Summary
توضح هذه المقالة بروتوكولات مفصلة لتلفيق النظام الإيكولوجي للأجهزة (اكوفابس) التي تمكن من دراسة النباتات والتفاعلات بين الميكروبات والنبات في الظروف المختبرية شديد.
Abstract
التفاعلات بين الميكروبات والنبات مفيدة توفر حلاً بيولوجية مستدامة مع القدرة على زيادة إنتاج الغذاء والطاقة الحيوية ذات المدخلات المنخفضة. فهم ميكانيكية أفضل لهذه التفاعلات المعقدة الميكروبات والنباتات ستكون حاسمة في تحسين الإنتاج النباتي كما جيدا كما المنفذ الأساسي الإيكولوجية دراسات التفاعلات بين النباتية-التربة-الميكروبات والتحقيق. هنا، يقدم وصفاً مفصلاً لتلفيق النظام الإيكولوجي، باستخدام تقنيات الطباعة 3D متاحة على نطاق واسع، لإنشاء مختبر مراقبة الموائل (اكوفابس) للدراسات الميكانيكية للتفاعلات بين الميكروبات والنبات داخل محددة البيئية شروط. ويرد حجمين من اكوفابس التي هي مناسبة للتحقيق في التفاعلات الميكروبية بمختلف الأنواع النباتية، بما في ذلك التمويل نبات، ديستاتشيون براتشيبوديوم، و دخن عصوي. تتيح هذه الأجهزة من خلال تدفق الخاضعة للتلاعب وأخذ عينات من ميكروبيوميس الجذر، الجذر الكيمياء، فضلا عن التصوير مورفولوجيا الجذر والتعريب الميكروبية. ويشمل هذا البروتوكول التفاصيل للحفاظ على ظروف معقمة داخل اكوفابس وتركيب نظم الخفيفة الصمام مستقلة على اكوفابس. طرق مفصلة لإضافة أشكال مختلفة من وسائل الإعلام، بما في ذلك التربة والرمال، ووسائط النمو السائلة بالإضافة إلى توصيف هذه النظم باستخدام التصوير ويتم وصف جميع. معا، هذه النظم تمكين التحقيق دينامية ومفصلة للنبات واتحادات الميكروبية النباتية بما في ذلك التلاعب بتكوين ميكروبيومي (بما في ذلك طفرات)، رصد نمو النبات، مورفولوجيا الجذر، وتكوين الإفرازات، و الميكروبية ومسلم تحت ظروف خاضعة للرقابة البيئية. ونحن نتوقع أن هذه البروتوكولات تفصيلاً سيكون بمثابة نقطة انطلاق هامة للباحثين الآخرين، من الناحية المثالية المساعدة في إنشاء نظم تجريبية موحدة للتحقيق في التفاعلات بين الميكروبات والنبات.
Introduction
تطبيق الميكروبات النباتية المفيدة في مجال الزراعة يوفر إمكانيات كبيرة زيادة إنتاج الوقود الحيوي لتوفير لتزايد سكان1،2،،من34والغذائي المستدام. قدرا كبيرا من العمل يدعم أهمية ميكروبيوميس النبات في امتصاص المغذيات النباتية، التسامح إلى الضغوط، والمقاومة للمرض5،6،،من78. ومع ذلك، من الصعب أن التحقيق في هذه الآليات من التفاعلات بين الميكروبات والنبات في مجال النظم الإيكولوجية بسبب تعقيد والمرتبطة إيريبرودوسيبيليتي وعدم القدرة على التحكم بدقة في تكوين ميكروبيومي وعلم الوراثة (على سبيل المثال-، باستخدام طفرات الميكروبية)4،،من910.
استراتيجية واحدة لبناء النظم الإيكولوجية نموذج مبسط لتمكين التحكم، التجارب المعملية منسوخة التحقيق التفاعلات بين الميكروبات والنبات لتوليد الأفكار التي يمكن اختبارها كذلك في الميدان10،، من11 12. ويبني هذا المفهوم على النهج التقليدي باستخدام النباتات التي تزرع في أواني مملوءة بالتربة أو على ألواح أجار داخل البيوت الزجاجية أو حاضنات13. على الرغم من أن هذه سيكون من المرجح أن تظل الأكثر استخداماً على النهج، وأنهم يفتقرون إلى القدرة على رصد أدق والتعامل مع بيئات نمو النبات. وتحقيقا لهذه الغايات، تمثل تحسنا كبيرا في القدرة على دراسة العمليات تحت الأرض14،15رهيزوبوكسيس ورهيزوترونس، ونشرت البروتوكولات الأولى لتحليل نواتج الأيض رهيزوسفيري في التربة16. في الآونة الأخيرة، أدت موائع جزيئية متقدمة الأجهزة13،17 مثل "رقاقة مصنع"18،19وروتاري20و21من روتشيب، لتمكين تحليل الإنتاجية العالية، وضعت كأدوات فعالة لمصنع phenotyping مع مقياس ميكرومتر القرار المكانية لرصد أولى مراحل نمو النبات نموذج صغير نبات التمويل المتوسط وتدفق السائل. في الآونة الأخيرة، وصفت منصة تصوير طبقتين يمكن تصوير الشعر الجذر من نبات التمويل في مرحلة الشتلة مع منصة موائع جزيئية22.
هنا، بروتوكولات مفصلة لبناء أجهزة مختبرية تحت التحكم (اكوفابس) المقدمة، لدراسة التفاعلات بين الميكروبات والنبات، وإظهار أنه يمكن استخدامها لدراسة مختلف النباتات بما في ذلك التمويل نبات، براتشيبوديوم ديستاتشيون23والشوفان البرية الهامة إيكولوجيا barbata آبينا، ومحاصيل الطاقة الحيوية دخن عصوي (switchgrass). اكوفاب هو منصة نمو النباتية عقيمة التي تضم اثنين من المكونات الأساسية: جهاز اكوفاب وحاوية شفافة معقمة الحجم المصنع. اكوفاب الجهاز وهي مصنوعة من بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS) تصنيع عملية تنطوي على الصب PDMS طبقات من العفن بلاستيك مطبوعة 3D والترابط طبقات PDMS على مجهر الشرائح باستخدام أساليب سبق وذكرت24،25 . إجراءات مفصلة لسير العمل اكوفاب، مثل تصنيع الجهاز والتعقيم وإنبات البذور، وزراعة الشتلات، ميكروب التطعيم/كوكولتيفيشن، إعداد عينة والتحليل، موصوفة في هذا البروتوكول (الشكل 1). يرد المزيد من التعديلات لسير العمل الأساسية، بما في ذلك تركيب الكمبيوتر التحكم الصمام تنمو الأضواء والاستفادة من ركائز متينة. الاستفادة من تقنيات التحقيق في مورفولوجيا الجذر التصوير يتغير، الاستعمار الميكروبي للجذور، وشرح لتصوير الطيفية كتلة من الإفرازات الجذرية. ونحن نتوقع أن تصميم بسيطة وغير مكلفة استناداً إلى مواد متاحة بسهولة، فضلا عن البروتوكولات التفصيلية المقدمة هنا، سوف تتحول منصة اكوفاب مورد مجتمع، توحيد الدراسات المختبرية للنبات-ميكروبيومي.
Protocol
تنبيه: يتضمن هذا البروتوكول استخدام المواد الكيميائية الخطرة وأشياء حادة، والأجهزة الكهربائية، والأجسام الساخنة وغيرها من الإخطار التي قد تؤدي إلى الإصابة. معدات الحماية الشخصية المناسبة (معدات الوقاية الشخصية، على سبيل المثال-، قفازات مقاومة كيميائيا، وسلامة النظارات، ومعطف مختبر، طويلة الملابس والأحذية الأصابع مغلقة، إلخ.) ينبغي أن ترتديه، وإجراءات السلامة المناسبة (التدريب على السلامة، واستخدام غطاء الدخان، إلخ.) وينبغي أن يتبع.
