Summary
Denna artikel beskriver detaljerat protokoll för ekosystemet tillverkning av enheter (EcoFABs) som möjliggör studier av växter och växt-mikrobinteraktioner i starkt kontrollerad laboratoriemiljö.
Abstract
Välgörande växt-mikrobinteraktioner erbjuda en hållbar biologiska lösning med potential att öka lågintensivt mat och bioenergi produktionen. En bättre mekanistisk förståelse av dessa komplexa växt-mikrobinteraktioner kommer att vara avgörande för att förbättra växtproduktionen så välpresterande basic ekologiska studier utredande växt-jord-mikrobinteraktioner. Här, presenteras en detaljerad beskrivning för ekosystemet fabrication, med hjälp av allmänt tillgängliga 3D trycktekniker, för att skapa kontrollerad laboratorium livsmiljöer (EcoFABs) för mekanistiska studier av växt-mikrobinteraktioner inom specifika miljö villkor. Två storlekar av EcoFABs beskrivs som är lämpade för utredning av mikrobiell interaktioner med olika växtarter, bland annat Arabidopsis thalianaoch Brachypodium distachyon Panicum virgatum. Enheterna genomflöde medger kontrollerade manipulation och provtagning av roten microbiomes, roten kemi samt imaging av roten morfologi och mikrobiell lokalisering. Detta protokoll innehåller information för att upprätthålla sterila förhållanden inuti EcoFABs och monteringssystem oberoende LED ljus på EcoFABs. Detaljerade metoder för tillägg av olika former av media, inklusive jord, sand, och flytande tillväxtmassmedia kopplat till karakterisering av dessa system som använder imaging och metabolomik beskrivs. Tillsammans, dessa system möjliggör dynamisk och detaljerad utredning av växt och växt-mikrobiella konsortier inklusive manipulering av mikrobiomet sammansättning (inklusive mutanter), övervakning av växternas tillväxt, roten morfologi, exsudat sammansättning, och mikrobiell lokalisering under kontrollerade miljöförhållanden. Vi räknar med att dessa detaljerade protokoll kommer att fungera som en viktig utgångspunkt för andra forskare, idealiskt hjälper att skapa standardiserade experimentella system för att undersöka växt-mikrobinteraktioner.
Introduction
Tillämpningen av välgörande växt mikrober i jordbruket erbjuder stor potential att öka hållbar mat och biobränsleproduktion att ge för en växande befolkning1,2,3,4. En betydande mängd arbete stöder vikten av växt microbiomes i anläggningen näringsupptag, tolerans mot påfrestningar och motstånd mot sjukdom5,6,7,8. Det är dock svårt att undersöka dessa mekanismer av växt-mikrobinteraktioner i fältet ekosystem på grund av komplexiteten och associerade irreproducibility och oförmåga att kontrollera exakt mikrobiomet sammansättning och genetik (t.ex., med mikrobiell mutanter)4,9,10.
En strategi är att konstruera förenklad modell ekosystem att aktivera kontrollerade, replikerade laborationer undersöker växt-mikrobinteraktioner för att generera insikter som ytterligare kan testas i fält10,11, 12. Detta koncept bygger på traditionella metoder med hjälp av växter som odlas i jord-fyllda krukor eller på agar plattor inom växthus eller inkubatorer13. Även om dessa kommer sannolikt att förbli mest använda metoder, de saknar förmågan att noggrant övervaka och manipulera växt tillväxt miljöer. Att för dessa ändamål, rhizoboxes och rhizotrons representerar en stor förbättring i förmågan att studera under jord processer14,15, och första protokoll publicerades för att analysera odlingsbädden metaboliter i jord16. Mer nyligen, för att aktivera hög genomströmning analys, avancerad mikroflödessystem enheter13,17 som växt Chip18,19och RootArray20RootChip21, har varit utvecklats som effektiva verktyg för växt fenotypning med mikrometer-skala rumslig upplösning att övervaka tillväxten tidigt i liten modell växten Arabidopsis thaliana i vätskeflödet medium. Nyligen beskrevs en två-lagers imaging plattform som möjliggör rotahåret avbildning av Arabidopsis thaliana på fröplanta scenen med en mikroflödessystem plattform22.
Här, tillhandahålls detaljerade protokoll för att konstruera kontrollerade laboratorium enheter (EcoFABs) för att studera växt mikrobinteraktioner och visa att de kan användas för att studera olika växter inklusive Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyon23, den ekologiskt viktiga wild oat Avena barbata, och bioenergi grödan Panicum virgatum (switchgrass). EcoFAB är en steril växt tillväxtplattform som innehåller två huvudsakliga komponenter: EcoFAB enheten och sterila växt-sized genomskinlig behållare. Den EcoFAB enheten är tillverkad av ett Polydimetylsiloxan (PDMS) tillverkning process som involverar gjutning PDMS lager från en 3D tryckta plast mögel och limning PDMS lager på objektglas med metoder tidigare rapporterade24,25 . De detaljerade förfarandena för EcoFAB arbetsflödet, till exempel enhet fabrication, sterilisering, frögroning, fröplanta transplantation, mikrob inympning/cocultivation, provberedning och analys, beskrivs i detta protokoll (figur 1). Ytterligare ändringar av den grundläggande arbetsflöden beskrivs, inklusive installation av dator kontrollerade LED växa lampor och utnyttjandet av fasta substrat. Utnyttjandet av imaging tekniker för att undersöka roten morfologi ändras, mikrobiell kolonisering av rötter, och massa spectroscopic imaging av roten exudat beskrivs. Vi räknar med att den enkla och billiga design baserad på lättillgängliga material, as well as de detaljerade protokoll som presenteras här, blir den EcoFAB plattformen till en gemenskapen resurs, standardisera växt-mikrobiomet laboratoriestudier.
Protocol
Varning: Detta protokoll inkluderar användning av farliga kemikalier, vassa föremål, elektriska apparater, heta föremål och andra faror som kan leda till skador. Lämplig personlig skyddsutrustning (PPE, t.ex., kemikaliebeständiga handskar, skyddsglasögon, laboratorierock, långa kläder, stängd-toed skor, osv.) ska bäras, och de lämpliga säkerhetsrutiner (säkerhetsutbildning, användning av dragskåp, etc.) bör följas.
