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पारिस्थितिकी तंत्र निर्माण (EcoFAB) संयंत्र-सूक्ष्म जीव बातचीत का अध्ययन करने के लिए डिज़ाइन प्रयोगशाला पारिस्थितिकी प्रणालियों के निर्माण के लिए प्रोटोकॉल

Published: April 10, 2018 doi: 10.3791/57170
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 2, 2, 4, 1,2
1Environmental Genomics and Systems Biology Division, Lawrence Berkeley National Laboratory, 2Joint Genome Institute, Department of Energy, 3Joint BioEnergy Institute, 4Department of Environmental Science Policy and Management, University of California

Summary

यह आलेख वर्णन करता है कि उपकरणों (EcoFABs) के पारिस्थितिकी तंत्र निर्माण के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल है कि पौधों और संयंत्र-सूक्ष्म जीव बातचीत के उच्च नियंत्रित प्रयोगशाला स्थितियों में के अध्ययन को सक्षम करें ।

Abstract

लाभकारी संयंत्र-सूक्ष्म जीव बातचीत की क्षमता कम इनपुट खाद्य और जैव ऊर्जा के उत्पादन को बढ़ावा देने के साथ एक स्थाई जैविक समाधान प्रदान करते हैं । इन जटिल संयंत्र के एक बेहतर यंत्रवत समझ-सूक्ष्म जीव बातचीत संयंत्र उत्पादन में सुधार के साथ ही बुनियादी पारिस्थितिकी संयंत्र की जांच अध्ययन-मिट्टी-सूक्ष्म जीव बातचीत करने के लिए महत्वपूर्ण हो जाएगा । यहां, पारिस्थितिकी तंत्र निर्माण के लिए एक विस्तृत वर्णन प्रस्तुत किया है, व्यापक रूप से उपलब्ध 3 डी मुद्रण प्रौद्योगिकियों का उपयोग कर, संयंत्र के यंत्रवत अध्ययन के लिए नियंत्रित प्रयोगशाला निवास (EcoFABs) बनाने के लिए-विशिष्ट पर्यावरण के भीतर सूक्ष्म जीव बातचीत शर्तों. EcoFABs के दो आकारों में वर्णित है कि विभिंन प्रजातियों के पौधे के साथ माइक्रोबियल बातचीत की जांच के लिए अनुकूल है, Arabidopsis थालियाना, Brachypodium distachyon, और Panicum virgatumसहित । इन उपकरणों के माध्यम से प्रवाह नियंत्रित हेरफेर और रूट microbiomes, रूट रसायन विज्ञान के साथ ही रूट आकृति विज्ञान और माइक्रोबियल स्थानीयकरण की इमेजिंग के नमूने के लिए अनुमति देते हैं । इस प्रोटोकॉल EcoFABs अंदर बाँझ शर्तों को बनाए रखने और EcoFABs पर स्वतंत्र एलईडी लाइट सिस्टम बढ़ते के लिए विवरण शामिल हैं । मिट्टी, रेत सहित मीडिया के विभिंन रूपों के अलावा के लिए विस्तृत तरीकों, और तरल विकास इमेजिंग और metabolomics का उपयोग कर इन प्रणालियों के लक्षण वर्णन करने के लिए मिलकर मीडिया में वर्णित हैं । एक साथ, इन प्रणालियों microbiome संरचना (म्यूटेंट सहित) के हेरफेर सहित संयंत्र और संयंत्र-माइक्रोबियल consortia की गतिशील और विस्तृत जांच सक्षम, संयंत्र विकास की निगरानी, रूट आकृति विज्ञान, रिसाव संरचना, और नियंत्रित पर्यावरणीय परिस्थितियों में माइक्रोबियल स्थानीयकरण । हमें आशा है कि इन विस्तृत प्रोटोकॉल अंय शोधकर्ताओं के लिए एक महत्वपूर्ण प्रारंभिक बिंदु के रूप में सेवा करेंगे, आदर्श संयंत्र-सूक्ष्म जीव बातचीत की जांच के लिए मानकीकृत प्रयोगात्मक प्रणाली बनाने में मदद ।

Introduction

कृषि में लाभकारी संयंत्र रोगाणुओं के आवेदन टिकाऊ खाद्य और जैव ईंधन उत्पादन बढ़ाने के लिए एक बढ़ती हुई जनसंख्या1,2,3,4के लिए प्रदान करने के लिए महान क्षमता प्रदान करता है । काम की एक महत्वपूर्ण राशि संयंत्र पोषक तत्व में microbiomes के महत्व का समर्थन करता है, तनाव को सहिष्णुता, और रोग के लिए प्रतिरोध5,6,7,8। हालांकि, यह संयंत्र के इन तंत्र-जटिलता और जुड़े irreproducibility और ठीक microbiome संरचना और आनुवंशिकी नियंत्रण करने के लिए अक्षमता के कारण क्षेत्र पारिस्थितिकी प्रणालियों में सूक्ष्म जीव बातचीत की जांच करने के लिए मुश्किल है (उदा, का उपयोग कर माइक्रोबियल म्यूटेंट)4,9,10।

एक रणनीति को सरलीकृत मॉडल पारिस्थितिकी प्रणालियों के निर्माण के लिए नियंत्रित, दोहराया प्रयोगशाला प्रयोगों संयंत्र-सूक्ष्म जीव बातचीत की जांच के लिए अंतर्दृष्टि है कि आगे के क्षेत्र में परीक्षण किया जा सकता है उत्पंन 10, 11, 12. इस अवधारणा को मिट्टी से भरे बर्तन में या ग्रीनहाउस या मशीनी13के भीतर स्लैब पर हो पौधों का उपयोग पारंपरिक दृष्टिकोण पर बनाता है । हालांकि इन की संभावना सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया दृष्टिकोण रहेगा, वे ठीक से निगरानी और संयंत्र विकास के वातावरण में हेरफेर करने की क्षमता की कमी होगी । इन समाप्त करने के लिए, rhizoboxes और rhizotrons नीचे अध्ययन करने की क्षमता में एक बड़े सुधार का प्रतिनिधित्व करते हैं-जमीन प्रक्रियाओं14,15, और, पहले प्रोटोकॉल16मिट्टी में rhizosphere चयापचयों का विश्लेषण करने के लिए प्रकाशित किया गया । हाल ही में, उच्च प्रवाह विश्लेषण को सक्षम करने के लिए, उंनत microfluidic उपकरणों13,17 जैसे संयंत्र चिप18,19, RootArray20, और RootChip21, गया है तरल प्रवाह माध्यम में छोटे मॉडल संयंत्र Arabidopsis थालियाना के प्रारंभिक विकास चरणों पर नजर रखने के लिए माइक्रोमीटर पैमाने स्थानिक संकल्प के साथ संयंत्र phenotyping के लिए कुशल उपकरण के रूप में विकसित की है । हाल ही में, एक दो परत इमेजिंग मंच है कि एक microfluidic मंच22के साथ अंकुर चरण में Arabidopsis थालियाना के रूट हेयर इमेजिंग सक्षम बनाता है वर्णन किया गया था ।

यहां, नियंत्रित प्रयोगशाला उपकरणों के निर्माण के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल (EcoFABs), संयंत्र सूक्ष्म जीव बातचीत का अध्ययन करने के लिए प्रदान की जाती है और पता चलता है कि वे Arabidopsisथालियाना सहित विविध पौधों का अध्ययन किया जा सकता है, Brachypodium distachyon23, पारिस्थितिकी रूप से महत्वपूर्ण जंगली जई Avena बरबटा, और के रूप में Panicum virgatum (switchgrass) । EcoFAB डिवाइस और बाँझ संयंत्र आकार पारदर्शी कंटेनर: EcoFAB एक बाँझ संयंत्र विकास मंच है कि दो प्राथमिक घटक भी शामिल है. EcoFAB डिवाइस एक polydimethylsiloxane (PDMS) विनिर्माण प्रक्रिया है कि एक 3 डी मुद्रित प्लास्टिक मोल्ड से PDMS परतों कास्टिंग शामिल है और सूक्ष्मदर्शी स्लाइड पर PDMS परतों संबंध का उपयोग पहले तरीकों की सूचना दी24,25 . EcoFAB कार्यप्रवाह की विस्तृत प्रक्रियाओं, जैसे डिवाइस निर्माण, नसबंदी, बीज अंकुरण, अंकुर प्रत्यारोपण, सूक्ष्म जीव टीका/cocultivation, नमूना तैयारी, और विश्लेषण, इस प्रोटोकॉल में वर्णित हैं (चित्र1) । इसके अलावा बुनियादी कार्यप्रवाह के संशोधनों का वर्णन किया गया है, सहित कंप्यूटर की स्थापना नियंत्रित एलईडी रोशनी बढ़ती है और ठोस सब्सट्रेट के उपयोग । इमेजिंग तकनीक का उपयोग रूट आकृति विज्ञान परिवर्तन की जांच करने के लिए, जड़ों के माइक्रोबियल औपनिवेशीकरण, और जड़ exudates के मास स्पेक्ट्रोस्कोपी इमेजिंग वर्णित हैं । हमें आशा है कि सरल, सस्ती आसानी से उपलब्ध सामग्री पर आधारित डिजाइन, साथ ही साथ विस्तृत प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत, एक समुदाय संसाधन में EcoFAB मंच बंद हो जाएगा, प्रयोगशाला संयंत्र-microbiome अध्ययन मानकीकरण ।