1-تصنيع الجهاز اكوفاب: صب طبقات PDMS (الشكل 2 و الشكل 3)
- إنشاء قوالب اكوفاب باستخدام تقنيات الطباعة ثلاثية الأبعاد (تصميم الملفات متوفرة. كل العفن ويشمل ثلاثة أجزاء: إطار صب وقاعدة العفن الموصى بها، وإدراج، كما هو مبين في الشكل 2. طباعة قاعدة العفن وإدراج من أصل فوتوبوليميرس كامد جامدة باستخدام طابعة بلاستيكية 3D. الاستفادة من الحد أدنى من 100 ميكرومتر القرار، وطباعة الإطار الصب مع ستايرين بوتادين أكريلونيتريل (ABS).
- مزيج من 40 مل من siloxane الاستومر قاعدة مع علاج عامل في حاوية ل 1 المتاح. اعتماداً على التجربة المطلوب (خطوات 2.1 و 2.2)، استخدام نسب مختلفة (v/v) الاستومر قاعدة/علاج عامل (5:1، 15:1، أو نسبة). المضي قدما بخطوات 1.3 إلى 1.8 لكل أنواع المخاليط.
تنبيه: ارتداء قفازات مقاومة كيميائيا وسلامة النظارات وغيرها بس. - وضع الحاوية في فراغ غرفة عن 30 دقيقة على الأقل لإزالة فقاعات الهواء من خليط الاستومر.
- صب الخليط في مجمع 3D مطبوعة بلاستيكية العفن (الشكل 3A) وإبقاء القالب على كتلة تدفئة في 85 درجة مئوية ح 4 (الشكل 3B).
تنبيه: ارتداء معدات الوقاية الشخصية لتجنب الحروق. - واسمحوا العفن يبرد لمدة 5 دقائق. ثم سحب الإدراج من العفن برفق (الشكل 3)، ثم قم بإدراج أداة سكين بين الإطار الصب و PDMS (خليط الاستومر طدت) للفصل بينهما (الشكل 2D) ببطء.
- اضغط العفن قاعدة مع PDMS حتى الخروج من الإطار الصب (3E الشكل). استخدام سكين أو أدوات أخرى لفصل طبقة PDMS بلطف من قاعدة العفن في الحواف (3F الشكل)، ومن ثم ببطء تقشر من سطح القالب (الشكل 3).
- إنشاء مدخل وقنوات مأخذ على طبقات PDMS بأحداث فتحات مم ~1.6 لمداخل ومخارج المنافذ مع 15 قياس الإبرة كليلة (الشكل 3 ح، وأنا).
ملاحظة: قد العفن القياسية منفذ مدخل ومخرج، بينما يحتاج العفن على نطاق منفذ فقط مدخل الميناء (الشكل 3 ح، وأنا). - استخدام مقص لتقليم حواف طبقات PDMS.
ملاحظة: ينبغي أن تكون طبقات PDMS قلص إيه سيفن سيكس مم × 51 مم المستطيلات للأجهزة اكوفاب الصغيرة وإيه وان زيرو تو مم × 83 مم مستطيلات كبيرة اكوفاب الأجهزة.
2-تصنيع الجهاز اكوفاب: إرفاق كيميائيا PDMS طبقات على الشرائح المجهر (رقم 3 و رقم 4)
- الربط بشكل دائم طبقات PDMS إلى شرائح المجهر
- شطف الجانب الترابط طبقة PDMS (مصنوعة من الاستومر 15:1 الأساس لعلاج خليط عامل) والمجهر سم × 5 7.6 الشريحة مع الميثانول وضربه ثم الجاف مع الهواء المضغوط أو بندقية نيتروجين نقي جداً.
تنبيه: الميثانول السامة. العمل في غطاء دخان وارتداء غطاء العين الواقية والقفازات وغيرها بيس. - ضع الشريحة المجهر وطبقة PDMS في بلازما أنظف مع الجانبين ارتباط بهم مواجهة (3J الشكل). إذا لم يتوفر بلازما أنظف، انتقل إلى الخطوة 2، 2.
- إغلاق الدائرة وصمام تنفيس الغاز البلازما أنظف، ودورة في فراغ، ومضخة أسفل الدائرة لمدة 1 دقيقة.
- تشغيل طاقة مولد البلازما، والتبديل على مستوى تردد الراديو (RF) إلى "مرحبا" لمدة 1 دقيقة.
- إيقاف تشغيل مضخة فراغ وطاقة البلازما، وتنفيس الدائرة إلى الغلاف الجوي.
- إخراج الشريحة المجهر وطبقة PDMS من غرفة البلازما، واضغط بسرعة على كافة الحواف الأربع طبقة PDMS على الشريحة مع الضغط حتى (الشكل 3 لتر). تأكد من أن منطقة بيضاوية مركز طبقة PDMS (قاعة الجذر) لا تمس الشريحة.
- وضع الجهاز اكوفاب مختومة على 120 درجة مئوية تدفئة كتلة لمدة 20 دقيقة لضمان زيادة الترابط الدائم بين طبقة PDMS والشريحة المجهر.
- ترك الجهاز يبرد للحد الأدنى 5 تقليم قبالة الحواف الزائدة طبقة PDMS بسكين.
- شطف الجانب الترابط طبقة PDMS (مصنوعة من الاستومر 15:1 الأساس لعلاج خليط عامل) والمجهر سم × 5 7.6 الشريحة مع الميثانول وضربه ثم الجاف مع الهواء المضغوط أو بندقية نيتروجين نقي جداً.
- ختم المادية عكسها طبقات PDMS إلى شرائح المجهر
- عكسها ختم تقنية تستخدم مجموعة من المشابك المخصصة (أما طباعتها بواسطة طابعة 3D بلاستيكية أو تشكيلة في المعادن، الرسومات تظهر في الشكل 4).
- ضع الشريحة المجهر إلى انقطاع في أسفل لوحة المشبك، ومحاذاة الطبقة PDMS (مصنوعة من قاعدة الاستومر 5:1 لعلاج خليط عامل) ثم فوق الشريحة.
- ضع لوحة المشبك العلوي فوق طبقة PDMS. تأمين لوحات العلوي والسفلي معا باستخدام أربعة مسامير غطاء عرافة، توجيه المسامير حيث أن المكسرات ومترابطة على من الجزء العلوي من المشبك.
- PDMS الانضمام مباشرة إلى شرائح المجهر
- ضع طبقة PDMS (مصنوعة من قاعدة الاستومر نسبة إلى علاج خليط عامل) على أعلى شريحة مجهر.
- اضغط على طبقة PDMS إلى الشريحة. يجب أن يلتزم طبقة PDMS لينة، لاصقة جداً (خمس) للشريحة إنشاء ختم لماء دون الربط الكيميائية الدائمة أو الصحافة المادية من المشبك (الشكل 3 لتر).
- عكسها ختم تقنية تستخدم مجموعة من المشابك المخصصة (أما طباعتها بواسطة طابعة 3D بلاستيكية أو تشكيلة في المعادن، الرسومات تظهر في الشكل 4).
3-اكوفابس التعقيم
- شطف الأجهزة اكوفاب بالماء عالي النقاوة.
- ضع جهاز اكوفاب واحد في حاوية اكوفاب، وإضافة الإيثانول 70% حتى هي مغمورة الجهاز. إغلاق غطاء حاوية وهزه برفق الرطب جميع الأسطح داخل مع الإيثانول. تأكد من أن يتم تعبئة الدائرة النمو الجذري للجهاز اكوفاب مع الإيثانول، مع عدد قليل جداً أو فقاعات الهواء لا.
- بعد 30 دقيقة حضانة في درجة حرارة الغرفة، من أجل إيقاف الإيثانول 70%، وكرر في الحضانة مع الإيثانول 100% لمدة 5 دقائق.