1. EcoFAB enhet Fabrication: Casting PDMS lager (figur 2 och figur 3)
- Konstruera EcoFAB formarna använder 3D tryckteknik (design filerna är tillgängliga på. Varje mögel omfattar tre delar: en Ingjutningsram, presenterade mögel bas och ett skär, som visas i figur 2. Skriv ut mögel basen och infoga av styv ogenomskinlig polymerer med hjälp av en 3D plast-skrivare. Använda minst 100 µm upplösning och skriva ut Ingjutningsram med akrylnitril-butadien-styren (ABS).
- Blanda 40 mL av siloxan elastomer bas med härdare i en disponibel 1 L behållare. Beroende på önskad experimentet (steg 2.1 och 2.2), använda olika nyckeltal (v/v) av elastomer bas/härdare (5:1, 15:1, eller 30: 1). Fortsätt till steg 1.3-1.8 för alla typer av blandningar.
Försiktighet: Använd kemikaliebeständiga handskar, skyddsglasögon och andra PPEs. - Placera behållaren i en vakuumkammare för minst 30 min att ta bort luftbubblor från elastomer blandningen.
- Häll blandningen i den monterade 3D tryckta plast mögel (figur 3A) och hålla formen på en värmeblocket vid 85 ° C i 4 h (figur 3B).
Försiktighet: Bära PPE att undvika brännskador. - Låt formen svalna i 5 min. Dra sedan ut insatsen från formen försiktigt (figur 3 c), och sedan långsamt in en mattkniv mellan Ingjutningsram och PDMS (stelnad elastomer blandningen) att separera dem (figur 2D).
- Tryck på mögel bas med PDMS upp ur gjutning ramen (figur 3E). Använda en kniv eller andra verktyg att försiktigt separera PDMS lagret från basen mögel på kanterna (figur 3F), och sedan långsamt lossnar det från mögel ytan (figur 3 g).
- Skapa inlopp och utlopp kanaler på PDMS lagren genom att göra ~1.6 mm hål för de in- och utsugningskanaler med 15 gauge trubbig nål (figur 3 H, I).
Obs: Standard mögel har ett inlopp och utlopp port, medan wide-outlet mögel behöver bara inloppsport (figur 3 H, I). - Använd sax för att trimma kanterna av PDMS lager.
Obs: Trimmade PDMS lagren bör ≥76 mm x 51 mm rektanglar för små EcoFAB enheter och ≥102 mm x 83 mm rektanglar för stora EcoFAB enheter.
2. EcoFAB enhet Fabrication: kemiskt fästa PDMS lager på objektglas (figur 3 och figur 4)
- Permanent limning PDMS lagren till objektglas
- Skölj bindning sida PDMS lagret (gjorda av en 15:1-elastomer bas till härdning agent blandning) och 7,6 × 5 cm Mikroskop glida med metanol och sedan blåsa torrt med tryckluft eller en ultrarent kväve pistol.
Försiktighet: Metanol är giftigt. Arbeta i dragskåp och bära skyddande ögat som täcker, handskar och andra PPEs. - Placera den objektglas och PDMS lager i en plasma renare med deras bindning sidor uppåt (figur 3J). Om det inte finns en plasma som är renare, hoppa till steg 2.2.
- Nära kammaren gasen ventilationsventil av plasman renare och slå på dammsuga och pump ner kammaren för 1 min.
- Slå på strömmen av plasma generatorn och byta radiofrekvens (RF) nivån till ”Hej” för 1 min.
- Stäng av både vakuumpumpen och plasma makt och ventilera kammaren till atmosfären.
- Ta ut objektglas och PDMS lager från plasma kammaren och tryck snabbt på alla fyra kanter av lagrets PDMS in i bilden med ett jämnt tryck (figur 3 L). Kontrollera regionen center oval av lagrets PDMS (roten kammaren) inte vidrör bilden.
- Placera förseglade EcoFAB enheten på en 120 ° C värme block för 20 min att ytterligare säkra permanent limning mellan PDMS lagret och objektglas.
- Låt enheten svalna i 5 min. Trim av extra kanterna av lagrets PDMS med en kniv.
- Skölj bindning sida PDMS lagret (gjorda av en 15:1-elastomer bas till härdning agent blandning) och 7,6 × 5 cm Mikroskop glida med metanol och sedan blåsa torrt med tryckluft eller en ultrarent kväve pistol.
- Reversibel fysisk försegling av PDMS lagren till objektglas
- Den reversibla tätning teknik använder tredjeparts en uppsättning anpassade klämmor (antingen skrivas ut av en 3D plast skrivare eller maskinbearbetade i metall, ritningar visas i figur 4).
- Placera objektglas i utskärningen på klämman bottenplattan, och sedan justera PDMS lagret (gjorda av en 5:1 elastomer bas till härdning agent blandning) ovanpå bilden.
- Placera den övre klämma plattan över PDMS lagret. Säkra övre och nedre plattorna tillsammans med fyra hex cap skruvar, orientera skruvarna så att muttrarna är gängade på från toppen av klämman.
- Vidhängande PDMS direkt till objektglas
- Placera det PDMS lagret (gjorda av en 30: 1 elastomer bas till härdning agent blandning) ovanpå ett objektglas.
- Tryck på PDMS lagret i bilden. Mjuk, mycket självhäftande PDMS lagret (30: 1) bör hålla sig till bild skapar en vattentät tätning utan permanent kemisk bindning eller fysisk press från en klämma (figur 3 L).
- Den reversibla tätning teknik använder tredjeparts en uppsättning anpassade klämmor (antingen skrivas ut av en 3D plast skrivare eller maskinbearbetade i metall, ritningar visas i figur 4).
3. EcoFABs sterilisering
- Skölj EcoFAB enheter med ultrarent vatten.
- Placera en EcoFAB enhet i en EcoFAB behållare och tillsätt 70% etanol tills enheten är nedsänkt. Stäng behållare locket och skaka försiktigt våta alla ytor inuti med etanol. Kontrollera att roten tillväxt kammare EcoFAB enheten fylls med etanol, med mycket få eller inga luftbubblor.
- Efter inkubation vid rumstemperatur i 30 min, Häll av 70% etanol och upprepa inkubering med 100% etanol för 5 min.
- Rinna ut etanol och inkubera den steriliserade EcoFAB för 16 h i en LAF för att torka den helt. Om tillgängligt, sterilisera systemet genom att vrida på UV ljus inom huva för 1 h.
Försiktighet: Bära lämplig personlig skyddsutrustning vid arbete med UV ljus. - Förvara den steriliserade EcoFABs i en steril huva eller autoklaveras väskor för framtida bruk.