Protocol

चेतावनी: इस प्रोटोकॉल खतरनाक रसायनों, तेज वस्तुओं, बिजली के उपकरणों, गर्म वस्तुओं, और चोट में परिणाम हो सकता है कि अन्य खतरों का उपयोग भी शामिल है । उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई, उदा, रासायनिक प्रतिरोधी दस्ताने, सुरक्षा चश्मा, लैब कोट, लंबे कपड़े, बंद पंजे जूते, आदि) पहना जाना चाहिए, और उपयुक्त सुरक्षा प्रक्रियाओं (सुरक्षा प्रशिक्षण, एक धुएं के हुड का उपयोग, आदि) पालन किया जाना चाहिए ।

1. EcoFAB डिवाइस निर्माण: कास्टिंग PDMS परतें (चित्रा 2 और चित्रा 3)

  1. 3 डी मुद्रण तकनीकों का उपयोग कर EcoFAB मोल्ड का निर्माण (डिजाइन फ़ाइलें पर उपलब्ध हैं । प्रत्येक मोल्ड में तीन भाग शामिल होते हैं: एक कास्टिंग फ़्रेम, एक विशेष रुप से प्रदर्शित मोल्ड बेस, और एक संमिलित, जैसा चित्र 2में दिखाया गया है । प्रिंट मोल्ड आधार और कठोर अपारदर्शी photopolymers के बाहर एक 3 डी प्लास्टिक प्रिंटर का उपयोग कर डालें । 100 µm संकल्प की एक ंयूनतम उपयोग, और acrylonitrile ब्यूटाडाइन styrene (ABS) के साथ कास्टिंग फ्रेम प्रिंट ।
  2. एक डिस्पोजेबल 1 एल कंटेनर में इलाज एजेंट के साथ siloxane elastomer बेस के 40 मिलीलीटर मिश्रण । वांछित प्रयोग (चरण 2.1 और 2.2) के आधार पर, elastomer बेस/इलाज एजेंट (5:1, 15:1 या 30:1) के विभिन्न अनुपात (v/v) का उपयोग करें । के लिए कदम आगे बढ़ना 1.3 मिश्रण के सभी प्रकार के लिए 1.8 ।
    चेतावनी: रासायनिक प्रतिरोधी दस्ताने, सुरक्षा चश्मा पहनते हैं, और अंय PPEs ।
  3. elastomer मिश्रण से हवा के बुलबुले को दूर करने के लिए एक वैक्यूम चैंबर में कम से 30 मिनट के लिए कंटेनर प्लेस ।
  4. इकट्ठे 3 डी मुद्रित प्लास्टिक मोल्ड (चित्रा 3ए) में मिश्रण डालो और 4 घंटे के लिए 85 डिग्री सेल्सियस पर एक हीटिंग ब्लॉक पर मोल्ड रखने के लिए (चित्र बी) ।
    सावधानी: जलने से बचने के लिए पीपीई पहनें ।
  5. मोल्ड 5 मिनट के लिए नीचे ठंडा करते हैं । फिर मोल्ड से डालने से धीरे से बाहर खींचो (आंकड़ा 3सी), और फिर धीरे कास्टिंग फ्रेम और PDMS (जम elastomer मिश्रण) के बीच एक उपयोगिता चाकू डालने के लिए उंहें अलग (चित्रा 2d) ।
  6. PDMS के साथ मोल्ड बेस को कास्टिंग फ़्रेम (चित्र 3E) से बाहर दबाएं । एक चाकू या अंय उपकरणों का प्रयोग करें धीरे किनारों पर मोल्ड आधार से PDMS परत अलग (चित्रा 3F), और फिर धीरे से इसे छील मोल्ड सतह से (चित्रा 3 जी) ।
  7. प्रवेश और एक 15 गेज कुंद सुई (चित्रा 3H, मैं) के साथ प्रवेश और आउटलेट बंदरगाहों के लिए ~ 1.6 mm छेद बनाने के द्वारा PDMS परतों पर आउटलेट चैनल बनाएं ।
    नोट: मानक मोल्ड एक प्रवेश और आउटलेट बंदरगाह है, जबकि व्यापक आउटलेट मोल्ड ही प्रवेश बंदरगाह (चित्रा 3H, मैं) की जरूरत है ।
  8. PDMS परतों के किनारों को ट्रिम करने के लिए कैंची का उपयोग करें।
    नोट: छंटनी की PDMS परतों ≥ छोटे EcoFAB उपकरणों के लिए 76 मिमी x 51 मिमी आयत और ≥ 102 मिमी x 83 मिमी आयत बड़े EcoFAB उपकरणों के लिए किया जाना चाहिए ।

2. EcoFAB डिवाइस निर्माण: रासायनिक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर PDMS परतों संलग्न (चित्रा 3 और चित्रा 4)

  1. स्थाई रूप से माइक्रोस्कोप स्लाइड करने के लिए PDMS परतों बांड
    1. PDMS परत के संबंध पक्ष कुल्ला (एजेंट मिश्रण के इलाज के लिए एक 15:1 elastomer आधार से बना) और 7.6 × 5 सेमी माइक्रोस्कोप मेथनॉल के साथ स्लाइड और फिर संकुचित हवा या एक अल्ट्रा शुद्ध नाइट्रोजन बंदूक के साथ सूखी झटका ।
      सावधानी: मेथनॉल विषाक्त है । एक धुएं डाकू में काम करते है और सुरक्षात्मक आंख को कवर, दस्ताने और अंय PPEs पहनते हैं ।
    2. एक प्लाज्मा क्लीनर में उनके संबंध पक्ष (चित्रा 3J) का सामना करना पड़ के साथ माइक्रोस्कोप स्लाइड और PDMS परत प्लेस । यदि एक प्लाज्मा क्लीनर उपलब्ध नहीं है, 2.2 कदम के लिए छोड़ दें ।
    3. बंद चैंबर और गैस प्लाज्मा क्लीनर की वेंट वाल्व, और निर्वात पर बारी और 1 मिनट के लिए नीचे चैंबर पंप ।
    4. प्लाज्मा जनरेटर की शक्ति पर बारी है, और 1 मिनट के लिए "हाय" रेडियो आवृत्ति (आरएफ) स्तर स्विच ।
    5. दोनों वैक्यूम पंप और प्लाज्मा बिजली बंद करें, और वातावरण के लिए चैंबर वेंट ।
    6. प्लाज्मा चैंबर से माइक्रोस्कोप स्लाइड और PDMS परत बाहर ले लो, और जल्दी से भी दबाव (चित्रा 3L) के साथ स्लाइड पर PDMS परत के सभी चार किनारों दबाएँ. सुनिश्चित करें कि PDMS लेयर का केंद्र अंडाकार क्षेत्र (रूट चैंबर) स्लाइड को स्पर्श नहीं करता है ।
    7. और PDMS परत और माइक्रोस्कोप स्लाइड के बीच स्थाई संबंध सुरक्षित करने के लिए 20 मिनट के लिए एक 120 डिग्री सेल्सियस हीटिंग ब्लॉक पर सील EcoFAB डिवाइस प्लेस ।
    8. डिवाइस 5 मिनट के लिए शांत हो जाओ एक चाकू के साथ PDMS परत के अतिरिक्त किनारों बंद ट्रिम कर दीजिए ।
  2. माइक्रोस्कोप स्लाइड करने के लिए PDMS परतों की प्रतिवर्ती शारीरिक सीलिंग
    1. प्रतिवर्ती सील तकनीक कस्टम clamps का एक सेट का उपयोग करता है (या तो एक 3 डी प्लास्टिक प्रिंटर या धातु में machined द्वारा मुद्रित, चित्र चित्रा 4में दिखाया गया है) ।
      1. नीचे दबाना प्लेट पर कटआउट में माइक्रोस्कोप स्लाइड प्लेस, और फिर PDMS परत (एक 5:1 elastomer बेस के एजेंट मिश्रण इलाज के लिए) स्लाइड के शीर्ष पर संरेखित करें ।
      2. PDMS परत पर शीर्ष दबाना प्लेट प्लेस । ऊपर और नीचे प्लेटें एक साथ चार हेक्स टोपी शिकंजा का उपयोग कर सुरक्षित, इतना है कि पागल दबाना के ऊपर से पिरोया है शिकंजा ओरिएंट ।
    2. अवय PDMS सीधे माइक्रोस्कोप स्लाइड
      1. स्थिति PDMS परत (एजेंट मिश्रण के इलाज के लिए एक 30:1 elastomer आधार से बना) एक खुर्दबीन स्लाइड के शीर्ष पर ।
      2. स्लाइड के लिए PDMS लेयर दबाएं । नरम, बहुत चिपकने वाला PDMS परत (30:1) एक क्लैंप (चित्रा 3L) से स्थायी रासायनिक संबंध या शारीरिक प्रेस के बिना एक निविड़ अंधकार सील बनाने स्लाइड करने के लिए छड़ी चाहिए ।