- استنزاف من الإيثانول، واحتضان اكوفاب معقمة ح 16 في غطاء الاندفاق الصفحي أن يجف تماما. إذا كان متوفراً، تعقيم النظام عن طريق تشغيل الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة داخل غطاء ح 1.
تنبيه: ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة عند العمل مع مصابيح الأشعة فوق البنفسجية. - تخزين اكوفابس معقمة في غطاء عقيمة أو أكياس يعقم لاستخدامها في المستقبل.
4-اكوفابس مع الصمام تنمو الأضواء (الشكل 5)
- إرفاق الصمام شرائط على حاويات اكوفاب
- وضع علامة خارج المواقع في حاوية اكوفاب 9 الصمام القصاصات. بدء تشغيل مع القصاصة الأولى 120 ملم أعلى من الجزء السفلي من الحاوية على طول حافة (الشكل 5A)، والمضي قدما لوضع علامة خارج مواقع القصاصة في دوامة حول الحاوية، مع كل مقطع التالي إسقاط 10 ملم. دوامة مقاطع 9 يسمح شريط LED 1 م للالتفاف حول الحاوية مرتين.
- الغراء الساخن علامة إحدى قصاصات LED لكل موقف بإضافة اللمسات اثنين من الغراء الساخن على الحاوية، تتماشى مع موقف الثقوب المتزايدة للقصاصات. اضغط الثقوب القصاصة إلى هذه اللمسات اثنين من الغراء، ثم أضف الدأب آخر من الغراء على رأس الثقوب. كرر الإجراء لكافة القصاصات حتى 9 مقاطع تشكل دوامة (الشكل 5 (ب)).
تنبيه: ارتداء القفازات وغيرها من معدات الوقاية الشخصية عند العمل بالغراء الساخن لتجنب الحروق. - مؤشر ترابط في قطاع الصمام عن طريق القصاصات في شكل دوامة، مع مصابيح Led التي تواجه في الحاوية. قطاع غزة أن دائرة مرتين (الشكل 5).
- توصيل LED شرائط للإمداد بالطاقة مع وحدة تحكم (يعرضالرقم 5 ويرد تشكيل غرفة اكوفاب مع أضواء مضيئة، وبرمجة وحدة التحكم في الخطوة 4، 3).
تحذير: خطر الصدمة الكهربائية: تأكد من إمدادات الطاقة غير موصول بالمأخذ عند توصيل الأسلاك.- قم بتوصيل المحطات الإيجابية والسلبية للإمداد بالطاقة للمحطات الطرفية "الإدخال: V +" و "الإدخال: V-" وحدة تحكم باستخدام 2-سلك كابل (الشكل 5E يعرض تخطيطي الرسم من إعداد وحدة تحكم).
- قم بتوصيل زمام المبادرة السلبية من نهاية كبل أنثى عارية عارية قناة واحدة "الإخراج" على وحدة تحكم.
ملاحظة: هناك خمس قنوات على وحدة التحكم التي تستخدم في هذا البروتوكول، حتى أنه يمكن دعم يصل إلى خمسة شرائط 1 م الصمام. - الاتصال يؤدي إيجابية جميع الكابلات ميثاقا الربط موصل (إذا كانت هناك حاجة إلى قنوات أكثر من واحد)، وثم ربط هذا الموصل إلى المحطة الطرفية "الإخراج V +" لوحدة تحكم.
- قم بتوصيل كل قطاع الصمام الإناث نهاية الكابلات، حيث كل الصمام لديه القناة الخاصة به التحكم. إذا رغبت في ذلك، استخدام كبلات الإناث إلى الذكور لتوسيع النطاق.
- برنامج وحدة تحكم لدورة ضوء المطلوب وفقا لإرشادات الشركة المصنعة،
5-زراعة النباتات في اكوفابس
- تعقيم البذور والإنبات
ملاحظة: تعقيم البذور وجميع الخطوات التالية مع الشتلات فلابد في ظروف معقمة. عملية التعقيم مناقشتها أدناه مناسبة لبذور نبات التمويل، barbata آبينا، ديستاتشيون براتشيبوديوم، و دخن عصوي. ثمام عصوي ينبغي تعليق البذور في حامض الكبريتيك 60% ح 1 قبل عملية التعقيم. ينصح بتحضير البذور 1-2 لكل جهاز اكوفاب، والنظر في معدل إنبات وتجانس الإنبات.- نقع البذور في الإيثانول 70% لمدة 2 دقيقة.
- إزالة الإيثانول مع ماصة، وشطف البذور مع الماء المعقم ثلاث مرات.
- ترك البذور في محلول التبييض 10% لمدة 5 دقائق.
- إزالة الحل التبييض، ودقة تغسل البذور باستخدام الماء المعقم ثلاث مرات.
- إضافة الماء المعقم للبذور، واحتضان أنبوب ميكروسينتريفوجي في ثلاجة 4 درجة مئوية لمدة 7 أيام.
- بالتساوي تنتشر البذور في المتوسط 0.5 Murashige & سكوغ (مللي ثانية) مع فيتاجيل 0.6% وختم اللوحات مع الشريط ميكروبوري.
- تنمو النباتات لطول جذر من حوالي 5 ملم لنقل إلى اكوفابس (الشكل 6A). للتجارب التي عرضت هنا، تطبيق نظام إضاءة مظلمة ح الضوء/8 ح 16 في دائرة نمو 22 درجة مئوية، واحتضان النباتات د 2-7 قبل نقلها إلى اكوفاب (2 أيام barbata افينا و ديستاتشيون براتشيبوديوم، 7 أيام لنبات التمويل و دخن عصوي).
- نقل الشتلات إلى اكوفابس مع السائلة المتوسطة (الشكل 6)
- استخدام المحاقن المعقمة أو ميكروبيبيتي، دافق الدائرة الجذر لجهاز اكوفاب مع الماء المعقم لثلاث مرات، وقم بملء قاعة الجذر مع متوسط النمو للفائدة، على سبيل المثال 0.5 MS المتوسطة (الشكل 6B، الخطوة 5.1.6).
- عناية إدراج شتلات مفردة في خزان مصنع الجهاز اكوفاب (الشكل 6).
ملاحظة: الجذر ينبغي أن يكون تماما مغمورة داخل قاعة الجذر، مع تبادل لإطلاق النار تخرج من الخزان. - أضف 3 مل الماء المعقم في الحاوية، تجنب الجهاز اكوفاب. وهذا زيادة نسبة الرطوبة وتقليل تبخر المتوسط من دائرة الجذر.
- إغلاق الحاوية، وختم الغطاء مع الشريط ميكروبوري (الشكل 6).
- ضع في اكوفاب إلى حاضنة نبات، أو الاستفادة من نظام الإضاءة اكوفاب في درجة حرارة التي تسيطر عليها بيئة مناسبة لنمو النبات كل منهما (الخطوة 4). لهذه الدراسة، تعيين الدائرة إلى 24 درجة مئوية.
- فحص دوري اكوفاب إعادة ملء وسائط النمو داخل قاعة النمو الجذري وإضافة المياه إلى الحاوية. تنفيذ كافة الخطوات في ظروف معقمة.
ملاحظة: للمراحل الأولى من نمو النبات، إعادة الملء لدائرة النمو الجذري ضروري كل 5 إلى 7 أيام. لمراحل نمو لاحقة، إعادة الملء ضروري كل 2 إلى 3 أيام. إذا رغبت في ذلك، استخدام المحاقن أو ماصة لتجميع حل الإفرازات الجذرية من الدوائر النمو الجذري في أنبوب ميكروسينتريفوجي وتخزينها في ثلاجة-80 درجة مئوية؛ أيضا، صورة مورفولوجيا الجذر مع تصوير هلام أو المجهر.