4. EcoFABs med LED växa lampor (figur 5)
- Fästa LED remsor på EcoFAB behållare
- Märk ut platserna på behållaren EcoFAB för 9 LED clips. Börja med det första klippet 120 mm upp från botten av behållaren längs en kant (figur 5A) och fortsätt Markera ut klippet platser i en spiral runt behållaren med varje nästa klipp att lämna 10 mm. En spiral av 9 klipp som gör att en 1 m LED strip att linda runt behållaren två gånger.
- Varmlimma en LED clip till varje markerad position genom att lägga till två sandskädda av varmt lim på behållaren, i linje med ståndpunkten som klippen monteringshålen. Tryck in klipp hål i dessa två sandskädda lim, sedan lägga en annan dab lim ovanpå hålen. Upprepa proceduren för alla klipp tills 9 klipp bildar en spiral (figur 5B).
Försiktighet: Använd skyddshandskar och annan personlig skyddsutrustning när du arbetar med varmt lim att undvika brännskador. - Trä LED strip igenom klippen i en spiralform, med lysdioder vänd in i behållaren. Remsan bör cirklar runt två gånger (figur 5 c).
- Anslutning LED remsor till elnätet med en handkontroll (figur 5 d visar en EcoFAB kammare med belysta ljus, programmering av handkontrollen beskrivs i steg 4,3).
Varning: Risk för elektriska stötar: se till att nätadaptern är urkopplad när du ansluter kablarna.- Anslut de positiva och negativa terminalerna för strömförsörjning till ”INPUT: V +” och ”INPUT: V-” plintar av handkontrollen med 2-tråds kabel (figur 5E visar en schematisk ritning av controller setup).
- Anslut negativa från bare slutet av en kvinna-till-bare kabel till en ”OUTPUT” kanal på handkontrollen.
Obs: Det finns fem kanaler på den controller som utnyttjas i detta protokoll, så det kan stödja upp till fem 1 m LED strips. - Ansluta alla positiva leder kablar till en kompakt skarvning connector (om mer än en kanaler behövs), och sedan länka den här kontakten till ”OUTPUT V +” terminal av registeransvarige.
- Anslut varje LED strip till honkontakten på kablarna, så varje lysdiod har en egen kanal kontrolleras. Om så önskas, Använd kvinna-till-hane kablar för att utöka räckvidden.
- Programmera registeransvarige för en önskad ljus cykel enligt tillverkarens instruktioner,
5. odling av växter i EcoFABs
- Utsäde sterilisering och grobarhet
Obs: Utsäde sterilisering och alla följande steg med plantor måste utföras under sterila förhållanden. Steriliseringsprocessens diskuteras nedan är lämplig att frön från Arabidopsis thaliana, Avena barbata, Brachypodium distachyonoch Panicum virgatum. Panicum virgatum frön bör avbrytas i 60% svavelsyra för 1 h innan steriliseringsprocessen. Det är klokt att förbereda 1-2 frön per EcoFAB enhet, med tanke på grobarheten och homogenitet grobarhet.- Blötlägg fröna i 70% etanol i 2 min.
- Ta bort etanol med en pipett, och skölj fröna med sterilt vatten tre gånger.
- Lämna fröna i 10% blekmedel lösning för 5 min.
- Ta bort blekmedel lösningen och tvätta frön med sterilt vatten tre gånger.
- Lägga till sterilt vatten fröna och inkubera mikrocentrifug röret i kylskåp 4 ° C i 7 dagar.
- Jämnt sprida frön på 0,5 Murashige & Skoog (MS) medium med 0,6% phytagel och förslut plattorna med mikaeljacobsson tejp.
- Odla växterna till en rot längd av ca 5 mm för överföring till EcoFABs (figur 6A). För experiment presenteras här, applicera en 16 h ljus/8 h mörka belysning regim i en kammare med 22 ° C i tillväxt, och inkubera växterna 2-7 d innan överföring till EcoFAB (2 dagar för Avena barbata och Brachypodium distachyon, 7 dagar för Arabidopsis thaliana och Panicum virgatum).
- Överföra plantor till EcoFABs med flytande medium (figur 6)
- Med en steril spruta eller mikropipett, spola roten kammaren av en EcoFAB enhet med sterilt vatten för tre gånger, och sedan fylla roten kammaren med odlingsmedium sevärdheter, till exempel 0,5 MS medium (figur 6B, steg 5.1.6).
- För försiktigt in en enda fröplanta i reservoaren växt av EcoFAB enheten (figur 6 c).
Obs: Roten bör vara helt nedsänkt inuti roten kammaren, med skjuta sticker ut ur behållaren. - Tillsätt 3 mL sterilt vatten i behållaren, för att undvika EcoFAB enheten. Detta kommer att öka luftfuktigheten och minska avdunstningen av mediet från roten kammaren.
- Stäng behållaren och försegla locket med mikaeljacobsson tejp (figur 6 d).
- Placera EcoFAB i en växt inkubator, eller utnyttja EcoFAB belysning systemet i en kontrollerad temperatur miljö lämplig för tillväxten av anläggningen respektive (steg 4). För denna studie, in i kammaren till 24 ° C.
- Regelbundet kontrollera EcoFAB för att fylla tillväxtmassmedia inne i roten tillväxt kammaren och lägga till vatten i behållaren. Utföra alla steg i sterila förhållanden.
Obs: För tidig växt tillväxtfaserna, påfyllning av roten tillväxt kammaren krävs varje 5 till 7 dagar. För senare tillväxtfaserna krävs en påfyllning varje 2 till 3 dagar. Om du vill använda en spruta eller pipett att samla rot exsudat lösning från roten tillväxt kamrarna i en mikrocentrifug rör och förvaras det i-80 ° C frys; Dessutom bild rot morfologi med en gel imager eller Mikroskop.
- Överföra plantor till EcoFABs med fasta substrat
- Använd rot kamrarna fabricerade med en 5:1 blandning av elastomer bas till härdare om använder en uppsättning anpassade klämmor för att fästa det till ett objektglas (figur 3 K, figur 4); eller välja ett PDMS lager av 30: 1 bas till härdning agent blandning om följa PDMS lager bilder direkt (som beskrivs i steg 2.2).
- Sterilisera de EcoFAB kammarna, som beskrivs i steg 3.
- Försiktigt lägga till steriliserade jord/sand in i roten kammaren, vänd PDMS lagret upp och ned och lägga substratet till roten kammaren. Undvika eventuella partiklar faller på området som kommer i kontakt med objektglas, eftersom detta kommer att minska vidhäftning.