3. EcoFABs नसबंदी

  1. कुल्ला ultrapure पानी के साथ EcoFAB उपकरणों ।
  2. एक EcoFAB कंटेनर में एक EcoFAB डिवाइस प्लेस, और 70% इथेनॉल जोड़ने जब तक डिवाइस जलमग्न है । कंटेनर ढक्कन बंद करें और धीरे से हिला सभी इथेनॉल के साथ अंदर सतहों गीला करने के लिए । सुनिश्चित करें कि EcoFAB डिवाइस के रूट विकास चैंबर इथेनॉल से भरा है, बहुत कुछ या कोई हवा के बुलबुले के साथ.
  3. कमरे के तापमान पर 30 मिनट की मशीन के बाद, बंद डालो 70% इथेनॉल, और 5 मिनट के लिए 100% इथेनॉल के साथ मशीन को दोहराने ।
  4. बाहर इथेनॉल नाली, और एक लामिना प्रवाह हूड में 16 घंटे के लिए निष्फल EcoFAB मशीन इसे पूरी तरह से सूख । यदि उपलब्ध है, 1 एच के लिए हुड के भीतर यूवी प्रकाश पर मोड़ द्वारा प्रणाली निष्फल ।
    चेतावनी: उपयुक्त पीपीई पहनते है जब यूवी रोशनी के साथ काम कर रहे ।
  5. एक बाँझ डाकू या भविष्य के उपयोग के लिए autoclaved बैग में निष्फल EcoFABs की दुकान ।

एलईडी रोशनी बढ़ने के साथ 4. EcoFABs (चित्रा 5)

  1. EcoFAB कंटेनरों पर एलईडी स्ट्रिप्स संलग्न
    1. EcoFAB कंटेनर पर 9 एलईडी क्लिप्स के लिए स्थानों को चिह्नित करें । एक किनारे पर कंटेनर के नीचे से पहले क्लिप 120 मिमी के साथ शुरू करें (चित्र 5 ए), और प्रत्येक अगले क्लिप 10 मिमी छोड़ने के साथ कंटेनर के आसपास एक सर्पिल में क्लिप स्थानों को चिह्नित करने के लिए आगे बढ़ना । 9 क्लिप है कि एक 1 मीटर एलईडी पट्टी कंटेनर के आसपास दो बार लपेट की अनुमति देता है की एक सर्पिल ।
    2. गर्म गोंद कंटेनर पर गर्म गोंद के दो dabs जोड़कर प्रत्येक चिह्नित स्थिति के लिए एक एलईडी क्लिप, ' क्लिप बढ़ते छेद की स्थिति के साथ गठबंधन । गोंद के इन दो dabs में क्लिप छेद दबाएं, तो छेद के शीर्ष पर गोंद का एक और ढाब जोड़ें । सभी क्लिप्स के लिए प्रक्रिया को दोहराएँ जब तक 9 क्लिप्स एक सर्पिल फार्म (चित्रा 5B) ।
      चेतावनी: दस्ताने और अंय पीपीई जब गर्म गोंद के साथ काम करने के लिए जलता से बचने पहनते हैं ।
    3. एक सर्पिल आकार में क्लिप के माध्यम से एलईडी पट्टी धागे, एल ई डी कंटेनर में सामना करना पड़ के साथ । पट्टी के आसपास दो बार सर्कल चाहिए (चित्रा 5C) ।
  2. एक नियंत्रक के साथ बिजली की आपूर्ति करने के लिए एलईडी स्ट्रिप्स कनेक्ट (चित्रा 5d प्रबुद्ध रोशनी के साथ एक EcoFAB चैंबर को प्रदर्शित करता है, नियंत्रक के प्रोग्रामिंग कदम 4.3 में वर्णित है) ।
    चेतावनी: विद्युत सदमे खतरा: सुनिश्चित करें कि बिजली की आपूर्ति के तारों को जोड़ने जब अनप्लग है ।
    1. बिजली की आपूर्ति के सकारात्मक और नकारात्मक टर्मिनलों से कनेक्ट करें "इनपुट: v +" और "इनपुट: v-" नियंत्रक के टर्मिनलों का उपयोग कर 2-वायर केबल (चित्रा 5E नियंत्रक सेटअप का एक योजनाबद्ध आरेखण प्रदर्शित करता है) ।
    2. एक महिला के नंगे अंत से नकारात्मक नेतृत्व कनेक्ट करने के लिए नंगे केबल नियंत्रक पर एक "आउटपुट" चैनल के लिए.
      नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाता है कि नियंत्रक पर पांच चैनल हैं, तो यह पांच 1 मीटर एलईडी स्ट्रिप्स के लिए समर्थन कर सकते हैं.
    3. एक कॉम्पैक्ट ब्याह संबंधक के लिए केबल के सभी सकारात्मक सुराग कनेक्ट (यदि एक से अधिक चैनलों की जरूरत है), और फिर नियंत्रक के "आउटपुट वी +" टर्मिनल के लिए इस कनेक्टर लिंक.
    4. केबल के महिला अंत में प्रत्येक एलईडी पट्टी प्लग, तो प्रत्येक एलईडी को नियंत्रित किया जा करने के लिए अपने स्वयं के चैनल है. यदि वांछित, पहुंच का विस्तार करने के लिए महिला के लिए पुरुष केबल का उपयोग करें ।
  3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक वांछित प्रकाश चक्र के लिए नियंत्रक कार्यक्रम,