- نقل الشتلات إلى اكوفابس مع ركائز متينة
- استخدام الدوائر الجذر ملفقة مع خليط 5:1 من الاستومر قاعدة لعلاج وكيل في حالة استخدام مجموعة من المشابك المخصصة لنعلق على شريحة مجهر (الشكل 3 ك، الرقم 4)؛ أو اختر طبقة PDMS مصنوعة من خمس قاعدة لعلاج خليط الوكيل إذا كان الالتزام PDMS طبقات على الشرائح مباشرة (كما هو موضح في الخطوة 2، 2).
- تعقيم الدوائر اكوفاب، كما هو موضح في الخطوة 3.
- عناية إضافة تعقيم التربة/الرمال في قاعة الجذر واقلب طبقة PDMS وإضافة الركازة إلى دائرة الجذر. تفادي أي سقوط الجسيمات في المنطقة التي ستكون على اتصال الشريحة المجهر، حيث أن هذا سوف يقلل من التصاق.
- ضع الشريحة المجهر فوق طبقة PDMS، ثم اضغط جميع الحواف بشدة. الوجه الجهاز اكوفاب بعناية حيث أن التربة/الرمال لا يقع خارج الخزان فتح.
ملاحظة: لأجهزة اكوفاب بقاعدة 5:1 لعلاج خليط وكيل، استخدام المشبك مخصصة لتأمين الختم. - تدفق متوسط السائل أو الماء من خلال مدخل أو مخرج قناة الجهاز اكوفاب، ونقل شتلات خزان مصنع به، كما هو موضح في الخطوة 3، 3.
- إضافة الميكروبات في اكوفابس
- نقل مستعمرة الميكروبية إلى أنبوب حضانة مع 8 مل مرق رطل، وأنها تنمو إلى OD 0.5 (حوالي 12 ح).
- نقل الحل الثقافة في أنبوب الطرد مركزي 15 مل، والطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في ز x 3000 بيليه الميكروبات.
- إزالة المادة طافية، وإضافة 8 مل متوسطة النمو النباتية المستخدمة في الهدف اكوفاب. تعليق بيليه للميكروبات، والطرد المركزي الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في 3000 x ز.
- كرر الخطوة 5.4.3. مرتين لإزالة أي آثار ليبره المغذيات.
- إضافة متوسط نمو النبات إلى بيليه ميكروب غسلها حتى كثافته الضوئية هو 0.5 حوالي 600 نانومتر.
- إضافة 20 ميليلتر من الحل ميكروب في قاعة الجذر من خلال منفذ اكوفاب. سافر السلالات المستخدمة في هذا المنشور لزرع جذور في 2-3 أيام، وبدأت السطوح الجذرية المستعمر.
- لإجراء هندسة عكسية على تشيميلومينيسسينت، تأكد من تضمين محفز (1 مم إيبتج) في مصنع النمو المتوسط للحث على التعبير لوسيفراس.
6-المستقلب التنميط من الإفرازات الجذرية من اكوفابس
- إعداد نموذج ل LC/MS على أساس تحليل جميع
- وضع أنابيب ميكروسينتريفوجي مع الإفرازات الجذرية التي جمعت من اكوفابس في ليوفيليزير، وقم بتشغيل ليوفيليزير لإزالة جميع المياه من الأنابيب.
- إضافة 300 ميليلتر من الميثانول الصف LC-مرض التصلب العصبي المتعدد في كل أنبوب، و sonicate لمدة 30 دقيقة.
تنبيه: ارتداء معدات الوقاية الشخصية عند العمل مع الميثانول. - ضع الأنابيب في أجهزة الطرد مركزي، والطرد المركزي لهم في ز x 3000 لمدة 5 دقائق.
- نقل الحلول طافية في أنابيب ميكروسينتريفوجي جديدة، ويتبخر الميثانول في مركز فراغ.
- إضافة 150 ميليلتر من الميثانول مع 1 مم LC-مرض التصلب العصبي المتعدد المعايير الداخلية في كل أنبوب، واحتضان هذه الأنابيب في ثلاجة 4 درجات مئوية عن ح 12.
- الطرد المركزي هذه الأنابيب في ز 3000 x لمدة 5 دقائق، ونقل المادة طافية إلى 0.22 ميكرومتر مرشح أنابيب.
- الطرد المركزي أنابيب التصفية، ونقل الحلول التي تمت تصفيتها في قنينات LC/MS 2.0 مل مع 200 ميليلتر من إدراج.
- ضع قنينة داخل رف LC/MS، وتحميل الرف داخل السيارات LC/MS-أخذ العينات.
- تحليل البيانات
- الحصول على وصول "أطلس المستقلب" و البرامج النصية بيثون مخصصة26 أو استخدام برنامج تحليل البيانات الأخرى.
- تحديد نواتج الأيض استناداً إلى م/قيمz والوقت الاحتفاظ بأنماط تجزؤ المركب باستخدام مكتبة معايير المستقلب. 27
7-قداس الطيفية تصوير لجذور النباتات في اكوفابس (الشكل 7)
ملاحظة: تستخدم أجهزة اكوفاب مصنوعة من الاستومر 5:1 قاعدة لعلاج خليط عامل مع المشابك المخصصة (الشكل 7 أ) جذر الختم على البادئ nanostructure الكتلي (نيم) الرقائق،28،29،30 حيث يمكن أن تكون طبقات PDMS المستعبدين منصبه على أسطح رقائق نيم.
- تعقيم سطح رقاقة نيم مع الأشعة فوق البنفسجية ح 1.
- اختيار اكوفاب مع مصنع متزايد من الحاضنة، ووضعه في غطاء عقيمة.
- فتح حاوية اكوفاب، وإزالة الصفيحة العلوية من المشبك.
- أرفع طبقة PDMS جنبا إلى جنب مع المصنع داخل، ونولي عناية الطبقة PDMS مع المصنع على رقاقة نيم (الشكل 7، د، ه).
ملاحظة: عندما يمس الجذر على سطح رقاقة نيم، ينبغي أن لا يمكن تحريكه. وهذا ما يمنع "تلطيخ" من نواتج الأيض الجذر. - اضغط برفق أسفل على الجذور من خلال طبقة PDMS حتى الجذور اتصل بالكامل على سطح نيم. ترك الجذور على سطح نيم لمدة 20 دقيقة.
- رفع قبالة طبقة PDMS بما في ذلك المصنع من رقاقة نيم، مرة أخرى تجنب نقل الجذر عبر السطح نيم. عودة المصنع المشبك إذا رغبت في ذلك.
- إرفاق الرقاقة نيم على استخدام لوحة مخصصة وتحميل اللوحة استخدام مطياف لوسائل التصوير (الشكل 7).
- استخدام برنامج أوبينمسي لإنشاء صورة نيم الجذر من الأيض (الشكل 7-ز)31.
Representative Results
يتضمن كل نظام اكوفاب جهاز اكوفاب ومصنع للحجم حاوية بلاستيكية شفافة. واحد اكوفاب الجهاز يحتوي مستودع مصنع ودائرة نمو الجذري، مدخل تدفق 1.6 ملم ومنفذ 1.6 ملم لجهاز اكوفاب القياسي (الشكل 2D & ح الشكل 3) أو منفذ 10 مم للجهاز اكوفاب على نطاق منفذ (الشكل 2 واو & 3I الشكل ). صمم الخزان النبات في شكل شبه منحرف بافتتاح أعلى 6 مم وافتتاح السفلي 3 مم، وهذا التصميم يقلل من فرصة لتسرب التدفق خلال الحقن السائل، ويضمن أيضا مساحة كافية لنمو النباتات. قاعة النمو الجذري يعتمد على شكل بيضاوي مع 2 مم لتناسب نظم جذور كثير من النباتات النموذجية، كما هو مبين في الشكل 2 ، و هاء. يمكن توصيل قنوات مدخل ومخرج لجهاز اكوفاب القياسية مع أنابيب PTFE حتى حلول المغذيات يمكن أن تتدفق دائرة النمو الجذري دون فتح الحاوية اكوفاب. الجهاز اكوفاب على نطاق منفذ إلى حد كبير يقلل من مقاومة التدفق من المآخذ، ويفضل أن تستخدم عند زراعة النباتات مع نظم جذور سميكة أو دورية جمع الجذر نتحات بعد النظم الجذرية المعقدة المشتقة من النباتات.