- Placera objektglas ovanpå PDMS lagret och tryck på alla kanterna ordentligt. Noggrant flip EcoFAB enheten så att ingen jord/sand faller ur reservoaren öppning.
Obs: För EcoFAB enheter tillverkade av en 5:1 bas att bota agent blandningen, Använd en anpassad klämma för att säkra tätningen. - Flow flytande medium eller vatten genom inlopp eller utlopp EcoFAB enheten och överföra en fröplanta i dess växt reservoar, som beskrivs i steg 3.3.
- Lägga till mikrober i EcoFABs
- Överföra en mikrobiell koloni till en inkubation röret med 8 mL LB buljong och odla den till OD 0,5 (ca 12 h).
- Överför kulturen lösningen i en 15 mL centrifugrör och centrifugera det i rumstemperatur 5 minuter vid 3000 x g till pellet mikrober.
- Avlägsna supernatanten och tillsätt 8 mL växt tillväxt medium används i målet EcoFAB. Centrifugerade av mikrober och centrifugera röret i rumstemperatur 5 minuter vid 3000 x g.
- Upprepa steg 5.4.3. två gånger för att helt avlägsna alla LB näringsämnen spår.
- Lägga till växten odlingsmedium tvättade mikrob pelleten tills dess optiska densitet är ca 0,5 på 600 nm.
- Tillsätt 20 µL av mikrob lösningen in i roten kammaren genom EcoFAB utlopp. De stammar som används i denna publikation reste för att plantera rötter inom 2-3 dagar och började kolonisera rotytor.
- För konstruerad Kemiluminiscens, se till att inkludera induceraren (1 mM IPTG) i växten odlingsmedium inducera luciferas uttryck.
6. metabolit profilering av roten exudat från EcoFABs
- Provberedning för LC/MS baserad metabolomik analys
- Sätta mikrocentrifugrör med roten exudat som samlats in från EcoFABs i en lyophilizer, och slå på lyophilizer att ta bort allt vatten från rören.
- Tillsätt 300 µL av LC-MS grade metanol i varje rör och Sonikera i 30 min.
Försiktighet: Använd personlig skyddsutrustning när du arbetar med metanol. - Placera rören i en centrifug och centrifugera dem 3000 x g i 5 min.
- Överför supernatanten lösningar till nya mikrocentrifugrör och avdunsta metanol i en vakuum koncentrator.
- Tillsätt 150 µL av metanol med 1 mM LC-MS interna standarder i varje rör och inkubera rören i kylskåp 4 ° C i 12 h.
- Centrifugera rören vid 3000 x g i 5 min, och överför supernatanten till 0,22 µm filter tubes.
- Centrifugera rören filter, och överföra de filtrerade lösningarna till 2,0 mL LC/MS injektionsflaskor med 200 µL av skär.
- Placera rören inuti en LC/MS rack och ladda racket inuti LC/MS auto-sampler.
- Analys av data
- Får en tillgång av metaboliten Atlas och anpassade Python skript26 eller använda andra data analysprogram.
- Identifiera metaboliter baserat på m /z -värden, retentionstiden och sammansatta fragmentering mönster med hjälp av ett bibliotek av metaboliten standarder. 27
7. massa Spectroscopic Imaging av växternas rötter i EcoFABs (figur 7)
Obs: EcoFAB enheter av en 5:1 elastomer bas till härdning agent blandning med anpassade klämmor (figur 7A) används för roten stämpling på nanostruktur-initierare masspektrometri (NIMS) chips,28,29,30 eftersom PDMS lager kan limmas fast omvänt till ytbehandlar av NIMS marker.
- Sterilisera en NIMS chip yta med UV-ljus för 1 h.
- Plocka en EcoFAB med en växande växt ur ruvmaskinen, och placera den i en steril huva.
- Öppna behållaren EcoFAB och ta bort den övre plattan av klämman.
- Lyft upp det PDMS lagret tillsammans med växten inne och fäst försiktigt PDMS lagret med växten på en NIMS chip (figur 7BD, E).
Obs: När roten vidrör NIMS chip yta, det bör inte flyttas. Detta förhindrar ”smetar” root metaboliter. - Tryck försiktigt ner rötterna genom PDMS lagret tills rötterna fullt kontakta NIMS ytan. Lämna rötterna på NIMS ytan i 20 min.
- Lyft av PDMS lagret inklusive växten från NIMS chip, igen undvika flytta roten över NIMS ytan. Tillbaka växten till klämman om så önskas.
- Fäst NIMS chip på en anpassad MALDI-tallrik och läsa in plattan i en MALDI spektrometer för massa imaging (figur 7 c).
- Använda OpenMSI program för att generera NIMS bilden av roten metaboliter (figur 7 d-G)31.
Representative Results
Varje EcoFAB-systemet innehåller en EcoFAB-enhet och en växt stora genomskinliga plastbehållare. En EcoFAB enhet har en växt reservoar, en rot tillväxt kammare, en 1,6 mm flöde inlopp och en 1,6 mm utlopp för standard EcoFAB enhet (figur 2D & figur 3 H) eller en 10 mm utlopp för wide-outlet EcoFAB enhet (figur 2F & figur 3I ). Reservoaren anläggning är utformad i en trapetsoid form som har en 6 mm topp öppning och 3 mm botten öppning, och denna design minskar risken för flöde läckage under flytande injektion och säkerställer också tillräckligt med utrymme för växternas tillväxt. Roten tillväxt kammaren antar en oval form med 2 mm djup för att passa många modell växternas rotsystem, som visas i figur 2 c och E. Både in- och utlopp kanaler av en standard EcoFAB-enhet kan anslutas med PTFE slangar så näringslösningar kan flöda in i roten tillväxt kammaren utan att öppna behållaren EcoFAB. Wide-outlet EcoFAB enheten kraftigt minskar motståndet av utlopp och används företrädesvis vid odling av växter med tjocka rotsystem eller regelbundet samla rot exudat efter komplexa rotsystem härrör från växter.
Gjutning formarna för att fabricera PDMS lager av EcoFAB enheter skapas i en design mjukvara, och sedan 3D tryckta i styv ogenomskinlig polymerer, som visas i figur 2 och figur 3. Växter inne EcoFABs kan observeras direkt med ett Mikroskop med en lång arbetsavstånd, att säkerställa den sterila växa miljö (figur 8A, Kompletterande fil 1). EcoFAB enheter med växter kan även passa till en högupplöst Mikroskop scenen, som möjliggör högre upplösning imaging av växt-mikrobinteraktioner (figur 8B, Kompletterande fil 2). Sterilitet bevaras inte i denna miljö och högupplösta imaging är därför endast lämplig för endpoint mätningar.