5. EcoFABs में बढ़ते पौधे

  1. बीज नसबंदी और अंकुरण
    नोट: बीज नसबंदी और अंकुर के साथ सभी निम्न चरणों बाँझ स्थितियों में किया जाना चाहिए. नीचे चर्चा की गई नसबंदी प्रक्रिया Arabidopsis थालियाना, Avena बरबटा, Brachypodium distachyon, और Panicum virgatum के बीजों के लिए उपयुक्त है । Panicum virgatum बीजों को नसबंदी प्रक्रिया से पहले 1 ज के लिए 60% सल्फर अम्ल में निलंबित किया जाना चाहिए । अंकुरण की दर और अंकुरण की एकरूपता को देखते हुए EcoFAB डिवाइस प्रति 1-2 बीज तैयार करने की सलाह दी जाती है ।
    1. 2 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में बीज लेना ।
    2. एक पिपेट के साथ इथेनॉल निकालें, और तीन बार बाँझ पानी के साथ बीज कुल्ला ।
    3. 5 मिनट के लिए 10% ब्लीच समाधान में बीज छोड़ दें ।
    4. ब्लीच समाधान निकालें, और अच्छी तरह से तीन बार बाँझ पानी का उपयोग कर बीज धोने.
    5. बीज के लिए बाँझ पानी जोड़ें, और 7 दिनों के लिए एक 4 ° c फ्रिज में microcentrifuge ट्यूब की मशीन ।
    6. समान रूप से 0.5 Murashige और Skoog (एमएस) मध्यम पर 0.6% phytagel के साथ बीज फैला है और micropore टेप के साथ प्लेटें सील ।
    7. EcoFABs (चित्रा 6A) के लिए स्थानांतरण के लिए के बारे में 5 मिमी की एक जड़ लंबाई के लिए पौधों को आगे बढ़ाएँ । यहां प्रस्तुत प्रयोगों के लिए, एक 22 ° c विकास कक्ष में एक 16 ज लाइट/8 एच डार्क प्रदीप्ति शासन लागू होते हैं, और पौधों 2-7 डी EcoFAB करने के लिए स्थानांतरण से पहले (2 दिन के लिए Avena बरबटा औरBrachypodium distachyon, 7 दिन के लिए Arabidopsis के लिए थालियाना और Panicum virgatum) ।
  2. तरल माध्यम के साथ EcoFABs में अंकुर स्थानांतरण (चित्रा 6)
    1. एक बाँझ सिरिंज या micropipette का उपयोग करना, तीन बार के लिए बाँझ पानी के साथ एक EcoFAB डिवाइस के रूट चैंबर फ्लश, और फिर ब्याज के विकास के माध्यम से रूट चैंबर को भरने, उदाहरण के लिए 0.5 MS मध्यम (चित्रा घमण्ड, कदम 5.1.6).
    2. ध्यान से EcoFAB डिवाइस (चित्रा 6C) के संयंत्र जलाशय में एक अंकुर डालें ।
      नोट: रूट पूरी तरह से रूट चैंबर के अंदर जलमग्न होना चाहिए, गोली के साथ जलाशय के बाहर चिपके हुए ।
    3. कंटेनर में बाँझ पानी की 3 मिलीलीटर जोड़ें, EcoFAB डिवाइस से परहेज । इससे उमस बढ़ेगी और रूट चैंबर से मध्यमा का वाष्पीकरण कम होगा ।
    4. कंटेनर बंद करें, और micropore टेप के साथ ढक्कन सील (चित्रा 6D) ।
    5. एक संयंत्र मशीन में EcoFAB प्लेस, या संबंधित संयंत्र (चरण 4) के विकास के लिए उपयुक्त एक नियंत्रित तापमान वातावरण में EcoFAB रोशनी प्रणाली का उपयोग । इस अध्ययन के लिए, 24 डिग्री सेल्सियस के लिए चैंबर सेट ।
    6. आवधिक रूप से जड़ विकास चैंबर के अंदर विकास मीडिया फिर से भरना और कंटेनर के लिए पानी जोड़ने के लिए EcoFAB की जाँच करें । बाँझ स्थितियों में सभी चरणों का पालन करें ।
      नोट: जल्दी संयंत्र विकास चरणों के लिए, जड़ विकास चैंबर के refilling हर 5 से 7 दिनों के लिए आवश्यक है । बाद के विकास चरणों के लिए, एक फिर से भरना आवश्यक है हर 2 से 3 दिन । यदि वांछित, एक सिरिंज या पिपेट जड़ विकास कक्षों से एक microcentrifuge ट्यूब में जड़ रिसाव समाधान इकट्ठा करने के लिए और एक-80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में यह दुकान का उपयोग करें; इसके अलावा, एक जेल imager या माइक्रोस्कोप के साथ रूट आकृति विज्ञान छवि.
  3. ठोस सब्सट्रेट के साथ EcoFABs में अंकुर स्थानांतरित
    1. अगर कस्टम clamps का एक सेट का उपयोग कर एक खुर्दबीन स्लाइड (चित्रा 3K, चित्रा 4) को संलग्न करने के लिए एजेंट इलाज के लिए elastomer बेस का एक 5:1 मिश्रण के साथ गढ़े रूट कक्षों का उपयोग करें; या एजेंट मिश्रण के इलाज के लिए 30:1 आधार से बना एक PDMS परत का चयन करें यदि PDMS परतों का पालन करने के लिए सीधे स्लाइड (के रूप में 2.2 कदम में वर्णित) ।
    2. EcoFAB कक्षों को निष्फल करें, जैसा चरण 3 में वर्णित है ।
    3. ध्यान से जड़ चैंबर में निष्फल मिट्टी/रेत जोड़ने के लिए, PDMS परत उल्टा बारी है, और जड़ चैंबर में सब्सट्रेट जोड़ें । इस क्षेत्र है कि माइक्रोस्कोप स्लाइड के साथ संपर्क में हो जाएगा पर किसी भी कण गिर से बचें, के बाद से यह आसंजन को कम करेगा ।
    4. PDMS परत के शीर्ष पर माइक्रोस्कोप स्लाइड प्लेस, और सभी किनारों मजबूती से दबाएँ । EcoFAB डिवाइस को ध्यान से पलटें ताकि जलाशय खुलने से कोई मिट्टी/
      नोट: एजेंट मिश्रण के इलाज के लिए एक 5:1 आधार के बने EcoFAB उपकरणों के लिए, सील सुरक्षित करने के लिए एक कस्टम क्लैंप का उपयोग करें ।
    5. प्रवाह तरल मध्यम या EcoFAB डिवाइस के प्रवेश या आउटलेट चैनल के माध्यम से पानी, और अपने संयंत्र जलाशय में एक अंकुर हस्तांतरण, के रूप में 3.3 कदम में वर्णित है ।
  4. EcoFABs में रोगाणुओं को जोड़ना
    1. पौंड शोरबा के 8 मिलीलीटर के साथ एक मशीन ट्यूब के लिए एक माइक्रोबियल कॉलोनी हस्तांतरण, और यह आयुध डिपो 0.5 (लगभग 12 एच) के लिए बढ़ता है ।
    2. एक 15 एमएल केंद्रापसारक ट्यूब में संस्कृति समाधान हस्तांतरण, और यह कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 3000 एक्स जी में यह केंद्रापसारक गोली रोगाणुओं के लिए ।
    3. supernatant को निकालें, और लक्ष्य EcoFAB में उपयोग किए जाने वाले पादप विकास माध्यमों में से 8 मिलीलीटर जोड़ें । रोगाणुओं की गोली निलंबित, और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 3000 x जी में ट्यूब केंद्रापसारक
    4. दोहराएँ चरण 5.4.3. दो बार पूरी तरह से किसी भी पौंड पोषक तत्व निशान हटाने के लिए ।
    5. अपने ऑप्टिकल घनत्व के बारे में 0.5 600 एनएम पर है जब तक धोया सूक्ष्म जीव गोली के लिए संयंत्र विकास माध्यम जोड़ें ।
    6. EcoFAB आउटलेट के माध्यम से रूट चैंबर में सूक्ष्म जीव समाधान के 20 µ एल जोड़ें । इस प्रकाशन में इस्तेमाल उपभेदों 2-3 दिनों के भीतर पौधे की जड़ें कूच करने के लिए, और बस्तियां जड़ सतहों शुरू कर दिया ।
    7. इंजीनियर chemiluminescent के लिए, luciferase अभिव्यक्ति प्रेरित करने के लिए संयंत्र विकास माध्यम में उत्प्रेरण (1 मिमी IPTG) शामिल करने के लिए सुनिश्चित करें.