يتم إنشاء قوالب الصب لاختلاق طبقات PDMS من الأجهزة اكوفاب في برامج تصميم ومن ثم طباعة 3D في فوتوبوليميرس كامد جامدة، كما هو مبين في الشكل 2 و الشكل 3. ويمكن ملاحظة النباتات داخل اكوفابس مباشرة مجهر باستخدام مسافة طويلة من عمل، ضمان تنمو تعقيم البيئة (الشكل 8 أ، ملف تكميلي 1). أيضا يمكن أن تناسب الأجهزة اكوفاب مع النباتات على مرحلة مجهر عالي الدقة، مما يتيح تصوير قرار أعلى من التفاعلات بين الميكروبات والنبات (الشكل 8B، ملف تكميلي 2). لا يتم الاحتفاظ العقم في هذه البيئة، وتصوير عالي الدقة ولذلك فقط مناسبة للقياسات نقطة النهاية.
اكوفابس مصممة لتمكين دراسات منهجية من النباتات، مثل علم التشكل، والايض، والمجتمعات الميكروبية مراحل مختلفة من النمو عبر دورة حياتها. وبحثت اكوفابس هنا، كقاعدة عامة لدراسة مجموعة متنوعة من أنواع النباتات. الشكل 8 وتظهر -E 7-القديمة يوم التمويل نبات، ديستاتشيون براتشيبوديوم، و دخن عصوي المتنامية في اكوفابس. تم العثور على كل ثلاثة مصانع تنمو جيدا في اكوفاب لأكثر من شهر. سواء ديكت و التمويل نبات ومونوكوت، تم العثور على ديستاتشيون براتشيبوديوم أن ترقى إلى مراحلها الاستنساخ في اكوفابس.
عكسها ختم نظام يسمح باستخدام ركائز متينة (على سبيل المثال-، التربة) داخل اكوفابس (الخطوة 2، 2). عكسها هذا الختم نهج يتيح تحميل ركائز متينة في دوائر النمو الجذري، ويمكن أيضا جمع العينات من مناطق محددة من رهيزوسفيريس الجذر. 8F الشكل ح- إظهار مجموعة من 14-يوم القديمة ديستاتشيون براتشيبوديوم ينمو في تربة المتوسطة، فضلا عن الرمال والتربة وتستكمل مع تربة المتوسطة (الرمال) والمياه (التربة). طبقة رقيقة من الركازة الصلبة في دوائر النمو الجذري يسمح للضوء لاختراق عن طريق لتصوير مجهرية من نظم الجذور.
مورفولوجيا الجذر يعرف التكوين المكاني وتوزيع نظام جذر النبات، وقد اعتمد كاستجابة فسيولوجية أساسية لبيئات النمو المختلفة، مثل المياه أو المواد الغذائية توفر32،33، 34. اكوفابس توفير نهج ملائمة دراسة شكلياء النبات مع مرور الوقت، أو في ظل ظروف المغذيات المختلفة. إظهار الرقم 9 ألف-و مثال على استخدام اكوفابس لتتبع جذور مورفولوجيس من ديستاتشيون براتشيبوديوم في الأسابيع الثلاثة الأولى. نقل شتلات ديستاتشيون براتشيبوديوم إلى الجهاز اكوفاب، وسجلت كاميرا داخل تصوير جل الأحيائي راد هيكلها الجذر. يمكن تطبيق برنامج معالجة الصور، مثل "ي الصورة" وبيثون matlab، كذلك قياس تغيرات مورفولوجيس الجذر مع مرور الوقت، أو في بيئات مختلفة متوسطة. التحديد الكمي للمجال الجذر الإجمالية على مدى ثلاثة أسابيع أظهرت زيادة تدريجية في مرحلة مبكرة (< 1 أسبوع) متبوعاً باتجاه نمو الطولي لنهاية مدة ثلاثة أسابيع، كما هو مبين في الشكل 9.
دافع أساسي لبناء اكوفاب دراسة التفاعلات بين الميكروبات والنبات. كما هو موضح في الخطوة 5، 4، يتم نقل الكائنات الدقيقة في الدوائر نمو الجذر من الأجهزة اكوفاب عن طريق مدخل القناة. يبين الشكل 10 ، اكوفاب التي تحتوي على WCS417 سيما Pseudomonas (سابقا، والمتألقة) (WCS417)، نمو نبات تشجيع رهيزوباكتيريا مع التسميات تشيميلومينيسسينت، تمت إضافة إلى نظم جذور النباتات مع تركيز 106 خلايا كل النباتات. تم الكشف عن إشارة WCS417 مع تصوير هلام، مما يدل توزيع المكاني متميزة للميكروبات WCS417 في دوائر النمو الجذري. في كل مرض التصلب العصبي المتعدد السائلة المتوسطة مع أو بدون الركيزة الصلبة الرمال، استعمرت الميكروبات WCS417 السطوح النظم الجذرية كاملة مع الميكروبات تتركز حول مجالات تلميح الجذر، ربما بسبب إنتاج المغذيات النشطة من تلميحات الجذر (الرقم 10 & H)35. من ناحية أخرى، تراكمت الميكروبات WCS417 في الركيزة التربة حول منطقة الخزان النبات بدلاً من تلميحات الجذر (الشكل 10أنا). كما تم إضافة الميكروبات من خلال قناة المآخذ، الميكروبات هي أيضا قادرة على التحرك في الركيزة التربة، ولكن لا تتراكم على الجذر، كما لاحظت في متوسطة السائل مع أو بدون الرمل. قد يشير هذا إلى أن التربة مصدر المواد الغذائية كافية، والميكروبات هاجروا إلى خزان المحطة لظروف التنفس الأمثل.
دراسة التنميط المستقلب نتحات جذر النبات، فضلا عن امتصاص المستقلب والإفراج عن التفاعلات بين الميكروبات والنبات، جمعت الحلول الإفرازات من الدوائر النمو الجذري عبر مختلف مراحل نمو النباتات في اكوفابس. كما هو موضح في الخطوة 6، ثم يتم استخراج عينات الإفرازات للتحليل LC-مرض التصلب العصبي المتعدد. باستخدام هذا الأسلوب، تم الكشف عن مجموعة من نواتج الأيض ناضح بالمصنّع، وتستهلك بالميكروبات، والتنميط المستقلب ذات الصلة من الإفرازات الجذرية مع أو بدون استعمار الميكروبات حاليا قيد التحقيق.
رقم 1: سير العمل "اكوفاب"- النباتات هي نامي في اللوحة، ونقلها إلى اكوفاب معقمة، يمكن إضافة الميكروبات. أخذ العينات غير تدميري: يمكن أخذ عينات الإفرازات الجذرية وتصويرها، ويمكن تصور مورفولوجيا الجذر. أخذ العينات المدمرة يسمح تحليل ميكروب والجذرية، ومعلمات تبادل لإطلاق النار بالتفصيل.