EcoFABs är utformad så att systematiska studier av växter, såsom deras morfologi, ämnesomsättning och mikrobiella samhällen på de olika tillväxtfaserna hela deras livscykel. Här undersöktes EcoFABs som en allmän plattform för att studera en mängd växtarter. Figur 8 c -E visar 7 - dag-gammal Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyonoch Panicum virgatum växer i EcoFABs. Alla tre växter konstaterades för att växa bra i EcoFAB för över en månad. Både dikotyledon, Arabidopsis thaliana och enhjärtbladiga, hittades Brachypodium distachyon för att leva upp till deras reproduktion stadier i EcoFABs.
Den reversibla tätningssystem tillåter användning av fasta substrat (t.ex., jord) inom EcoFABs (steg 2.2). Detta reversibel tätning tillvägagångssätt möjliggör lastning av fasta substrat in rot tillväxt kamrarna och möjliggör också insamling av prover från specifika regioner av roten rhizospheres. Figur 8F -H visar en grupp 14 - dag-gammal Brachypodium distachyon odling i hydrokultur medium, samt sand och jord som kompletteras med hydroponiska medium (sand) och vatten (jord). Tunn fasta substrat lagret i roten tillväxt chambers tillåter ljuset att tränga igenom för mikroskopbilder av rotsystem.
Root morfologi definieras som rumsliga konfiguration och distribution av ett plant rotsystem och har godkänts som ett grundläggande fysiologi svar på olika tillväxt miljöer, såsom näringsämne eller vatten tillgänglighet32,33, 34. EcoFABs ger en bekväm metod att studera växt morfologi över tid eller under olika näringsrika förhållanden. Figur 9A-F visar ett exempel på att använda EcoFABs för att spåra rot morfologier av Brachypodium distachyon i de första tre veckorna. En Brachypodium distachyon fröplanta överfördes till EcoFAB enheten och dess roten struktur spelades av en kamera inuti en BIO-RAD gel imager. Bild bearbetningsprogram, såsom bild J, python och matlab, kan tillämpas ytterligare för att kvantifiera ändringarna av roten morfologier över tid eller på olika medium miljöer. Kvantifiering av totala root område under loppet av tre veckor visade en gradvis ökning i tidigt skede (< 1 vecka) följt av en linjär tillväxttrend till slutet av tre veckor, som visas i figur 9G.
En primär motivation för att konstruera EcoFAB är att undersöka växt-mikrobinteraktioner. Som beskrivs i steg 5,4, överförs mikroorganismer till roten tillväxt avdelningar med EcoFAB enheter genom öppningen kanaliserar. Figur 10 visar, en EcoFAB som innehåller Pseudomonas simea (tidigarefluorescens) WCS417 (WCS417), en växttillväxt att främja rhizobacteria med Kemiluminiscens etiketter, lades in i växten rotsystem med en koncentration av 106 celler per planta. WCS417 signalen upptäcktes med en gel imager, som indikerade en distinkt rumsliga fördelning av WCS417 mikrober i roten tillväxt chambers. I både MS flytande medium med och utan sand fasta substrat koloniserade WCS417 mikrober ytbehandlar av hela rotsystem med mikrober koncentrerade runt roten tip, möjligen på grund av aktiva näringsämnen produktion av roten tips (figur 10G & H)35. Å andra WCS417 mikrober i jord substrat samlats runt regionen växt reservoar i stället för roten tips (figur 10jag). Som mikrober tillfogades genom kanalen utlopp, mikrober kunde också flytta i jord substrat, men ackumuleras inte på roten, som observerats i flytande medium med eller utan sand. Detta kan tyda på att jorden är en tillräcklig näringskälla och mikrober migrerat till reservoaren växt för optimal andning villkor.
För att studera metabolit profilering av växten rot exudat samt metabolit upptag och släppa från växt-mikrobinteraktioner, samlades de exsudat lösningarna från roten tillväxt kamrarna investeringsfaser olika tillväxt av växter i EcoFABs. Som beskrivs i steg 6, extraheras sedan exsudat prover för LC-MS-analys. Med den här metoden upptäcktes en rad metaboliter exuded vid växten och konsumeras av mikrober och relaterade metabolit profilering av roten exudat med och utan mikrober colonization är för närvarande under utredning.
Figur 1: The EcoFAB arbetsflöde. Växter är grodde på plattan, och överföras till den steriliserade EcoFAB, mikrober kan läggas. Icke-förstörande provtagning: roten exudat kan provtas och avbildade, och roten morfologi kan visualiseras. Destruktiva provtagning tillåter analys av mikrob, rot och skjuta parametrar i detalj.