6. EcoFABs से रूट Exudates की Metabolite profile

  1. LC/MS आधारित metabolomics विश्लेषण के लिए नमूना तैयारी
    1. एक lyophilizer में EcoFABs से एकत्र जड़ exudates के साथ microcentrifuge ट्यूबों रखो, और ट्यूबों से सभी पानी को दूर करने के लिए lyophilizer पर बारी ।
    2. जोड़ें 300 µ नियंत्रण रेखा के एल-एमएस ग्रेड मेथनॉल प्रत्येक ट्यूब में, और sonicate 30 मिनट के लिए ।
      चेतावनी: मेथनॉल के साथ काम करते समय पीपीई पहनें ।
    3. एक केंद्रापसारक में ट्यूबों प्लेस, और उंहें 5 मिनट के लिए 3000 x g पर केंद्रापसारक ।
    4. नए microcentrifuge ट्यूबों में supernatant समाधान स्थानांतरण, और एक निर्वात ध्यान में मेथनॉल लुप्त हो जाना ।
    5. 1 मिमी नियंत्रण रेखा के साथ मेथनॉल के 150 µ एल जोड़ें-एमएस एक ट्यूब में आंतरिक मानकों, और 12 एच के लिए एक 4 ° c रेफ्रिजरेटर में ट्यूबों गर्मी ।
    6. 5 मिनट के लिए 3000 x g पर ट्यूबों केंद्रापसारक, और 0.22 µm फिल्टर ट्यूबों में supernatant हस्तांतरण ।
    7. फिल्टर ट्यूबों केंद्रापसारक, और 2.0 मिलीलीटर नियंत्रण रेखा/MS शीशियों में से 200 µ l के साथ आवेषण में फ़िल्टर समाधान हस्तांतरण ।
    8. एक नियंत्रण रेखा/एमएस रैक के अंदर शीशियों प्लेस, और नियंत्रण रेखा के अंदर रैक लोड/
  2. डेटा विश्लेषण
    1. Metabolite एटलस और कस्टम पायथन लिपियों के एक पहुंच प्राप्त26 या अंय डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें ।
    2. metabolite मानकों की एक लाइब्रेरी का उपयोग करके m/z मान, अवधारण समय और यौगिक विखंडन प्रतिमानों के आधार पर चयापचयों की पहचान करें । 27

7. EcoFABs में पौधे की जड़ों का द्रव्यमान स्पेक्ट्रोस्कोपी इमेजिंग (figure 7)

नोट: EcoFAB उपकरणों कस्टम clamps (चित्रा 7A) के साथ एजेंट मिश्रण के इलाज के लिए एक 5:1 elastomer आधार से बना nanostructure पर मुद्रांकन रूट के लिए उपयोग किया जाता है-सर्जक जन स्पेक्ट्रोमेट्री (NIMS) चिप्स,28,29,30 के बाद से PDMS परतों रिवर्स NIMS चिप्स की सतहों के लिए बंधुआ हो सकता है ।

  1. 1 एच के लिए यूवी प्रकाश के साथ एक NIMS चिप सतह निष्फल ।
  2. मशीन से एक बढ़ते संयंत्र के साथ एक EcoFAB उठाओ, और यह एक बाँझ डाकू में जगह है ।
  3. EcoFAB संग्राहक खोलें, और क्लैंप की शीर्ष प्लेट निकालें ।
  4. ऊपर PDMS परत लिफ्ट के अंदर संयंत्र के साथ, और ध्यान से एक NIMS चिप पर संयंत्र के साथ PDMS परत देते (चित्रा 7B, डी, ई) ।
    नोट: एक बार जड़ छू NIMS चिप सतह, यह नहीं ले जाया जाना चाहिए । यह जड़ चयापचयों के "धब्बा" रोकता है ।
  5. धीरे जड़ों पर PDMS परत के माध्यम से नीचे प्रेस जब तक जड़ों पूरी तरह से NIMS सतह से संपर्क करें । 20 मिनट के लिए NIMS सतह पर जड़ों को छोड़ दें ।
  6. NIMS चिप से संयंत्र सहित PDMS परत से लिफ्ट, फिर से परहेज NIMS सतह के पार जड़ जा । यदि वांछित संयंत्र वापस दबाना करने के लिए ।
  7. एक कस्टम मालदी प्लेट पर NIMS चिप संलग्न और मास इमेजिंग के लिए एक मालदी स्पेक्ट्रोमीटर में प्लेट लोड (चित्रा 7C).
  8. रूट चयापचयों की NIMS इमेज (फिगर 7d-G)31उत्पन्न करने के लिए OpenMSI प्रोग्राम का उपयोग करें ।

Representative Results

प्रत्येक EcoFAB प्रणाली शामिल है एक EcoFAB डिवाइस और एक संयंत्र पारदर्शी प्लास्टिक कंटेनर आकार । एक EcoFAB डिवाइस एक संयंत्र जलाशय, एक रूट विकास चैंबर, एक 1.6 mm प्रवाह प्रवेश, और मानक EcoFAB डिवाइस के लिए एक 1.6 mm आउटलेट (चित्रा 2d और चित्रा 3H) या चौड़े आउटलेट EcoFAB डिवाइस के लिए एक 10 मिमी आउटलेट (चित्रा 2F और चित्रा 3I ). संयंत्र जलाशय एक चतुर्भुज आकार है कि एक 6 मिमी शीर्ष खोलने और 3 मिमी नीचे खोलने है में बनाया गया है, और इस डिजाइन तरल इंजेक्शन के दौरान प्रवाह रिसाव का मौका कम कर देता है और यह भी संयंत्र के विकास के लिए पर्याप्त स्थान सुनिश्चित करता है । रूट ग्रोथ चैंबर 2 मिमी गहराई के साथ एक अंडाकार आकार को गोद ले कई मॉडल संयंत्रों के रूट सिस्टम फिट करने के लिए, के रूप में चित्र 2c और ईमें दिखाया गया है । दोनों प्रवेश और एक मानक EcoFAB डिवाइस के आउटलेट चैनलों PTFE टयूबिंग के साथ जोड़ा जा सकता है तो पोषक तत्व समाधान EcoFAB कंटेनर को खोलने के बिना जड़ विकास कक्ष में प्रवाह कर सकते हैं । वाइड आउटलेट EcoFAB डिवाइस बहुत आउटलेट के प्रवाह प्रतिरोध को कम कर देता है, और अधिमानतः प्रयोग किया जाता है जब मोटी जड़ प्रणालियों के साथ पौधों को बढ़ रही है या जटिल रूट सिस्टम के बाद समय-वक्त पर इकट्ठा रूट exudates पौधों से प्राप्त कर रहे हैं ।

EcoFAB उपकरणों के PDMS परतों के निर्माण के लिए कास्टिंग molds एक डिजाइन सॉफ्टवेयर में बनाया जाता है, और फिर 3 डी कठोर अपारदर्शी photopolymers में मुद्रित, के रूप में चित्रा 2 और चित्रा 3में दिखाया गया है । पौधों के अंदर EcoFABs सीधे एक लंबे काम की दूरी का उपयोग कर एक खुर्दबीन के साथ मनाया जा सकता है, बाँझ विकसित पर्यावरण सुनिश्चित करने (चित्रा 8A, अनुपूरक फ़ाइल 1). पौधों के साथ EcoFAB उपकरणों को भी एक उच्च संकल्प माइक्रोस्कोप मंच है, जो संयंत्र के उच्च रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग-सूक्ष्म जीव बातचीत (चित्रा8B, अनुपूरक फाइल 2) में सक्षम बनाता है पर फिट कर सकते हैं । इस वातावरण में बांझपन बनाए रखा नहीं है, और उच्च संकल्प इमेजिंग इसलिए केवल समापन बिंदु माप के लिए उपयुक्त है ।

EcoFABs पौधों के व्यवस्थित अध्ययन को सक्षम करने के लिए तैयार कर रहे हैं, जैसे उनके आकृति विज्ञान, चयापचय, और माइक्रोबियल समुदायों उनके जीवन चक्र के पार अपने अलग विकास चरणों में. यहां EcoFABs प्रजातियों के पौधों की एक किस्म का अध्ययन करने के लिए एक सामान्य मंच के रूप में जांच की गई । चित्रा 8C -ई शो 7 दिन पुरानी Arabidopsis थालियाना, Brachypodium distachyon, और Panicum में बढ़ रही virgatum EcoFABs । सभी तीन संयंत्रों के लिए एक महीने से अधिक के लिए EcoFAB में अच्छी तरह से विकसित पाया गया । dicot, Arabidopsis थालियाना और monocot, Brachypodium distachyon दोनों EcoFABs में अपने प्रजनन चरणों के लिए जीना पाया गया ।

प्रतिवर्ती सील प्रणाली EcoFABs (कदम 2.2) के भीतर ठोस सब्सट्रेट (जैसे, मिट्टी) के उपयोग की अनुमति देता है । यह प्रतिवर्ती सील दृष्टिकोण जड़ विकास कक्षों में ठोस सब्सट्रेट की लोडिंग सक्षम बनाता है, और भी रूट rhizospheres के विशिष्ट क्षेत्रों से नमूना संग्रह सक्षम बनाता है । चित्रा 8F -एच 14 दिन पुराने Brachypodium distachyon के एक समूह को दिखाने के hydroponic माध्यम में बढ़ रही है, साथ ही रेत और मिट्टी hydroponic मध्यम (रेत) और पानी (मिट्टी) के साथ पूरक । जड़ विकास कक्षों में पतली ठोस सब्सट्रेट परत प्रकाश रूट सिस्टम के सूक्ष्म इमेजिंग के लिए के माध्यम से घुसना करने के लिए अनुमति देता है ।