رقم 2: مكونات 3D طباعة قوالب لتصنيع جهاز اكوفاب- (أ) أعلى وآماله آراء الإطار الصب. (ب) أعلى وآماله وجهات النظر لإدراج. (ج) أعلى والآراء يميل قاعدة العفن القياسية. (ﻫ) أعلى وآماله آراء قاعدة العفن على نطاق منفذ. (D, F) قوالب مجمعة لاختلاق الأجهزة القياسية ومنفذا على مستوى اكوفاب، على التوالي. شكل بيضوي أبعاد هي 51 مم × 34 مم للعفن اكوفاب الصغيرة و 76 ملم × 62 ملم لكبير اكوفاب العفن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: تصنيع جهاز اكوفاب- (أ) صب خليط عامل أساسي وعلاج الاستومر إلى القالب. (ب) تدفئة العفن مع الخليط في 85 درجة مئوية ل 4 حاء (ج) إزالة الإدراج من العفن. (د) فصل في PDMS من الإطار الصب. (ه) دفع القالب الأساسي للخروج من الإطار الصب. (و) استخدام سكين لفصل في PDMS من العفن على امتداد الحواف. (ز) تقشير طبقة PDMS ببطء قبالة قاعدة العفن. (ح) ثقوب بوكينج لقنوات مدخل ومخرج طبقة PDMS القياسية. (ط) دس حفرة لمدخل قناة طبقة PDMS على نطاق منفذ. (ي) PDMS طبقة (مصنوعة من الاستومر 15:1 الأساس لعلاج خليط عامل) وشريحة مجهر تشطف، وحولت إلى بلازما أنظف للربط. (ك) استخدام المشابك التمسك PDMS الطبقة (مصنوعة من قاعدة الاستومر 5:1 لعلاج خليط عامل) في شريحة مجهر. (ل) ضغط الطبقة PDMS (مصنوعة من قاعدة الاستومر نسبة إلى علاج خليط عامل) مباشرة على شريحة مجهر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: تصميم المشابك المخصصة. (A) المشبك وجهات النظر الأعلى ومائلة من أعلى اللوحة. (ب) المشبك وجهات النظر أعلى ومائلا في قاع اللوحة. (ج) أعلى وآماله آراء المشبك تجميعها مع أربع مجموعات من عرافة كاب مسامير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: تركيب الصمام تنمو الأضواء. (A) وضع علامات على المواقع لمقاطع الصمام 9 في دوامة حول الحاوية اكوفاب. (ب) الصمام مقاطع تعلق على الحاوية اكوفاب. (ج) مؤشر الترابط قطاع الصمام عن طريق هذه القصاصات. (د) الاتصال بقطاع الصمام إلى وحدة تحكم سلكية مع إمدادات طاقة 24V. (ﻫ) تخطيطي الوصلات السلكية إلى المراقب المالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: نقل الشتلات إلى اكوفابس- (أ) محطات ديستاتشيون براتشيبوديوم نمت لمدة يومين على طبق 0.5 مللي ثانية. (ب) ملء قاعة الجذر مع متوسط نمو النبات. (ج) استخدام الملاقط عناية إدراج الجذر في الخزان النبات. (د) ختم الحاوية اكوفاب مع ميكروبوري الشريط، بعد إضافة 3 مل من الماء إلى الجزء السفلي من الحاوية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 7: تصوير نيم من النبات الجذور في اكوفابس- (أ) ديستاتشيون براتشيبوديوم ينمو في اكوفاب عقيمة. (ب) ربط طبقة PDMS مع المصنع على رقاقة نيم للشريط (ج) استخدام النحاس 20 دقيقة لإرفاق الرقاقة نيم على استخدام لوحة مخصصة، وتحميله إلى استخدام مطياف كتلة. (د-ز) 7-القديمة يوم واحد وواحد 20-اليوم ديستاتشيون براتشيبوديوم المحطة القديمة المستخدمة للتصوير نيم (د، ه) والصور نيم المقابلة (و، ز). وسلط الأيونات الغالبة في الأحمر، الأخضر، والأزرق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 8: التطبيقات العامة من اكوفابس- (أ) مباشرة التقاط نمو الجذر من ديستاتشيون براتشيبوديوم في اكوفاب مع إعداد مجهر مسافة طويلة من عمل. (ب) مباشرة مراقبة التفاعلات بين الميكروبات والجذر مع إعداد مجهر عالي الدقة. 7-اليوم القديم (ج-ه) التمويل نبات (ج)، ديستاتشيون براتشيبوديوم (د)، و دخن عصوي (ه) في 0.5 MS تربة المتوسطة، (وح) 14-يوم القديمة ديستاتشيون براتشيبوديوم نمت في المغذيات 0.5 مللي ثانية (و) وفي الرمال (ز) والتربة (ح) الركيزة التي زودت بالماء، والمتوسطة 0.5 مللي ثانية على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 9: استخدام اكوفابس لدراسة مورفولوجيا الجذر. (واو) تطوير الجذر ينمو ديستاتشيون براتشيبوديوم في اكوفابس مليئة بالمتوسطة 0.5 مللي ثانية خلال الأسابيع الثلاثة الأولى: (أ) 2 أيام، (ب) 4 أيام، (ج) 7 أيام، (د) 11 يوما، (ه) 14 يوما، (و) 21 يوما للنمو. (ز) وقدرت المساحات السطحية الجذر متوسط البرمجيات إيماجيج. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 10: استخدام اكوفابس لدراسة التفاعلات بين الميكروبات والجذرية- (أ، ب، ج) مجموعة مكونة من 15-قديمة اليوم استعمار ديستاتشيون براتشيبوديوم مع WCS417 المتألقة Pseudomonas في أشكال مختلفة من وسائل الإعلام--مرض التصلب العصبي المتعدد ركائز الحل والرمل والتربة السائلة. (د، ه، و) الصور الميدانية مشرق نظمها الجذرية. (ز، ح، أنا) الصور تشيميلومينيسسينت المقابلة لهذه النظم الجذرية بعد 14 يوما من زراعة المشارك. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
التكميلية الملف 1. استخدام اكوفاب لالتقاط نمو الجذر. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
التكميلية الملف 2. استخدام اكوفاب لالتقاط التفاعلات الجذرية-الميكروبات. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Discussion
ذكرت البروتوكولات هنا لاستخدام تلفيق النظام الإيكولوجي لإنشاء اكوفابس يوفر موارد المجتمع لمصنع منهجية دراسات البيولوجيا في الظروف المختبرية شديد. التقدم في مجال الطباعة ثلاثية الأبعاد توفر تكنولوجيات متاحة على نطاق واسع لبناء وتحسين شكل تكراري تصميمات اكوفاب. تم العثور على قاعة الجذر المقدمة هنا لتكون مناسبة تماما للتصوير المجهري، والحفاظ على العقم، مما يتيح إضافة الخاضعة للميكروبات للتحقيق في التفاعلات بين الميكروبات والنبات. منصة اكوفاب متوافق مع مختلف أنواع النباتات. من المهم أن ندرك الآثار الفسيولوجية لزراعة النباتات داخل الدائرة الضيقة الجذر مثل أنه سيطلب المزيد من التجارب تعميم النتائج للنباتات التي تنمو في البيئات الطبيعية.
استخدام الدوائر العقيمة والصمام ضوء النمو يمكن التحقيق في آثار ظروف الإضاءة المختلفة، بما في ذلك الطول الموجي وكثافة، والمدة، وعلى نمو النبات والمعلمات الفسيولوجية المرتبطة بالتوازي. عكسها ارتباط الجذر الدوائر تسمح باستخدام ركائز صلبة، وكذلك فيما يتعلق بجمع العينات الصلبة لتحليل البيوكيميائية والوراثية مكانياً. الطلبات المقدمة ركائز متينة، مثل التربة والرمل والكوارتز الخرز، توفر إمكانيات استخدام اكوفابس لبناء المختبرات ذات الصلة أكثر إيكولوجيا النظم الإيكولوجية. ومع ذلك، جميع النظم المعروضة هنا من استخدام سائل المشبعة (تربة الثقافات) التي ليست انعكاسا دقيقا لمعظم أنواع التربة، وأنه سيكون من المهم لزيادة صقل هذه التصاميم للحفاظ على جيوب الهواء داخل التربة بأنها تمثل أفضل التربة الطبيعية.