Figur 2: komponenter i 3D tryckta formar för EcoFAB enhet fabrication. (A) övre och lutad över en Ingjutningsram. (B) topp och lutad över ett skär. (C) topp och lutad över en standard mögel bas. (E) topp och lutad över en wide-outlet mögel bas. (D, F) Monterade formar för fabricera standard och wide-outlet EcoFAB enheter, respektive. Oval måtten är 51 mm x 34 mm för liten EcoFAB mögel och 76 mm x 62 mm för stora EcoFAB mögel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: EcoFAB enhet fabrication. (A) hälla blandningen av elastomer bas och bota agent i mögel. (B) värme formen med blandningen vid 85 ° C i 4 h. (C) ta bort insatsen från mögel. (D) separera PDMS från Ingjutningsram. (E) driver mögel bas ur gjutning ramen. (F) använda en kniv för att skilja PDMS från mögel längs kanterna. (G) peeling PDMS lagret långsamt bort mögel basen. (H) peta hål för både in- och utlopp kanaler av lagrets standard PDMS. (I) peta ett hål för öppningen kanaliserar av lagrets wide-outlet PDMS. (J) PDMS lager (gjorda av en 15:1-elastomer bas till härdning agent blandning) och ett objektglas är sköljda och överförs till en plasma renare för limning. (K) använda klämmor för att behålla ett objektglas PDMS lagret (gjorda av en 5:1 elastomer bas till härdning agent blandning). (L) trycka på PDMS lagret (gjorda av en 30: 1 elastomer bas till härdning agent blandning) direkt på ett objektglas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: utformningen av anpassade klämmor. (A) övre och lutad över en topp klämma plattan. (B) topp och lutad över en botten klämma plattan. (C) topp och lutad över monterade klämma med fyra uppsättningar av hex cap skruvar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: installera LED växa lampor. (A) märkning ut platserna för 9 LED klipp i en spiral runt behållaren EcoFAB. (B) LED clips fäst till behållaren för EcoFAB. (C) threading en LED strip genom dessa klipp. (D) anslutning LED strip till en styrenhet som fast med en 24V strömförsörjning. (E) Schematisk bild av kabelanslutningar till styrenheten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: överföra plantor till EcoFABs. (A) Brachypodium distachyon växter som odlas för 2 dagar på en 0.5 MS tallrik. (B) fylla roten kammaren med växt odlingsmedium. (C) använda en pincett för att försiktigt in roten i reservoaren växt. (D) tätning EcoFAB behållaren med mikaeljacobsson tejp, efter att tillsätta 3 mL vatten i botten av behållaren. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: NIMS avbildning av växten rötter i EcoFABs. (A) en Brachypodium distachyon växer i en steril EcoFAB. (B) fästa PDMS lagret med växten på en NIMS marker för 20 min. (C) använda koppar band att fästa NIMS chip på en anpassad MALDI-tallrik och laddar det i en MALDI masspektrometer. (D-G) en 7 - dag gammal och en 20 - dag-gammal Brachypodium distachyon anläggning som används för NIMS imaging (D, E) och de motsvarande NIMS bilderna (F, G). De dominerande jonerna belystes i röd, grön och blå. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: de allmänna tillämpningarna av EcoFABs. (A) direkt fånga rottillväxt av Brachypodium distachyon i en EcoFAB med en lång arbete avstånd Mikroskop setup. (B) direkt observera rot-mikrobinteraktioner med en högupplöst Mikroskop setup. (C-E) 7 - dag-gammal Arabidopsis thaliana (C), Brachypodium distachyon (D) och Panicum virgatum (E) i 0,5 MS hydroponiska medium, (F-H) 14 - dag-gammal Brachypodium distachyon vuxit i 0.5 MS hydrokultur (F), i sand (G) och jord (H) substrat som levereras med 0.5 MS medium och vatten, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9: använda EcoFABs för att studera rot morfologi. (A-F) Rotutveckling Brachypodium distachyon växa i EcoFABs fylld med 0.5 MS medium under första tre veckorna: a 2 dagar, (B) 4 dagar, (C) 7 dagar, (D) 11 dagar, (E) 14 dagar, f 21 dagar av tillväxt. (G) i genomsnitt rot ytor uppskattades av ImageJ software. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 10: använda EcoFABs för att studera rot-mikrobinteraktioner. (A, B, C) En grupp av 15 - dag-gammal Brachypodium distachyon kolonisera med Pseudomonas fluorescens WCS417 i olika former av media-MS substrat för flytande lösning, sand och jord. (D, E, F) Ljusa fält bilder på deras rotsystem. (G, H, I) Motsvarande Kemiluminiscens bilder av dessa rotsystem efter 14 dagar samtidig odling. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande fil 1. Använda EcoFAB för att fånga rottillväxt. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande fil 2. Använda EcoFAB för att fånga rot-mikrober interaktioner. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Discussion
Protokollen redovisas här för att skapa med ekosystemet fabrication EcoFABs innehåller gemenskapens resurser för systematiskt växt systembiologiska studier i starkt kontrollerad laboratoriemiljö. Framsteg inom 3D-printing tillhandahålla lättillgänglig teknik för att konstruera och iterativt raffinering EcoFAB mönster. Roten kammaren presenteras här visar sig vara väl lämpad för imaging mikroskopi och upprätthålla sterilitet, möjliggör kontrollerad tillsats av mikrober att undersöka växt-mikrobinteraktioner. EcoFAB plattformen är kompatibel med olika växtarter. Det är viktigt att känna igen fysiologiska effekter av växande växter inom smala roten kammaren så att ytterligare experiment kommer att behöva generalisera resultaten till växter som växer i naturliga miljöer.
Användning av sterila kamrar och LED ljusna gör undersökningen av effekterna av olika ljusförhållanden, inklusive våglängd, intensitet och varaktighet, om växters tillväxt och relaterade fysiologiska parametrar parallellt. Reversibel limning rot kammare tillåta användning av fasta substrat samt att rumsligt samla fasta prover för biokemisk och genetisk analys. Tillämpningar av fasta substrat, såsom jord, sand och kvarts pärlor, erbjuda möjligheterna att använda EcoFABs för att konstruera mer ekologiskt relevanta laboratorium ekosystem. Men förfina alla de system som presenteras här använder mättad vätska (hydroponiska kulturer) som inte är en korrekt speglar de flesta jordar och det blir viktigt att ytterligare dessa mönster att upprätthålla luftfickor i marken så att de bättre representera naturliga jordar.
Användningen av både enkla kameror och Mikroskop beskrivs till imageutveckling rotsystem morfologi på både bulk till cellulära nivåer. Denna lämplighet för övervakning rot morfologi avbildning och kvantifiering kommer sannolikt bra för att förstå regleringsmekanismer av växten fysiologiska och molekylära signaler utlöses av växten genotypisk anpassningar till tillväxt villkorar. En begränsning för att studera fysiologiska rotutveckling är dock aktuella horisontell placering av EcoFAB enheten. I naturliga miljöer leder rötter gravitropic svar till en övervägande vertikal utveckling av rotsystemet. Således, det horisontella systemet presenteras här sannolikt skiljer sig i vissa faktorer från en naturlig miljö och tillverkning av EcoFAB system med vertikal placering av roten kammaren är ett önskvärt mål för framtida EcoFAB versioner. Även om de nuvarande EcoFAB enheterna placeras horisontellt, är analys av roten morfologi parametrar i olika förhållanden, eller som svar på mikrober, möjligt. Hög upplösning imaging kan användas för att fånga roten kolonisation dynamiken i enstaka isolat eller samhällen, som ger information om vilken växt delar är koloniserade i olika näringsämnen tillräcklig och bristfälliga förhållanden. Det förväntas att sådana studier kommer att ge viktiga nya insikter i hur växten microbiomes monteras, och hur dessa dynamics förändras över tid, till exempel som rötterna utvecklas.