रूट आकृति विज्ञान एक संयंत्र जड़ प्रणाली के स्थानिक विन्यास और वितरण के रूप में परिभाषित किया गया है और इस तरह के पोषक तत्व या पानी की उपलब्धता के रूप में विविध विकास के वातावरण के लिए एक आवश्यक फिजियोलॉजी प्रतिक्रिया के रूप में मंजूरी दी गई है32,33, 34. EcoFABs समय के साथ या विभिन्न पोषक तत्वों की स्थिति के तहत अध्ययन संयंत्र आकृति विज्ञान का एक सुविधाजनक दृष्टिकोण प्रदान करते हैं । चित्रा 9A-एफ पहले तीन हफ्तों में Brachypodium distachyon के रूट morphologies ट्रैक करने के लिए EcoFABs का उपयोग करने का एक उदाहरण दिखाएँ. एक Brachypodium distachyon अंकुर EcoFAB डिवाइस में स्थानांतरित किया गया था, और इसकी जड़ संरचना एक जैव रेड जेल imager के अंदर एक कैमरा द्वारा दर्ज किया गया था । छवि जे, अजगर और matlab के रूप में इस तरह के चित्र प्रसंस्करण कार्यक्रम, आगे समय पर या अलग मध्यम वातावरण में जड़ morphologies के परिवर्तन मात्रा में लागू किया जा सकता है । तीन सप्ताह के दौरान कुल रूट क्षेत्र के ठहराव ने प्रारंभिक चरण (< 1 सप्ताह) में तीन सप्ताह के अंत तक रेखीय वृद्धि की प्रवृत्ति के बाद एक क्रमिक वृद्धि दिखाई, जैसा कि चित्र 9Gमें दिखाया गया है ।

EcoFAB के निर्माण के लिए एक प्राथमिक प्रेरणा संयंत्र-सूक्ष्म जीव बातचीत की जांच करने के लिए है । 5.4 कदम में वर्णित के रूप में, सूक्ष्मजीवों प्रवेश चैनल के माध्यम से EcoFAB उपकरणों की जड़ विकास कक्षों में स्थानांतरित कर रहे हैं । चित्रा 10 से पता चलता है, एक EcoFAB युक्त Pseudomonas simea (पूर्व, fluorescens) WCS417 (WCS417), एक संयंत्र के विकास rhizobacteria लेबल के साथ chemiluminescent को बढ़ावा देने, संयंत्र जड़ प्रणालियों में एक एकाग्रता के साथ जोड़ा गया था 106 कोशिकाओं प्रति संयंत्र । WCS417 संकेत एक जेल imager है, जो रूट विकास कक्षों में WCS417 रोगाणुओं के एक अलग स्थानिक वितरण संकेत के साथ पता चला था । दोनों के साथ एमएस तरल माध्यम में और रेत ठोस सब्सट्रेट के बिना, WCS417 रोगाणुओं जड़ टिप क्षेत्रों के आसपास केंद्रित रोगाणुओं के साथ पूरे रूट सिस्टम की सतहों, संभवतः जड़ सुझावों के सक्रिय पोषक तत्व उत्पादन के कारण (चित्रा 10G व H)35. दूसरी ओर, मिट्टी सब्सट्रेट में WCS417 रोगाणुओं के बजाय रूट युक्तियाँ के संयंत्र जलाशय क्षेत्र के आसपास संचित (चित्रा 10मैं). के रूप में रोगाणुओं आउटलेट चैनल के माध्यम से जोड़ रहे थे, रोगाणुओं को भी मिट्टी सब्सट्रेट में स्थानांतरित करने में सक्षम थे, लेकिन जड़ पर जमा नहीं किया, के रूप में या रेत के बिना तरल माध्यम में मनाया । यह संकेत हो सकता है कि मिट्टी एक पर्याप्त पोषक तत्व स्रोत है, और रोगाणुओं इष्टतम श्वसन शर्तों के लिए संयंत्र जलाशय के लिए चले गए ।

संयंत्र जड़ exudates के रूप में अच्छी तरह के रूप में metabolite और संयंत्र से जारी-सूक्ष्म जीव बातचीत के metabolite रूपरेखा का अध्ययन करने के लिए, जड़ विकास मंडलों से रिसाव समाधान EcoFABs में पौधों के विभिंन विकास चरणों में एकत्र किया गया । चरण 6 में वर्णित के रूप में, रिसाव नमूने तो नियंत्रण रेखा-एमएस विश्लेषण के लिए निकाले जाते हैं । इस विधि का उपयोग कर, संयंत्र द्वारा इंग्लैण्ड चयापचयों की एक श्रृंखला और रोगाणुओं द्वारा भस्म का पता लगाया गया था, और के साथ और रोगाणु औपनिवेशीकरण के बिना रूट exudates की रूपरेखा संबंधित metabolite वर्तमान में जांच के अंतर्गत है ।

Figure 1
चित्र 1: EcoFAB कार्यप्रवाह. पौधों की थाली पर अंकुरित कर रहे हैं, और निष्फल EcoFAB को हस्तांतरित, रोगाणुओं जोड़ा जा सकता है । विनाशकारी नमूना: रूट exudates नमूना और imaged किया जा सकता है, और रूट आकृति विज्ञान visualized किया जा सकता है । विनाशकारी नमूना विस्तार में सूक्ष्म जीव, जड़, और गोली मार मापदंडों के विश्लेषण की अनुमति देता है ।