يرد وصف استخدام كاميرات بسيطة ومجاهر التنمية مورفولوجيا جذر النظام الصورة على كلا الجزء الأكبر للمستويات الخلوية. مدى ملاءمة هذا لتصوير مورفولوجيا الجذر الرصد والقياس الكمي سيكون على الأرجح مفيداً لفهم الآليات التنظيمية لمصنع الإشارات الجزيئية والفيزيولوجية الناجمة عن مصنع أدابتيونس أوضح أن ظروف النمو. القيد لدراسة التنمية الجذرية الفسيولوجية غير موضع الأفقي الحالي للجهاز اكوفاب. في البيئات الطبيعية، يؤدي رد جرافيتروبيك الجذور لتنمية رأسية غالباً من جذر النظام. وبالتالي، النظام الأفقي المعروضة هنا من المحتمل أن يختلف في بعض عوامل من بيئة طبيعية، وتصنيع أنظمة اكوفاب مع الموضع العمودي في دائرة الجذر هدف مرغوب فيه للإصدارات المستقبلية اكوفاب. على الرغم من أن يتم وضع أجهزة اكوفاب الحالية أفقياً، تحليل معلمات مورفولوجيا الجذر في ظروف مختلفة، أو استجابة للميكروبات، من الممكن. يمكن تطبيق التصوير بدقة عالية لالتقاط ديناميات الاستعمار الجذر يعزل واحد أو المجتمعات، وتوفير المعلومات حول المصنع الذي يتم استعمرت أجزاء في مختلف ظروف كافية ونقص المغذيات. ومن المتوقع أن توفر هذه الدراسات رؤى جديدة هامة في كيف يتم تجميعها بمصنّع ميكروبيوميس، وكيفية تغيير هذه الديناميات على مر الزمن، وعلى سبيل المثال كالجذور وضع.
تمكين أجهزة موائع جزيئية تصوير النباتات الصغار جداً، وعادة لا يكفي لتحليل لكمس كمية نواتج الأيض التي جمعت. الأنظمة المستندة إلى التربة، مثل رهيزوترونس، السماح تصوير مورفولوجيا الجذر عندما يتم تحويل أما النباتات مع بناء تشيميلومينيسسينت (Glo الجذر) أو مع الأساليب المستندة إلى الرنين المغناطيسي النووي33،34. المستقلب المستخرجة من هذه النظم مضيعة للوقت بسبب حجم كبير من العينات. اكوفابس مزيج من كليهما: التلفيق مشابه لأجهزة موائع جزيئية. اكوفابس صممت لتكون بسيطة وغير مكلفة لإنتاج، ولكن يمكن ضبط حجم الدائرة لزراعة النباتات مع نظم جذور صغيرة أو كبيرة، تصل إلى مراحلها الإنجابية. الملاحظات المتزامن للتغييرات مورفولوجيا الجذر، والجذر نتحه الممكنة. هذا النظام عقيم، تمكين التحكم بالإضافة للميكروبات المحددة.
اكوفابس مصممة لتمكين إدخال الخاضعة للمراقبة وأخذ العينات من الميكروبات ونواتج الأيض. على وجه التحديد، تم العثور على عينات جمعت من دوائر النمو الجذري كافياً للتنميط المستقلب الطيفية الجماعية. دمج تصوير الطيف الكتلي (مثلاً.، تقنية نيم المعروضة هنا) يوفر نهجاً غير مدمرة لدراسة المستقلب التوزيعات المكانية لنظم الجذور. هذا الأسلوب سيكون على الأرجح تجارب التتبع مفيدة النظائر المستقرة في المستقبل ورسم الخرائط التعريب الميكروبية لنواتج الأيض محددة36. في حين أن هذا البروتوكول قد ركز على عزل وحيد، يمكن استخدام نفس التصميم التأكيد للمجتمعات أكثر تعقيداً. حجم العينة والكتلة الحيوية داخل اكوفابس من المرجح أكثر من كافية لمواصلة إدماج التكنولوجيات تسلسل الحمض النووي، الذي سيكون من المهم أن تميز ورصد المجتمع الميكروبي الهيكل والجينات التعبير.
وفي الختام، تفاصيل هذا البروتوكول تلفيق مختبر النظم الإيكولوجية الرامية للتحقيق في التفاعلات بين الميكروبات والنبات، مع التركيز على أساليب بسيطة وسهلة المنال التي يمكن تنفيذها بسهولة ومدد من الباحثين في جميع أنحاء العالم. تهدف الجهود الحالية مما يدل على إمكانية تكرار نتائج بين مختبرات، وإدماج نظام التحكم في درجة الحرارة بكل اكوفاب وسوف تسيطر بشكل مستقل الضوء ودرجة الحرارة. سوف يكون مزيد من تقدم المنظومة التكامل الآلي أخذ العينات وإعادة الملء الدوائر الجذرية اكوفاب ووضع بروتوكولات استنساخه لإنشاء مصنع ذات الصلة ميكروبيوميس داخل اكوفابس.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذا العمل كان يدعمها برنامج "مختبر البحوث الموجهة" والتنمية (لدرد) من "مختبر لورنس بيركلي الوطني" يدعمه "مكتب العلم"، من "وزارة الطاقة الأميركية" تحت "رقم العقد" دي-AC02-05CH11231، وجائزة SC0014079 دي من "الإدارة الأمريكية للطاقة مكتب العلوم" "جامعة كاليفورنيا في بيركلي". وأيد العمل في "مسبك الجزيئية" تحت "إدارة الولايات المتحدة الطاقة العقد رقم" دي-AC02-05CH11231. ونشكر أيضا لوي كاثرين وبنيامين ص بوين، سوزان م. كوسينا وبنجامين ج. كول في "مختبر لورنس بيركلي الوطني" لكل ما قدموه من المساعدة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printed custom mold | LBNL | STL files available here www.eco-fab.org; The EcoFABs molds described here were printed by FATHOM: http://studiofathom.com | |
| Dow sylgard 184 silicone elastomer clear kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Air duster spray | VWR | 75780-350 | any compressed gas duster should work |
| 15 gauge blunt needle | VWR | 89166-240 | |
| 5 mL syringe with Luer-Lok Tip | VWR | BD309646 | |
| 3”x2” microscope glass slide | VWR | 48382-179 | |
| 1.75" x 2.56" x 3.56" EcoFAB box | Amazon | B005GAQ25Q | |
| 4” x 3 ¼” microscope glass slide | Ted Pella | 260231 | |
| 4.87" x 4.87" x 5.50" EcoFAB box | Amazon | B00P9QVOS2 | |
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| 3D printed custom clamp | LBNL | STL files available from Trent Northen's lab | |
| Sterile hood | AirClean Systems | AC600 Series PCR Workstations | |
| PTFE syringe tubing | Sigma-Aldrich | Z117315-1EA | |
| Ethanol | VWR | 89125-172 | |
| Bleach | |||
| Murashige and Skoog (MS) Macronutrient Salt Base | Phytotechnologies Laboratories | M502 | |
| Murashige and Skoog (MS) Micronutrient Salt Base | Phytotechnologies Laboratories | M554 | |
| Soil | Hummert International | Pro-Mix PGX | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | 71010-52-1 | |
| Arabidopsis thaliana | Lehle Seeds | WT-24 Col-4 Columbia wild type | |
| Brachypodium distachyon | LBNL | Standard Bd-21 line | Available from John Vogel's lab |
| Panicum virgatum | The Samuel Roberts Noble Foundation | Alamo switchgrass | |
| Micropore tape | VWR | 56222-182 | |
| LC-MS grade methanol | VWR | JT9830-3 | |
| Lyophilizer | LABCONCO | FreeZone 2.5 Plus | |
| SpeedVAC concentrator | Thermo Scientific | Savant™ SPD111 SpeedVac | |
| Ultrafree-MC GV Centrifugal Filter-0.22 µm | Millipore | UFC30GV00 | |
| Liquid chromotography system | Agilent | Agilent 1290 LC system | |
| Q Exactive mass spectrometer | Thermo Scientific | Q Exactive™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap MS | |
| NIMS chip and custom MALDI plate | LBNL | For detailed protocol see: doi:10.1038/nprot.2008.110 | |
| MALDI mass spectrometer | AB Sciex | TOF/TOF 5800 MALDI MS | |
| Nano-coated LED grow light strip | LED World Lighting | HH-SRB60F010-2835 | |
| Power supply | LED World Lighting | MD45W24VA, LV100-24N-UNV-J | |
| TC420 controller | Amazon | B0197U7R8Q | |
| Silicone LED clips | Amazon | B00N9X1GI0 | |
| Hot glue gun | Amazon | B006IY359K | |
| Female-to-bare LED connector cable | LED World Lighting | HH-F05 | |
| Female-to-male LED connector extension cable | LED World Lighting | HH-MF1 | |
| 20AWG 2-wire cable | LED World Lighting | 6102051TFT4 | |
| WAGO 221-415 Splicing Connector | LED World Lighting | 221-415 |
References
- Morrissey, J. P., Dow, J. M., Mark, G. L., O'Gara, F. Are microbes at the root of a solution to world food production. EMBO Rep. 5 (10), 922-926 (2004).