Mikroflödessystem enheter aktivera avbildning av mycket unga plantor och mängden metaboliter samlas in räcker oftast inte för LCMS analys. Jord-baserade system, såsom rhizotrons, Tillåt bildtagning av roten morfologi när antingen växterna omvandlas med Kemiluminiscens konstruera (Glo-root) eller med NMR-baserade metoder33,34. Metabolit extraktioner från dessa system är tidskrävande på grund av stor mängd prover. EcoFABs är en kombination av båda: tillverkning är liknar mikroflödessystem enheter. EcoFABs utformades för att vara enkel och billig att återge, men storleken på kammaren kan justeras för att odla växter med små eller stora rotsystem, upp till deras reproduktiva faser. Samtidiga observationer av roten morfologi förändringar och rot exsudation är möjliga. Systemet är steril, möjliggör kontrollerad tillsats av särskilda mikrober.
EcoFABs är utformade för att möjliggöra kontrollerad introduktion och provtagning av mikrober och metaboliter. Specifikt, befunnits prover som tagits från roten tillväxt chambers vara tillräckliga för massa spektroskopiska metabolit profilering. Integrationen av masspektrometri imaging (t.ex., NIMS teknik presenteras här) ger en oförstörande metod att studera metabolit rumsliga distributioner av rotsystem. Denna teknik kommer sannolikt bra i framtiden stabil isotop spårning experiment och mappning mikrobiell lokalisering till specifika metaboliter36. Detta protokoll har fokuserat på enstaka isolat, kan samma design säkert användas för mer komplexa samhällen. De provmängder och biomassa inom EcoFABs är sannolikt mer än tillräcklig för ytterligare integration med DNA-sekvensering teknik, som kommer att vara viktigt att karakterisera och övervaka mikrobiell gemenskapens struktur och gen uttryck.
Avslutningsvis detta protokoll Detaljer tillverkning av laboratoriet ekosystem utformats för utredning av växt-mikrobinteraktioner, med betoning på enkla och tillgängliga metoder som enkelt kan implementeras och utökad av forskare runt den världen. Aktuella insatser syftar till att påvisa reproducerbarhet mellan labs och integrering av ett system för kontroll av temperatur så att varje EcoFAB kommer har reglerbar ljus och temperatur. En ytterligare befordran av systemet kommer att integrationen av automatiserad provtagning och påfyllning av EcoFAB rot kamrarna och utvecklingen av reproducerbara protokoll för att fastställa relevanta växt microbiomes inom EcoFABs.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av laboratorium riktad forskning och utveckling (LDRD) program av Lawrence Berkeley National Laboratory stöds av i Office of Science, av US Department of Energy under Kontraktsnr DE-AC02-05CH11231 och en utmärkelse DE-SC0014079 från US Department of Energy Office av Science till UC Berkeley. Arbete molekylär Gjuteriet fick stöd enligt US Department av energi Kontraktsnr. DE-AC02-05CH11231. Vi tackar också Suzanne M. Kosina, Katherine Louie, Benjamin P. Bowen och Benjamin J. Cole vid Lawrence Berkeley National Laboratory för all deras hjälp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printed custom mold | LBNL | STL files available here www.eco-fab.org; The EcoFABs molds described here were printed by FATHOM: http://studiofathom.com | |
| Dow sylgard 184 silicone elastomer clear kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Air duster spray | VWR | 75780-350 | any compressed gas duster should work |
| 15 gauge blunt needle | VWR | 89166-240 | |
| 5 mL syringe with Luer-Lok Tip | VWR | BD309646 | |
| 3”x2” microscope glass slide | VWR | 48382-179 | |
| 1.75" x 2.56" x 3.56" EcoFAB box | Amazon | B005GAQ25Q | |
| 4” x 3 ¼” microscope glass slide | Ted Pella | 260231 | |
| 4.87" x 4.87" x 5.50" EcoFAB box | Amazon | B00P9QVOS2 | |
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| 3D printed custom clamp | LBNL | STL files available from Trent Northen's lab | |
| Sterile hood | AirClean Systems | AC600 Series PCR Workstations | |
| PTFE syringe tubing | Sigma-Aldrich | Z117315-1EA | |
| Ethanol | VWR | 89125-172 | |
| Bleach | |||
| Murashige and Skoog (MS) Macronutrient Salt Base | Phytotechnologies Laboratories | M502 | |
| Murashige and Skoog (MS) Micronutrient Salt Base | Phytotechnologies Laboratories | M554 | |
| Soil | Hummert International | Pro-Mix PGX | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | 71010-52-1 | |
| Arabidopsis thaliana | Lehle Seeds | WT-24 Col-4 Columbia wild type | |
| Brachypodium distachyon | LBNL | Standard Bd-21 line | Available from John Vogel's lab |
| Panicum virgatum | The Samuel Roberts Noble Foundation | Alamo switchgrass | |
| Micropore tape | VWR | 56222-182 | |
| LC-MS grade methanol | VWR | JT9830-3 | |
| Lyophilizer | LABCONCO | FreeZone 2.5 Plus | |
| SpeedVAC concentrator | Thermo Scientific | Savant™ SPD111 SpeedVac | |
| Ultrafree-MC GV Centrifugal Filter-0.22 µm | Millipore | UFC30GV00 | |
| Liquid chromotography system | Agilent | Agilent 1290 LC system | |
| Q Exactive mass spectrometer | Thermo Scientific | Q Exactive™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap MS | |
| NIMS chip and custom MALDI plate | LBNL | For detailed protocol see: doi:10.1038/nprot.2008.110 | |
| MALDI mass spectrometer | AB Sciex | TOF/TOF 5800 MALDI MS | |
| Nano-coated LED grow light strip | LED World Lighting | HH-SRB60F010-2835 | |
| Power supply | LED World Lighting | MD45W24VA, LV100-24N-UNV-J | |
| TC420 controller | Amazon | B0197U7R8Q | |
| Silicone LED clips | Amazon | B00N9X1GI0 | |
| Hot glue gun | Amazon | B006IY359K | |
| Female-to-bare LED connector cable | LED World Lighting | HH-F05 | |
| Female-to-male LED connector extension cable | LED World Lighting | HH-MF1 | |
| 20AWG 2-wire cable | LED World Lighting | 6102051TFT4 | |
| WAGO 221-415 Splicing Connector | LED World Lighting | 221-415 |
References
- Morrissey, J. P., Dow, J. M., Mark, G. L., O'Gara, F. Are microbes at the root of a solution to world food production. EMBO Rep. 5 (10), 922-926 (2004).
- Farrar, K., Bryant, D., Cope-Selby, N. Understanding and engineering beneficial plant-microbe interactions: plant growth promotion in energy crops. Plant Biotechnol J. 12 (9), 1193-1206 (2014).