Figure 2
चित्रा 2: EcoFAB डिवाइस निर्माण के लिए 3 डी मुद्रित molds के घटक. (क) एक कास्टिंग फ्रेम के ऊपर और झुका हुआ दृश्य । (ख) एक डालने के ऊपर और झुका हुआ दृश्य । (ग) एक मानक मोल्ड आधार के ऊपर और झुका हुआ दृश्य । (ङ) एक व्यापक आउटलेट मोल्ड आधार के ऊपर और झुका हुआ दृश्य । (डी, एफ) क्रमशः मानक और व्यापक आउटलेट EcoFAB उपकरणों के निर्माण के लिए molds इकट्ठे हुए । ओवल आयाम छोटे EcoFAB मोल्ड के लिए 51 मिमी x 34 मिमी और बड़े EcoFAB मोल्ड के लिए 76 मिमी x 62 मिमी हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: EcoFAB डिवाइस निर्माण. (क) मोल्ड में elastomer बेस और इलाज एजेंट का मिश्रण डालना. (ख) 4 घंटे के लिए 85 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण के साथ मोल्ड हीटिंग (ग) मोल्ड से डालने को हटाने । (घ) PDMS को ढलाई के फ्रेम से पृथक करना. (ङ) ढलाई फ़्रेम के बाहर मोल्ड बेस को धकेलना । (च) एक चाकू का उपयोग करने के लिए किनारों के साथ मोल्ड से PDMS अलग । (छ) PDMS परत छीलने धीरे मोल्ड बेस बंद । (एच) दोनों प्रवेश और मानक PDMS परत के आउटलेट चैनलों के लिए Poking छेद । (I) व्यापक आउटलेट PDMS परत के प्रवेश चैनल के लिए एक छेद Poking । (जंमू) PDMS परत (एजेंट मिश्रण के इलाज के लिए एक 15:1 elastomer आधार से बना) और एक खुर्दबीन स्लाइड कुल्ला कर रहे हैं, और बांड के लिए एक प्लाज्मा क्लीनर में स्थानांतरित कर दिया । (कश्मीर) clamps का उपयोग करने के लिए PDMS परत पकड़ (एक 5:1 elastomer आधार एजेंट मिश्रण के इलाज के लिए) एक खुर्दबीन स्लाइड पर बनाया है । (एल) PDMS परत दबाने (एजेंट मिश्रण के इलाज के लिए एक 30:1 elastomer आधार से बना) सीधे एक खुर्दबीन स्लाइड पर । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: कस्टम clamps के डिजाइन. (क) एक शीर्ष दबाना प्लेट के ऊपर और झुका हुआ दृश्य । (ख) एक नीचे दबाना प्लेट के ऊपर और झुका विचारों । (ग) हेक्स कैप शिकंजा के चार सेट के साथ इकट्ठे क्लैंप के ऊपर और झुका हुआ दृश्य । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: एलईडी रोशनी बढ़ने की स्थापना. (क) बाहर EcoFAB कंटेनर के आसपास एक सर्पिल में 9 एलईडी क्लिप के लिए स्थानों अंकन । (ख) EcoFAB कंटेनर से जुड़ी एलईडी क्लिप्स । (ग) इन क्लिप्स के माध्यम से एक एलईडी पट्टी थ्रेडिंग । (घ) एक 24V बिजली की आपूर्ति के साथ वायर्ड एक नियंत्रक के लिए एलईडी पट्टी जोड़ने । (ङ) नियंत्रक को तार कनेक्शन की योजनाबद्ध । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: EcoFABs में अंकुर स्थानांतरण । (क) Brachypodium distachyon एक 0.5 MS प्लेट पर 2 दिनों के लिए उगाया पौधों । (ख) पादप विकास माध्यम के साथ मूल चैम्बर भरना. (ग) एक नोचना का उपयोग करने के लिए ध्यान से संयंत्र जलाशय में जड़ डालें । (घ) micropore टेप के साथ EcoFAB कंटेनर सील, कंटेनर के नीचे करने के लिए पानी की 3 मिलीलीटर जोड़ने के बाद । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7: EcoFABs में पौधे की जड़ों की NIMS इमेजिंग । (क) एक बाँझ EcoFAB में बढ़ती हुई एक Brachypodium distachyon . (ख) 20 मिनट के लिए एक NIMS चिप पर संयंत्र के साथ PDMS परत संलग्न (ग) तांबे टेप का उपयोग करने के लिए एक कस्टम मालदी प्लेट पर NIMS चिप संलग्न, और यह एक मालदी मास स्पेक्ट्रोमीटर में लोड हो रहा है । (डी जी) एक 7 दिन पुराने और १ २० दिन पुराने Brachypodium distachyon संयंत्र NIMS इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया (डी, ई) और इसी NIMS छवियों (एफ, जी) । प्रमुख आयनों लाल, हरे, और नीले रंग में प्रकाश डाला गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्र 8: EcoFABs के सामान्य अनुप्रयोग. (एक) सीधे एक लंबे समय से काम की दूरी माइक्रोस्कोप सेटअप के साथ एक EcoFAB में Brachypodium distachyon की जड़ विकास पर कब्जा । (ख) सीधे एक उच्च संकल्प माइक्रोस्कोप सेटअप के साथ रूट सूक्ष्म जीव बातचीत देख रहे हैं । (सी-ई) 7 दिन पुरानी Arabidopsis थालियाना (c), Brachypodium distachyon (D), और Panicum virgatum (E) में 0.5 ms hydroponic माध्यम, (f-H) 14 दिन पुराने Brachypodium distachyon में उगाए गए 0.5 ms हीड्रोपोनिक्स (f), में रेत (G) और मिट्टी (ज) सब्सट्रेट क्रमशः 0.5 MS मध्यम और पानी के साथ आपूर्ति की । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 9
चित्र 9: रूट आकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए EcoFABs का उपयोग. (क-च) Brachypodium distachyon के रूट विकास पहले तीन हफ्तों के दौरान 0.5 MS माध्यम से भरे EcoFABs में बढ़ रहा है: (A) 2 दिन, (B) 4 दिन, (C) 7 दिन, (D) 11 दिन, (E) 14 दिन, (च) वृद्धि के 21 दिन । (छ) औसत जड़ सतह क्षेत्रों ImageJ सॉफ्टवेयर द्वारा अनुमानित थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 10
चित्र 10: रूट-सूक्ष्म जीव इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए EcoFABs का उपयोग करना . (A, B, C) 15 दिन पुराने Brachypodium distachyon बस्तियां के एक समूह के साथ Pseudomonas fluorescens WCS417 के विभिंन रूपों में मीडिया-एमएस तरल समाधान, रेत और मिट्टी सब्सट्रेटs । (डी, ई, एफ) उनके रूट सिस्टम के उज्ज्वल क्षेत्र तस्वीरें । (G, H, I) 14 दिनों के सह-खेती के बाद इन रूट सिस्टम की इसी chemiluminescent छवियां । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

अनुपूरक फाइल 1. EcoFAB का उपयोग जड़ विकास को पकड़ने के लिए । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

अनुपूरक फाइल 2. रूट रोगाणुओं बातचीत पर कब्जा करने के लिए EcoFAB का उपयोग. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Discussion

प्रोटोकॉल EcoFABs बनाने के लिए पारिस्थितिकी तंत्र निर्माण का उपयोग कर के लिए यहां की सूचना दी उच्च नियंत्रित प्रयोगशाला शर्तों में व्यवस्थित संयंत्र जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए समुदाय संसाधन प्रदान करता है । 3d मुद्रण में अग्रिमों के निर्माण और iteratively शोधन EcoFAB डिजाइनों के लिए व्यापक रूप से सुलभ प्रौद्योगिकियों प्रदान करते हैं । रूट चैंबर यहां प्रस्तुत करने के लिए अच्छी तरह से इमेजिंग माइक्रोस्कोपी और बनाए रखने के लिए अनुकूल हो पाया है, रोगाणुओं के नियंत्रण के अलावा सक्षम करने के लिए संयंत्र-सूक्ष्म जीव बातचीत की जांच । EcoFAB मंच विभिन्न प्रजातियों के पौधे के साथ संगत है । यह संकीर्ण रूट चैंबर के भीतर पौधों को उगाने के शारीरिक प्रभाव को पहचानने के लिए महत्वपूर्ण है कि इस तरह के अतिरिक्त प्रयोगों प्राकृतिक वातावरण में बढ़ पौधों के लिए निष्कर्षों को सामान्य करने के लिए आवश्यक हो जाएगा.

बाँझ मंडलों और एलईडी प्रकाश का उपयोग विभिन्न प्रकाश स्थितियों के प्रभाव की जांच सक्षम बनाता है, तरंग दैर्ध्य सहित, तीव्रता, और अवधि, संयंत्र विकास पर और समानांतर में संबंधित शारीरिक मापदंडों. प्रतिवर्ती बांडिंग रूट चैंबर ठोस सब्सट्रेट के उपयोग के साथ ही स्थानिक जैव रासायनिक और आनुवंशिक विश्लेषण के लिए ठोस नमूने लेने के लिए अनुमति देते हैं । ऐसे मिट्टी, रेत के रूप में ठोस सब्सट्रेट, के आवेदन, और क्वार्ट्ज मोती, अधिक पारिस्थितिकी प्रासंगिक प्रयोगशाला पारिस्थितिकी प्रणालियों का निर्माण करने के लिए EcoFABs का उपयोग करने की संभावनाओं की पेशकश. हालांकि, सभी प्रणालियों यहां प्रस्तुत उपयोग संतृप्त तरल (hydroponic संस्कृतियों) जो सबसे मिट्टी का एक सटीक प्रतिबिंब नहीं है और यह आगे इन डिजाइनों को परिष्कृत करने के लिए मिट्टी के भीतर हवा जेब ऐसी है कि वे बेहतर प्रतिनिधित्व बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण होगा प्राकृतिक मिट्टी ।

दोनों सरल कैमरों और सूक्ष्मदर्शी का उपयोग सेलुलर स्तर के लिए दोनों थोक में छवि जड़ प्रणाली आकृति विज्ञान विकास के लिए वर्णित है । रूट आकृति विज्ञान इमेजिंग और ठहराव की निगरानी के लिए यह उपयुक्तता की संभावना संयंत्र के नियामक तंत्र को समझने के लिए मददगार होगा शारीरिक और आणविक संयंत्र genotypic रूपांतरों द्वारा ट्रिगर विकास की स्थिति के लिए संकेत. हालांकि, शारीरिक जड़ विकास का अध्ययन करने के लिए एक सीमा EcoFAB डिवाइस के वर्तमान क्षैतिज स्थान है । प्राकृतिक वातावरण में, जड़ों gravitropic प्रतिक्रिया जड़ प्रणाली के एक मुख्य रूप से ऊर्ध्वाधर विकास की ओर जाता है । इस प्रकार, क्षैतिज प्रणाली यहां प्रस्तुत की संभावना एक प्राकृतिक वातावरण से कुछ कारकों में अलग है, और रूट चैंबर के कार्यक्षेत्र स्थान के साथ EcoFAB प्रणालियों के निर्माण भविष्य EcoFAB संस्करणों के लिए एक वांछनीय लक्ष्य है । हालांकि वर्तमान EcoFAB उपकरणों क्षैतिज रखा जाता है, विभिन्न स्थितियों में रूट आकृति विज्ञान मापदंडों का विश्लेषण, या रोगाणुओं के जवाब में, संभव है. उच्च संकल्प इमेजिंग एक अलग या समुदायों की जड़ औपनिवेशीकरण गतिशीलता पर कब्जा करने के लिए लागू किया जा सकता है, जानकारी प्रदान करने के बारे में जो संयंत्र भागों विभिंन पोषक तत्व पर्याप्त और कमी की स्थिति में बृहदांत्र हैं । यह प्रत्याशित है कि इस तरह के अध्ययनों में महत्वपूर्ण नई अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा कैसे संयंत्र microbiomes इकट्ठा कर रहे हैं, और कैसे इन गतिशीलता समय के साथ बदल जाते हैं, उदाहरण के लिए जड़ों के रूप में विकसित ।