- Farrar, K., Bryant, D., Cope-Selby, N. Understanding and engineering beneficial plant-microbe interactions: plant growth promotion in energy crops. Plant Biotechnol J. 12 (9), 1193-1206 (2014).
- Singh, J. S., Abhilash, P. C., Gupta, V. K. Agriculturally Important Microbes in Sustainable Food Production. Trends Biotechnol. 34 (10), 773-775 (2016).
- Dubey, R. K., Tripathi, V., Dubey, P. K., Singh, H. B., Abhilash, P. C. Exploring rhizospheric interactions for agricultural sustainability: the need of integrative research on multi-trophic interactions. J Clean Prod. 115, 362-365 (2016).
- Hunter, P. Plant microbiomes and sustainable agriculture. EMBO Rep. 17 (12), 1696-1699 (2016).
- van der Heijden, M. G. A., Hartmann, M. Networking in the Plant Microbiome. PLoS Biol. 14 (2), e1002378 (2016).
- Vessey, J. K. Plant growth promoting rhizobacteria as biofertilizers. Plant Soil. 255 (2), 571-586 (2003).
- Yang, J., Kloepper, J. W., Ryu, C. -M. Rhizosphere bacteria help plants tolerate abiotic stress. Trends Plant Sci. 14 (1), 1-4 (2009).
- Reynolds, H. L., Packer, A., Bever, J. D., Clay, K. GRASSROOTS ECOLOGY: PLANT-MICROBE-SOIL INTERACTIONS AS DRIVERS OF PLANT COMMUNITY STRUCTURE AND DYNAMICS. Ecology. 84 (9), 2281-2291 (2003).
- Finkel, O. M., Castrillo, G., Herrera Paredes, S., Salas González, I., Dangl, J. L. Understanding and exploiting plant beneficial microbes. Curr Opin Plant Biol. 38, 155-163 (2017).
- Northen, T. R., Zhang, Z., Gao, J., Swenson, T., Yoshikuni, Y. Advancing Our Understanding of the Chemistry of Soil Microbiomes. National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. 2017. The Chemistry of Microbiomes: Proceedings of a Seminar Series. , The National Academies Press. Washington, DC. (2017).
- Busby, P. E., et al. Research priorities for harnessing plant microbiomes in sustainable agriculture. PLOS Biology. 15 (3), e2001793 (2017).
- Sanati Nezhad, A. Microfluidic platforms for plant cells studies. Lab Chip. 14 (17), 3262-3274 (2014).
- Oburger, E., et al. Evaluation of a novel tool for sampling root exudates from soil-grown plants compared to conventional techniques. Environ Exp Bot. 87, 235-247 (2013).
- Van Der Krift, T. A. J., Berendse, F. Root life spans of four grass species from habitats differing in nutrient availability. Funct Ecol. 16 (2), 198-203 (2002).
- Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. P Natl. Acad. Sci. USA. 114 (17), 4549-4554 (2017).
- Sanati Nezhad, A., Naghavi, M., Packirisamy, M., Bhat, R., Geitmann, A. Quantification of cellular penetrative forces using lab-on-a-chip technology and finite element modeling. P Natl. Acad. Sci. USA. 110 (20), 8093-8098 (2013).
- Jiang, H., Xu, Z., Aluru, M. R., Dong, L. Plant chip for high-throughput phenotyping of Arabidopsis. Lab Chip. 14 (7), 1281-1293 (2014).
- Parashar, A., Pandey, S. Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis. Appl. Phys. Lett. 98 (26), 263703 (2011).
- Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression. Nat Methods. 9 (11), 1101-1106 (2012).
- Grossmann, G., et al. The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science. Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).
- Aufrecht, J. A., Ryan, J. M., Hasim, S., Allison, D. P., Nebenführ, A., Doktycz, M. J., Retterer, S. T. Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform. J. Vis. Exp. (126), (2017).
- Garvin, D. F., et al. Development of Genetic and Genomic Research Resources for Brachypodium distachyon, a New Model System for Grass Crop Research. Crop Sci. 48 (Supplement_1), S69-S84 (2008).
- Lisensky, G. C., et al. Replication and Compression of Surface Structures with Polydimethylsiloxane Elastomer. J. Chem. Educ. 76 (4), 537 (1999).
- Friend, J., Yeo, L. Fabrication of microfluidic devices using polydimethylsiloxane. Biomicrofluidics. 4 (2), 026502 (2010).
- Yao, Y., et al. Analysis of Metabolomics Datasets with High-Performance Computing and Metabolite Atlases. Metabolites. 5 (3), 431-442 (2015).
- Sumner, L. W., et al. Proposed minimum reporting standards for chemical analysis Chemical Analysis Working Group (CAWG) Metabolomics Standards Initiative (MSI). Metabolomics. 3 (3), 211-221 (2007).
- Gao, J., de Raad, M., Bowen, B. P., Zuckermann, R. N., Northen, T. R. Application of Black Silicon for Nanostructure-Initiator Mass Spectrometry. Anal. Chem. 88 (3), 1625-1630 (2016).
- Gao, J., et al. Morphology-Driven Control of Metabolite Selectivity Using Nanostructure-Initiator Mass Spectrometry. Anal. Chem. 89 (12), 6521-6526 (2017).
- Woo, H. -K., Northen, T. R., Yanes, O., Siuzdak, G. Nanostructure-initiator mass spectrometry: a protocol for preparing and applying NIMS surfaces for high-sensitivity mass analysis. Nat. Protoc. 3 (8), 1341-1349 (2008).
- Rübel, O., et al. OpenMSI: A High-Performance Web-Based Platform for Mass Spectrometry Imaging. Anal. Chem. 85 (21), 10354-10361 (2013).
- López-Bucio, J., Cruz-Ramı́rez, A., Herrera-Estrella, L. The role of nutrient availability in regulating root architecture. Curr Opin Plant Biol. 6 (3), 280-287 (2003).
- Lynch, J. P. Steep, cheap and deep: an ideotype to optimize water and N acquisition by maize root systems. Ann. Bot. 112 (2), 347-357 (2013).
- Rellán-Álvarez, R., et al. GLO-Roots: an imaging platform enabling multidimensional characterization of soil-grown root systems. eLife. 4, e07597 (2015).
- Kamilova, F., Validov, S., Azarova, T., Mulders, I., Lugtenberg, B. Enrichment for enhanced competitive plant root tip colonizers selects for a new class of biocontrol bacteria. Environ. Microbiol. 7 (11), 1809-1817 (2005).
- Klitgaard, A., Nielsen, J. B., Frandsen, R. J. N., Andersen, M. R., Nielsen, K. F. Combining Stable Isotope Labeling and Molecular Networking for Biosynthetic Pathway Characterization. Anal. Chem. 87 (13), 6520-6526 (2015).