- Singh, J. S., Abhilash, P. C., Gupta, V. K. Agriculturally Important Microbes in Sustainable Food Production. Trends Biotechnol. 34 (10), 773-775 (2016).
- Dubey, R. K., Tripathi, V., Dubey, P. K., Singh, H. B., Abhilash, P. C. Exploring rhizospheric interactions for agricultural sustainability: the need of integrative research on multi-trophic interactions. J Clean Prod. 115, 362-365 (2016).
- Hunter, P. Plant microbiomes and sustainable agriculture. EMBO Rep. 17 (12), 1696-1699 (2016).
- van der Heijden, M. G. A., Hartmann, M. Networking in the Plant Microbiome. PLoS Biol. 14 (2), e1002378 (2016).
- Vessey, J. K. Plant growth promoting rhizobacteria as biofertilizers. Plant Soil. 255 (2), 571-586 (2003).
- Yang, J., Kloepper, J. W., Ryu, C. -M. Rhizosphere bacteria help plants tolerate abiotic stress. Trends Plant Sci. 14 (1), 1-4 (2009).
- Reynolds, H. L., Packer, A., Bever, J. D., Clay, K. GRASSROOTS ECOLOGY: PLANT-MICROBE-SOIL INTERACTIONS AS DRIVERS OF PLANT COMMUNITY STRUCTURE AND DYNAMICS. Ecology. 84 (9), 2281-2291 (2003).
- Finkel, O. M., Castrillo, G., Herrera Paredes, S., Salas González, I., Dangl, J. L. Understanding and exploiting plant beneficial microbes. Curr Opin Plant Biol. 38, 155-163 (2017).
- Northen, T. R., Zhang, Z., Gao, J., Swenson, T., Yoshikuni, Y. Advancing Our Understanding of the Chemistry of Soil Microbiomes. National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. 2017. The Chemistry of Microbiomes: Proceedings of a Seminar Series. , The National Academies Press. Washington, DC. (2017).
- Busby, P. E., et al. Research priorities for harnessing plant microbiomes in sustainable agriculture. PLOS Biology. 15 (3), e2001793 (2017).
- Sanati Nezhad, A. Microfluidic platforms for plant cells studies. Lab Chip. 14 (17), 3262-3274 (2014).
- Oburger, E., et al. Evaluation of a novel tool for sampling root exudates from soil-grown plants compared to conventional techniques. Environ Exp Bot. 87, 235-247 (2013).
- Van Der Krift, T. A. J., Berendse, F. Root life spans of four grass species from habitats differing in nutrient availability. Funct Ecol. 16 (2), 198-203 (2002).
- Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup. P Natl. Acad. Sci. USA. 114 (17), 4549-4554 (2017).
- Sanati Nezhad, A., Naghavi, M., Packirisamy, M., Bhat, R., Geitmann, A. Quantification of cellular penetrative forces using lab-on-a-chip technology and finite element modeling. P Natl. Acad. Sci. USA. 110 (20), 8093-8098 (2013).
- Jiang, H., Xu, Z., Aluru, M. R., Dong, L. Plant chip for high-throughput phenotyping of Arabidopsis. Lab Chip. 14 (7), 1281-1293 (2014).
- Parashar, A., Pandey, S. Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis. Appl. Phys. Lett. 98 (26), 263703 (2011).
- Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression. Nat Methods. 9 (11), 1101-1106 (2012).
- Grossmann, G., et al. The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science. Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).
- Aufrecht, J. A., Ryan, J. M., Hasim, S., Allison, D. P., Nebenführ, A., Doktycz, M. J., Retterer, S. T. Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform. J. Vis. Exp. (126), (2017).
- Garvin, D. F., et al. Development of Genetic and Genomic Research Resources for Brachypodium distachyon, a New Model System for Grass Crop Research. Crop Sci. 48 (Supplement_1), S69-S84 (2008).
- Lisensky, G. C., et al. Replication and Compression of Surface Structures with Polydimethylsiloxane Elastomer. J. Chem. Educ. 76 (4), 537 (1999).
- Friend, J., Yeo, L. Fabrication of microfluidic devices using polydimethylsiloxane. Biomicrofluidics. 4 (2), 026502 (2010).
- Yao, Y., et al. Analysis of Metabolomics Datasets with High-Performance Computing and Metabolite Atlases. Metabolites. 5 (3), 431-442 (2015).
- Sumner, L. W., et al. Proposed minimum reporting standards for chemical analysis Chemical Analysis Working Group (CAWG) Metabolomics Standards Initiative (MSI). Metabolomics. 3 (3), 211-221 (2007).
- Gao, J., de Raad, M., Bowen, B. P., Zuckermann, R. N., Northen, T. R. Application of Black Silicon for Nanostructure-Initiator Mass Spectrometry. Anal. Chem. 88 (3), 1625-1630 (2016).
- Gao, J., et al. Morphology-Driven Control of Metabolite Selectivity Using Nanostructure-Initiator Mass Spectrometry. Anal. Chem. 89 (12), 6521-6526 (2017).
- Woo, H. -K., Northen, T. R., Yanes, O., Siuzdak, G. Nanostructure-initiator mass spectrometry: a protocol for preparing and applying NIMS surfaces for high-sensitivity mass analysis. Nat. Protoc. 3 (8), 1341-1349 (2008).
- Rübel, O., et al. OpenMSI: A High-Performance Web-Based Platform for Mass Spectrometry Imaging. Anal. Chem. 85 (21), 10354-10361 (2013).
- López-Bucio, J., Cruz-Ramı́rez, A., Herrera-Estrella, L. The role of nutrient availability in regulating root architecture. Curr Opin Plant Biol. 6 (3), 280-287 (2003).
- Lynch, J. P. Steep, cheap and deep: an ideotype to optimize water and N acquisition by maize root systems. Ann. Bot. 112 (2), 347-357 (2013).
- Rellán-Álvarez, R., et al. GLO-Roots: an imaging platform enabling multidimensional characterization of soil-grown root systems. eLife. 4, e07597 (2015).
- Kamilova, F., Validov, S., Azarova, T., Mulders, I., Lugtenberg, B. Enrichment for enhanced competitive plant root tip colonizers selects for a new class of biocontrol bacteria. Environ. Microbiol. 7 (11), 1809-1817 (2005).
- Klitgaard, A., Nielsen, J. B., Frandsen, R. J. N., Andersen, M. R., Nielsen, K. F. Combining Stable Isotope Labeling and Molecular Networking for Biosynthetic Pathway Characterization. Anal. Chem. 87 (13), 6520-6526 (2015).