Microfluidic उपकरणों बहुत युवा पौधों की इमेजिंग सक्षम है, और आमतौर पर एकत्र चयापचयों की मात्रा LCMS विश्लेषण के लिए पर्याप्त नहीं है । rhizotrons के रूप में मृदा आधारित सिस्टम, रूट आकृति विज्ञान के इमेजिंग की अनुमति दें जब या तो पौधों chemiluminescent निर्माण के साथ बदल रहे हैं (Glo-root) या एनएमआर-आधारित विधियों के साथ33,34. इन प्रणालियों से Metabolite निकालने के नमूनों की बड़ी मात्रा की वजह से समय लगता है । EcoFABs दोनों का एक संयोजन कर रहे हैं: निर्माण microfluidic उपकरणों के समान है । EcoFABs को पुन: पेश करने के लिए सरल और सस्ती डिजाइन किए गए थे, लेकिन चैंबर के आकार को छोटे या बड़े रूट सिस्टम के साथ पौधों को विकसित करने के लिए समायोजित किया जा सकता है, उनके प्रजनन चरणों तक । रूट आकृति परिवर्तन और जड़ की एक साथ अवलोकन संभव है । प्रणाली बाँझ, विशिष्ट रोगाणुओं के नियंत्रण के अलावा सक्षम है ।

EcoFABs नियंत्रित परिचय और रोगाणुओं और चयापचयों के नमूने को सक्षम करने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं । विशेष रूप से, रूट विकास कक्षों से एकत्र नमूनों को सामूहिक स्पेक्ट्रोस्कोपी metabolite रूपरेखा के लिए पर्याप्त पाया जाता है । जन स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग के एकीकरण (जैसे, NIMS तकनीक यहां प्रस्तुत) रूट सिस्टम के metabolite स्थानिक वितरण का अध्ययन के एक गैर विनाशकारी दृष्टिकोण प्रदान करता है । इस तकनीक की संभावना भविष्य स्थिर आइसोटोप पता लगाने और मानचित्रण विशिष्ट चयापचयों36के लिए माइक्रोबियल स्थानीयकरण में सहायक हो जाएगा । हालांकि इस प्रोटोकॉल एकल अलग पर ध्यान केंद्रित किया है, एक ही डिजाइन निश्चित रूप से अधिक जटिल समुदायों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । EcoFABs के भीतर नमूना मात्रा और बायोमास डीएनए अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों, जो निस्र्पक और माइक्रोबियल समुदाय संरचना और जीन अभिव्यक्ति की निगरानी के लिए महत्वपूर्ण हो जाएगा के साथ आगे एकीकरण के लिए पर्याप्त से अधिक की संभावना है ।

अंत में, इस प्रोटोकॉल विवरण संयंत्र की जांच के लिए डिज़ाइन किया गया प्रयोगशाला पारिस्थितिकी प्रणालियों के निर्माण-सूक्ष्म जीव बातचीत, सरल और सुलभ तरीकों कि आसानी से लागू किया जा सकता है और आसपास के शोधकर्ताओं द्वारा विस्तारित पर जोर देने के साथ दुनिया. वर्तमान प्रयासों प्रयोगशालाओं और एक तापमान नियंत्रण प्रणाली है कि प्रत्येक EcoFAB स्वतंत्र रूप से नियंत्रित किया जाएगा प्रकाश और तापमान के एकीकरण के बीच reproducibility प्रदर्शन के उद्देश्य से कर रहे हैं । इस प्रणाली के आगे उंनति स्वचालित नमूना और EcoFAB रूट मंडलों के पुनः भरना और EcoFABs के भीतर प्रासंगिक संयंत्र microbiomes स्थापित करने के लिए reproducible प्रोटोकॉल के विकास के एकीकरण होगा ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम के द्वारा समर्थित किया गया था प्रयोगशाला निर्देशित अनुसंधान और विकास (LDRD) लॉरेंस बर्कले राष्ट्रीय प्रयोगशाला के कार्यक्रम के विज्ञान के कार्यालय द्वारा समर्थित, अमेरिका के ऊर्जा विभाग के तहत अनुबंध No. de-AC02-05CH11231 और एक पुरस्कार de-SC0014079 अमेरिका के ऊर्जा विभाग के कार्यालय से UC बर्कले के लिए । आणविक फाउंड्री में काम अमेरिकी ऊर्जा विभाग के अनुबंध सं के तहत समर्थित था । DE-AC02-05CH11231 । हम भी सुजान एम Kosina, कैथरीन Louie, बेंजामिन पी Bowen, और बेंजामिन जे कोल सभी उनकी मदद के लिए लॉरेंस बर्कले नेशनल लेबोरेटरी में धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D printed custom mold LBNL STL files available here www.eco-fab.org; The EcoFABs molds described here were printed by FATHOM: http://studiofathom.com
Dow sylgard 184 silicone elastomer clear kit Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Air duster spray VWR 75780-350 any compressed gas duster should work
15 gauge blunt needle VWR 89166-240
5 mL syringe with Luer-Lok Tip VWR BD309646
3”x2” microscope glass slide VWR 48382-179
1.75" x 2.56" x 3.56" EcoFAB box Amazon B005GAQ25Q
4” x 3 ¼” microscope glass slide Ted Pella 260231
4.87" x 4.87" x 5.50" EcoFAB box Amazon B00P9QVOS2
Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-001
3D printed custom clamp LBNL STL files available from Trent Northen's lab
Sterile hood AirClean Systems AC600 Series PCR Workstations
PTFE syringe tubing Sigma-Aldrich Z117315-1EA
Ethanol VWR 89125-172
Bleach
Murashige and Skoog (MS) Macronutrient Salt Base Phytotechnologies Laboratories M502
Murashige and Skoog (MS) Micronutrient Salt Base Phytotechnologies Laboratories M554
Soil Hummert International Pro-Mix PGX
Phytagel Sigma-Aldrich 71010-52-1
Arabidopsis thaliana Lehle Seeds WT-24 Col-4 Columbia wild type
Brachypodium distachyon LBNL Standard Bd-21 line Available from John Vogel's lab
Panicum virgatum The Samuel Roberts Noble Foundation Alamo switchgrass
Micropore tape VWR 56222-182
LC-MS grade methanol VWR JT9830-3
Lyophilizer LABCONCO FreeZone 2.5 Plus
SpeedVAC concentrator Thermo Scientific Savant™ SPD111 SpeedVac
Ultrafree-MC GV Centrifugal Filter-0.22 µm Millipore UFC30GV00
Liquid chromotography system Agilent Agilent 1290 LC system
Q Exactive mass spectrometer Thermo Scientific Q Exactive™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap MS
NIMS chip and custom MALDI plate LBNL For detailed protocol see: doi:10.1038/nprot.2008.110
MALDI mass spectrometer AB Sciex TOF/TOF 5800 MALDI MS
Nano-coated LED grow light strip LED World Lighting HH-SRB60F010-2835
Power supply LED World Lighting MD45W24VA, LV100-24N-UNV-J
TC420 controller Amazon B0197U7R8Q
Silicone LED clips Amazon B00N9X1GI0
Hot glue gun Amazon B006IY359K
Female-to-bare LED connector cable LED World Lighting HH-F05
Female-to-male LED connector extension cable LED World Lighting HH-MF1
20AWG 2-wire cable LED World Lighting 6102051TFT4
WAGO 221-415 Splicing Connector LED World Lighting 221-415

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References

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