS OF PLANT COMMUNITY STRUCTURE AND DYNAMICS. Ecology. 84 (9), 2281-2291 (2003).
- Finkel, O. M., Castrillo, G., Herrera Paredes, S., Salas González, I., Dangl, J. L. Understanding and exploiting plant beneficial microbes. Curr Opin Plant Biol. 38, 155-163 (2017).
- Northen, T. R., Zhang, Z., Gao, J., Swenson, T., Yoshikuni, Y. Advancing Our Understanding of the Chemistry of Soil Microbiomes. National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. 2017. The Chemistry of Microbiomes: Proceedings of a Seminar Series. , The National Academies Press. Washington, DC. (2017).
- Busby, P. E., et al. Research priorities for harnessing plant microbiomes in sustainable agriculture. PLOS Biology. 15 (3), e2001793 (2017).
- Sanati Nezhad, A. Microfluidic platforms for plant cells studies. Lab Chip. 14 (17), 3262-3274 (2014).
- Oburger, E., et al. Evaluation of a novel tool for sampling root exudates from soil-grown plants compared to conventional techniques. Environ Exp Bot. 87, 235-247 (2013).
- Van Der Krift, T. A. J., Berendse, F. Root life spans of four grass species from habitats differing in nutrient availability. Funct Ecol. 16 (2), 198-203 (2002).
- Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. P Natl. Acad. Sci. USA. 114 (17), 4549-4554 (2017).
- Sanati Nezhad, A., Naghavi, M., Packirisamy, M., Bhat, R., Geitmann, A. Quantification of cellular penetrative forces using lab-on-a-chip technology and finite element modeling. P Natl. Acad. Sci. USA. 110 (20), 8093-8098 (2013).
- Jiang, H., Xu, Z., Aluru, M. R., Dong, L. Plant chip for high-throughput phenotyping of Arabidopsis. Lab Chip. 14 (7), 1281-1293 (2014).
- Parashar, A., Pandey, S. Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis. Appl. Phys. Lett. 98 (26), 263703 (2011).
- Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression. Nat Methods. 9 (11), 1101-1106 (2012).
- Grossmann, G., et al. The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science. Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).
- Aufrecht, J. A., Ryan, J. M., Hasim, S., Allison, D. P., Nebenführ, A., Doktycz, M. J., Retterer, S. T. Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform. J. Vis. Exp. (126), (2017).
- Garvin, D. F., et al. Development of Genetic and Genomic Research Resources for Brachypodium distachyon, a New Model System for Grass Crop Research. Crop Sci. 48 (Supplement_1), S69-S84 (2008).
- Lisensky, G. C., et al. Replication and Compression of Surface Structures with Polydimethylsiloxane Elastomer. J. Chem. Educ. 76 (4), 537 (1999).
- Friend, J., Yeo, L. Fabrication of microfluidic devices using polydimethylsiloxane. Biomicrofluidics. 4 (2), 026502 (2010).
- Yao, Y., et al. Analysis of Metabolomics Datasets with High-Performance Computing and Metabolite Atlases. Metabolites. 5 (3), 431-442 (2015).
- Sumner, L. W., et al. Proposed minimum reporting standards for chemical analysis Chemical Analysis Working Group (CAWG) Metabolomics Standards Initiative (MSI). Metabolomics. 3 (3), 211-221 (2007).
- Gao, J., de Raad, M., Bowen, B. P., Zuckermann, R. N., Northen, T. R. Application of Black Silicon for Nanostructure-Initiator Mass Spectrometry. Anal. Chem. 88 (3), 1625-1630 (2016).
- Gao, J., et al. Morphology-Driven Control of Metabolite Selectivity Using Nanostructure-Initiator Mass Spectrometry. Anal. Chem. 89 (12), 6521-6526 (2017).
- Woo, H. -K., Northen, T. R., Yanes, O., Siuzdak, G. Nanostructure-initiator mass spectrometry: a protocol for preparing and applying NIMS surfaces for high-sensitivity mass analysis. Nat. Protoc. 3 (8), 1341-1349 (2008).
- Rübel, O., et al. OpenMSI: A High-Performance Web-Based Platform for Mass Spectrometry Imaging. Anal. Chem. 85 (21), 10354-10361 (2013).
- López-Bucio, J., Cruz-Ramı́rez, A., Herrera-Estrella, L. The role of nutrient availability in regulating root architecture. Curr Opin Plant Biol. 6 (3), 280-287 (2003).
- Lynch, J. P. Steep, cheap and deep: an ideotype to optimize water and N acquisition by maize root systems. Ann. Bot. 112 (2), 347-357 (2013).
- Rellán-Álvarez, R., et al. GLO-Roots: an imaging platform enabling multidimensional characterization of soil-grown root systems. eLife. 4, e07597 (2015).
- Kamilova, F., Validov, S., Azarova, T., Mulders, I., Lugtenberg, B. Enrichment for enhanced competitive plant root tip colonizers selects for a new class of biocontrol bacteria. Environ. Microbiol. 7 (11), 1809-1817 (2005).
- Klitgaard, A., Nielsen, J. B., Frandsen, R. J. N., Andersen, M. R., Nielsen, K. F. Combining Stable Isotope Labeling and Molecular Networking for Biosynthetic Pathway Characterization. Anal. Chem. 87 (13), 6520-6526 (2015).
